Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-21T03:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColetta_Ricardo_M.pdf: 1863333 bytes, checksum: 44c85001fc634c2cd4363b8f4868e6bc (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A participação das metaloproteinases durante o desenvolvimento dental ainda não está bem estabelecida. Neste trabalho foram realizados estudos no intuito de caracterizar e detenninar o sítio principal de atuação dos grupos de metaloproteinases associadas ao germe dental' do primeiro molar em desenvolvimento. Verificou-se a presença de enznnas gelatinolíticas e caseinolíticas com comportamento, quanto à ação de inibidores específicos, ação colagenolítica e peso molecular, semelhante ao das enzimas pertencentes. ao grupo das metaloproteinases. A análise nos diversos períodos do desenvolvimento do germe dental mostrou que a maturação dental é acompanhada por um aumento na secreção dessas proteinases. Quando analisado o sítio de atuação dessas metaloproteinases, observou-se maior ação gelatinolítica na. papila dental quando comparado com o órgão do esmalte. A ação caseinolítica foi maior no órgão do esmalte. Estes resultados indicam que enzimas pertencentes ao grupo das metaloproteinases estão associadas ao desenvolvimento e crescimento do órgão dental. A presença de caseínases, principalmente no órgão do esmalte, pode estar relacionada ao processo de mineralização dental / Abstract: The participation of metalloproteinases during the tooth development is not well established. This work was performed in order to determine and characterize the expression of metalloproteinases during the rat first molar development. Gelatinolytic and caseinolytic activities were analyzed by zymography on polyacrylamide gels containing one of the substracts. The maturation of the rat first molar was accompanied by changes in the expression of metalloproteinases. Gelatinolytic activity increased progressively from day O to 15, while caseinolytic activity increased rapidly from day 3 to 10, decreasing on day 15. Mechanical separation of compartments of tooth genn showed that caseinolytic activity was restricted, mainly in the enamel organ whi1e gelatinolytic activity was localized mainly in the papillae. All the enzymes detected were inhibited by 1,10phenanthroline, which is a specific inhibitor for metalloproteinases. These data suggest that matrix metalloproteinases pIay an important role in the developmtmt and maturation of tooth germ / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Ciências

Orientador: Marcelo Cristianini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-27T06:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arasaki_LeticiaHarumi_M.pdf: 18571902 bytes, checksum: 189d2c3a59ee931f6a4e385373d18c97 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Os resíduos da indústria pesqueira representam problemas ambientais e um desperdício significativo de um material com alto teor protéico. A carne escura de atum é descartada juntamente com outros tipos de resíduos, que incluem as vísceras, a cabeça, a cauda e os espinhos. A hidrólise enzimática de proteínas é uma alternativa para o reaproveitamento do resíduo e em alguns casos aumentar seu valor agregado, já que este processo pode melhorar algumas propriedades funcionais de proteínas. O objetivo deste trabalho foi utilizar a Metodologia de Superfície de Resposta para estudar os efeitos do pH, temperatura e relação enzimalsubstrato no grau de hidrólise de carne escura de atum, utilizando as enzimas proteolíticas comerciais Proteinase 1.5L (Prozyn) e Savinase@(Novo Nordisk). A carne escura de atum apresentou a seguinte composição centesimal: 64,63% de umidade, 26,88% de proteínas, 5,79% de lipídios e 1,85% de cinzas. Utilizando-se a enzima Proteinase 1.5L, foi realizado um planejamento experimental 23 para estudar os efeitos das variáveis independentes pH, temperatura e relação enzimalsubstrato. Os intervalos estudados foram: pH de 6,75 a 7,25, temperatura de 40 a 60°e e relação enzima substrato de 0,1 a 0,3 %. Dentro das faixas estudadas, a variável de maior efeito no processo foi o pH, seguido da relação enzimalsubstrato. Observou-se que a temperatura não influenciou o processo significativamente (p<0,05). Foi então realizado um segundo planejamento experimental completo 22 para estudar os efeitos do pH e relação enzimalsubstrato no grau de hidrólise. Os intervalos estudados foram: pH de 6,6 a 7,4 e relação enzima substrato de 0,06 a 0,34 %. A variável de maior efeito no processo foi o pH. O processo foi considerado como ótimo na região onde houve um maior grau de hidrólise, onde o pH variou de 6,6 a 6,7 e a relação enzimalsubstrato de 0,30 a 0,34%. Para o estudo da obtenção do hidrolisado protéico utilizando a enzima Savinase@ foi realizado um planejamento experimental completo 23 para avaliar os efeitos do pH, temperatura e relação enzimalsubstrato. Os intervalos estudados foram: pH de 8,5 a 9,5, temperatura de 36,6 a 53,4°C e relação enzima substrato de 0,03 a 0,37 %. Foi observado que as três variáveis dentro da faixa estudada influenciaram significativamente o processo. A variável de maior efeito no processo foi a relação enzima/substrato, seguida da temperatura e do pH. O processo foi considerado como ótimo na região onde houve um maior grau de hidrólise, onde o pH variou de 9,4 a 9,5, a temperatura de 52 a 53,4°C e a relação enzima/substrato de 0,28 a 0,37 %. Foi obtido um modelo matemático para cada enzima estudada para descrever o processo de hidrólise nas regiões estudadas. Tais modelos foram validados comparando-se dados experimentais com resultados esperados pelo modelo. Foram obtidas superfícies de resposta que descrevem o processo nas regiões estudadas. Dois métodos de secagem foram comparados para a obtenção do hidrolisado em pó: um utilizando um secador de jorro cônico e outro uma estufa com circulação forçada. Comparando-se os hidrolisados produzidos com a Proteinase 1.5L, o produto seco em estufa apresentou uma solubilidade maior do que o seco em secador de jorro cônico. Para os\ hidrolisados produzidoscom a Savinase@,o processo de secagem não influiu significativamente na solubilidade dos produtos. / Abstract: Fish processing wastes represent environmental problems and a meaningful waste of high protein material. Tuna dark meat is wasted as other kind of wastes, which include offal, head, tail and bones. Protein enzymatic hydrolysis is an alternative way to add value to by-products, as this process improves some of their functional properties. The objective of this work was to study the effects of pH, temperature and enzyme/substrate ratio using Response Surface Methodology on the degree of hydrolysis of tuna dark meat using the commercial enzymes Proteinase 1.5L and Savinase@. Tuna dark meat showed the following chemical composition: 64,63% moisture, 26,88% protein, 5,79% fat and 1,85% of ash. Using the enzyme Proteinase 1.5L, an experimental design 23 was used to evaluate the effects of the independent variables pH, temperature and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis of tuna dark meat. The parameters studied were pH from 6,75 to 7,25, temperature from 40 to 60°C and enzyme/substrate ratio from 0,1 to 0,3%. The factor of highest eftect on the reaction was the pH, followed by the enzyme/substrate ratio. It was observed that the temperature didn't influence the process significantly. Therefore, a second experimental design 22elaborated to study the effect of pH and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis. The parameters studied were pH 6,6 to 7,4 and enzyme/substrate ratio 0,06 to 0,34%. The factor of highest effect was the pH. The process was considered optimum in the region where there was a highest degree of hydrolysis, the pH varied from 6,6 to 6,7 and the enzyme/substrate ratio from 0,30 to 0,34%. An experimental design 23 was used to evaluate the effects of the independent variables pH, temperature and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis of tuna dark meat using the enzyme Savinase@,The intervals studied were: pH 8,5 to 9,5, temperature 36,6 to 53,4°C and enzyme/substrate ratio trom 0,03 to 0,37. It was observed that the three factors influenced the process significantly . The factor of highest effect on the reaction was the enzyme/substrate ratio. The process was considered optimum in the region where there was a highest degree of hydolysis, where the pH varied from 9,4 to 9,5, the temperature trom 52 to 53,4°C and enzyme/substrate ratio from 0,28 to 0,37%. A mathematical model was obtained for each enzyme to describe the hydrolysis reaction in the studied areas. Such models were considered predictive in the region studied. Two drying methods to obtain a dried product were compared: fIuidized bed and conventional oven. Comparing the protein hydrolysates produced with Proteinase 1.5L, the sample dried in the oven showed higher solubility than the one dried in the fIuidized bed. For the protein hydrolysate obtained with Savinase@,the drying method did not influence significantly the product solubility. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Fabio Marcio Squina / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:41:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_ThabataMaria_D.pdf: 22982311 bytes, checksum: 1bc2a260df2bfab4948ffb299f13a63f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Devido à necessidade do desenvolvimento de fontes de energias renováveis é de grande interesse a descoberta de novas enzimas envolvidas na desconstrução da parede celular vegetal para a produção de bicombustíveis. A metagenômica é uma poderosa ferramenta para a descoberta de novos genes em comunidades microbianas que não são passíveis de cultivo pelas técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo desta tese foi o desenvolvimento de estratégias metagenômicas para prospecção de novas enzimas atuantes na degradação da biomassa vegetal no metagenoma de solo de canavial bem como a caracterização funcional das mesmas. A biblioteca metagenômica construída com DNA extraído de um consórcio microbiano especializado na degradação de bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor e deslignificado foi empregada nos experimentos de triagem funcional de alto desempenho. Como resultado, foram identificados três clones positivos com atividade celulolítica e dois clones com atividade xilanolítica. A análise dos insertos de cada um dos clones resultou na localização de ORFs cujas sequências de aminoácidos apresentaram identidade com domínios conservados de glicosil hidrolases da família 5 (celulases E-1 e E-2), família 6 (celulase E-3), família 10 (xilanase X-1) e família 16 (glicosil hidrolase X-2). A celulase E-1 apresentou em sua estrutura além do domínio catalítico, E-1 Cat, um domínio de ligação a carboidratos, denominado E-1 CBM, que não apresentou identidade de sequência com domínios conservados conhecidos. A análise funcional do E-1 CBM revelou tratar-se de um CBM específico para cadeias de glucano com grau de polimerização mínimo de cinco unidades de glicose. Ensaios de atividade enzimática em diferentes substratos mostraram que E-1 Cat atuou especificamente na hidrólise das ligações glicosídicas do tipo ß(1,4) entre resíduos de glicose. Os maiores valores de atividade enzimática foram obtidos em pH 7,0 e temperatura de 50ºC. Os parâmetros cinéticos calculados em CMC foram Km igual a 6,05 ± 0,37 mg/mL, Vmax de 42,51 ± 1,2 ?mol/min/mg e eficiência catalítica kcat/Km de 4,06 mL/mg/s. A enzima apresentou termoestabilidade a 40ºC por cinco horas. A atividade enzimática de E-1 Cat em celulose cristalina e bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor resultou na liberação de açúcares solúveis, evidenciando sua potencial aplicação em processos de conversão da biomassa vegetal. Ensaios de atividade em diferentes substratos mostraram que X-1 apresentou maior atividade enzimática em xilana não ramificada, nas condições de pH e temperatura de 6,0 e 45ºC, respectivamente. Os parâmetros cinéticos calculados utilizando como substrato xilana de madeira de faia foram Km de 2,18 ± 0,13 mg/mL, Vmax de 1.435 ± 30,4 ?mol/min/mg e kcat/Km de 496,32 mL/mg/s. Em relação à termoestabilidade, a enzima se manteve estável a 40ºC e 50ºC por seis horas. A hidrólise de substratos complexos com X-1 resultou na liberação de xilooligossacarídeos, xilobiose e xilose, que são compostos que apresentam potencial aplicação nas indústrias alimentícias e de biocombustíveis. Os resultados obtidos neste estudo validaram a abordagem metagenômica desenvolvida para a descoberta de novos genes codificantes para glicosil hidrolases. Além disso, a estratégia descrita nesta tese pode ser estendida para a descoberta de uma miríade de bioprodutos de interesse biotecnológico / Abstract: Due to the necessity of development of renewable sources of energy, it is of great interest the discovery of novel enzymes involved in plant cell wall deconstruction for biofuels production. Metagenomics is a powerful tool for the discovery of novel genes in microbial communities that are not liable to cultivation by traditional techniques. In this context, the aim of this thesis was the development of metagenomic strategies for prospection of novel enzymes involved in plant biomass degradation in sugarcane field soil metagenome and functional characterization of the identified enzymes. The metagenomic library constructed with DNA extracted from a microbial consortium specialized in degradation of steam exploded delignified sugarcane bagasse was used in the experiments of high-performance functional screening. As a result, we identified three positive clones with cellulolytic activity and two clones with xylanolytic activity. The analysis of the inserts from each clone resulted in the location of ORFs whose amino acid sequences showed identity to conserved domains of glycoside hydrolase family 5 (cellulases E-1 and E-2), family 6 (cellulase E-3), family 10 (xylanase X-1) and family 16 (glycoside hydrolase X-2). Cellulase E-1 exhibited in addition to the catalytic domain, E-1 Cat, a carbohydrate binding module, called E-1 CBM, which showed no sequence identity with known conserved domains. Functional analysis of E-1 CBM showed that it is a CBM specific for glucan chains with a degree of polymerization of at least five units of glucose. Assays with a set of different substrates revealed that E-1 Cat hydrolyzed specifically ß(1,4) glycoside bonds between glucose residues. The highest value of enzymatic activity was obtained at pH 7.0 and temperature of 50°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using CMC were 6.05 ± 0.37 mg/mL, 42.51 ± 1.2 ?mol/min/mg and 4.06 mL/mg/s, respectively. The enzyme showed thermal stability at 40°C for five hours. The enzymatic activity of E-1 Cat in crystalline cellulose and steam exploded sugarcane bagasse resulted in the release of soluble sugars, demonstrating its potential application in processes of biomass conversion. The xylanase X-1 showed higher enzyme activity in debranched xylan, in reactions conducted in pH 6.0 and temperature of 45°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using beechwood xylan were 2.18 ± 0.13 mg/mL, 1,435 ± 30.4 ?mol/min/mg and 496.32 mL/mg/s, respectively. In relation to thermal stability, the enzyme was stable at 40°C and 50°C for six hours. The hydrolysis of complex substrates resulted in the release of xylo-oligosaccharides, xylobiose and xylose, which are compounds that have potential application in food and biofuels industries. The results of this study validated the metagenomic approach developed for the discovery of novel genes coding for glycoside hydrolases. Moreover, the strategy described in this work can be extended to the discovery of a myriad of byproducts of biotechnological interest / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T08:16:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_MarcosGarcia_M.pdf: 1468128 bytes, checksum: 509b553e635606c76700ca3af2c9578d (MD5) Previous issue date: 1977 / Resumo: A atividade proteinásica de uma fração solúvel, rotulada como FS, obtida a partir de lisados da forma epimastigota de T. cruzi foi investigada em diferentes pH, utilizando diferentes tampões e o método de Anson modificado. A atividade proteolítica em pH 7,0 foi particularmente investigada utilizando-se diferentes substratos protéicos. A caracterização da proteinase neutra foi tentada utilizando-se os métodos de detecção de atividade proteolítica em gel de agarose, após eletroforese, imunoeletroforese simples e imunoeletroforese cruzada. Os resultados obtidos mostram que: 1. A FS exibe atividade proteolítica em uma ampla faixa de pH (entre 1,0 e 9,0), ocorrendo picos de atividade na zona ácida (pH 2,6 a 3,6), na zona alcalina (pH 8,5) e a zona neutra. 2. A atividade proteinásica da zona neutra apresentou um ótimo de atividade em pH 7,0, quando se utilizou tampão fosfato e homoglobina bovina ou humana como substratos. Um mesmo Km foi encontrado para as duas hemoglobinas que quando testadas frente a diferentes concentrações de FS, obteve-se uma relação praticamente linear entre dose e efeito quando os valores de 'delta¿DO se situam entre 0 e 0,500. 3. A proteinase neutra é capaz de agir sobre SNC, SAB, SAH e GGH, não alterando contudo o motivo antigênico desses substratos... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Juan Alberto Coch Frugoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-15T08:46:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribas_IsabelMariadoAmaral_M.pdf: 2674577 bytes, checksum: 7f74ce897b742083f99274d66e0c265e (MD5) Previous issue date: 1978 / Resumo: Realizaram-se alguns estudos experimentais de atividade enzimática proteolítica do extra do aparelho digestivo da corvina (Micropogon furnieri), segundo o seguinte plano de trabalho: 1) provas da exietência de atividades enzimáticas proteolítica ; 2) Influência do pH a temperatura constante ; Influência da temperatura a pH constante. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Some experimental studies of the proteolitic enzimatic activity of extracts from the digestive system of the croaker (Micropogon furnieri) were made according to the follwing plan: 1) Evidence of the proteolitic enzymatic activity ; 2) Influence of pH at a constant temperature ; 3) Influence of temperature at a constant pH. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Marcio Vinicius Bertacine Dias / Banca: Gustavo Fernando Mercaldi / Banca: Cristiane Rodrigues Guzzo Carvalho / Banca: Robson Francisco de Souza / Banca: Felipe Santiago Chambergo Alcade / Resumo: As epóxido hidrolases (EHs) são enzimas que catalisam a conversão de epóxidos em dióis vicinais. Esses compostos são menos reativos, menos mutagênicos, menos tóxicos e são excretados mais rapidamente das células pois apresentam maior solubilidade. Nas reações de catálise, as EHs utilizam a água como o único co-substrato, o que é uma característica particular desta classe enzimática. Em microrganismos, elas atuam na adaptação ao meio ambiente, metabolizando fontes naturais de carbono e contaminantes. Em patógenos, como M. tuberculosis, atuam na virulência e desintoxicação. Além disso, têm importantes aplicações industriais, farmacêuticas e agroquímicas, como a degradação de xenobióticos, separação enantiomérica de misturas de epóxidos, hidrólise regio e enantiosseletiva de de epóxidos quirais e biossíntese de antibióticos poliéteres ionóforos. Os objetivos do presente trabalho são a cristalização e resolução estrutural das epóxido hidrolases B1EPH2 de Streptomyces wadayamensis e TrEH de Trichoderma reesei, que apresentam interesse biotecnológico devido a propriedades enantioseletivas e do mutante Lsd19 E197D (S. lasaliensis) e TsnB (S. longisporoflavius), envolvidas na biossíntese dos antibióticos poliéteres ionóforos lasalocida e tetronasina, respectivamente. Estas enzimas foram co-cristalizadas com diferentes epóxidos, inibidores, substratos e análogos de substrato e as estruturas foram resolvidas por substituição molecular. A B1EPH2 e TrEH apresentaram... / Abstract: Epoxide hydrolases (EHs) are enzymes that catalyze the conversion of epoxides to vicinal diols. These compounds are less reactive, less mutagenic, less toxic and are excreted more rapidly from the cells because they have greater solubility. In the catalysis reactions, the EHs use water as the only co-substrate, which is a particular characteristic of this enzymatic class. In microorganisms, they act in the adaptation to the environment, metabolizing natural sources of carbon and contaminants. In pathogens, such as M. tuberculosis, they act on virulence and detoxification. In addition, they have important industrial, pharmaceutical and agrochemical applications, such as degradation of xenobiotics, enantiomeric separation of epoxide mixtures, regio and enantioselective hydrolysis of chiral epoxides and biosynthesis of ionophores polyethers antibiotics. The objectives of the present work are the crystallization and structural resolution of the epoxide hydrolases B1EPH2 from Streptomyces wadayamensis and TrEH from Trichoderma reesei, which show biotechnological interest due to enantioselective properties and the mutant Lsd19 E197D (S. lasaliensis) and TsnB (S. longisporoflavius), involved in the biosynthesis of the ionophores antibiotics lasalocid and tetronasin, respectively. These enzymes were co-crystallized with different epoxides, inhibitors, substrates and substrate analogues and the structures were resolved by molecular substitution. B1EPH2 and TrEH showed ... / Doutor

A contaminação por micoplasma em culturas celulares pode causar consideráveis interferências no metabolismo celular, acarretando em um sério problema para os laboratórios de cultura de células. Com o objetivo de avaliar o efeito da contaminação por micoplasma e do tratamento com o antibiótico removedor de micoplasma (MRA), sobre a medida da atividade de hidrolases lisossômicas, foram cultivadas culturas de fibroblastos de indivíduos normais para realização destas medidas. Para tanto, foram selecionadas enzimas de referência do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo do Serviço de Genética Médica do HCPA sendo elas: ß-galactosidase, ß-glicosidase, arilsulfatase A, ß-glicuronidase e hexosaminidase (Total e A). Mediu-se a atividade em fibroblastos contaminados com micoplasma, antes e após adição do MRA. Os resultados foram comparados com a atividade enzimática em fibroblastos controles (sem contaminação) e fibroblastos controles tratados com MRA. Somente a enzima ß-glicosidade não alterou significativamente sua atividade na presença do micoplasma e nem do MRA. A hexosaminidase Total e a ß-galactosidase sofreram interferência significativa na presença do micoplasma e do MRA. A hexosaminidase A e a arilsulfatase A sofreram interferência significativa somente na presença do MRA. A ß-glicuronidase sofreu alteração de sua atividade somente na presença do micoplasma. Estes resultados mostraram que as enzimas testadas comportaramse de maneira diferente frente à pre sença do MRA e/ou do micoplasma, levandonos a avaliar, em um segundo momento, se estes agentes (micoplasma e antibiótico), poderiam alterar a medida da atividade enzimática em cultura de fibroblastos de pacientes com doenças lisossômicas (DL). Para tanto foi realizada a medida da atividade das enzimas: ß-galactosidase, arilsulfatase B (ASB), hexosaminidase A e a-glicosidase. A atividade destas foram medidas em culturas de fibroblastos contaminadas por micoplasma, antes e após adição do MRA. Os resultados destas atividades foram comparados com as atividades enzimáticas em culturas cultivadas na ausência de contaminação. Somente a ASB alterou significativamente sua atividade tanto na presença do micoplasma quanto do MRA. As demais enzimas não sofreram interferência significativa na presença de ambos. Os resultados obtidos nos permitem concluir que em cultura de fibroblastos, tanto a contaminação por micoplasma quanto o uso de um tipo de antibiótico (MRA), podem ser fator de interferência para medida da atividade de algumas hidrolases lisossômicas. Sendo assim, sugerimos que haja a prevenção da contaminação através da detecção do micoplasma bem como o uso de técnicas assépticas e, para aquelas culturas que não podem ser descartadas, faça-se o uso criterioso de antibióticos capazes de remover o micoplasma, como o analisado neste estudo. Dessa maneira, trabalharíamos com um grau de confiabilidade maior nos resultados laboratoriais. / Contamination of cellular cultures by mycoplasma can cause considerable interference with the cellular metabolism and result in serious problems for cell culture laboratories. To evaluate the effects of mycoplasma contamination and treatment with the mycoplasma removal antibiotic agent (MRA) on the measurement of the activity of lysosomal hydrolyses; fibroblast cultures from normal individuals were cultivated specifically to realize these measurements. To do this, we selected reference enzymes from the Laboratory of Inborn Errors of Metabolism maintained by the Service of Genetic Medicine at the HCPA in Porto Alegre, Brazil as follows: ß-galactosidase, ß-glicosidase, arilsulfatase A, ßglicuronidase and hexosaminidase (Total and A). The activity of the fibroblasts contaminated by mycoplasma was measured before and after the addition of the MRA. The results were compared with the enzymatic activity in controls both of non-contaminated fibroblasts and others treated with MRA. The ß-glycosidase enzyme was the only enzyme that demonstrated no significant activity alterations in the presence of either the mycoplasma or the MRA. All the others showed significant changes - the total hexosaminidase and the ß-galactosidase from the presence of the both the mycoplasma and the MRA ; the hexosaminidase A and the arilsulfatase A from the presence of the MRA only; while the presence of the mycoplasma on its own significantly altered the ß-glicuronidase activity. These results prove that the enzymes we tested behave differently when exposed to MRA and/or the mycoplasma. This raises the question as to whether these agents (mycoplasma and antibiotic) could alter the measurement of enzymatic activity in fibroblast cultures from patients with lysosomatic diseases (DL). To resolve this question, the activities of the ß-galactosidase, arilsulfatase B (ASB), hexosaminidase A and a-glicosidase enzymes were measured in cultures of fibroblasts contaminated with mycoplasma, before and after the addition of MRA. The results obtained were compared with the enzymatic activities of uncontaminated cultures. Significant alteration of activity in the presence of MRA and the mycoplasma was observed only in the ABS. The other enzymes demonstrated no significant alteration in the presence of either. The results obtained permit us to conclude that, in a fibroblast culture, both contamination by mycoplasma and the effects of the use of a type of antibiotic (MRA) can interfere in the results of the measurement of the activity of some lysosomatic hydrolyses. Therefore, we suggest that measures be taken to prevent contamination by the detection of the mycoplasma and the employment of aseptic techniques, and, in those cases where the cultures cannot be disposed of, antibiotics capable of removing the mycoplasma should be utilized as analyzed in this study. In this way, greater confidence in the respective laboratory results can be assured.