Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-11T17:03:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Aurenice PPGBAS UFPE.pdf: 4016432 bytes, checksum: bd06ba7277fb3d10f4a5c7495f4cfd65 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-11T17:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Aurenice PPGBAS UFPE.pdf: 4016432 bytes, checksum: bd06ba7277fb3d10f4a5c7495f4cfd65 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / CAPES / CNPQ / Heparina imobilizada em suportes sólidos tem sido utilizada como ligante de afinidade em processos de identificação e purificação de diversas proteínas. No presente estudo, foram sintetizados e caracterizados dois diferentes suportes magnéticos: Dacron (polietilenotereftalato) magnético (mDAC) e magnetita revestida com polianilina (MAG-PANI). Esses materiais foram utilizados como suporte para imobilização covalente de heparina e os compósitos magnéticos obtidos foram usados no fracionamento, depleção e purificação de proteínas do plasma humano. Para produzir o suporte mDAC, o Dacron foi tratado com hidrato de hidrazina, formando Dacron-hidrazida, e, em seguida, foi utilizado para formar um compósito com a magnetita, produzida por co-precipitação de sais de ferro II e III. O suporte MAG-PANI foi obtido a partir do revestimento da magnetita (obtida por coprecipitação) com polianilina através da oxidação da anilina pelo permanganato de potássio. Para imobilizar a heparina aos suportes foi necessária a ativação dos seus grupos carboxílicos com carbodiimida (EDAC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). Análise por microscopia eletrônica mostrou que mDAC possui um tamanho de 1,5 ± 0,5 μm e 14,4 ± 0,9 nm para MAG-PANI. Difratograma de raio-X indicou a presença do Dacron nas partículas de mDAC e da polianilina em MAG-PANI e em ambos a formação do cristal de magnetita. Além disso, medidas de magnetização demonstraram um comportamento superparamagnético para as duas partículas e uma saturação magnética de 23 e 66 emu/g para mDAC e MAG-PANI, respectivamente, nas temperaturas de 293 K, 300 K e 313 K. A quantidade de heparina imobilizada foi de 51 ± 0,1 e 26,4 ± 0,09 μg de heparina por mg de mDAC e MAG-PANI, respectivamente. Plasma humano foi incubado nos compósitos com heparina imobilizada covalentemente (mDAC-HEP e MAG-PANI-HEP) e posteriormente foram lavados com tampão fosfato com concentrações crescentes de NaCl (0,25; 0,5; 1,0 M). Após esse processo, os eluatos obtidos foram submetidos à eletroforese SDS/PAGE de proteínas. Foram observadas muitas proteínas nas primeiras frações que foram depletadas do plasma (albumina, por exemplo) e as frações obtidas com NaCl 1,0 M demonstraram bandas com peso molecular de 58 kDa que correspondem à antitrombina. Além disso, ao realizar a incubação com a provável antitrombina purificada com o plasma normal, o valor do teste de tromboplastina parcial ativado (TTPa) se mostrou prolongado. Isso ocorreu devido à ação anticoagulante da antitrombina que inibiu a formação da trombina e assim o plasma não coagulou. Sendo assim, o método aqui proposto se mostrou útil como ferramenta de depleção de proteínas plasmáticas e purificação da antitrombina humana apresentando as seguintes vantagens: fácil síntese e separação por afinidade magnética. / Heparin immobilized on solid supports has been used as a ligand in affinity purification processes and identification of several proteins. In the present study, two different magnetic supports were synthesized and characterized: Dacron (polyethylene terephthalate) magnetic (mDAC) and magnetite coated with polyaniline (MAG-PANI). These materials were used as supports for covalent immobilization of heparin and these magnetic obtained composites were used for the fractionation, depletion and purification of human plasma protein. To produce the support mDAC, Dacron was treated with hydrazine hydrate forming Dacron hydrazide, and then was used to form a composite with magnetite produced by co-precipitation of salts iron II and III. MAG-PANI support was obtained from the coating magnetite (obtained by co-precipitation) with polyaniline by oxidation of aniline with potassium permanganate. To immobilize the heparin on the supports it was necessary to activate its carboxyl groups with carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). Electron microscopy analysis showed that mDAC has a size of 1.5 ± 0.5 μm and 14.4 ± 0.9 nm for MAG-PANI. X-ray diffraction indicated the presence of Dacron in mDAC particles and polyaniline in PANI-MAG and formation of magnetite crystal in both preparations. Furthermore, magnetization measurements demonstrated a superparamagnetic behavior for the two particles and a magnetic saturation of 23 and 66 emu/g to mDAC and MAG-PANI, respectively, at temperatures of 293 K, 300 K and 313 K. The amount of heparin immobilized was 51 ± 0.1 g and 26.4 ± 0.09 g heparin per mg of mDAC and MAG-PANI, respectively. Human plasma was incubated with the magnetic composites of heparin (mDAC-HEP and MAG-PANI-HEP) that were subsequently washed with phosphate buffer containing increasing concentrations of NaCl (0.25; 0.5; 1.0 M). After this process, the obtained eluates were subjected to electrophoresis SDS/PAGE of proteins. Many proteins were observed in the early fractions that were depleted of the plasma (albumin, for example) and the fractions obtained from 1.0 M NaCl showed bands with a molecular weight of 58 kDa corresponding to antithrombin. Furthermore, by performing incubation with this purified antithrombin from the plasma the value of the activated partial thromboplastin time test (APTT) showed prolonged. Therefore, the proposed method has proven useful as a tool depletion of plasma proteins and purification of human antithrombin having the following advantages: facile synthesis and magnetic affinity separation.

Orientador: Julia Prado Franceschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T18:08:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tarsitano_ChristianeAparecidaBadin_M.pdf: 3776401 bytes, checksum: da949a6570ac85fc05d84aa93ee16374 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Este trabalho objetivou demonstrar que entre as toxinas crotálicas, só a convulxina é capaz de causar trombose pulmonar em camundongos e buscou, ao mesmo tempo, investigar o mecanismo pelo qual a convulxina produz a trombose pulmonar. A convulxina, isolada tanto do veneno de C. d. terrificus como da C. d cascavel/a, mostrou ser a única capaz de agregar plaquetas e evocar a formação de trombos em pulmões de camundongos. Como não houve diferença entre o grau de trombose causado pela convulxina das duas subespécies, os resultados obtidos com cada uma, em separado, foram agrupados. Na tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na trombose, utilizamos não só os inibidores clássicos da agregação via tromboxano Az (AAS e Dazoxiben), como também a prostaciclina, capaz de elevar os níveis intracelulares de AMPc. Usamos também inibidores da trombina (heparina) e antagonistas ensaiados, anteriormente, na agregação e/ou broncoconstrição, induzidas pela convulxina (metisergida, mepiramina e metronidazol). Os resultados obtidos levam-nos às seguintes conclusões: a convulxina, poderoso agente agregante plaquetário in vitro, induz à formação de trombos no pulmão de camundongos; tanto a heparina, como a aspirina, a prostaciclina e o dazoxiben mostraramse capazes de inibir o efeito trombótico da convulxina, sozinhos ou em associaç~o; a heparina potencializou os efeitos das demais drogas e o seu efeito antitrombótico foi potencializado pela associação com o dermatan. O modelo é autolimitado, pois não admite a possibilidade de aumento de dose da convulxina / Abstract: Convulxin is a high molecular weight, non-enzymatic, platelet aggregating protein present in the venom of South American rattlesnake, Crotalus durissus terrificus. In this work, we investigatd the ability of convulxin to cause pulmonary thrombosis in mice after intravenous injection and examined the possible mechanism (s) involved using specific inhibitors. Convulxin was purified ftom C. d. cascavella e C. d terrificus venom by chromatography on Sephadex G-75 in 0.005 M ammonium formate, ph 3.5. Male Swiss mice were injected i.v. with varying doses of convulxin and then euthanized 30 minoLater after wich the lungs were rapidly removed, fixed and processed for histological analysis to determine the ftequency of pulmonary thrombosis. Human platelet-rich plasma was prepared by standart differential centrifugation. Convulxin ftom C. d cascavella e C. d terrificus venoms aggregated hurnan platelet at concentrations 8 ng/ml and cause pulmonary thrombosis at doses20 ~g/kg. The latter was dose-dependent at doses up to 400 ~g/kg, but decreased at higher dose (up to 1000 ~g/kg) which produced the convulsions characteristic of.this toxin. In no caso did the ftequency ofthrombi (expressed as the percentage of vessels occuded with thrombi) exceed 70%. Histological examination by light microscopy showed that there was no thrombus formation in other organs such as heart, kidney and tiver. Heparin and dermatan (anionic molecules) were partially effective at preventing the thrmbotic action of convulxin, particularlyat low doses of the latter, perhaps through a direct electrostatic interaction with convulxin. Mepyramine (histaminer H2 , receptorantagonist), methysergide (5-HT receptor antagonist) and metronidazole há no effect on the formation of thrombi induced by convulxin. Sirnilary, prostacyclin, which increases intracelular cAMP levels, dazoxiben, a thromboxane A2 synthase inhibitor, and aspirin, a cyc100xygenase inhibitor, did not inhibit convulxin-induced thrombosis. These results suggest that is no direct reationship between the platelet aggregation and the convulsions produced by convulxin and that mediators known to affect convulxin-induce aggregation do not affect the thrombotic activity, perhaps because these actions involve different pathways / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-24T20:21:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Anna Carolina Teixeira Mesquita.pdf: 1833249 bytes, checksum: 495771ad0010e48794c98504d2ad4f25 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-27T17:00:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Anna Carolina Teixeira Mesquita.pdf: 1833249 bytes, checksum: 495771ad0010e48794c98504d2ad4f25 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-27T17:00:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Anna Carolina Teixeira Mesquita.pdf: 1833249 bytes, checksum: 495771ad0010e48794c98504d2ad4f25 (MD5) Previous issue date: 2016-11-30 / FACEPE / Dentre os métodos para quantificação de heparinas têm se que o método turbidimétrico utiliza as condições de 37 ºC, pH reacional de 4,4 e tempo de reação de 1hora. Através da ferramenta estatística de planejamento de experimentos uma nova condição reacional foi obtida, garantindo o conhecimento da influência de cada fator sobre a metodologia. No comprimento de 500nm foi realizado um planejamento fatorial com ponto central 2³. Em seguida foi realizada a expansão deste planejamento com a adição dos níveis axiais com o objetivo de obtenção da superfície ótima do estudo das variáveis investigadas neste trabalho. Na literatura, é possível também encontrar a utilização de um comprimento de onda menor (290nm) para quantificação de complexos contendo concentrações menores de HBPM. Assim como em 500nm, também foi realizado um estudo de avaliação da influência destes fatores para o comprimento de onda de 290nm, cuja abordagem foi através do planejamento fatorial com ponto central 2³ e em seguida um 2². Os modelos construídos revelaram que mais de metade das variações (> 60%) puderam ser explicadas pelas variáveis investigadas nestes planejamentos em 500nm e 290nm. Então foram determinadas as novas condições para leituras obtidas em 500nm, sendo a temperatura em 37 ºC, pH reacional de 5,4 e tempo de reação em 45minutos. E para 290nm foram estabelecidas as condições experimentais de temperatura em 37ºC, pH reacional de 5,4 e o tempo de reação de 20minutos. Sobre a influência destes parâmetros na resposta do método foi comprovado que a temperatura reacional do meio, tanto para as respostas em 500nm, como em 290nm, não modifica a resposta. No entanto, o pH reacional para as leituras em 500nm produzem modificações consistentes no desempenho do método. O tempo de reação foi um ponto importante avaliado por este trabalho para ambos comprimentos de onda. Houve uma compreensão deste parâmetro frente as concentrações de HBPM que antes não tinha sido relatada em outro trabalho científico. Assim o tempo de reação para 500nm pôde ser modificado para 45minutos. E para 290nm para 20minutos. Após esta etapa de planejamento de experimentos, o método turbidimétrico foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pelos guias do ICH para validação de procedimentos analíticos para a quantificação de diferentes concentrações de HBPM. A realização do estudo da curva de calibração demonstrou que o limite de quantificação para o comprimento de 500nm, com precisão e exatidão, foi até 20μg/mL. Sendo assim, a faixa de linearidade para o comprimento de 500nm foi de 20 – 200μg/mL e devido à presença de heterocedasticidade dos dados a equação de regressão obtida pelo método dos mínimos quadrados ponderados foi y = -0,03421 + 0,00340C. Já para o comprimento de 290nm a faixa de linearidade foi de 3 - 20μg/mL e a equação da regressão obtida pelo método dos mínimos quadrados ordinários foi y = -0,00921 + 0,00583C. A partir da aprovação do método para os demais parâmetros da validação o método foi robusto para variações de temperatura, preciso e exato para ambos comprimentos de onda. / Among the methods for the quantification of heparins have that the method turbidimétrico uses the conditions of 37° C, pH of reaction mass of 4,4 and reaction time of 1 hour. Through the statistical tool of design of experiments a new condition, a reaction mass was obtained, ensuring the knowledge of the influence of each factor on the methodology. At the length of 500nm was performed a factorial planning with central point 2³. Then was held the expansion of this planning with the addition of levels axial with the goal of obtaining the surface great the study of the variables investigated in this work. In the literature, it is possible to also find the use of a shorter wavelength (290nm) for the quantification of complexes containing lower concentrations of HBPM. As well as 500nm, there was also performed an assessment study of the influence of these factors to the wavelength of 290nm, whose approach has been through the factorial planning with central point 2³ and then one 2². The models constructed revealed that more than half of the variation (> 60%) could be explained by the variables investigated in these plans at 500nm and 290nm. Then there were certain new conditions to the readings obtained in 500nm, the temperature at 37°C , pH of reaction of 5,4 and reaction time in 45 minutes. And for 290nm were established the experimental conditions of temperature at 37ºC, pH, reaction 5,4 and the reaction time of 20minutes. About the influence of these parameters on the response of the method has been proven that the temperature reaction of the medium, both for the answers at 500nm, as in 290nm, does not modify the response. However, the pH of reaction for the readings at 500nm to produce changes consistent the performance of the method. The reaction time was an important point evaluated by this work for both wavelengths. There was an understanding of this parameter front the concentrations of HBPM that had not previously been reported in other scientific work. Thus the reaction time to 500nm could be modified for 45minutes. And for 290nm for 20minutes. After this step of the planning of experiments, the method turbidimétrico was validated according to the parameters established by the guides ICH for validation of analytical procedures for the quantification of different concentrations of HBPM. The study of the calibration curve showed that the limit of quantification for the length of 500nm, with precision and accuracy, was up to 20μg/mL. Thus, the range of linearity for the length of 500nm was 20 – 200μg/mL, and due to the presence of heterocedasticidade of the data the regression equation obtained by the method of least squares weighted was y = -0,03421 + 0,00340C. As for the length of 290nm in the range of linearity was 3 - 20μg/mL and the regression equation obtained by the method of ols was y = -0,00921 + 0,00583C. with The approval of the method for the other parameters of the validation the method was robust to variations of temperature, precise and accurate for both wavelengths.

Submitted by Milena Dias (milena.dias@ufpe.br) on 2015-03-12T18:12:58Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO RENATA VIEIRA1.pdf: 999593 bytes, checksum: 7a8f3c528bbbb2faff8a133b10f0e1a7 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T18:12:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO RENATA VIEIRA1.pdf: 999593 bytes, checksum: 7a8f3c528bbbb2faff8a133b10f0e1a7 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES / Antitrombina (AT) é uma serpina que está envolvida na regulação da coagulação sanguínea através da inibição de enzimas pró-coagulativas. A heparina é um ativador alostérico da AT que se liga a ela e causa uma mudança conformacional no sítio reativo, o que faz aumentar sua ação anticoagulante. Sendo assim, a fim de obter AT purificada através de separação por afinidade, este trabalho propôs imobilizar heparina utilizando a sua propriedade de se ligar à AT. O suporte para imobilização foram as membranas nanoporosas de óxido de alumínio anódico (AAO), adquiridas da Whatman®. Estas foram tratadas com solução de permanganato de potássio a 0,1 M, 50 ºC por 12 horas e revestidas com polianilina (PANI) a 0,5 M por 2 horas. Posteriormente, uma solução de heparina de 3 mg/mL foi imobilizada ao suporte por 12 horas a 25 ºC e então foi determinada a quantidade de heparina fixada à membrana. O suporte foi incubado com plasma humano por 1 hora à 4 ºC. A remoção das proteínas ligadas ao suporte foi realizada mediante aumento da força iônica, utilizando soluções de NaCl 0,5 M, 1,0 M, 1,5 M e 2,0 M tipo stepwise. Em seguida, os eluatos foram submetidos à eletroforese (SDS-PAGE), segundo metodologia de Laemmli (1970). O percentual da quantidade de heparina imobilizada foi 53,04 % do total ofertado. O tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e a dosagem da atividade da antitrombina constataram a presença de antitrombina nos eluatos, a qual começa a dissociar da membrana após concentração de sal de 1,5 M. A presença de AT complexada à membrana foi confirmado pela eletroforese. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que este novo modelo de imobilização de heparina pode ser aplicado nas áreas de purificação de proteínas e biomateriais.

A antitrombina (AT) é uma serpina glicoprotéica responsável pela inibição fisiológica das proteases da cascata de coagulação. É o receptor-alvo responsável pela ação anticoagulante da heparina e de outros glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs), capazes de potencializar sua ação inibitória sobre, principalmente, fIIa e fXa. Tal modulacão da AT por GAGs está associada intrinsecamente à parte sacarídica desta serpina, uma vez que mudanças no seu padrão de glicosilação modulam sua ativação por polissacarídeos. Em função de efeitos colaterais decorrentes da terapia anticoagulante atualmente disponível, um grande esforço vem sendo dedicado na busca de novos polissacarídeos, capazes de reproduzirem os efeitos terapêuticos da heparina, sem apresentar seus efeitos colaterais. Nesta busca, podem-se incluir polissacarídeos isolados de ouriços-do-mar, como galactanas e fucanas. Particularmente, galactanas 2-sulfatadas, 3-ligadas são anticoagulantes, enquanto que fucanas 2-sulfatadas, 3- ligadas não o são. Contudo, as razões moleculares para tais diferenças ainda permanecem desconhecidas. Diante do exposto, um dos objetivos deste trabalho reside na caracterização do reconhecimento molecular de GAGs obtidos de fontes animais pela AT, através um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas tanto livres em solução aquosa quanto complexadas à AT, utilizando cálculos ab initio, cálculos de docking receptor-ligante e simulações por dinâmica molecular (DM). Adicionalmente, objetiva-se a descrição do perfil conformacional da estrutura de glicosilação da AT (ATg), através de mapas de contorno e simulações por DM, tendo-se em vista a importância da glicosilação para as propriedades anticoagulantes da AT e da carência de informações conformacionais acerca desta parte da molécula. As simulações por DM da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas indicam que ambas apresentam perfis conformacionais semelhantes em solução aquosa. Quando complexadas à AT, os dois polissacarídeos apresentam orientações distintas, o que explica as diferenças nas suas atividade anticoagulantes. Com relação às simulações por DM da estrutura glicosídica da AT em solução aquosa, os resultados mostraram que sua conformação em soluçãodifere significativamente da obtida por métodos de difração de raios-X em cristais. Estes dados evidenciam a existência de distorções na estrutura cristalográfica da AT glicosilada, resultantes de efeitos de empacotamento devido ao cristal. / Antithrombin (AT) is a glycoproteic serpin responsible for physiologic inhibition of coagulation cascade proteases. It is the target receptor responsible for heparin and other glycosaminoglycans (GAGs) anticoagulat activities, capable of potentialize its inhibitory action over, mainly, fIIa and fXa. Such AT modulation by GAGs is intrinsically associated with the sacaridic part of this serpin, since changes on its glycosilation pattern modulate its activation by polisaccharides. Due to side effects that occur from the use of the available anticoagulant therapy, efforts have been dedicated in the search for new polisaccharides, capable to reproduce heparin therapeutic effects, in the absence of its adverse effects. In this search, can be included polisaccharides isolated from sea urchins, like galactans and fucans. Particularly, 2-sulfated, 3-linked galactans are anticoagulants, while 2- sulfated, 3-linked fucans are not. However, the molecular reasons of such differences are still unknown.Thus, this work aims the characterization of the molecular recognition pattern of GAGs obtained from animal sources by AT, through a molecular modeling study of 2- sulfated, 3-linked galactan and fucan conformational profiles, free in aqueous solution or complexed with AT, using ab initio, ligand-receptor docking and molecular dynamics (MD) calculations. Additionally, we purpose the description of the conformational profile of AT glycosilation structure (ATg) using energy contour plots and MD simulations, due to the importance of ATg to AT anticoagulant properties and the lack of conformational information regarding this part of the protein. 2-sulfated, 3-linked galactan and fucan decasaccharide MD simulations indicate that both polisaccharides present similar conformations in aqueous solution. When complexed with AT, the two polisaccharides present distinct orientations, which explains the differences in its anticoagulant activities. Regarding AT glycosidic structure MD simulations in aqueous solution, the results show that its conformation differs in a great extent from that determined by X-ray crystallographic methods. These data evidenciate the existence of distortions in the crystallographic structure, which results from packing effects.

A antitrombina (AT) é uma serpina glicoprotéica responsável pela inibição fisiológica das proteases da cascata de coagulação. É o receptor-alvo responsável pela ação anticoagulante da heparina e de outros glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs), capazes de potencializar sua ação inibitória sobre, principalmente, fIIa e fXa. Tal modulacão da AT por GAGs está associada intrinsecamente à parte sacarídica desta serpina, uma vez que mudanças no seu padrão de glicosilação modulam sua ativação por polissacarídeos. Em função de efeitos colaterais decorrentes da terapia anticoagulante atualmente disponível, um grande esforço vem sendo dedicado na busca de novos polissacarídeos, capazes de reproduzirem os efeitos terapêuticos da heparina, sem apresentar seus efeitos colaterais. Nesta busca, podem-se incluir polissacarídeos isolados de ouriços-do-mar, como galactanas e fucanas. Particularmente, galactanas 2-sulfatadas, 3-ligadas são anticoagulantes, enquanto que fucanas 2-sulfatadas, 3- ligadas não o são. Contudo, as razões moleculares para tais diferenças ainda permanecem desconhecidas. Diante do exposto, um dos objetivos deste trabalho reside na caracterização do reconhecimento molecular de GAGs obtidos de fontes animais pela AT, através um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas tanto livres em solução aquosa quanto complexadas à AT, utilizando cálculos ab initio, cálculos de docking receptor-ligante e simulações por dinâmica molecular (DM). Adicionalmente, objetiva-se a descrição do perfil conformacional da estrutura de glicosilação da AT (ATg), através de mapas de contorno e simulações por DM, tendo-se em vista a importância da glicosilação para as propriedades anticoagulantes da AT e da carência de informações conformacionais acerca desta parte da molécula. As simulações por DM da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas indicam que ambas apresentam perfis conformacionais semelhantes em solução aquosa. Quando complexadas à AT, os dois polissacarídeos apresentam orientações distintas, o que explica as diferenças nas suas atividade anticoagulantes. Com relação às simulações por DM da estrutura glicosídica da AT em solução aquosa, os resultados mostraram que sua conformação em soluçãodifere significativamente da obtida por métodos de difração de raios-X em cristais. Estes dados evidenciam a existência de distorções na estrutura cristalográfica da AT glicosilada, resultantes de efeitos de empacotamento devido ao cristal. / Antithrombin (AT) is a glycoproteic serpin responsible for physiologic inhibition of coagulation cascade proteases. It is the target receptor responsible for heparin and other glycosaminoglycans (GAGs) anticoagulat activities, capable of potentialize its inhibitory action over, mainly, fIIa and fXa. Such AT modulation by GAGs is intrinsically associated with the sacaridic part of this serpin, since changes on its glycosilation pattern modulate its activation by polisaccharides. Due to side effects that occur from the use of the available anticoagulant therapy, efforts have been dedicated in the search for new polisaccharides, capable to reproduce heparin therapeutic effects, in the absence of its adverse effects. In this search, can be included polisaccharides isolated from sea urchins, like galactans and fucans. Particularly, 2-sulfated, 3-linked galactans are anticoagulants, while 2- sulfated, 3-linked fucans are not. However, the molecular reasons of such differences are still unknown.Thus, this work aims the characterization of the molecular recognition pattern of GAGs obtained from animal sources by AT, through a molecular modeling study of 2- sulfated, 3-linked galactan and fucan conformational profiles, free in aqueous solution or complexed with AT, using ab initio, ligand-receptor docking and molecular dynamics (MD) calculations. Additionally, we purpose the description of the conformational profile of AT glycosilation structure (ATg) using energy contour plots and MD simulations, due to the importance of ATg to AT anticoagulant properties and the lack of conformational information regarding this part of the protein. 2-sulfated, 3-linked galactan and fucan decasaccharide MD simulations indicate that both polisaccharides present similar conformations in aqueous solution. When complexed with AT, the two polisaccharides present distinct orientations, which explains the differences in its anticoagulant activities. Regarding AT glycosidic structure MD simulations in aqueous solution, the results show that its conformation differs in a great extent from that determined by X-ray crystallographic methods. These data evidenciate the existence of distortions in the crystallographic structure, which results from packing effects.

A antitrombina (AT) é uma serpina glicoprotéica responsável pela inibição fisiológica das proteases da cascata de coagulação. É o receptor-alvo responsável pela ação anticoagulante da heparina e de outros glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs), capazes de potencializar sua ação inibitória sobre, principalmente, fIIa e fXa. Tal modulacão da AT por GAGs está associada intrinsecamente à parte sacarídica desta serpina, uma vez que mudanças no seu padrão de glicosilação modulam sua ativação por polissacarídeos. Em função de efeitos colaterais decorrentes da terapia anticoagulante atualmente disponível, um grande esforço vem sendo dedicado na busca de novos polissacarídeos, capazes de reproduzirem os efeitos terapêuticos da heparina, sem apresentar seus efeitos colaterais. Nesta busca, podem-se incluir polissacarídeos isolados de ouriços-do-mar, como galactanas e fucanas. Particularmente, galactanas 2-sulfatadas, 3-ligadas são anticoagulantes, enquanto que fucanas 2-sulfatadas, 3- ligadas não o são. Contudo, as razões moleculares para tais diferenças ainda permanecem desconhecidas. Diante do exposto, um dos objetivos deste trabalho reside na caracterização do reconhecimento molecular de GAGs obtidos de fontes animais pela AT, através um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas tanto livres em solução aquosa quanto complexadas à AT, utilizando cálculos ab initio, cálculos de docking receptor-ligante e simulações por dinâmica molecular (DM). Adicionalmente, objetiva-se a descrição do perfil conformacional da estrutura de glicosilação da AT (ATg), através de mapas de contorno e simulações por DM, tendo-se em vista a importância da glicosilação para as propriedades anticoagulantes da AT e da carência de informações conformacionais acerca desta parte da molécula. As simulações por DM da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas indicam que ambas apresentam perfis conformacionais semelhantes em solução aquosa. Quando complexadas à AT, os dois polissacarídeos apresentam orientações distintas, o que explica as diferenças nas suas atividade anticoagulantes. Com relação às simulações por DM da estrutura glicosídica da AT em solução aquosa, os resultados mostraram que sua conformação em soluçãodifere significativamente da obtida por métodos de difração de raios-X em cristais. Estes dados evidenciam a existência de distorções na estrutura cristalográfica da AT glicosilada, resultantes de efeitos de empacotamento devido ao cristal. / Antithrombin (AT) is a glycoproteic serpin responsible for physiologic inhibition of coagulation cascade proteases. It is the target receptor responsible for heparin and other glycosaminoglycans (GAGs) anticoagulat activities, capable of potentialize its inhibitory action over, mainly, fIIa and fXa. Such AT modulation by GAGs is intrinsically associated with the sacaridic part of this serpin, since changes on its glycosilation pattern modulate its activation by polisaccharides. Due to side effects that occur from the use of the available anticoagulant therapy, efforts have been dedicated in the search for new polisaccharides, capable to reproduce heparin therapeutic effects, in the absence of its adverse effects. In this search, can be included polisaccharides isolated from sea urchins, like galactans and fucans. Particularly, 2-sulfated, 3-linked galactans are anticoagulants, while 2- sulfated, 3-linked fucans are not. However, the molecular reasons of such differences are still unknown.Thus, this work aims the characterization of the molecular recognition pattern of GAGs obtained from animal sources by AT, through a molecular modeling study of 2- sulfated, 3-linked galactan and fucan conformational profiles, free in aqueous solution or complexed with AT, using ab initio, ligand-receptor docking and molecular dynamics (MD) calculations. Additionally, we purpose the description of the conformational profile of AT glycosilation structure (ATg) using energy contour plots and MD simulations, due to the importance of ATg to AT anticoagulant properties and the lack of conformational information regarding this part of the protein. 2-sulfated, 3-linked galactan and fucan decasaccharide MD simulations indicate that both polisaccharides present similar conformations in aqueous solution. When complexed with AT, the two polisaccharides present distinct orientations, which explains the differences in its anticoagulant activities. Regarding AT glycosidic structure MD simulations in aqueous solution, the results show that its conformation differs in a great extent from that determined by X-ray crystallographic methods. These data evidenciate the existence of distortions in the crystallographic structure, which results from packing effects.

Orientadores : Lea Rodrigues Simioni, Maria Alice da Cruz-Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T17:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_YokoOshima_D.pdf: 36881160 bytes, checksum: f76f491f0939facad9ad247c1983472b (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A bothropstoxina-I (BthTX-I), principal miotoxina do veneno de Bothrops jararacussu, tem atividades neurotóxica e miotóxica. Investigou-se a habilidade do antiveneno crotoxínico e da heparina em prevenir as atividades neurotóxica e miotóxica da BthTX-I. Preparações nervo ftênico-diaftagma (NFD) de camundongos estimuladas indiretamente (0.2 ms, O.I Hz) foram incubadas com BthTX-I (20 flglmI) ou com BthTX-I pré-incubada com antiveneno ou heparina, por 30 min a 37°C. BthTX-I (20 flg/ml) produziu 50% de bloqueio neuromuscular em preparações NFD em 31 :t 4 min, com completo bloqueio ocorrendo aos 120 mino...Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Bothropstoxm-I (BthTX-I), the principal myotoxm of Bothrops jararacussu venom, has myotoxic and neurotoxic activities. The ability of crotoxm antisermn and heparin in preventing the myotoxic and neurotoxic effects of BthTX-I was investigated. Mouse phrenic nerve-diaphragm preparations (PND) stimulated indirect1y with supramaximaI stimuli (0.2 ms, 0.1 Hz) were incubated with BthTX-I (20 llg/mI) alone or with BthTX-I preincubated with antisermn or heparin for 30 min at 37°C prior to testing. BthTX-I (20 1lg/mI) produced 50% neuromuscuIar blockade in PND preparatíons in 31 ::!:4 min, with complete blockade occurring in 120 min. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Farmacologia

La heparina es una familia de cadenas de glicosaminoglicanos (GAGs) formados por residuos de glucosamina y ácido urónico, cuya eficacia y seguridad en la profilaxis y tratamiento de las enfermedades trombóticas están bien establecidas.El descubrimiento de que parecía posible desdoblar el efecto inhibidor del factor Xa de la inhibición de la trombina, con las fracciones de bajo peso molecular de la heparina despertó grandes expectativas y condujo a la introducción en terapéutica de las heparinas y heparinoides de bajo peso molecular. Debido a los distintos procedimientos de obtención y a las diferentes unidades utilizadas por los fabricantes para expresar la actividad de sus productos, las comparaciones entre los distintos preparados eran complicadas.Esta situación indujo a la realización de la presente tesis en la que se comparó el efecto de distintos GAGs sobre la hemostasia en un modelo de trombosis in vitro.Los productos estudiados fueron: Fragmin® (Kabi) y Fraxiparinc® (Sanofi), dos heparinas de bajo peso molecular que se obtienen a partir de la heparina por despolimerización y purificación; Lomoparán® (Organon) un hiparinoide de bajo peso molecular que se produce directamente de mucosa intestinal porcina; Org 31550 es un derivado sintético del pentasacárido natural de unión a la ATIII y está exento de toda acción inhibidora de la trombina; la heparina no fraccionada estudiada (HNF, Laboratorios Rovi) es la disponible comercialmente y se obtiene de mucosa intestinal porcina.Debido a las distintas unidades empleadas por los fabricantes, en primer lugar hubo que seleccionar la concentración óptima que sería utilizada en las perfusiones, para cada uno de los productos. De forma arbitraria se decidió utilizar la mínima necesaria que inhibiera la formación de trombina en sangre mantenida en reposo a temperatura ambiente. Como indicador de la formación de trombina se determinó la concentración de fibrinopéptido A (FPA).A continuación se estudió el efecto de los GAGs sobre el funcionalismo plaquetario a las dosis seleccionadas. Para ello se realizaron perfusiones en las que se cuantificó el depósito de plaquetas sobre la superficie expuesta al flujo y se evaluó la formación de microagregados plaquetarios.Las perfusiones se realizaron en una cámara de perfusión desarrollada por Sakariassen. La superficie adhesiva era matriz extracelular (MEC) de células endoteliales (CE) cultivadas in vitro. Expuesta al flujo esta matriz induce la adhesión plaquetaria, pero no la formación de trombos. Para obtener una matriz trombogénica que permitiera estudiar la formación de fibrina y trombos plaquetarios, las células fueron estimuladas con un éster de forbol que induce en las CE la síntesis y depósito de factor tisular en la MEC que activará la cascada de la coagulación que conducirá a la producción de trombina.En la evaluación en face de la adhesión plaquetaria se cuantificó la superficie cubierta (SC) por plaquetas. Los trombos plaquetarios se evaluaron en sección transversal que permite cuantificar la superficie cubierta por trombos de diferentes alturas. Al finalizar las perfusiones se midió la formación de microagregados (SPD) realizando recuentos en EDTA y en glutaraldehído en un contador automático fijando la ventana de recuento entre 3,2 y 16 fl. La idea es que los microagregados formados durante la perfusión se deshacen al colocarlos en una EDTA, y por el contrario son fijados en glutaraldehído y no son valorados por el contador.El siguiente paso consistió en encontrar un método fiable que permitiera cuantificar la fibrina depositada sobre la matriz. En primer lugar se comparó la técnica que se pensaba utilizar, que es la del Fg-PO con la del Fg marcado con iodo 125 que se considera el patrón pero que tiene el inconveniente de que obliga a trabajar con material radioactivo. Para el estudio comparativo se realizaron perfusiones sobre matriz trombogénica en las que la fibrina se midió con las dos técnicas a la vez.Una vez establecida la técnica a utilizar se estudió el efecto de los glicosaminoglicanos y de las condiciones de flujo sobre la formación de fibrina, utilizando las mismas condiciones de perfusiones que antes.RESULTADOSSe observa que Fragmin y Fraxiparine son casi igualmente efectivas inhibiendo la formación de trombina en la sangre en reposo en términos de molaridad (33,2 Y 36,8 nmol/ml aunque difieren considerablemente cuando se expresan en las U del fabricante (20 y 40 U/mi). Mucha mayor cantidad se requiere de Lomoparan (146,4 nmol/ml) y del pentasacárido 31550 (95,2 nmol/ml) posiblemente debido a su menor actividad inhibidora de la trombina. Como cabía esperar por su actividad anti-trombina mucha menor cantidad de HNF fue necesaria (1,9 nmol/ml).Con la sangre anticoagulada con Lomoparan, la SC por plaquetas es significativamente mayor a los otros GAGs. Respecto al SPD la cifra de Lomoparan es menor aunque sólo es estadísticamente significativa comparada con la obtenida con Fragmin. Al estudiar la relación entre SC y SPD en cada una de las perfusiones realizadas, se observa que presentan una correlación lineal inversa estadísticamente significativa. Parece probable que la mayor SC observada con Lomoparan sea debido a su menor capacidad de formación de microagregados.Cuando se estudió el efecto sobre la formación de agregados, sólo en la superficie cubierta por agregados mayores de 10 milimicras se observaron diferencias, siendo menor para heparina no fraccionada y Lomoparan que para Fragmin y Fraxiparine. Sabemos que la formación de trombos plaquetarios en estas condiciones es un proceso trombina dependiente. Por lo tanto las diferencias observadas en los agregados de mayor tamaño posiblemente sea debida a diferencias en la cantidad de trombina formada. Presentando la HNF la mayor capacidad de inhibición, y tras ella Lomoparan, Fragmin y Fraxiparine.Tras realizar los estudios comparativos se decidió utilizar el marcaje con yodo pues a pesar de que la manipulación del material radioactivo es más engorrosa, proporciona unos resultados fiables.Una vez seleccionada la técnica a utilizar, se estudió el efecto de los glicosaminoglicanos y del flujo sobre el depósito de fibrina.La cantidad de fibrina depositada en las perfusiones realizadas con sangre anticoagulada con la HNF, a ambos coeficientes de cizalladura es casi inexistente. Ni la microscopía óptica ni la electrónica, mostraron fibrina en absoluto; estas cifras probablemente muestran los valores de fondo correspondientes al Fg-Yodo asociado a la MEC y/o a las plaquetas.Por el contrario, la fibrina formada con los otros GAGs varió considerablemente dependiendo del tipo de anticoagulante y el coeficiente de cizalladura. A 300 s(-1) el pentasacárido Org 31550 proporcionó las cantidades mayores de fibrina formada, seguido por Fraxiparine y Fragmin. Lomoparan inhibió el depósito de fibrina en mayor proporción.Cuando el coeficiente de cizalladura se aumentó a 1.300 s(-1) la cantidad de fibrina disminuyó. Para el pentasacárido y la HNF, la reducción no alcanzó significación estadística. Sí lo fue para Fraxiparine, Fragmin y Lomoparán, en los que rondó alrededor del 80%.La generación del FPA siguió el mismo patrón que la fibrina, es decir el menor aument o correspondió a la HNF, ya continuación Lornoparan, Fragmin y Fraxiparine y el mayor al pentasacárido. El aumento en los niveles de fibrinopéptido A se detuvo al fmalizar la perfusión en todos los GAGs excepto para el pentasacárido. En este caso, a los 15' de acabar la perfusión los niveles de FPA habían crecido aproximadamente un 30%. Esto probablemente indica que una vez se ha formado trombina escapa a los mecanismos de inhibición y continua ejerciendo su acción en la fase líquida.Entre los GAGs de bajo peso molecular Lomoparán posee un efecto antitrombina mayor que Fragmin y Fraxiparine. Este mayor potencial antitrombólico podría deberse a la presencia de dermatán sulfato, pues recientemente se ha demostrado que los complejos de dermatán sulfato-cofactor JI de la heparina son capaces de inhibir a la trombina unida a la fibrina mientras que los complejos de antitrombina III-heparina no lo son. El perfil de acción de Fragmin y Fraxiparine es más o menos igual con una tendencia de Fraxiparine hacia un menor efecto antitrombótico.Las diferencias observadas en la generación de FPA comparando los dos coeficientes de cizalladura no fueron estadísticamente significativas. Esto sugiere que la menor cantidad de fibrina depositada a alto coeficiente de cizalladura posiblemente se debe a una menor polimerización de los monómeros de fibrina inducida por el flujo que a un defecto en la formación de trombina. / Low molecular weight heparin(oid)s (LMWH) differ markedly in terms of molecular composition and activity. In order lo gel more insight into the effect on platelets and fibrin deposition we have compared Fragmin® (KabiVitrum, FA), Fraxiparine® (Choay Laboratories, FP), Lornoparan®, a LMW heparinoid (Organon, LO), a synthetic derivative of rhe natural pentasaccharide, Organon 31550 (PE) and unfractionated heparin (Rovi Laboratories, UH) in a perfusion systern. The concentration selected for perfusion studies was the lowest which inhibited thrombin generation (measured as increase in fibrinopeptide A, FPA) in blood stored for 3 hours at room temperature. Blood from healthy donors was anticoagulated with FA 20 U/ml, FP 40 U/ml, LO 15 U/ml, PE 200 U/ml and UH 5 U/ml. Perfusions were carried out in a rectangular chamber at a shear rate of 300 and 1300 s(-1) for 5 minutes. The extracellular matrices (ECM) used as adhesive surface were obtained from cultured human umbilical vein endothelial cells. A part of these cells were stimulated with phorbol myristate acetate for 16 hours to induce tissue factor synthesis and thrombin formation in the ECM.The extent of platelet aggregation during perfusion was measured as single platelet disappearance (SPD) by comparing platelet counts in EDTA and glutaraldehyde. Fibrin deposition was measured with IUI-fibrinogen. FPA generation during perfusion was assessed with a RIA kit. In the perfusions performed al 1300 s(-1)' for 5 min, over non stimulated ECM, LO showed a significantly higher platelet adhesion than the other heparins. This correlated with a significantly lower SPD during perfusion. In perfusions carried out at 300 s(-1) over stimulated ECM, all LMWH's and PE gave significantly more fibrin deposition than UH. LO gave less fibrin than the others LMWH's. When the shear rate was increased to 1,300 s(-1) the amount of fibrin deposited on !he ECM decreased, with no changes in the amount of FPA generated, indicating that probably it was due to a defect on fibrin polymerisation more than to a impairment of thrombin formation. In conclusion: in this experimental model, LO exerts less effect on platelets than the other heparins studied. All LMWH's tested and PE, but not UH, a1low local thrombin generation and fibrin deposition on subendothelium. LO inhibited fibrin deposition to a larger extent than the other LMWH's.

Introdução: Ensaios clínicos comprovam que, na ausência de profilaxia, a incidência média de trombose venosa profunda (TVP) pode chegar a 19% em pacientes cirúrgicos. Apesar da existência de recomendações que orientam a prescrição de esquemas profiláticos, estudos mostram que apenas um terço dos pacientes recebem profilaxia adequada. Objetivo: Avaliar a utilização de heparinas para profilaxia cirúrgica em pacientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), comparando a prescrição com recomendações pré-estabelecidas pela Comissão de Protocolos do HCPA e recomendações descritas na literatura. Metodologia: O alvo dessa pesquisa foram pacientes com idade superior a 12 anos, de ambos os gêneros, submetidos a colecistectomias, curetagens uterinas, histerectomias, transplantes renais ou cirurgias de quadril no ano de 2003. Os prontuários foram localizados no Serviço de Arquivo Médico em Saúde (SAMIS). Foram analisadas as indicações e as prescrições de heparinas feitas para esses pacientes, comparando-as com as preconizadas pelas recomendações interna e externa. Para análise estatística, foi desenvolvido banco de dados no programa EpiInfo 6.0. Resultados: A amostra foi composta por 333 pacientes, predominantemente do sexo feminino (80,8%), com idade média de 42,8 (12-92) anos. Duzentos e cinqüenta e um (75,4%) apresentaram indicação para uso de profilaxia, dos quais 114 apresentaram paralelamente contra-indicação para essa prescrição. Apenas 95 (28,5%) pacientes fizeram uso de anticoagulantes. O fármaco mais utilizado foi heparina não-fracionada, na dose de 5.000 UI, com intervalo de 12 horas. A duração média da profilaxia foi 4,5 dias (1 a 20 dias). O seguimento da recomendação interna (esquema + indicação) ocorreu em 33,3% dos casos e da recomendação externa, em 25,2%. Momento de início da profilaxia foi o item do esquema de administração em que houve maior inconformidade. O uso de métodos profiláticos não-farmacológicos foi menor que o preconizado. Discussão e Conclusão: Os resultados encontrados estão de acordo com os de estudos semelhantes publicados na literatura e demonstram que, apesar do conhecimento existente, a prática de prescrição ainda não reflete os avanços da área. Para adequar a profilaxia, é de fundamental importância maior detalhamento e divulgação das recomendações entre os prescritores.