As doenças lisossômicas de depósito (DLD) são erros inatos do metabolismo causadas pela deficiência de uma proteína, normalmente uma enzima, que resulta no depósito de lipídios nos lisossomos. Neste trabalho, nos propusemos a avaliar uma metodologia para a investigação bioquímica das DLDs. Amostras em papel filtro apresentam um menor volume de sangue coletado e uma maior facilidade quanto ao transporte e acondicionamento. Tivemos por objetivos estabelecer fatores pré-analíticos em amostras de sangue em papel filtro (SPF) tais como: efeito de anticoagulantes, temperatura de armazenamento e estabilidade ao longo do tempo para as enzimas b-galactosidase (b-gal), hexosaminidase total (Hex t), alfa-galactosidase (GLA), arilsulfatase B (ASB) e alfa-glicosidase (GAA). Também foi realizada a miniaturização e a correlação das metodologias em estudo. Descrevemos ainda nossa experiência no rastreamento das DLD em SPF em uma população de alto risco. Amostras de sangue de indivíduos normais (controles) foram coletadas em tubos com anticoagulantes EDTA, heparina, ou diretamente impregnados em papel filtro e armazenadas em diferentes temperaturas (-20, 4, 25 e 37ºC) e tempos (3, 10, 17 e 180 dias). Através da determinação da atividade enzimática em SPF por técnicas fluorométricas chegamos aos seguintes resultados: não houve diferença significativa entre os diferentes métodos de coleta do estudo para nenhuma das enzimas pesquisadas. Com relação ao efeito da temperatura e do tempo foi possível determinar que aos três dias de armazenamento, em todas as temperaturas estudadas e para todas as enzimas, as atividades permaneceram estáveis. A partir deste tempo cada enzima demonstrou um efeito diferente ao longo do tempo para as diversas temperaturas estudadas. Existem aquelas que não sofrem variação em sua atividade até 180 dias de armazenamento nas temperaturas estudadas (Hex t e GLA), aquelas que só vão diminuir sua atividade aos 180 dias em todas as temperaturas (ASB) ou somente a 37°C (b-gal) ou ainda aquela que diminui constantemente sua atividade a partir de 10 dias de armazenamento em todas as temperaturas (GAA). Se o objetivo for medir a atividade de todas as enzimas no mesmo papel filtro, então o melhor será armazenar o papel filtro por no máximo 10 dias em qualquer uma das temperaturas estudadas. Este tempo pode ser estendido até 180 dias em qualquer das temperaturas se formos analisar somente as atividades enzimáticas da Hex t, GLA e b-gal. O estudo de correlação das amostras de papel filtro de 1,2mm e 3mm de diâmetro para as enzimas alfagalactosidase, arilsulfatase B e alfa-glicosidase resultou nos coeficientes 0,994; 0,900 e 0,957; respectivamente. Isto demonstra que podemos diminuir o picote de papel sem perda da qualidade do ensaio. Por fim realizamos um rastreamento para as doenças de Pompe, Fabry, Mucopolissacaridose I e VI em 205 amostras de pacientes de alto risco, onde foi observado uma freqüência de 2,9% para estas DLDs após a utilização da metodologia pesquisada. Nossos resultados mostram a viabilidade na medida da atividade enzimática em SPF, o que facilita a coleta, envio e armazenamento das amostras para a triagem destas doenças lisossômicas. / Lysosomal storage diseases (LSD) are inborn errors of metabolism caused by deficiency of a protein, usually an enzyme, which results in storage of lipids in lysosomes. In this work, we have proposed a methodology for the biochemical investigation of LSD. Dried blood spot samples on filter paper (DBS) have a lower volume of blood collected and ease about the transport and storage. The aims of the study for pre-analytical factors on DBS were: to investigate the effect of anticoagulants, storage temperature and stability over time for the enzymes b-galactosidase (b-gal), total hexosaminidase (Hex t), alphagalactosidase (GLA), arylsulfatase B (ASB) and alpha-glucosidase (GAA). We also made the miniaturization and the correlation of the methodologies under study. Also describe our experience in LSD screening on DBS in a high-risk population. Blood samples from normal individuals (controls) were collected in tubes with anticoagulant EDTA, heparin, either directly impregnated on filter paper and stored at different temperatures (-20, 4, 25 and 37ºC) and times (3, 10, 17 and 180 days). The enzymatic activities in DBS were determined by fluorometric techniques and we achieved the following results: no significant difference between the different collection methods was observed for any of the enzymes. Regarding the effect of temperature and time it was determined that the three days of storage at all temperatures studied and for all the enzymes, the activity remained stable. From this time each enzyme showed a different effect over time for various temperatures. There are enzymes that do not suffer variations in their activity until 180 days of storage at temperatures studied (t- Hex and GLA), there are those that will slow down their activity after 180 days at all temperatures only (ASB) or only at 37°C (b-gal ) or only that is constantly decreasing its activity after 10 days of storage at all temperatures (GAA). If the goal is to measure the activity of all enzymes in the same DBS, then it is best to store the DBS for a maximum of 10 days in any of the temperatures studied. This time can be extended to 180 days in any of the temperatures if we consider only the enzymatic activities of t-Hex, GLA and b-gal. The correlation study of samples of DBS of 1.2 mm and 3 mm in diameter for the enzyme GLA, ASB and GAA resulted in the coefficients 0.994, 0.900 and 0.957, respectively. This shows that we can decrease the paper punch without losing the quality of the test. Finally we performed a screening for Pompe disease, Fabry disease, Mucopolysaccharidosis I and VI in 205 samples of DBS of high-risk patients. This screening revealed a frequency of 2.9% of these LSD after using the methodology researched. Our results demonstrated the feasibility for measurement of enzymatic activity in DBS, which facilitates the collection, sending and storage of samples for the screening of these lysosomal disorders.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-29T14:32:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 427613 bytes, checksum: bd224faa89c39c548eb2dc9bf539fe9e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T14:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 427613 bytes, checksum: bd224faa89c39c548eb2dc9bf539fe9e (MD5) Previous issue date: 2005-12-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A baixa disponibilidade de P é um dos principais limitantes da produtividade nos solos tropicais. No Brasil, uma grande proporção das pastagens está degradada, embora as gramíneas forrageiras tropicais sejam adaptadas às condições de baixa fertilidade. As formas orgânicas de P constituem um grande reservatório deste nutriente nos solos; assim, espera-se que o Po contribua para manter a disponibilidade de P no solo, necessária à manutenção da produtividade das gramíneas forrageiras. Sob condições de deficiência em P, a remobilização deste nutriente na planta é outro fator que pode contribuir para a produtividade das forrageiras e, conseqüentemente, para a sustentabilidade dos pastos. Assim, alterações nos teores das formas orgânicas de P no solo e na sua remobilização na planta poderão sinalizar o início do processo de degradação dos pastos. Um dos objetivos deste trabalho foi relacionar os teores de P de diferentes frações inorgânicas (Pi) e orgânicas (Po) com a produtividade dos pastos. Outro objetivo foi avaliar a atividade da fosfatase ácida (APase) e da ribonuclease (RNase) em forrageiras crescidas sob diferentes disponibilidades de P e mantidas sob diferentes intensidades de corte. Para atender ao primeiro objetivo foram coletadas amostras de solo de seis pastos de Brachiaria brizantha cv. Marandú com diferentes idades e produtividades, cultivados em um Latossolo Vermelho-Amarelo arenoso, em Brasilândia de Minas, região noroeste de Minas Gerais. Determinaram-se os teores de Pi e Po das frações mais lábeis, extraídas por resina e NaHCO 3 , Pi e Po extraídos com NaOH e Pi extraído com H 2 SO 4 , sendo estas ultimas frações, consideradas pouco lábeis. Também foram coletadas amostras de folha, coleto e raiz da forrageira para determinar a atividade da APase e RNase. Para avaliar relação entre a atividade das enzimas e a remobilização de P, plantas de B. decumbens e de Panicum maximum cv. Tanzânia foram cultivadas em casa de vegetação, em amostras de um Latossolo Vermelho- Amarelo argiloso, que receberam as doses de 100, 200 e 500 mg dm -3 de P, e mantidas sem corte e sob duas alturas de corte específicas para cada forrageira. As atividades da APase e RNase foram determinadas em amostras de folha, base do caule (coleto) e raiz coletadas até 45 dias após o início dos cortes. A maior produtividade dos pastos foi associada a maiores teores de Pi e Po extraídos pela resina de troca aniônica e pelo NaHCO 3, 0,5 mol L -1 , que se caracterizam por serem mais lábeis. Assim, os teores destas frações podem ser indicadores sensíveis para diagnosticar o processo de degradação dos pastos. Os teores foliares de P relacionaram positivamente com os teores de Pi e Po das frações extraídas pela resina e pelo NaHCO 3 , e foram significativamente maiores na forrageira dos pastos mais produtivos. A atividade da APase e da RNase não se relacionou com os teores foliares de P e com os teores desse elemento no solo, nas frações mais lábeis (P-resina e P- NaHCO 3 ), mas houve maior atividade dessas enzimas nos pastos mais produtivos. Não houve diferença significativa entre a produção de biomassa da Brachiaria e do Panicum, mas a adição de P propiciou maior produção e maior teor deste nutriente na parte aérea destas forrageiras. As plantas com menor altura de corte apresentaram menor produção e maiores teores de P na parte aérea. Ocorreu efeito significativo das doses de P sobre a atividade da APase e da RNase nas duas forrageiras. As plantas cultivadas com a menor dose de P apresentaram as maiores atividades dessas enzimas e maior eficiência de utilização de P (EUP). Independentemente da altura de corte, a Brachiaria apresentou maior teor de P e maior eficiência de aquisição deste nutriente, fato suportado pela maior atividade da APase nas raízes dessa forrageira. A atividade de ambas as fosfatases decresceu com a idade das plantas. No tratamento com a menor altura de corte, independentemente da dose de P, tanto a Brachiaria quanto o Panicum apresentaram menor EUP. Isso ocorreu associado à maior atividade das enzimas APase e RNase, indicando que outros mecanismos relacionados à adaptação das plantas a baixas disponibilidades de P podem estar envolvidos. / The low P availability is one of the main constraints to crop productivity in tropical soils. In Brazil, a great proportion of pastures is degraded, even though the tropical grasses are adapted to the low fertility conditions. The organic P forms constitute a large reservoir of this nutrient on soils; thus, it is expected that Po contributes to maintain the availability of P in the soil, which is necessary to the maintenance of the forrage grasses productivity. Under deficient P conditions, the remobilization of this nutrient in the plant is another factor that can contribute for the forrages productivity and, consequently, for the pastures sustainability. Thus, alterations in concentration of Poforms in the soil and their remobilization in the plant may indicate the beginning of pastures degradation process. One of the objectives of this work was to relate the P concentration of different inorganic (Pi) and organic (Po) fractions with the pasture productivity. Another objective was to evaluate acid phosphatase (APase) and ribonuclease (RNase) activities in forrages grown under different P availabilities and kept under different cut intensities. In order to accomplish the first objective soil samples from six pastures of Brachiaria brizantha cv. Marandú with different ages and productivities cultivated in a loamy-sand Red Latosol, were collected in Brasilândia de Minas, northwestern Minas Gerais state. In these soil samples it was quantified the concentrations of Pi and Po of the more labile fractions, extracted with resin and NaHCO 3 , and the less labile Pi and Po fractions were extracted with NaOH, and Pi extracted with H 2 SO 4 . Also, leaf, crown and roots samples were collected to determine the APase and RNase activity. To evaluate the relation between the enzymes activity and P remobilization, B. decumbens and Panicum maximum cv. Tanzânia plants were cultivated in a greenhouse, in pots filled with a clayey Yellow Red Latosol. The soil was fertilized with 100, 200 and 500 mg dm -3 of P, and plants were kept without cut ting, or under two specific cut heights for each. The APase and RNase activities were ixdetermined in samples of leaf, base crown and root collected up to 45 days after beginning the cutting treatments. The higthest pastures productivity was associated to the biggest Pi and Po concentrations extracted with the anion exchange-resin and NaHCO 3 , 0,5 mol L -1 , which are more labile. Thus, the concentration of these fractions can be more sensitive to early diagnosis the pasture degradation process. The leaf P concentration related positively with Pi and Po concentrations of the fractions extracted with resin and the NaHCO 3 , and were significantly higher in plants from the most productive pasture. The APase and the RNase activity did not relate with leaf P concentration and the concentration of this element in soil labile fractions (resin-P and NaHCO 3 -P), but greater activity of these enzymes was observed in the most productive pasture. There was no significant difference between the biomass production of the Brachiaria and the Panicum, but the P addition led to greater production and greater concentration of this nutrient in shoots of these. The plants wiht shorter cut height presented smaller production and greater P concentration in shoots. A significant effect of P rates occurred on the APase and the RNase activity in the two forrages. The plants cultivated with the smaller P rate presented the highest activity of these enzymes and greater P use efficiency (PUE). Independently of the cut height, the Brachiaria presented greater P concentration and greater acquisition efficiency of this nutrient, apparently due to the high root APase activity in this forrage. The activity of both phosphatases decreased with the age of the plants. In the treatment with smaller cut height, independently of the P rate, not only the Brachiaria, but also the Panicum presented smaller PUE. This occurred associated to the highest APase and RNase activities, indicating that other mechanisms may be contribute to the adaptation of these species to low P availability. .

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Introdução: Durante a progressão da neoplasia maligna, as células tumorais desenvolvem a habilidade de invadir 0 tecido normal adjacente e de formar novos focos à distância. Recentemente, pesquisas tem destacado as alterações que ocorrem no ambiente entre a célula e a matriz extracelular durante 0 processo de expansão neoplásica. A enzima heparanase-1 possui a capacidade de degradar 0 heparam sulfato, um importante polissacarídeo que participa da estrutura da matriz extracelular e da membrana basal. Diversos artigos associam 0 aumento de sua expressão ao potencial invasor, angiogênico e metastático de diversos tumores malignos. A heparanase-2, provavelmente, esta relacionada com a perda da adesividade celular. Objetivo: Associar novos conhecimentos a respeito desta isoforma poderá ser útil para esclarecer as inúmeras mudanças que ocorrem nas neoplasias. Métodos: Analisamos 75 espécimes de ovários de pacientes atendidas no Departamento de Ginecologia da Unifesp-EPM. Selecionamos 23 (30,66%) pacientes com neoplasia ovariana epitelial maligna; destas, cinco tinham neoplasia restrita aos ovários - estádios IA e 1B (FIGO) e 17 tinham neoplasia nos estádios IC ou superior. Outras 35 mulheres (46,66%) apresentavam neoplasia ovariana epitelial benigna e as 17 (22,66%) restantes, tinham 0 diagnóstico histológico de ovário não neoplásico. Utilizamos duas técnicas metodológicas para avaliar a imunoexpressão da heparanase¬2. A primeira, obedecendo ao critério qualitativo de positivo ou negativo em relação a expressão da enzima e, a segunda, realizando, nas mesmas laminas, quantificação computadorizada desta expressão. Resultados: Na análise quantitativa, encontramos índice de positividade (IP) de expressão de heparanase-2 de 72,24% e 87,34% nas amostras de neoplasias benigna e maligna, respectivamente. Nelas, a intensidade de expressão e 0 índice de expressão foram de, respectivamente, 147,24 e 121,29 para as neoplasias benignas e de 134,15 e 118,01 para as neoplasias malignas. Qualitativamente, a expressão da heparanase-2 foi de intensidade forte ou moderada em 44,2% dos tumores benignos e 78,2% dos malignos. Todas as amostras não neoplásicas foram negativas para a expressão da enzima, com exceção de uma amostra em que a análise qualitativa foi fracamente positiva. Conclusões: Pudemos observar a importância desta enzima na expansão tumoral, devido a evidente diferença entre os grupos de neoplasias comparados com 0 grupo de amostras de tecido ovariano não neoplásico. Entretanto, não verificamos variação significativa entre as neoplasias quanta à presença e intensidade de reação imunohistoquímica entre a neoplasia benigna e maligna, nas duas técnicas de análise.. / Introduction: During the progression of malignant neoplasia, the tumor cells develop the ability to invade the adjacent normal tissue and form new foci at a distance. Recently, studies have highlighted the changes that take place in the environment between the cell and the extracellular matrix during the process of neoplastic expansion. The enzyme heparanase-1 has the capacity to degrade heparan sulfate, which is an important polysaccharide that participates in the structure of the extracellular matrix and the basal membrane. Several papers have made an association between increased expression of this enzyme and the invasive, angiogenic and metastatic potential of various malignant tumors. Heparanase-2 is probably related to loss of cell adhesion. Objective: Making associations with new knowledge on this isoform may be useful for explaining the large number of changes that occur in neoplasia. Methods: We analyzed 75 ovary specimens from patients attended at the Department of Gynecology of Unifesp-EPM. We selected 23 patients (30.66%) with malignant epithelial ovarian neoplasia. Of these, five had neoplasia that was restricted to the ovaries, in FIGO stages IA and IB, and 17 had neoplasia in stages IC or higher. Another 35 women (46.66%) presented benign epithelial ovarian neoplasia and the histological diagnosis for the remaining 17 (22.66%) was that their ovaries were not neoplastic. We used two methodological techniques for evaluating the immunoexpression of heparanase-2. The first followed the qualitative criterion of positive or negative in relation to expression of the enzyme, and the second involved computerized quantification of this expression, performed on the same slides. Results: In the quantitative analysis, we found positivity indices for heparanase-2 expression of 72.24% and 87.34% in the samples of benign and malignant neoplasias, respectively. In these, the intensity of expression and the express index were, respectively, 147.24 and 121.29 for the benign neoplasias and 134.15 and 118.01 for the malignant neoplasias. Qualitatively, the expression of heparanase-2 was strong or moderate in intensity in 44.2% of the benign tumors and 78.2% of the malignant tumors. All the nonneoplastic samples were negative for the expression of this enzyme, with the exception of one sample in which the qualitative analysis was weakly positive. Conclusions: We were able to observe the importance of this enzyme in tumor expansion because of the evident difference between the neoplastic groups and the non-neoplastic group of ovarian tissue samples. However, we did not find any significant variation among the neoplasias with regard to the presence and intensity of the immunohistochemical reaction, between benign and malignant neoplasia, for either of the analysis techniques. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5) Publico-00268b.pdf: 2029279 bytes, checksum: 0ce31c253ab625a6b402e5c0b4abffe0 (MD5) / O vírus da febre aftosa (FMDV), um patógeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genômico de fita simples que, após infectar a célula, é imediatamente traduzido numa única poliproteína. Esta poliproteína produzida é processada durante a síntese em várias proteínas maduras através de peptidases codificadas pelo próprio vírus. A primeira clivagem da poliproteína viral é realizada pela Lbpro entre sua própria região C-terminal e a região N-terminal da proteína VP4. Lbpro também cliva especificamente dois homólogos dos fatores eucarióticos de iniciação (eIF) 4G, resultando na supressão da translação proteica do hospedeiro realizadas através dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do FMDV, que inicia a tradução via IRES, e não requer o eIF4G intacto, pode usar livremente a maquinaria de síntese protéica do hospedeiro para tradução viral. Nós usamos uma série de peptídeos fluorogênicos desenhados especificamente para examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e força iônica sobre a atividade catalítica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cisteínos peptidases, como a papaína e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas caracteríticas únicas como alta sensibilidade à sais e um sítio de ligação ao substrato muito específico, extendendo-se até a posição P7. Análises de dados estruturais mostraram que Lbpro liga os resíduos P1-P3 do substrato em uma conformação extendida, enquanto os resíduos P4-P7 são ligados numa curta hélice 310. A especificidade da Lbpro, revelada através dos peptídios substituídos pode ser explicada para todas as posições, exceto para P5. / Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host capdependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7 are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted peptides could be explained for all positions except P5. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 geovane_lopes_ioc_mest_2014.pdf: 4146940 bytes, checksum: 332c9cbd56d1a1690235d637c48eaeef (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar e identificar peptidases ativas presentes nos intestinos de machos e fêmeas de Anopheles aquasalis bem como identificar as proteínas expressas no intestino e gônadas de fêmeas dessa espécie. Para a caracterização proteolítica foram usadas distintas abordagens bioquímicas que permitiram reunir um grupo importante de informações sobre a expressão de enzimas proteolíticas nesta espécie de mosquito. Usando o substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC em solução e a técnica de enzimografia por SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina foi possível observar um perfil proteolítico composto por serina peptidases do tipo tripsina no intestino de machos e fêmeas de An. aquasalis. Estas enzimas apresentam maior atividade proteolítica na faixa de pH alcalino e ampla estabilidade térmica, sendo ativas entre 25 °C \2013 80 °C, com maior atividade entre 37 °C \2013 50 °C. Diferenças qualitativas e quantitativas na expressão das peptidases também foram detectadas. Foi observado que o perfil proteolítico difere entre macho e fêmea, sugerindo com isso que a expressão de algumas dessas enzimas é sexo-específica Para análise proteômica do intestino e gônadas de fêmeas alimentadas com açúcar usou-se uma abordagem \201Cbottom-up\201D acoplada à análise bioinformática de dados para identificação das proteínas expressas. A análise do intestino foi feita através de um procedimento de digestão em solução sem pré-fracionamento das proteínas, ao passo que a análise das gônadas foi feita usando um protocolo de digestão em gel após fracionamento das proteínas por SDS-PAGE. Usando estas estratégias, um total de 137 e 995 proteínas foram identificadas no intestino e gônadas, respectivamente. As proteínas foram identificadas usando os programas ProLuCID e/ou PEAKS, e uma base de dados \201Ccustomizada\201D incluindo todas as sequencias de Culicídeos depositadas na base de dados UniProt (81,000 sequencias, em outubro de 2013). As identificações foram posteriormente analisadas com relação ao enriquecimento de termos de ontologia gênica e foram classificadas de acordo com seu processo biológico e função molecular, usando o módulo GeneOntology da plataforma PatternLab. A caracterização proteômica revelou para o intestino (i) a presença de várias serina peptidases do tipo tripsina, corroborando a expressão e atividade das enzimas observadas na enzimografia; (ii) a expressão de vários genes codificantes para quimiotripsina, embora a sua atividade não tenha sido detectada pela enzimografia; e para as gônadas (iii) proteínas associadas à vitelogênese; e (iv) a expressão massiva de proteínas implicadas na preparação do tecido para reprodução Finalmente, até o presente, esta é a primeira caracterização abrangente da atividade proteolítica de machos e fêmeas de An. aquasalis bem como a primeira caracterização proteômica do intestino e gônadas de fêmeas desta espécie alimentadas com açúcar. Os resultados obtidos neste trabalho além de fornecerem informações sobre a localização tecidual de proteínas no mosquito e abrirem diversas vias de estudo da biologia e fisiologia deste vetor, contribuem também para a anotação funcional do genoma desta espécie, visto tratar-se de uma espécie com genoma ainda não concluído / The aim of this study was to characterize and identify active peptidases from the midgut of males and females of Anopheles aquasalis and to identify protein expressed in the midgut and gonads of females of this species. The different bioche mical approaches used for the proteolytic characterization allowed gather ing a group of important information about the expression of proteolytic enzymes in this mosquito species. Using the fluorogenic substrate Z - Phe - Arg - AMC for in - solution enzymatic assays and by zymographic analyses (SDS - PAGE co - polymerized with gelatin) it was possible to observe a proteolytic profile composed of trypsin - like serine peptidases in the midgut of male and female A n . aquasalis . These pepti dases exhibit high proteolytic activity at a w ide range of alkaline pH and thermal stability, being active between 25° C - 80 ° C, with more activity between 37° C - 50° C. Qualitative and quantitative differences in the expression of peptidases were also detected. It was observed that proteolytic profile differs between males and females, thereby suggesting that the expression of some of these enzymes is sex - specific. For proteomic analysis of the midgut and gonads of females fed on sugar it was used a "bo ttom - up" proteomic approach coupled with bioinformatic s data analysis to identify tissue - specific expressed protein s . The midgut analysis was taken through an in - solution digestion procedure without pre - fractionation of the proteins, while the analysis of gonads was made using an in - gel digestion protocol after fractionation of proteins by SDS - PAGE. Using these strategies, a total of 137 and 995 proteins were identified in the midgut and gonads, respectively. Proteins were identified using the ProLuCID and/ or PEAKS software , and a customized database including all Culicidae protein sequences deposited at the UniProt database (81,000 sequences, in October 2013). Protein identifications were further analyzed for the enrichment of gene ontology terms and were c lassified according to their biological process and molecular function using the GeneOntology module of the PatternLab platform. The proteomic characterization of midgut revealed (i) the presence of various t rypsin - like serine peptidases , confirming the ex pression and activity of these enzymes observed by zymography, (ii) the expression of several chymotrypsin coding genes, although its activity was not detected by zymography . Proteomics of gonads from female fed with sugar revealed (iii) the expression of proteins associated with vitellogenesis and (iv) the massive expression of proteins involved in tissue preparation for reproduction process. F inally, to the present , t his is the first characterization of the proteolytic activity of males and females midgut s of An. aquasalis well as the first proteomic characterization of the midgut and gonads of A n . aquasalis females fed with sugar. The results obtained in this work in addition to providing information about the cellular localization of proteins in the mosq uito , open several avenues of study of the biology and physiology of this vector, and also contribute to the functional annotation of the genome of this species with genome not yet completed

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:16:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ellen_altoe_ioc_mest_2013.pdf: 1397353 bytes, checksum: 107b103e24982f28206bdb6e9749cd60 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfície de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamífero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfície das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomíneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquímicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatídeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolítica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possível participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania / The highly abundant surface metallopeptidase of Leishmania, gp63, contributes to a myriad of well-established functions in the interaction of this parasite with the mammalian host. However, despite this molecule being abundantly expressed on the surface of promastigote forms, found in the insect vector, little is known about the functions performed by this metallopeptidase in the phlebotomine. Our research group, using biochemical approaches, has demonstrated that gp63 molecules from several not pathogenic trypanosomatids to man are implicated in the adhesion to guts of insect hosts. Here, we analyzed the role of gp63 in the interaction of Leishmania braziliensis and Leishmania infantum with their respective insect hosts, Lutzomyia intermedia and Lu. longipalpis and with the cell line derived from Lu. longipalpis (LL5). The dissected insect guts were pretreated or not with purified phosphoglycan (PG) derived from the lipophosphoglycan and placed to bind with the parasites. In parallel, promastigotes of L. braziliensis and L. infantum were pretreated with anti-gp63 antibodies or with metallopeptidase inhibitors. Thereafter, the parasites were placed to interact with dissected insect guts or with the LL5 cells. As expected, PG virtually eliminates parasites ability of bind to the insect guts. All treatments related to gp63 also provoked a pronounced decrease in these binding assays. Moreover, the culture supernatant of L. braziliensis was concentrated by precipitation with ammonium sulfate and analyzed by SDS-PAGE and SDS-PAGE-gelatin. We observed a proteolytic degradation around 63 kDa, which corresponds to the gp63 enzyme already identified and characterized in several Leishmania species. These results together demonstrate a possible role of gp63 in the interaction with the insect vector and stimulate us to continue studying the role of this metallopeptidase in the life cycle of Leishmania.

As doenças lisossômicas de depósito (DLD) são erros inatos do metabolismo causadas pela deficiência de uma proteína, normalmente uma enzima, que resulta no depósito de lipídios nos lisossomos. Neste trabalho, nos propusemos a avaliar uma metodologia para a investigação bioquímica das DLDs. Amostras em papel filtro apresentam um menor volume de sangue coletado e uma maior facilidade quanto ao transporte e acondicionamento. Tivemos por objetivos estabelecer fatores pré-analíticos em amostras de sangue em papel filtro (SPF) tais como: efeito de anticoagulantes, temperatura de armazenamento e estabilidade ao longo do tempo para as enzimas b-galactosidase (b-gal), hexosaminidase total (Hex t), alfa-galactosidase (GLA), arilsulfatase B (ASB) e alfa-glicosidase (GAA). Também foi realizada a miniaturização e a correlação das metodologias em estudo. Descrevemos ainda nossa experiência no rastreamento das DLD em SPF em uma população de alto risco. Amostras de sangue de indivíduos normais (controles) foram coletadas em tubos com anticoagulantes EDTA, heparina, ou diretamente impregnados em papel filtro e armazenadas em diferentes temperaturas (-20, 4, 25 e 37ºC) e tempos (3, 10, 17 e 180 dias). Através da determinação da atividade enzimática em SPF por técnicas fluorométricas chegamos aos seguintes resultados: não houve diferença significativa entre os diferentes métodos de coleta do estudo para nenhuma das enzimas pesquisadas. Com relação ao efeito da temperatura e do tempo foi possível determinar que aos três dias de armazenamento, em todas as temperaturas estudadas e para todas as enzimas, as atividades permaneceram estáveis. A partir deste tempo cada enzima demonstrou um efeito diferente ao longo do tempo para as diversas temperaturas estudadas. Existem aquelas que não sofrem variação em sua atividade até 180 dias de armazenamento nas temperaturas estudadas (Hex t e GLA), aquelas que só vão diminuir sua atividade aos 180 dias em todas as temperaturas (ASB) ou somente a 37°C (b-gal) ou ainda aquela que diminui constantemente sua atividade a partir de 10 dias de armazenamento em todas as temperaturas (GAA). Se o objetivo for medir a atividade de todas as enzimas no mesmo papel filtro, então o melhor será armazenar o papel filtro por no máximo 10 dias em qualquer uma das temperaturas estudadas. Este tempo pode ser estendido até 180 dias em qualquer das temperaturas se formos analisar somente as atividades enzimáticas da Hex t, GLA e b-gal. O estudo de correlação das amostras de papel filtro de 1,2mm e 3mm de diâmetro para as enzimas alfagalactosidase, arilsulfatase B e alfa-glicosidase resultou nos coeficientes 0,994; 0,900 e 0,957; respectivamente. Isto demonstra que podemos diminuir o picote de papel sem perda da qualidade do ensaio. Por fim realizamos um rastreamento para as doenças de Pompe, Fabry, Mucopolissacaridose I e VI em 205 amostras de pacientes de alto risco, onde foi observado uma freqüência de 2,9% para estas DLDs após a utilização da metodologia pesquisada. Nossos resultados mostram a viabilidade na medida da atividade enzimática em SPF, o que facilita a coleta, envio e armazenamento das amostras para a triagem destas doenças lisossômicas. / Lysosomal storage diseases (LSD) are inborn errors of metabolism caused by deficiency of a protein, usually an enzyme, which results in storage of lipids in lysosomes. In this work, we have proposed a methodology for the biochemical investigation of LSD. Dried blood spot samples on filter paper (DBS) have a lower volume of blood collected and ease about the transport and storage. The aims of the study for pre-analytical factors on DBS were: to investigate the effect of anticoagulants, storage temperature and stability over time for the enzymes b-galactosidase (b-gal), total hexosaminidase (Hex t), alphagalactosidase (GLA), arylsulfatase B (ASB) and alpha-glucosidase (GAA). We also made the miniaturization and the correlation of the methodologies under study. Also describe our experience in LSD screening on DBS in a high-risk population. Blood samples from normal individuals (controls) were collected in tubes with anticoagulant EDTA, heparin, either directly impregnated on filter paper and stored at different temperatures (-20, 4, 25 and 37ºC) and times (3, 10, 17 and 180 days). The enzymatic activities in DBS were determined by fluorometric techniques and we achieved the following results: no significant difference between the different collection methods was observed for any of the enzymes. Regarding the effect of temperature and time it was determined that the three days of storage at all temperatures studied and for all the enzymes, the activity remained stable. From this time each enzyme showed a different effect over time for various temperatures. There are enzymes that do not suffer variations in their activity until 180 days of storage at temperatures studied (t- Hex and GLA), there are those that will slow down their activity after 180 days at all temperatures only (ASB) or only at 37°C (b-gal ) or only that is constantly decreasing its activity after 10 days of storage at all temperatures (GAA). If the goal is to measure the activity of all enzymes in the same DBS, then it is best to store the DBS for a maximum of 10 days in any of the temperatures studied. This time can be extended to 180 days in any of the temperatures if we consider only the enzymatic activities of t-Hex, GLA and b-gal. The correlation study of samples of DBS of 1.2 mm and 3 mm in diameter for the enzyme GLA, ASB and GAA resulted in the coefficients 0.994, 0.900 and 0.957, respectively. This shows that we can decrease the paper punch without losing the quality of the test. Finally we performed a screening for Pompe disease, Fabry disease, Mucopolysaccharidosis I and VI in 205 samples of DBS of high-risk patients. This screening revealed a frequency of 2.9% of these LSD after using the methodology researched. Our results demonstrated the feasibility for measurement of enzymatic activity in DBS, which facilitates the collection, sending and storage of samples for the screening of these lysosomal disorders.

A contaminação por micoplasma em culturas celulares pode causar consideráveis interferências no metabolismo celular, acarretando em um sério problema para os laboratórios de cultura de células. Com o objetivo de avaliar o efeito da contaminação por micoplasma e do tratamento com o antibiótico removedor de micoplasma (MRA), sobre a medida da atividade de hidrolases lisossômicas, foram cultivadas culturas de fibroblastos de indivíduos normais para realização destas medidas. Para tanto, foram selecionadas enzimas de referência do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo do Serviço de Genética Médica do HCPA sendo elas: ß-galactosidase, ß-glicosidase, arilsulfatase A, ß-glicuronidase e hexosaminidase (Total e A). Mediu-se a atividade em fibroblastos contaminados com micoplasma, antes e após adição do MRA. Os resultados foram comparados com a atividade enzimática em fibroblastos controles (sem contaminação) e fibroblastos controles tratados com MRA. Somente a enzima ß-glicosidade não alterou significativamente sua atividade na presença do micoplasma e nem do MRA. A hexosaminidase Total e a ß-galactosidase sofreram interferência significativa na presença do micoplasma e do MRA. A hexosaminidase A e a arilsulfatase A sofreram interferência significativa somente na presença do MRA. A ß-glicuronidase sofreu alteração de sua atividade somente na presença do micoplasma. Estes resultados mostraram que as enzimas testadas comportaramse de maneira diferente frente à pre sença do MRA e/ou do micoplasma, levandonos a avaliar, em um segundo momento, se estes agentes (micoplasma e antibiótico), poderiam alterar a medida da atividade enzimática em cultura de fibroblastos de pacientes com doenças lisossômicas (DL). Para tanto foi realizada a medida da atividade das enzimas: ß-galactosidase, arilsulfatase B (ASB), hexosaminidase A e a-glicosidase. A atividade destas foram medidas em culturas de fibroblastos contaminadas por micoplasma, antes e após adição do MRA. Os resultados destas atividades foram comparados com as atividades enzimáticas em culturas cultivadas na ausência de contaminação. Somente a ASB alterou significativamente sua atividade tanto na presença do micoplasma quanto do MRA. As demais enzimas não sofreram interferência significativa na presença de ambos. Os resultados obtidos nos permitem concluir que em cultura de fibroblastos, tanto a contaminação por micoplasma quanto o uso de um tipo de antibiótico (MRA), podem ser fator de interferência para medida da atividade de algumas hidrolases lisossômicas. Sendo assim, sugerimos que haja a prevenção da contaminação através da detecção do micoplasma bem como o uso de técnicas assépticas e, para aquelas culturas que não podem ser descartadas, faça-se o uso criterioso de antibióticos capazes de remover o micoplasma, como o analisado neste estudo. Dessa maneira, trabalharíamos com um grau de confiabilidade maior nos resultados laboratoriais. / Contamination of cellular cultures by mycoplasma can cause considerable interference with the cellular metabolism and result in serious problems for cell culture laboratories. To evaluate the effects of mycoplasma contamination and treatment with the mycoplasma removal antibiotic agent (MRA) on the measurement of the activity of lysosomal hydrolyses; fibroblast cultures from normal individuals were cultivated specifically to realize these measurements. To do this, we selected reference enzymes from the Laboratory of Inborn Errors of Metabolism maintained by the Service of Genetic Medicine at the HCPA in Porto Alegre, Brazil as follows: ß-galactosidase, ß-glicosidase, arilsulfatase A, ßglicuronidase and hexosaminidase (Total and A). The activity of the fibroblasts contaminated by mycoplasma was measured before and after the addition of the MRA. The results were compared with the enzymatic activity in controls both of non-contaminated fibroblasts and others treated with MRA. The ß-glycosidase enzyme was the only enzyme that demonstrated no significant activity alterations in the presence of either the mycoplasma or the MRA. All the others showed significant changes - the total hexosaminidase and the ß-galactosidase from the presence of the both the mycoplasma and the MRA ; the hexosaminidase A and the arilsulfatase A from the presence of the MRA only; while the presence of the mycoplasma on its own significantly altered the ß-glicuronidase activity. These results prove that the enzymes we tested behave differently when exposed to MRA and/or the mycoplasma. This raises the question as to whether these agents (mycoplasma and antibiotic) could alter the measurement of enzymatic activity in fibroblast cultures from patients with lysosomatic diseases (DL). To resolve this question, the activities of the ß-galactosidase, arilsulfatase B (ASB), hexosaminidase A and a-glicosidase enzymes were measured in cultures of fibroblasts contaminated with mycoplasma, before and after the addition of MRA. The results obtained were compared with the enzymatic activities of uncontaminated cultures. Significant alteration of activity in the presence of MRA and the mycoplasma was observed only in the ABS. The other enzymes demonstrated no significant alteration in the presence of either. The results obtained permit us to conclude that, in a fibroblast culture, both contamination by mycoplasma and the effects of the use of a type of antibiotic (MRA) can interfere in the results of the measurement of the activity of some lysosomatic hydrolyses. Therefore, we suggest that measures be taken to prevent contamination by the detection of the mycoplasma and the employment of aseptic techniques, and, in those cases where the cultures cannot be disposed of, antibiotics capable of removing the mycoplasma should be utilized as analyzed in this study. In this way, greater confidence in the respective laboratory results can be assured.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T04:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_SimoneMoraes_M.pdf: 1495773 bytes, checksum: 493a0576675a8aad3c2879147aa7745f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Nas últimas décadas as reações utilizando biocatalisadores tem sido amplamante aplicadas na síntese orgânica, como componentes chave de muitos processos químicos industriais, levando ao aumento na demanda por novas enzimas. A maneira mais rápida e simples de detectar enzimas é através de metodologias de triagem de alto desempenho (HTS) que permitam identificação rápida da atividade enzimática, como por exemplo, os ensaios utilizando compostos fluorogênicos e cromogênicos. Nesse trabalho nós aplicamos HTS baseado em substratos fluorogênicos para detecção de epóxido-hidrolases e esterases em microrganismos brasileiros. Inicialmente foram selecionados cinco microrganismos com alta atividade epóxido-hidrolase, e 18 pela a presença de esterases. Inspirados nesse principio nós adaptamos a metodolgia conhecida como "Quick E" para a avaliação rápida das enantiosseletividades de epóxido-hidrolases em células íntegras através de medidas das velocidades iniciais de substratos fluorogênicos quirais avaliados separadamente com adição de um competidor. Os ensaios de enantiosseletividade mostraram que os experimentos com competidor apresentaram valores de enatiosseletividade muito próximos dos valores de E determinados via biocatálise convencional. Além disso, alguns microrganismos selecionados por HTS foram testados para reações de biotransformação frente a substratos de interesse sintético, o que permitiu, além da confirmação das atividades enzimáticas e seletividades observadas, detectar a capacidade do microrganismo C. albícans CCT 0776 de desracemizar álcoois secundários por estereoinversão, fornecendo o (S)-1,2-octanodiol com 100 % de rendimento teórico e ee > 99 %, e o (S)-4-fenilmetoxi-1,2-butanodiol com ee 45 % / Abstract: Since the past decades the biocatalysts have been applied in organic chemistry, as key components of many industrial chemical processes, thus increasing the demand for novel enzymes. High-Throughput Screening (HTS), using fluorogenic probes are among the best assays to discovery new enzymes, easily adapted to whole cells format. In this work, have been applied fluorogenic probes to screen epoxide hydrolases and esterases in Brazilian Collection Cultures of microorganisms, which allowed to detect epoxide hydrolases in five microorganisms, and esterases in 18 microrganisms. Additionally, were used chiral probes to implement a Quick E assay, for a fast valuation of epoxide hydrolases enantioselectivity by measuring initial rates of pure enantiomers. Optimization of the methodology revealed that almost true E were obtained by competitive experiments of each enantiomer and a substrate of similar reactivity. The quick E assay was validated by determining conversion and ee using GC/MS and NMR (using mandelic acid derivatives) and is now a new method to determine the enantiomeric ratio for epoxide hidrolases. Finally, the outstanding HTS results were better investigated by conventional catalysis detecting a stereoinversion process performed by C. albicans CCT 0776, which furnished (S)-1 ,2-octanodiol in 100 % theoretical yield and ee of 100%, and (S)-4-fenilmetoxi-1,2-butanodiol in ee of 45% / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

As doenças lisossômicas de depósito (DLD) são erros inatos do metabolismo causadas pela deficiência de uma proteína, normalmente uma enzima, que resulta no depósito de lipídios nos lisossomos. Neste trabalho, nos propusemos a avaliar uma metodologia para a investigação bioquímica das DLDs. Amostras em papel filtro apresentam um menor volume de sangue coletado e uma maior facilidade quanto ao transporte e acondicionamento. Tivemos por objetivos estabelecer fatores pré-analíticos em amostras de sangue em papel filtro (SPF) tais como: efeito de anticoagulantes, temperatura de armazenamento e estabilidade ao longo do tempo para as enzimas b-galactosidase (b-gal), hexosaminidase total (Hex t), alfa-galactosidase (GLA), arilsulfatase B (ASB) e alfa-glicosidase (GAA). Também foi realizada a miniaturização e a correlação das metodologias em estudo. Descrevemos ainda nossa experiência no rastreamento das DLD em SPF em uma população de alto risco. Amostras de sangue de indivíduos normais (controles) foram coletadas em tubos com anticoagulantes EDTA, heparina, ou diretamente impregnados em papel filtro e armazenadas em diferentes temperaturas (-20, 4, 25 e 37ºC) e tempos (3, 10, 17 e 180 dias). Através da determinação da atividade enzimática em SPF por técnicas fluorométricas chegamos aos seguintes resultados: não houve diferença significativa entre os diferentes métodos de coleta do estudo para nenhuma das enzimas pesquisadas. Com relação ao efeito da temperatura e do tempo foi possível determinar que aos três dias de armazenamento, em todas as temperaturas estudadas e para todas as enzimas, as atividades permaneceram estáveis. A partir deste tempo cada enzima demonstrou um efeito diferente ao longo do tempo para as diversas temperaturas estudadas. Existem aquelas que não sofrem variação em sua atividade até 180 dias de armazenamento nas temperaturas estudadas (Hex t e GLA), aquelas que só vão diminuir sua atividade aos 180 dias em todas as temperaturas (ASB) ou somente a 37°C (b-gal) ou ainda aquela que diminui constantemente sua atividade a partir de 10 dias de armazenamento em todas as temperaturas (GAA). Se o objetivo for medir a atividade de todas as enzimas no mesmo papel filtro, então o melhor será armazenar o papel filtro por no máximo 10 dias em qualquer uma das temperaturas estudadas. Este tempo pode ser estendido até 180 dias em qualquer das temperaturas se formos analisar somente as atividades enzimáticas da Hex t, GLA e b-gal. O estudo de correlação das amostras de papel filtro de 1,2mm e 3mm de diâmetro para as enzimas alfagalactosidase, arilsulfatase B e alfa-glicosidase resultou nos coeficientes 0,994; 0,900 e 0,957; respectivamente. Isto demonstra que podemos diminuir o picote de papel sem perda da qualidade do ensaio. Por fim realizamos um rastreamento para as doenças de Pompe, Fabry, Mucopolissacaridose I e VI em 205 amostras de pacientes de alto risco, onde foi observado uma freqüência de 2,9% para estas DLDs após a utilização da metodologia pesquisada. Nossos resultados mostram a viabilidade na medida da atividade enzimática em SPF, o que facilita a coleta, envio e armazenamento das amostras para a triagem destas doenças lisossômicas. / Lysosomal storage diseases (LSD) are inborn errors of metabolism caused by deficiency of a protein, usually an enzyme, which results in storage of lipids in lysosomes. In this work, we have proposed a methodology for the biochemical investigation of LSD. Dried blood spot samples on filter paper (DBS) have a lower volume of blood collected and ease about the transport and storage. The aims of the study for pre-analytical factors on DBS were: to investigate the effect of anticoagulants, storage temperature and stability over time for the enzymes b-galactosidase (b-gal), total hexosaminidase (Hex t), alphagalactosidase (GLA), arylsulfatase B (ASB) and alpha-glucosidase (GAA). We also made the miniaturization and the correlation of the methodologies under study. Also describe our experience in LSD screening on DBS in a high-risk population. Blood samples from normal individuals (controls) were collected in tubes with anticoagulant EDTA, heparin, either directly impregnated on filter paper and stored at different temperatures (-20, 4, 25 and 37ºC) and times (3, 10, 17 and 180 days). The enzymatic activities in DBS were determined by fluorometric techniques and we achieved the following results: no significant difference between the different collection methods was observed for any of the enzymes. Regarding the effect of temperature and time it was determined that the three days of storage at all temperatures studied and for all the enzymes, the activity remained stable. From this time each enzyme showed a different effect over time for various temperatures. There are enzymes that do not suffer variations in their activity until 180 days of storage at temperatures studied (t- Hex and GLA), there are those that will slow down their activity after 180 days at all temperatures only (ASB) or only at 37°C (b-gal ) or only that is constantly decreasing its activity after 10 days of storage at all temperatures (GAA). If the goal is to measure the activity of all enzymes in the same DBS, then it is best to store the DBS for a maximum of 10 days in any of the temperatures studied. This time can be extended to 180 days in any of the temperatures if we consider only the enzymatic activities of t-Hex, GLA and b-gal. The correlation study of samples of DBS of 1.2 mm and 3 mm in diameter for the enzyme GLA, ASB and GAA resulted in the coefficients 0.994, 0.900 and 0.957, respectively. This shows that we can decrease the paper punch without losing the quality of the test. Finally we performed a screening for Pompe disease, Fabry disease, Mucopolysaccharidosis I and VI in 205 samples of DBS of high-risk patients. This screening revealed a frequency of 2.9% of these LSD after using the methodology researched. Our results demonstrated the feasibility for measurement of enzymatic activity in DBS, which facilitates the collection, sending and storage of samples for the screening of these lysosomal disorders.