A heparina foi isolada no início do século XX e permanece, até os dias atuais, como um dos mais importantes e eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. Sua atividade anticoagulante deve-se à ativação da antitrombina (AT), uma serpina responsável pela inibição fisiológica de serino-proteinases plasmáticas, tais como fIIa e fXa. Os esforços no sentido da elucidação dos aspectos estruturais e dinâmicos associados ao reconhecimento molecular da heparina pela AT, em nível atômico, vêm encontrando diversas dificuldades, principalmente associadas aos compostos sacarídicos. Em decorrência de sua elevada polaridade e flexibilidade, glicosaminoglicanos como a heparina são difíceis de estudar e modelar. Soma-se a isto o fato de que os resíduos de iduronato presentes na heparina (IdoA) apresentam um incomum equilíbrio conformacional entre estados de cadeira (1C4) e bote-torcido (2SO), sendo esta última estrutura postulada como a possível conformação bioativa. Sendo assim, este trabalho apresenta um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da heparina, tanto em solução quanto complexada à AT, utilizando cálculos ab initio e simulações de dinâmica molecular (DM) Em decorrência da ausência de parâmetros capazes de descrever polissacarídeos nos campos de força atualmente disponíveis, cargas atômicas foram geradas, utilizando-se os esquemas de Mulliken, Löwdin e cargas ajustadas ao Potencial Eletrostático, através de cálculos quantum-mecânicos na base 6-31G** e testadas na simulação de DM da heparina. Diversas condições de simulação, tais como modelos de água, concentrações de sais e as conformações 1C4 e 2SO do IdoA, foram avaliadas de forma a identificar as melhores condições para a descrição conformacional da heparina em solução. O protocolo de DM obtido foi então utilizado no estudo do complexo AT-heparina. Os resultados obtidos estão de acordo com os dados experimentais atualmente disponíveis acerca da conformação da heparina e da contribuição energética de cada resíduo de aminoácido da AT para a formação do complexo com a heparina. A partir dos cálculos ab initio realizados, foi proposto um refinamento na estrutura da heparina determinada por RMN, enquanto que as simulações de DM permitiram reinterpretar aspectos da estrutura tridimensional da AT determinada por cristalografia de raios-X. Adicionalmente, os dados obtidos sugerem que não há requerimento conformacional para a interação do IdoA com a AT Globalmente, os dados indicam que simulações de DM podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação da heparina, assim como para caracterizar e quantificar suas interações com a AT. Assim sendo, propomos o uso de simulações de DM do complexo entre a AT e a heparina, ou entre a AT e compostos derivados da heparina, como uma ferramenta útil no processo de desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos e anticoagulantes.

Resumo não disponível

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-08-25T11:37:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916025 bytes, checksum: 85faad5f8964dc85d9e69cc0251905ad (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-25T11:37:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916025 bytes, checksum: 85faad5f8964dc85d9e69cc0251905ad (MD5) Previous issue date: 2017-07-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Leishmaniose Visceral (LV) está amplamente distribuída em 98 países, com mais de 350 milhões de pessoas em risco. Não existem vacinas licenciadas para uso em humanos e o antimônio pentavalente ainda é o fármaco de primeira escolha para o tratamento da doença, apesar de sua toxicidade. Em um estudo prévio foram realizados ensaios sobre a participação de proteína ligante de heparina de L. infantum chagasi (PLHLc) no processo infeccioso do parasito, considerando os processos de adesão, penetração e internalização em macrófagos, demonstrando que a proteína nativa está envolvida na interação entre parasito e hospedeiro. Também foram demonstrados níveis de imunogenicidade e de proteção contra L.infantum chagasi quando camundongos BALB/c foram imunizados com a PLHLc nativa. A partir disso, foi feito o sequenciamento dessa proteína e a produção da sua forma recombinante (rPLHLc). Nesse trabalho, utilizamos a rPLHLc em experimentos de imunização de camundongos BALB/c para avaliar se, assim como a proteína nativa, a forma recombinante também confere imunogenicidade e proteção após desafio com as formas promastigotas do parasito. Nossos resultados mostraram que no teste de imunogenicidade, os grupos imunizados com a rPLHLc, com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc produziram níveis altos de IgG1 e IgG2a anti-rPLHLc quando comparados aos seus grupos controles, caracterizando, de acordo com a razão IgG1/IgG2a, resposta mista nos grupos imunizados com rPLHLc e SAP + rPLHLce um perfil de resposta Th2 no grupo imunizado com AIF + rPLHLc. Já no teste de desafio, nossos resultados mostraram que houve redução da carga parasitária no baço e no fígado dos grupos imunizados com a rPLHLc, com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc. Os grupos imunizados com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc produziram as citocinas IFN-γ, TNF e IL-2, que direcionam o padrão de resposta imune para Th1, as citocinas IL-17 e IL-6 que direcionam para Th17 e a citocina reguladora IL-10, sendo que a média de produção dessas citocinas foi maior no grupo que tinha como adjuvante a SAP. Na produção de IgG1 e IgG2a anti-rPLHLcos grupos imunizados com a rPLHLc, com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc produziram níveis altos dos dois isotipos comparado aos seus grupos controles e de acordo com a razão IgG1/IgG2a conclui-se que encontramos perfil de resposta Th1 nos grupos imunizados com rPLHLc e com SAP + rPLHLc e perfil de resposta Th2 no grupo imunizado com AIF + rPLHLc. Portanto, concluímos que houve imunogenicidade e proteção contra L. infantum chagasi quando os grupos experimentais são imunizados com a proteína recombinante, mostrando a viabilidade de uso da mesma como vacina e que o grupo imunizado com SAP + rPLHLc foi o que apresentou resultados mais promissores, o que torna essa preparação uma possível vacina contra LV. / Visceral Leishmaniasis (VL) is widely distributed in 98 countries, with more than 350 million people at risk. There are no licensed vaccines for use in humans and the pentavalent antimony is still the drug of choice for treatment of this disease despite its toxicity. In a previous study, tests were performed on the involvement of the heparin binding protein of L.infantum chagasi (HBPLc) in the infectious process of the parasite, considering the processes of adhesion, penetration and internalization in macrophages, demonstrating that the native protein is involved in the interaction between parasite and host. Levels of immunogenicity and protection against L. infantum chagasi were also demonstrated when BALB/c mice were immunized with native HBPLc. From that, the sequencing of this protein and the production of its recombinant form (rHBPLc) was carried out. In this work, we used rHBPLc in experiments for immunization of BALB/c mice to evaluate whether, the recombinant protein form also confer immunogenicity and protection after challenge with the promastigote forms of the parasite. Our results showed that in the immunogenicity test, the groups immunized with rHBPLc, FIA + rHBPLc and ASP + rHBPLc produced high levels of anti-rHBPLc IgG1 and IgG2a when compared to their control groups, characterizing, according to the IgG1/IgG2a ratio, mixed response in the immunized groups with rHBPLc and ASP + rHBPLc and a Th2 response profile in the group immunized with FIA + rHBPLc. In the challenge test, our results showed that there was a reduction of the parasite load in the spleen and liver of the groups immunized with rHBPLc, with FIA + rHBPLc and with ASP + rHBPLc. The groups immunized with FIA + rHBPLc and ASP + rHBPLc produced the cytokines IFN-γ, TNF and IL-2, which direct the immune response pattern for Th1, the cytokines IL-17 and IL-6 directed for the Th17 and for the regulator cytokine IL-10, and the mean production of these cytokines was higher in the adjuvant group containing ASP. In the production of anti-rHBPLc IgG1 and IgG2a the groups immunized with rHBPLc, with FIA + rHBPLc and with ASP + rHBPLc produced high levels of the two isotypes compared to their control groups and according to the IgG1/IgG2a ratio we found that Th1 response profile in the group immunized with rHBPLc and with ASP + rHBPLc and Th2 response profile in the group immunized with FIA + rHBPLc. Therefore, we concluded that there was immunogenicity and protection against L.infantum chagasi when the experimental groups were immunized with the recombinant protein, showing the feasibility of using it as a vaccine and that the group immunized with ASP + rHBPLc presented the most promising results, which makes this preparation a potencial vaccine against VL.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-04T17:28:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2871487 bytes, checksum: 93ead2c58375b69782a5d7277b06e620 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T17:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2871487 bytes, checksum: 93ead2c58375b69782a5d7277b06e620 (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmania infantum chagasi é um protozoário intracelular responsável por causar uma doença fatal em humanos, a leishmaniose visceral. Identificar moléculas que estejam envolvidas no processo de infecção da célula do hospedeiro pelo parasito é importante para a concepção de estratégias para o controle da doença. Dentre estas moléculas estão as Proteínas Ligantes de Heparina (PLH’s), cuja característica principal é a capacidade de se ligar a carboidratos presentes em glicoproteínas ou glicolipídios. Há evidências de que PLH’s presentes na superfície de Leishmania participam dos processos de adesão e penetração dos parasitos nos tecidos e células, tanto dos hospedeiros vertebrados quanto dos invertebrados. Portanto, compreender as interações entre a PLH de L. chagasi (PLHLc) e o açúcar ao qual ela se liga, a heparina, bem como demonstrar propriedades da proteína, é importante para desenvolver mecanismos que interrompam a progressão da infecção. Este trabalho foi dividido em dois manuscritos onde foi proposto para o primeiro identificar e realizar análises estruturais in silico e análises funcionais da PLHLc. A proteína foi sequenciada e identificada como sendo a proteína LPG3 de L. infantum chagasi, que foi então sintetizada, clonada e a composição da sua estrutura foi determinada. Cromatografia de gel filtração, eletroforese em gel não desnaturante e ensaio de cross- linking sugerem que a rPLHLc/LPG3 está organizada como um tetrâmero. Calorimetria de titulação isotérmica confirma a capacidade da proteína em se ligar a heparina com afinidade micromolar. A inibição da atividade ATPásica pela presença da heparina, juntamente com as análises in silico, sugerem que o sítio de ligação a heparina sobrepõe ao sitio de ligação ao ATP. No segundo trabalho a proteína recombinante produzida foi avaliada para o imunodiagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina apresentando sensibilidade de 79-87% e especificidade de 63-83%, indicando o potencial da rPLHLc/LPG3 recombinante no diagnóstico imunológico da LVC. / Leishmania infantum chagasi is an intracellular protozoan parasite responsible for causing a fatal disease in humans, visceral leishmaniasis. Identification of molecules from the parasites involved in the host cell infection process is important for designing strategies to control this disease. Among these molecules is Heparin Binding Protein (HBP), whose main characteristic is the ability to bind to carbohydrates present in glycoproteins or glycolipids. Evidence suggests that HBP's present on Leishmania surface participate in the adhesion of parasites to tissues of both vertebrate and invertebrate hosts as well as in cell invasion. Therefore, understanding the interactions between L. chagasi HBP (HBPLc) and the sugar to which it binds, heparin, as well as demonstrating protein properties, is important to develop mechanisms that interrupt the infection progression. This work was divided into two manuscripts where it was proposed to first identify and perform in silico structural and functional PLHLc analyzes. The protein was sequenced and identified as the L. infantum chagasi LPG3 protein, which was then synthesized, cloned and the composition of its structure determined. Gel filtration chromatography, non-denaturing gel electrophoresis and cross-linking assay suggest that rPLHLc/LPG3 is organized as a tetramer. Isothermal titration calorimetry confirms the ability of the protein to bind heparin with micromolar affinity. Inhibition of ATPase activity by the presence of heparin, together with in silico analyzes, suggests that the heparin binding site overlaps the ATP binding site. In the second study, the recombinant protein was evaluated for the Canine Visceral Leishmaniasis immunodiagnosis presenting a sensitivity of 79-87% and specificity of 63-83%, indicating the potential of recombinant rPLHLc/LPG3 in the immunological LVC diagnosis.

Made available in DSpace on 2012-05-07T15:02:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000010.pdf: 672416 bytes, checksum: 70cf8a1b19f9e6bc3f794ea9716e54d9 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A heparina é um polissacarídeo sulfatado usado como droga anticoagulante com diferentes preparações comerciais disponíveis no mercado brasileiro. Em fevereiro de 2008, seu uso foi relacionado a uma centena de mortes nos Estados Unidos onde foi detectada a contaminação de alguns lotes por sulfato de condroitina. Este fato fez crescer mundialmente a busca por ensaios laboratoriais que garantam sua segurança e eficácia. Neste trabalho foram avaliados comparativamente, cinco lotes procedentes de diferentes produtores de heparinas não-fracionadas, de origem suína ou bovina. Estas amostras foram testadas contra o 5o Padrão Internacional de Heparina de Mucosa Intestinal Suína, provenientes de coletas efetuadas pelas autoridades sanitárias para análise quanto à pureza e potência anticoagulante, pelos dois métodos farmacopéicos: a Inibição da Coagulação do Plasma Ovino (ICPO) e o Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA), no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), laboratório nacional de controle. Os resultados obtidos (potências médias de 104,71por cento e 106,17por cento, respectivamente) apontaram boa concordância entre os métodos, além de comprovar que o TTPA apresenta metodologia mais simples e rápida devido à utilização do coagulômetro para a medição do tempo de formação de coágulos, em detrimento da leitura subjetiva com observação visual dos graus de coagulação adotado pelo ICPO. A implantação e a execução do TTPA, em paralelo à utilização do ICPO, permitirá uma melhoria na avaliação da segurança e eficácia de heparinas não-fracionadas. / Heparin is a sulfated polysaccharide used as anticoagulant having several commercial preparations in use in Brazil. In February 2008, hundreds of deaths, in the United States, were associated with its use due to a contamination with chondroitin sulfate. This fact started a worldwide search for laboratory tests that could ensure safety and effectiveness of the compound. On this study were comparatively evaluated five lots from different producers of non-fractionated heparins from porcine or bovine origin. These samples were tested against the 5th International Standard for heparin from swine intestinal mucosa, collected by Sanitary Authorities aiming to evaluate their purity and anticoagulant potency by two Pharmacopoeic methods: Sheep Plasma Coagulation Inhibition (SPCIA) and Partial Thromboplastin Activated Time (APTT) at the National Institute of Quality Control in Health (INCQS), the National Control Laboratory. The obtained results (mean potencies of 104,71% and 106,17% respectively) indicated excellent correlation between the methods, supporting the use of the APTT method, since it is easier and faster to perform due to the use of coagulometer for the measurement of clot-forming time, instead of the subjective visual observation of the degree of coagulation adopted by the SPCIA. The standardization and routine use of the APTT in parallel to the use of the SPCIA, will allow an increase in the assurance of the safety and the efficacy of non-fractionated heparins, during their quality control.

Made available in DSpace on 2015-02-27T17:39:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71.pdf: 672416 bytes, checksum: 70cf8a1b19f9e6bc3f794ea9716e54d9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A heparina é um polissacarídeo sulfatado usado como droga anticoagulante com diferentes preparações comerciais disponíveis no mercado brasileiro. Em fevereiro de 2008, seu uso foi relacionado a uma centena de mortes nos Estados Unidos onde foi detectada a contaminação de alguns lotes por sulfato de condroitina. Este fato fez crescer mundialmente a busca por ensaios laboratoriais que garantam sua segurança e eficácia. Neste trabalho foram avaliados comparativamente, cinco lotes procedentes de diferentes produtores de heparinas não-fracionadas, de origem suína ou bovina. Estas amostras foram testadas contra o 5o Padrão Internacional de Heparina de Mucosa Intestinal Suína, provenientes de coletas efetuadas pelas autoridades sanitárias para análise quanto à pureza e potência anticoagulante, pelos dois métodos farmacopéicos: a Inibição da Coagulação do Plasma Ovino (ICPO) e o Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA), no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), laboratório nacional de controle. Os resultados obtidos (potências médias de 104,71por cento e 106,17por cento, respectivamente) apontaram boa concordância entre os métodos, além de comprovar que o TTPA apresenta metodologia mais simples e rápida devido à utilização do coagulômetro para a medição do tempo de formação de coágulos, em detrimento da leitura subjetiva com observação visual dos graus de coagulação adotado pelo ICPO. A implantação e a execução do TTPA, em paralelo à utilização do ICPO, permitirá uma melhoria na avaliação da segurança e eficácia de heparinas não-fracionadas. / A heparina é um polissacarídeo sulfatado usado como droga anticoagulante com diferentes preparações comerciais disponíveis no mercado brasileiro. Em fevereiro de 2008, seu uso foi relacionado a uma centena de mortes nos Estados Unidos onde foi detectada a contaminação de alguns lotes por sulfato de condroitina. Este fato fez crescer mundialmente a busca por ensaios laboratoriais que garantam sua segurança e eficácia. Neste trabalho foram avaliados comparativamente, cinco lotes procedentes de diferentes produtores de heparinas não-fracionadas, de origem suína ou bovina. Estas amostras foram testadas contra o 5o Padrão Internacional de Heparina de Mucosa Intestinal Suína, provenientes de coletas efetuadas pelas autoridades sanitárias para análise quanto à pureza e potência anticoagulante, pelos dois métodos farmacopéicos: a Inibição da Coagulação do Plasma Ovino (ICPO) e o Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA), no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), laboratório nacional de controle. Os resultados obtidos (potências médias de 104,71% e 106,17%, respectivamente) apontaram boa concordância entre os métodos, além de comprovar que o TTPA apresenta metodologia mais simples e rápida devido à utilização do coagulômetro para a medição do tempo de formação de coágulos, em detrimento da leitura subjetiva com observação visual dos graus de coagulação adotado pelo ICPO. A implantação e a execução do TTPA, em paralelo à utilização do ICPO, permitirá uma melhoria na avaliação da segurança e eficácia de heparinas não-fracionadas.

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 francisco_junior_ioc_mest_2007.pdf: 5291215 bytes, checksum: 88ec236330fd3ac74ad110315d9ceb1b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A capacidade do Trypanosoma cruzi de reconhecer moléculas na superfície de células fagociticas e não-fagociticas profissionais é essencial para sua sobrevivência no hospedeiro vertebrado. O papel de proteoglicanos sulfatados no processo de reconhecimento celular tem sido relatado em muitos patógenos humanos, incluindo o T. cruzi. Dados do nosso grupo demonstraram a participação de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) de cardiomiócitos na invasão por formas tripomastigotas. Entretanto, a estrutura da molécula de PGHS envolvida na interação receptor-ligante e o papel de outros glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados no processo de invasão ainda não foram elucidados. Para avaliar a participação dos GAGs na invasão do T. cruzi, tripomastigotas, clone Dm28c, foram pré-tratados com 20µg/ml de heparina, queratam sulfato (KS) ou três fragmentos distintos de heparam sulfato (HS), os quais foram obtidos por tratamento enzimático (heparitinase I e II) e ácido nitroso. Nos ensaios de competição, os parasitas controles ou pré-tratados com GAGs solúveis foram incubados por 2hs a 37°C com culturas de cardiomiócitos e o percentual de infecção foi determinado após coloração pelo Giemsa. Nossos resultados revelaram uma inibição significante no índice de infecção de 84,8% e 45% após tratamento dos parasitas com heparina e com o fragmento N-acetilado/N-sulfatado (NA/NS), respectivamente, sugerindo o importante papel do domínio ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]3-[GlcUA-GlcNAc]4[GlcNAc]), da cadeia de HS no reconhecimento T. cruzi-cardiomiócito. Em contraste, o tratamento dos parasitas com KS, fragmento N-acetilado ou N-sulfatado não apresentou efeito no processo de invasão. O papel da sulfatação no processo de reconhecimento e invasão foi avaliado pelo tratamento de culturas de cardiomiócitos por 16hs a 37°C com diferentes concentrações de clorato de sódio e posteriormente, infectados com tripomastigotas (2hs)... (...) O declínio da sulfatação resultou na redução (dose dependente) do índice de infecção, alcançando níveis de inibição de 26%, 48,5% e 73,6% após o tratamento de cardiomiócitos com 25 mM, 50 mM e 75 mM de clorato de sódio, respectivamente, sugerindo a participação da carga negativa como moduladora do reconhecimento específico com o domínio NA/NS da cadeia de HS. Adicionalmente, ensaios bioquímicos foram realizados para caracterizar a proteína de ligação a heparina presente na superfície do T. cruzi. Duas bandas majoritárias de 65,8 kDa e 59 kDa foram identificadas no extrato protéico total das 3 formas evolutivas do T. cruzi por Western blotting, utilizando heparina, condroitim sulfato (CS) e HS conjugados a biotina. O ligante de heparina de T. cruzi foi isolado pela associação do método do Triton X-114 e cromatografia de afinidade a heparina-Sepharose. Após marcação metabólica (35S-Metionina), as proteínas hidrofóbicas foram isoladas em coluna de afinidade e separadas por SDS-PAGE, revelando um perfil protéico, similar ao extrato total, com duas bandas majoritárias (65,8 kDa e 59 kDa) eluídas com 0,5 M e 1,0 M de NaCl em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. A análise isotópica também revelou uma expressão superior deste ligante (1,3-2 vezes) em tripomastigotas quando comparado com epimastigotas. As proteínas de ligação a heparina (65,8 kDa e 59 kDa) foram detectadas na fração de membrana de epimastigotas obtida pelo método de fracionamento subcelular associado a purificação em coluna de afinidade. A detecção das proteínas eluídas da coluna de afinidade a heparina por Western blotting com heparina-, HS- e CS-biotinilados revelou intensa marcação principalmente na proteína de 59 kDa. Além disso, a análise das proteínas por eletroforese não desnaturante revelou a presença de duas bandas nas formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi... (...) Ensaios bioquímicos complementares serão realizados a fim de obter informações detalhadas sobre a proteína de ligação a heparina de T. cruzi. / The ability of Trypanosoma cruzi to recognize molecules at the surface of both the phagocytic and non-phagocytic cells is essential to its survival in the vertebrate host. The role of the sulfated proteoglycans in the cell reco gnition process has been reported in several human pathogens, including T. cruzi . Data from our group have demonstrated the participation of heparan sulfated proteoglycan (HSP G) of cardiomyocytes in the invasion for forms trypomastigotes. However, the structure of th e HSPG molecule involved in the receptor-ligand interaction and the role of other s ulfated glycosaminoglycans (GAGs) in the invasion process have not been elucidated yet. To evaluate the participation of GAGs in T. cruzi invasion, trypomastigotes, clone Dm28c, were pre-treated with 20μg/ml of heparin, ke ratan sulfate (KS) or three distinct fragments of heparan sulfate (HS) obtained by enzym atic (heparitinase I and II) and nitrous acid treatments. For competition assays, the untrea ted or soluble GAGs pre-treated parasites were incubated for 2h at 37°C with the ca rdiomyocyte cultures and the percentage of infection was determined after Giemsa staining. Our results revealed a significant inhibition of the infection index of 84.8% and 45% after treatment of the parasites with heparin and the N-acetylated/ N-sulfated fragment, respectively, suggesting the important role of the ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS] 3 -[GlcUA-GlcNAc] 4 [GlcNAc]) domain of the HS chain in the T. cruzi -cardiomyocyte recognition. In contrast, the treatm ent of the parasites with KS, N- acetylated or N-sulfated fragments did not display any effect in the invasion process. The role of sulfation in the recognition and invasion p rocess was evaluated by treating the cardiomyocytes cultures for 16h at 37°C with differ ent concentrations of sodium chlorate, followed by trypomastigotes infection (2h). The dec line of sulfation resulted in the reduction (dose dependent) of the infection index, achieving inhibition levels of 26%, 48.5% and 73.6% after treatment of cardiomyocyte cultures with 25mM , 50mM and 75mM of sodium chlorate, respectively, suggesting the participation of negat ive charge as modulator of the specific recognition with the NA/NS domain of HS chain. Additionately, biochemical assays were performed to characterize the heparin binding protein present at the surface of T. cruzi . Two major protein bands of 65.8 kDa and 59 kDa were identified in the total protein extract of all evolutive forms of T. cruzi by Western blotting , using biotin conjugated-heparin, -chondroitin sulfa te (CS) and -HS. The T. cruzi heparin ligand was isolated by association of Triton X-114 extraction method and heparin-Sepharose affinity chromatography. After metabolic labeling ( 35 S-Methionine), the hydrophobic proteins were isolated by affinity column and separated by S DS-PAGE, revealing a protein profile, similar to total protein extract, with two major ba nds (65.8 kDa and 59 kDa) eluted with 0.5M and 1M NaCl in trypomastigotes and epimastigotes, r espectively. The isotopic analysis also revealed a higher expression of heparin ligand (1.3 -2X) in trypomastigotes when compared to epimastigotes. The heparin binding proteins were detected at membrane fraction of epimastigotes obtained by cell fractionation method ology associated to the affinity column purification. The detection of proteins eluted from heparin affinity column with biotinilated heparin, CS and HS by Western blotting revealed intense labeling mainly at the 59 kDa protein. In addition, the analysis of the proteins by denaturant electrophoresis revealed the presence of two protein band in both trypomastigote s and epimastigotes forms of T. cruzi . Complementary biochemical assays will be carried ou t to get more detailed information about the T. cruzi heparin binding protein.

A Intervenção Coronariana Percutânea (ICP) provoca o rompimento da integridade vascular, desencadeando o processo da coagulação. O uso de anticoagulantes durante a ICP é fundamental para prevenção de eventos tromboticos associados ao procedimento. Sabe-se que o efeito anticoagulante da heparina não fracionada é errático, mesmo após ajuste da dose por peso do paciente. Portanto, para que haja anticoagulação adequada evitando eventos tromboticos ou hemorrágicos, o uso da heparina requer monitorização de seus efeitos. Esta monitorização pode ser feita através do Tempo de Coagulação Ativada (TCA), que é uma medida do nível de anticoagulação executada a beira do leito. Diversos estudos investigaram qual o TCA ideal para pacientes submetidos a ICP. Este artigo revisa a literatura a respeito, demonstrando que o nível de anticoagulação obtida com heparina é variável, dependendo das condições clínicas do paciente, da terapêutica adjunta e do equipamento utilizado para sua medida, devendo o nível de anticoagulante ser ajustado para obter-se o TCA desejado. Pacientes submetidos a ICP devem receber heparina não fracionada na dose necessária para atingirem TCA de 300s; quando associado ao Inibidor da Glicoproteína IIb/IIIa Abxicimab, o TCA deve ser de 200 a 250s, medidos através do Hemochron.

A heparina foi isolada no início do século XX e permanece, até os dias atuais, como um dos mais importantes e eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. Sua atividade anticoagulante deve-se à ativação da antitrombina (AT), uma serpina responsável pela inibição fisiológica de serino-proteinases plasmáticas, tais como fIIa e fXa. Os esforços no sentido da elucidação dos aspectos estruturais e dinâmicos associados ao reconhecimento molecular da heparina pela AT, em nível atômico, vêm encontrando diversas dificuldades, principalmente associadas aos compostos sacarídicos. Em decorrência de sua elevada polaridade e flexibilidade, glicosaminoglicanos como a heparina são difíceis de estudar e modelar. Soma-se a isto o fato de que os resíduos de iduronato presentes na heparina (IdoA) apresentam um incomum equilíbrio conformacional entre estados de cadeira (1C4) e bote-torcido (2SO), sendo esta última estrutura postulada como a possível conformação bioativa. Sendo assim, este trabalho apresenta um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da heparina, tanto em solução quanto complexada à AT, utilizando cálculos ab initio e simulações de dinâmica molecular (DM) Em decorrência da ausência de parâmetros capazes de descrever polissacarídeos nos campos de força atualmente disponíveis, cargas atômicas foram geradas, utilizando-se os esquemas de Mulliken, Löwdin e cargas ajustadas ao Potencial Eletrostático, através de cálculos quantum-mecânicos na base 6-31G** e testadas na simulação de DM da heparina. Diversas condições de simulação, tais como modelos de água, concentrações de sais e as conformações 1C4 e 2SO do IdoA, foram avaliadas de forma a identificar as melhores condições para a descrição conformacional da heparina em solução. O protocolo de DM obtido foi então utilizado no estudo do complexo AT-heparina. Os resultados obtidos estão de acordo com os dados experimentais atualmente disponíveis acerca da conformação da heparina e da contribuição energética de cada resíduo de aminoácido da AT para a formação do complexo com a heparina. A partir dos cálculos ab initio realizados, foi proposto um refinamento na estrutura da heparina determinada por RMN, enquanto que as simulações de DM permitiram reinterpretar aspectos da estrutura tridimensional da AT determinada por cristalografia de raios-X. Adicionalmente, os dados obtidos sugerem que não há requerimento conformacional para a interação do IdoA com a AT Globalmente, os dados indicam que simulações de DM podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação da heparina, assim como para caracterizar e quantificar suas interações com a AT. Assim sendo, propomos o uso de simulações de DM do complexo entre a AT e a heparina, ou entre a AT e compostos derivados da heparina, como uma ferramenta útil no processo de desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos e anticoagulantes.

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