京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20992号 / 医博第4338号 / 新制||医||1027(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小柳 義夫, 教授 髙折 晃史, 教授 河本 宏 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Le virus T lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1, Human T-cell Leukemia Virus type 1) est le premier rétrovirus oncogène humain à avoir été découvert. Sa protéine régulatrice Tax est la principale responsable du processus d’immortalisation et de transformation des lymphocytes T, cibles préférentielles d’HTLV-1 in vivo, qui est associé au développement de leucémies à cellules T de l’adulte. Ce mécanisme oncogénique est dû à la capacité de Tax à interagir avec de nombreux acteurs cellulaires, détournant ainsi différentes voies qui contrôlent notamment la prolifération et la survie des cellules. L’un des événements majeurs de ce mécanisme est l’activation constitutive de la voie NF-κB induite par Tax. Notre laboratoire ainsi que d’autres équipes ont montré que l’ubiquitinylation de Tax, notamment avec des chaînes liées en K63, est nécessaire pour que Tax recrute et active le complexe IKK (IκB Kinase), en se liant à sa sous-unité régulatrice NEMO dans le cytoplasme. Par ailleurs, il a également été décrit que Tax est SUMOylée ce qui lui permet de recruter les dimères NF-κB dans des corps nucléaires pour activer la transcription de leurs gènes cibles. Toutefois, de nombreuses interrogations persistent autour de l’implication et du mode d’action de chacune de ces modifications post-traductionnelles de Tax dans l’activation de la voie NF-κB. L’importance de la SUMOylation de Tax a en effet été remise en cause par notre laboratoire, suscitant une controverse qui nous décida à réexaminer complètement son rôle dans l’activation de la voie NF-κB. Pour cela, nous avons élaboré une nouvelle stratégie basée sur l’inhibition de la machinerie de SUMOylation endogène, grâce au blocage de l’unique enzyme E2 identifiée dans ce processus, l’enzyme Ubc9. Nous avons prouvé qu’une protéine Tax non SUMOylée, mais toujours ubiquitinylée, active la transcription à partir de promoteurs dépendants de NF-κB, qu’ils soient transfectés, intégrés stablement dans la chromatine cellulaire ou endogènes, démontrant ainsi que la SUMOylation de Tax n’est pas nécessaire à l’activation de la voie NF-κB, contrairement à son ubiquitinylation. Un autre point de questionnement concerne l’association de Tax au complexe NEMO/IKKα/IKKβ, pour laquelle l’ubiquitinylation de Tax est essentielle. Nous avons étudié l’implication de l’enzyme TRAF5 dans ces mécanismes, qui semblait être une potentielle E3 ligase de Tax, celle-ci restant encore inconnue. Grâce au blocage de TRAF5, nous avons montré que cette protéine interagit avec Tax et qu’elle est nécessaire à son ubiquitinylation, notamment avec des chaînes K63, sans toutefois que son activité ligase n’entre en jeu, excluant donc son rôle en tant qu’E3 ligase de Tax. Nous avons également découvert que TRAF5 induit la formation du complexe Tax/IKKα/IKKβ, mais n’est pas impliquée dans l’association Tax/NEMO, dessinant alors un nouveau modèle pour le recrutement et l’activation du complexe IKK par Tax. Ce travail permet donc d’apporter un nouvel éclairage sur l’impact de la SUMOylation et de l’ubiquitinylation de Tax dans l’activation de la voie NF-κB et de décrypter les étapes de cet événement crucial dans le mécanisme oncogénique déclenché par la protéine Tax du virus HTLV-1. / The Human T-cell Leukemia Virus type I is the first human oncoretrovirus discovered. The regulatory Tax protein is the main responsible of the immortalization process of primary CD4+ T lymphocytes, the preferential target cells of HTLV-1 in vivo, which is associated with adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), a highly aggressive malignant proliferation of CD4+ T lymphocytes. The oncogenic property of Tax is mainly due to its capacity to interact with many different cellular proteins belong to several pathways which control cell proliferation and survival. Constitutive activation of the NF-κB pathway induced by Tax plays a crucial role in this oncogenic mechanism. Our laboratory, and others, demonstrated that Tax ubiquitination, notably with K63-linked ubiquitin (Ub) chains, is required for the activation of the cytoplasmic IκB kinase (IKK) complex by directly interacting with the regulatory subunit NEMO. Moreover, in previous studies, we and others describe that Tax is also conjugated to either SUMO-1 or SUMO-2/3 molecules which facilitates its interaction with the NF-κB dimers in particular structures named Tax nuclear bodies, inducing promoter activation of target genes in the nucleus. However, many questions remain concerning the exact role of each Tax post-translational modification in the NF-κB pathway activation process. In the laboratory, we recently reconsidered the importance of Tax SUMOylation, provoking a controversy in our field. So, we decided to reexamine the role of this modification on NF-κB activation. To do this, we designed a novel strategy based on the inhibition of the endogenous SUMOylation machinery by blocking or silencing Ubc9, the unique E2-conjugating enzyme involves in this process. We found that an ubiquitinated but not SUMOylated Tax protein is still able to activate a transfected, an integrated or an endogenous NF-κB promoters, demonstrating that Tax SUMOylation is not required for Tax induced NF-κB pathway activation contrary to its ubiquitination. Another interrogation concerning the formation of the Tax/NEMO/IKKα/IKKβ complex, in which Tax ubiquitination is critical. We studied the role of TRAF5 in these mechanisms because this enzyme could be a potential Ub E3-ligase of Tax, which remains unknown. Thanks to the blockage of TRAF5, we showed that this protein interacts with Tax and that TRAF5 is necessary for Tax ubiquitination, notably with K63-linked Ub chains. However, TRAF5 is not the direct E3-ligase of Tax since we demonstrated that its ligase activity is not involved in Tax conjugation to ubiquitin. We also discovered that TRAF5 induces the formation of the Tax/ IKKα/IKKβ complex but not the association between Tax and NEMO, showing a new model for the recruitment and the activation of the IKK complex by Tax. In conclusion, our results led us to propose a new light on the impact of Tax SUMOylation and ubiquitination in the NF-κB pathway activation and to figure out the different steps of this process, which is crucial for the oncogenic mechanism induced by the HTLV-1 Tax protein.

Le virus T lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1, Human T-cell Leukemia Virus type 1) est le premier rétrovirus oncogène humain à avoir été découvert. Sa protéine régulatrice Tax est la principale responsable du processus d’immortalisation et de transformation des lymphocytes T, cibles préférentielles d’HTLV-1 in vivo, qui est associé au développement de leucémies à cellules T de l’adulte. Ce mécanisme oncogénique est dû à la capacité de Tax à interagir avec de nombreux acteurs cellulaires, détournant ainsi différentes voies qui contrôlent notamment la prolifération et la survie des cellules. L’un des événements majeurs de ce mécanisme est l’activation constitutive de la voie NF-κB induite par Tax. Notre laboratoire ainsi que d’autres équipes ont montré que l’ubiquitinylation de Tax, notamment avec des chaînes liées en K63, est nécessaire pour que Tax recrute et active le complexe IKK (IκB Kinase), en se liant à sa sous-unité régulatrice NEMO dans le cytoplasme. Par ailleurs, il a également été décrit que Tax est SUMOylée ce qui lui permet de recruter les dimères NF-κB dans des corps nucléaires pour activer la transcription de leurs gènes cibles. Toutefois, de nombreuses interrogations persistent autour de l’implication et du mode d’action de chacune de ces modifications post-traductionnelles de Tax dans l’activation de la voie NF-κB. L’importance de la SUMOylation de Tax a en effet été remise en cause par notre laboratoire, suscitant une controverse qui nous décida à réexaminer complètement son rôle dans l’activation de la voie NF-κB. Pour cela, nous avons élaboré une nouvelle stratégie basée sur l’inhibition de la machinerie de SUMOylation endogène, grâce au blocage de l’unique enzyme E2 identifiée dans ce processus, l’enzyme Ubc9. Nous avons prouvé qu’une protéine Tax non SUMOylée, mais toujours ubiquitinylée, active la transcription à partir de promoteurs dépendants de NF-κB, qu’ils soient transfectés, intégrés stablement dans la chromatine cellulaire ou endogènes, démontrant ainsi que la SUMOylation de Tax n’est pas nécessaire à l’activation de la voie NF-κB, contrairement à son ubiquitinylation. Un autre point de questionnement concerne l’association de Tax au complexe NEMO/IKKα/IKKβ, pour laquelle l’ubiquitinylation de Tax est essentielle. Nous avons étudié l’implication de l’enzyme TRAF5 dans ces mécanismes, qui semblait être une potentielle E3 ligase de Tax, celle-ci restant encore inconnue. Grâce au blocage de TRAF5, nous avons montré que cette protéine interagit avec Tax et qu’elle est nécessaire à son ubiquitinylation, notamment avec des chaînes K63, sans toutefois que son activité ligase n’entre en jeu, excluant donc son rôle en tant qu’E3 ligase de Tax. Nous avons également découvert que TRAF5 induit la formation du complexe Tax/IKKα/IKKβ, mais n’est pas impliquée dans l’association Tax/NEMO, dessinant alors un nouveau modèle pour le recrutement et l’activation du complexe IKK par Tax. Ce travail permet donc d’apporter un nouvel éclairage sur l’impact de la SUMOylation et de l’ubiquitinylation de Tax dans l’activation de la voie NF-κB et de décrypter les étapes de cet événement crucial dans le mécanisme oncogénique déclenché par la protéine Tax du virus HTLV-1. / The Human T-cell Leukemia Virus type I is the first human oncoretrovirus discovered. The regulatory Tax protein is the main responsible of the immortalization process of primary CD4+ T lymphocytes, the preferential target cells of HTLV-1 in vivo, which is associated with adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), a highly aggressive malignant proliferation of CD4+ T lymphocytes. The oncogenic property of Tax is mainly due to its capacity to interact with many different cellular proteins belong to several pathways which control cell proliferation and survival. Constitutive activation of the NF-κB pathway induced by Tax plays a crucial role in this oncogenic mechanism. Our laboratory, and others, demonstrated that Tax ubiquitination, notably with K63-linked ubiquitin (Ub) chains, is required for the activation of the cytoplasmic IκB kinase (IKK) complex by directly interacting with the regulatory subunit NEMO. Moreover, in previous studies, we and others describe that Tax is also conjugated to either SUMO-1 or SUMO-2/3 molecules which facilitates its interaction with the NF-κB dimers in particular structures named Tax nuclear bodies, inducing promoter activation of target genes in the nucleus. However, many questions remain concerning the exact role of each Tax post-translational modification in the NF-κB pathway activation process. In the laboratory, we recently reconsidered the importance of Tax SUMOylation, provoking a controversy in our field. So, we decided to reexamine the role of this modification on NF-κB activation. To do this, we designed a novel strategy based on the inhibition of the endogenous SUMOylation machinery by blocking or silencing Ubc9, the unique E2-conjugating enzyme involves in this process. We found that an ubiquitinated but not SUMOylated Tax protein is still able to activate a transfected, an integrated or an endogenous NF-κB promoters, demonstrating that Tax SUMOylation is not required for Tax induced NF-κB pathway activation contrary to its ubiquitination. Another interrogation concerning the formation of the Tax/NEMO/IKKα/IKKβ complex, in which Tax ubiquitination is critical. We studied the role of TRAF5 in these mechanisms because this enzyme could be a potential Ub E3-ligase of Tax, which remains unknown. Thanks to the blockage of TRAF5, we showed that this protein interacts with Tax and that TRAF5 is necessary for Tax ubiquitination, notably with K63-linked Ub chains. However, TRAF5 is not the direct E3-ligase of Tax since we demonstrated that its ligase activity is not involved in Tax conjugation to ubiquitin. We also discovered that TRAF5 induces the formation of the Tax/ IKKα/IKKβ complex but not the association between Tax and NEMO, showing a new model for the recruitment and the activation of the IKK complex by Tax. In conclusion, our results led us to propose a new light on the impact of Tax SUMOylation and ubiquitination in the NF-κB pathway activation and to figure out the different steps of this process, which is crucial for the oncogenic mechanism induced by the HTLV-1 Tax protein.