A hidrólise enzimática de penas residuais da indústria avícola constitui uma alternativa ao descarte irregular e uma fonte rica em aminoácidos para a produção de rações animais. A presença de queratinases em linhagens bacterianas probióticas, pode, concomitantemente, permitir um melhor aproveitamento de rações contendo queratina, devido a possibilidade de suplementação da dieta de animais monogástricos com tais microrganismos. Igualmente, proteases queratinolíticas possuem ampla utilização na indústria. Neste contexto, uma protease queratinolítica da linhagem probiótica FTC01PR01 de Bacillus subtilis foi purificada através de cromatografia líquida (Sephadex G-75 e DEAE Sepharose) e caracterizada por ensaio de proteólise em azocaseína com diversos interferentes, revelando uma serinoprotease com, aproximadamente, 31 kDa e atividade ótima a 60 °C em pH neutro e alcalino. Embora a enzima não seja termoestável, constatou-se que sua atividade é alterada na presença de íons manganês, apresentando estimulação em temperatura de 37 °C e aumento da termotolerância à 55°C. O crescimento do microrganismo em substratos queratinosos demonstrou eficiência para degradação de farinha de pena e penas brancas seguido por menor degradação de penas melânicas. Sendo constituído exclusivamente de α-queratina, o cabelo humano não sofreu proteólise. A enzima pode ser aplicada na indústria para a degradação de materiais recalcitrantes bem como a produção de ração animal. A efetividade do microrganismo in vivo para aumentar a digestibilidade da farinha de pena aliada a função probiótica, demanda mais estudos. / Enzymatic hydrolysis of waste feathers constitute an alternative to irregular disposal and a rich source of aminoacids for animal feed production. The presence of keratinases in probiotic bacterial strains may, concomitantly, allow better use of keratin-based feeds, due to the possibility of diet supplementation with beneficial microorganisms. In this context, a keratinolytic protease of Bacillus subtilis FTC01PR01 was purified by liquid chromatography (Sephadex G-75 and DEAE Sepharose) and characterized by azocasein proteolysis assay, revealing a serine protease with, approximately 31 kDa, and optimal activity at 60 ° C on neutral and alkaline pH. Although the enzyme was not thermostable, it’s activity was altered in presence of manganese ions, with stimulation at temperature of 37 °C and increased thermal tolerance at 55 °C. Microorganism growth on keratin substrates demonstrated efficiency for feather meal and white feathers degradation, followed by less degradation of melanized feathers. As a source of pure α-keratin, human hair was not degraded. The enzyme may be applied in industry for recalcitrant materials degradation and animal feed production. The effectiveness of the microorganism to increase the feather meal digestibility; ally to the probiotic function, demand further studies.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-20T14:04:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1414947 bytes, checksum: 6a4be3b6e22a467df00e66e4e680c4ed (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-20T14:04:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1414947 bytes, checksum: 6a4be3b6e22a467df00e66e4e680c4ed (MD5) Previous issue date: 2018-02-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos anatômicos, fisiológicos e bioquímicos durante a germinação de sementes de Melanoxylon. brauna sob estresse térmico são fundamentais diante da possibilidade do aumento da temperatura global, da importância econômica da espécie e do pouco conhecimento referente àquelas áreas específicas.Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivos:caracterizar alterações bioquímicas e fisiológicas durante a germinação sob estresse térmico. Também foram avaliadas as alterações anatômicas, reação de Fenton. Avaliou-se a germinação nas temperaturas constantes de 25, 35 e 45°C e em sementes embebidas por 24, 48 e 72 h em 35 e 45°C e posteriormente transferidas para 25°C. A CE, produção de EROs e atividade enzimática foram avaliadas em sementes embebidas por 0, 24, 48 e 72 h em 25, 35 e 45°C. A resistência micropilar foi avaliada em sementes secas e embebidas por 24 h em água e solução de H 2 O 2 nas concentração de 20 e 40 μ m.Os experimentos foram conduzidos no delineamento inteiramente casualizado (DIC).Para a germinação e CE foram utilizadas 5 repetições com 20 sementes cada. Para a produção de EROs e atividade enzimática foram utilizadas cinco repetições de 50 mg de eixos embrionários ou 100 mg de micrópilas. A força de rompimento região micropilar também foi avaliada em 3 repetições com 10micrópilas cada.A embebição das sementes em 35°C com posterior transferência para 25°C favorece a germinação. Em 45°C ocorre maiores danosao sistema de membranas, maior acúmulo de H2O2 , comprometimento do sistema antioxidante e posterior morte das sementes. Após 16 h de embebição, foram observadas as primeiras alterações anatômicas na região micropilar e endosperma lateral. A presença de H2O2 e redução da força de ruptura da região micropilar indicam provável ocorrência da reação de Fenton. A temperatura influenciou a atividade das enzimas, -galactosidase, poligalacturonase (PG), pectina - -1,4 glicosidase e o estresse térmico não comprometeu esse sistema enzimático, porém comprometeu a germinação em 45°C. / Anatomical, physiological and biochemical studies during the germination of Melanoxylon brauna seeds under thermal stress are fundamental to the possibility of global temperature increase, the economic importance of the species and the lack of knowledge related to those specific areas. In this sense, the present work has as objectives: to quantify germination, electrical conductivity (EC), production of reactive oxygen species (ROS) and enzymatic activity during germination under thermal stress. The anatomical alterations, Fenton reaction (H2O2 levels and Fe and Cu ion contents) and resistance of the micropillary region of the seeds during imbibition were also evaluated. The germination was evaluated at constant temperatures of 25, 35 and 45°C and in seeds soaked for 24, 48 and 72 h at 35 and 45°C and subsequently transferred to 25°C. EC, ERO production and enzymatic activity were evaluated in seeds soaked in 0, 24, 48 and 72 h at 25, 35 and 45°C. The micropylar resistance was evaluated in dry seeds and soaked for 24 h in water and H2O2 solution at the concentration of 20 and 40 m. The experiments were conducted in a completely randomized design (DIC). For germination and CE, 5 replicates with 20 seeds each were used. For the production of EROs and enzymatic activity, five replicates of 50 mg of embryonic axes or 100 mg of micropiles were used. The force breaking micropillary region was also evaluated in 3 replicates with 10 micropiles each. The imbibition of the seeds at 35°C with subsequent transfer to 25°C favors the germination. At 45°C, there is greater damage to the membrane system, higher accumulation of H2O2 , impaired antioxidant system and subsequent seed death. After 16 h of imbibition, the first anatomical changes were observed in the micropillary region and lateral endosperm. The presence of H2O2 , Fe and Cu and reduction of the rupture force of the micropylar region indicate a probable occurrence of the Fenton reaction. The temperature influenced the activity of the enzymes, -galactosidase, polygalacturonase (PG), pectin methyl esterases (PME), pectin lyase (PL), total cellulases, -1,3 glycosidase and -1,4 glycosidase. Thermal stress did not compromise the enzymatic system, but compromised the germination in 45°C.

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T11:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sabadin_IsabeleSerimarco_M.pdf: 18689391 bytes, checksum: fc0347d65995a6512c7579ac02277fea (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Helia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-06T15:33:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fleuri_LucianaFrancisco_D.pdf: 2217112 bytes, checksum: 6e5410649f00f4a57c5ec78f758b6ebb (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O presente trabalho visou o estudo da produção, purificação e aplicação de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases. A linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191 foi utilizada para o estudo da produção de b-1,3 glucanases e quitinases e as linhagens B26 e C. cellulans 191 foram utilizadas para a produção de proteases, em meios de cultivo contendo diferentes indutores. Foram realizados planejamentos fatorias 23, e os fatores estudados foram: pH inicial, temperatura (oC) e agitação dos frascos. No planejamento experimental para a produção de b-1,3 glucanase foi verificado maior produção da enzima (0,64 U/mL) em meio de cultivo A composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 10 g/L de parede celular de levedura em tampão fosfato 0,2 M, pH 8,5, após 24 h de fermentação, a 33oC e 200 rpm. Nos planejamentos experimentais para a produção de protease pelas linhagens B26 e 191 foi verificado maior produção da enzima em meio de cultivo B composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 80 g/L de levedura seca utilizada como indutor em tampão fosfato 0,15 M, pH 6,5, após 30 h de fermentação a 20oC e 200 rpm, sendo obtido 5,01 U/mL e 4,25 U/mL, respectivamente. No planejamento experimental para a produção de quitinase foi verificado maior produção da enzima (7,06 U/mL) em meio de cultivo C composto por 4,0 g/L de extrato de levedura; 2,0 g/L de triptona; 4,0 g/L de MgSO4.7H2O; 1,2 g/L de KH2PO4; 2,8 g/L de K2HPO4 e 15 g/L de quitina neutralizada utilizada como indutor, com pH inicial de 5,5 após 72 h de fermentação a 25oC e 200 rpm. Todos os modelos obtidos foram preditivos e significativos a um nível de confiança de 95%. No estudo de produção das enzimas da linhagem C. cellulans 191 em fermentador de 5 L, a maior produção de b-1,3 glucanase, utilizando meio de cultivo A e 1,5 vvm e 3 vvm, foi respectivamente 0,32 U/mL e 0,72 U/mL, após 24 h de fermentação a 30oC. Na produção de protease em fermentador de 5 L, utilizando meio de cultivo B e 1,5 vvm foi obtido 1,87 U/mL e 2,34 U/mL, respectivamente, após 6 h e 30 h de fermentação a 30oC; enquanto que com 3 vvm, foi obtido 4,89 U/mL e 6,14 U/mL de protease após 6 h e 33 h de fermentação, a 30oC. Em fermentador de 5 L, a maior produção de quitinase em meio de cultivo C foi de 4,19 U/mL com 1,5 vvm após 168 h de fermentação e 4,38 U/mL de quitinase após 144 h de fermentação com 3 vvm, a 25oC. No estudo de produção de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases da linhagem C. cellulans 191 em frascos agitados, em meios de cultivo A, B e C, foram produzidos respectivamente, 1,12 U/mL de b-1,3 glucanase; 4,2 U/mL de protease e 6,9 U/mL de quitinase. A b-1,3 glucanase (45 KDa) foi purificada 11,83 vezes com rendimento de 25% em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50. Na purificação das proteases em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50 foram obtidas três frações de proteases denominadas P1, P2 e P3. A fração P3 apresentou duas bandas de massas moleculares de 14 e 16 KDa em eletroforese SDS-PAGE. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes com rendimento de 46,61% em resina de filtração em gel Sepharose CL4B200. A b-1,3 glucanase purificada apresentou atividade de lise de diversas leveduras e foi capaz de formar protoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae KL-88. O pré-tratamento das leveduras com protease P3 purificada não aumentou a lise das leveduras com a ß-1,3 glucanase. A quitinase purificada foi capaz de lisar células de algumas espécies de fungos em suspensão aquosa, mas não foi capaz de inibir, o crescimento dos fungos em placas de ágar batata dextrose. A preparação bruta de quitinase apresentou halo de inibição do crescimento de alguns fungos estudados. Os produtos formados pela reação da b-1,3 glucanase purificada sobre a laminarina e da protease purificada sobre a levedura seca apresentaram capacidade antioxidante / Abstract: The aim of this work was to study the production, purification and application of b-1,3 glucanases, proteases and chitinases. The strain Cellulosimicrobium cellulans 191 was used to study the production of b-1,3 glucanases and chitinases and strains B26 and C. cellulans 191 for the production of proteases, using culture media containing different inductors. 23 factorial experimental designs were performed and the factors studied were: initial pH, temperature (oC) and flask rotatory speed. In the experimental design for the production of b-1,3 glucanase, greater enzyme production (0.64 U/mL) was obtained in culture medium A containing 2.0 g/L (NH4)2SO4; 0.2 g/L MgSO4.7H2O and 10 g/L cell wall yeast in 0.2 M phosphate buffer, pH 8.5, after 24 h of fermentation at 33oC and 200 rpm. In the experimental design for the production of protease by strains B26 and 191, greater enzyme production was obtained in culture medium B containing 2.0 g/L (NH4)2SO4; 0.2 g/L de MgSO4.7H2O and 80 g/L dry yeast in 0.15 M phosphate buffer, pH 6.5, after 30 h of fermentation at 20oC and 200 rpm, with yields of 5.01 U/mL and 4.25 U/mL, respectively. In the experimental design for the production of chitinase, greater enzyme production (7.06 U/mL) was obtained in culture medium C containing 4.0 g/L yeast extract; 2.0 g/L tryptone; 4.0 g/L MgSO4.7H2O; 1.2 g/L KH2PO4; 2.8 g/L K2HPO4 and 15 g/L of neutralized chitin with an initial pH of 5.5, after 72 h of fermentation at 25oC and 200 rpm. All models obtained were predictive and significant at a confidence level of 95%. In the study on the production of enzymes from C. cellulans strain 191 in a 5 L fermenter, the highest productions of b-1,3 glucanase in medium A with 1.5 vvm and 3.0 vvm were 0.32 U/mL and 0.72 U/mL respectively, after 24 h of fermentation at 30oC. In the production of protease in a 5 L fermenter using culture medium B and 1.5 vvm, 1.87 U/mL and 2.34 U/mL were obtained after 6 h and 30 h respectively of fermentation at 30oC, whilst with 3 vvm, 4.89 U/mL and 6.14 U/mL of protease were obtained after 6 h and 33 h respectively of fermentation at 30oC. In a 5 L fermenter, the highest production of chitinase from C. cellulans strain 191 using 1.5 vvm was 4.19 U/mL after 168 h of fermentation, whilst with 3 vvm, the production was 4.38 U/mL of chitinase after 144 h of fermentation at 25oC. In the study on the production of b-1,3 glucanases, proteases and chitinases from C. cellulans strain 191 in shaken flasks and culture media A, B and C, 1.12 U/mL of b-1,3 glucanase; 4.2 U/mL of protease and 6.9 U/mL of chitinase were produced respectively. In the purification study, the b-1,3 glucanase (45 KDa) was purified 11.83 times with a yield of 25% using a DEAE-Sephadex A50 ion-exchange resin. In the purification of the proteases using the DEAE-Sephadex A50 ion-exchange resin, three protease fractions were obtained named P1, P2 and P3. Fraction P3 presented two proteins with molecular weights of 14 and 16 KDa in SDS-PAGE electrophoresis. The chitinase (61 KDa) was purified about 6.65 times with a yield of 46.61% in a Sepharose CL4B200 gel filtration resin. The purified b-1,3 glucanase presented lysis activity against several yeasts and was able to form protoplasts from the Saccharomyces cerevisiae KL-88 yeast. Pre-treatment of the yeasts with the purified protease P3 did not increase cell lysis by the b-1,3 glucanase. The purified chitinase was able to lyse the cell walls of some fungal species in aqueous suspension, but was not able to inhibit the growth of these fungi on potato dextrose agar plates. The crude chitinase preparation presented growth inhibition halos for some of the fungi studied. The products formed from the reaction between the purified b-1,3 glucanase and laminarin and between the purified protease and the dry yeast presented antioxidant power / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:05:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalari_AlineAndreia_D.pdf: 2066715 bytes, checksum: 503395a4dfdc3832fc20cbf4193ea790 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A parede celular é um componente particular dos tecidos vegetais e conhecer a composição dos polissacarídeos que a constituem e suas interações é essencial para compreender a textura dos alimentos e suas alterações pós-colheita, em especial em frutos climatérios, como é caso do mamão. A parede celular esta dividida por três domínios: o primeiro é formado por celulose e hemiceluloses, o segundo domínio é formado por pectinas e o terceiro um domínio composto por proteínas. As modificações dos polímeros e suas proporções nestes respectivos domínios são resultados de ações enzimáticas, que no caso dos frutos carnosos, leva ao amaciamento da polpa. Portanto, estudar as modificações nesses polímeros através da análise dos OXG obtidos por hidrolise com celulase, é um caminho importante para entender as alterações neste polissacarídeo ao longo do desenvolvimento de frutos. O presente trabalho teve como objetivo compreender as modificações da parede celular durante o desenvolvimento do fruto do mamoeiro. Foram utilizados frutos de Carica papaya L. cv. Sunrise solo, coletados diretamente do produtor (Caliman S/A- Unhares- ES). As amostras de frutos foram colhidas em intervalos de 30 dias, sendo os estádios analisados de 30 a 150 após a antese (dpa). Os resultados demonstram queda acentuada na proporção de parede celular em relação a outros compostos, como açúcares, por exemplo, o que é possivelmente uma indicação do processo de expansão celular e conseqüentemente uma alteração de textura da parede celular durante o desenvolvimento. Observou-se que o principal açúcar solúvel é a sacarose, sendo esta provavelmente a principal fonte energética para o desenvolvimento do fruto de mamão, uma vez que este não sintetiza amido. De maneira geral, a proporção de oligossacarídeos de xiloglucano menos ramificados diminuiu aos 120 dpa, enquanto que os de maior peso molecular e ou grau de ramificação (com fucose) aumentaram proporcionalmente. Estes resultados sugerem que xiloglucanos (ou parte das moléculas destes) pobremente ramificados com fucose, são retirados da parede celular, consequente enriquecimento de oligosasacarídeos fucosilados. Como estes últimos tornam o xiloglucano mais interativo com ele próprio e com a celulose, é possivel que estes sejam os principais efeitos que as transformações na parede promovam no fruto. As alterações na parede foram acompanhadas pelo aumento concomitante nas ativades de beta­galacosidase e beta-glucosidase, duas das principais hidrolases de xiloglucano. Concumitantemente, observou-se uma diminuição acentuada na proporção de celulose na parede. Com base nestas observações, sugere-se que as paredes celulares sofrem transformações importantes nos frutos do mamoeiro até os 120 dpa I sendo que a partir deste estádio a parede se torna mais acessível à hidrólise e denotando a preparação do fruto para o amadurecimento. / Abstract: The plant cell wall is a unique component of plant tissues and its polysaccharide composition essential to understand food texture and its changes during post-harvestingl especially of climateric fruits, as is the case of papaya. The plant cell wall is composed of three domains: the first is formed by cellulose and hemicelluloses, the second of pectins and the third of proteins. The changes in polymers and their proportions in these domains are a result of enzyme action, which in the case of fleshy fruits lead to the softening of the pulp. Hydrolysis of hemicelluloses such as xyloglucan can play important functions in cell expansion, cell growth and cell wall degradation. Therefore, studying the modifications in xyloglucan by looking at is fine structure (Le. oligosaccharide (OXG) pattern obtained after cellulase action) may be an important way to understand polysaccharide change during fruit development. The present work aimed at understanding the modifications in cell wall during the development of the papaya fruit. Fruits of Carica papaya L. Cv.Sunrise solol were collected directly by the producer (Calimanl SAI Unharesl Espirito Santol Brazil). Samples of fruits were harvested at intervals between 30 and 150 days after anthesis (daa). Our results showed that there were drastic changes in the cell wall of the mesocarp in relation to other compoundsl such as soluble sugars. This is probably an indication that cell expansion process is at least part of the cause of the changes in texture during development. We observed that the main soluble sugar found in fruits is sucrose, this being probably the principal source of energy for development of the organ, as no starch is synthesised in this fruit. In general, the proportion of less branched xyloglucan oligosaccharides decreased at 120 daa, whereas the OXG branched with fucose increased constantly during development up to the same stage. These results suggest that xyloglucans (or part of their molecules) that are poorely brached with fucose are retrieved from the cell wall. This seems to lead to enrichment of fucosylation of xyloglucan. As these OXG turn xyloglucan more interactive with itself and with cellulose, it is possible that these would be the principal effects that the cell walls provoke in the fruit. The changes in the wall were followed by a concomitant increase in activities of beta-galactosidase and betaglucosidase, both thought to be related to xyloglucan hydrolysis in vivo. At the same time, we observed a decrease in the proportion of cellulose in the walls during development. On the basis of these results, we suggest that the cell walls of papaya fruits undertake structural changes untill 120daa after which the wall becomes more accessible to hydrolases denoting the preparation of the papaya fruit for ripening. / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T20:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valerio_AmandaAbdalla_D.pdf: 3553304 bytes, checksum: 97ba97062f1c23d4b29447c0b9a7316d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.-) são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas. Neste trabalho realizamos estudos funcionais e estruturais de duas glicosídeo hidrolases: a celulase XF0810 de Xylella fastidiosa e a lisozima digestiva 1 de Musca domestica (MdL1). A celulase XF0810 está anotada no genoma da X. fastidiosa como membro da família 5 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.4). Após a amplificação, clonagem, expressão e purificação da mesma; prosseguimos com os experimentos de filtração em gel analítica, dicroísmo circular, DLS, ensaio enzimático e cristalização desta proteína. Foi feito um estudo de modelagem onde ficou evidenciado que a XF0810 não pertenceria à família 5 pois quatro dos sete resíduos conservados que caracterizam esta família foram substituídos, incluindo os dois resíduos catalíticos de glutamato essenciais para o mecanismo de clivagem de retenção. Isto foi comprovado através da ausência de atividade nos ensaios feitos com a proteína purificada. A MdL1 pertence à família 22 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.17) e foi cristalizada com o ligante Nacetilquitotetraosídeo para a difração de raios X. A resolução da estrutura (2H5Z no PDB) foi realizada por meio do método de substituição molecular tendo como modelo a estrutura nativa. A análise comparativa da MdL1 com outras lisozimas de quatro classes diferentes de animais mostrou grande semelhança e pequenas diferenças apenas na região das voltas. Estas diferenças foram utilizadas para explicar as características especiais de uma lisozima com função digestiva. A volta na região definida pelos resíduos 98-100 apresenta uma deleção na MdL1, tornado-a menos exposta ao solvente, podendo justificar a resistência à proteólise. O resíduo Gln100 participa de uma interação com o ligante. Os resíduos Thr107 e Asn46 são apontados como responsáveis pelo decréscimo dos pKa dos grupos carboxilas dos resíduos catalíticos Glu32 e Asp50, respectivamente. A diminuição dos pKa explica o pH ótimo mais ácido característico de lisozimas digestivas / Abstract: Glycoside hydrolases (EC 3.2.1.-) are enzymes that hydrolyze glycoside bonds. In this work we studied functional and structural features of two glycoside hydrolases: the cellulase XF0810 of Xylella fastidiosa and the digestive lysozyme 1 of Musca domestica (MdL1). The cellulase XF0810 is annotated in the genome of X. fastidiosa as member of family 5 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.4). After the amplification, cloning, expression and purification of XF0810; we continued with the experiments of analytical gel filtration, circular dichroism, DLS, enzymatic assay and crystallization of this protein. A homology model was built which showed that XF0810 did not belong to family 5 because four of seven conserved residues that characterize the family were substituted, including the two catalytic residues of glutamate that are essential for the retention hydrolysis mechanism. This was further confirmed by the absence of activity in the assays (exocellulase with PNPc) performed with the purified protein. The MdL1 belongs to the family 22 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.17) and was crystallized with the ligand N-acetilchitotetraose for X-ray diffraction. The resolution of the structure (2H5Z in PDB) was accomplished by molecular replacement with the native structure as the searching model. The comparative analysis of MdL1 with other lysozymes of four different classes of animals showed a high similarity and few differences appeared only in the loops¿ regions. These differences were used to explain the special characteristics of the lysozyme with a digestive function. The loop in the region defined by residues 98-100 presents one deletion in the MdL1, becoming less exposed to the solvent, this might justify the proteolysis resistance. The residue Gln100 participates directly in an interaction with the ligand. The residues Thr107 and Asn46 are pointed out as responsible for a reduction in the pKa of the carboxyl groups of catalytic residues Glu32 e Asp50, respectively. The reduction in pKa explains the more acidic pH optimum that characterizes the digestive lysozymes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jaime Amaya-Farfan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-09T17:22:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nery-Diez_AnaClaudiaCoelho_M.pdf: 934583 bytes, checksum: 83182e794d4e4f53cd6b257610760e0c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas do soro do leite apresentam propriedades fisiológicas, funcionais e nutricionais diferentes que resultam na modulação ou melhoramento de funções bioquímicas e fisiológicas, aumentando a resistência e protegendo o organismo contra infecções ou retardando certos processos patológicos, assim como melhorando o desempenho físico. Estudos têm demonstrado melhoras em parâmetros bioquímicos e físicos proporcionados por estas proteínas. Assim, considerou-se de interesse investigar algumas das possíveis alterações ou efeitos fisiológicos, provocados pela ingestão de fonte protéica de alto peso molecular (isolado do soro do leite) e um hidrolisado enzimático dessa proteína. Além disso, levou-se em consideração o efeito da atividade física em ratos treinados em esteira, na atividade catalítica de proteases intestinais como: glutaminase, leucina-aminopeptidase, quimotripsina e tripsina e verificou-se também a possível absorção de peptídeos que constituem o hidrolisado, no intestino delgado. Na análise das atividades enzimáticas observou-se que o consumo da proteína hidrolisada promoveu diminuição da atividade da enzima glutaminase intestinal de 25 a 29%, em relação à atividade produzida pelas proteínas intactas (isolado e caseína). O treinamento, porém, teve como efeito aumentar a atividade glutaminase entre 27 e 32% para cada uma das dietas, exceto para o hidrolisado, que permaneceu sem alteração. A exaustão, por outro lado, resultou em diminuição da atividade glutaminase intestinal para quase todas as dietas (média aproximada de 30%). Na avaliação das enzimas presentes no lúmen intestinal, as atividades das três proteases, leucina-aminopeptidase, quimotripsina e tripsina, foram encontradas mais elevadas na fração do jejuno, em comparação ao íleo. Foi observada uma aparente inibição enzimática da tripsina na fração jejunal pela presença de caseína. Para verificar a possibilidade de absorção de peptídeos inteiros, foi realizada uma análise in vitro com os intestinos delgados. O intestino fresco extraído foi infundido com uma suspensão de cada proteína e incubado em solução fisiológica por duas horas, na temperatura de 37°C. Após, tal procedimento, os perfis de aminoácidos e de peptídeos perfusados foram obtidos por métodos cromatográficos e eletroforéticos. Neste estudo, pode-se constatar que houve maior passagem de aminoácidos nos intestinos delgados dos grupos sedentários-exaustos e treinados, que foram infundidos com o hidrolisado e nos grupos sedentários e treinados, que foram infundidos com isolado. Em relação aos diferentes níveis de atividade física, os animais treinados, alimentados com ambas as dietas, isolado e seu proteolisado, tiveram maior passagem de aminoácidos. Conclui-se que o consumo da proteína parcialmente hidrolisada não afetou de igual forma a atividade das três proteases, tripsina, quimotripsina e leucina-aminoeptidase, sendo que o treinamento e o hidrolisado, conjuntamente, redundaram em diminuição da atividade da quimotripsina, enquanto que a atividade da glutaminase foi visivelmente diminuída pela combinação da exaustão e o consumo do hidrolisado. Por sua vez, foi possível evidenciar a passagem de peptídeos do hidrolisado, do interior, para o exterior do jejuno perfusado do rato / Abstract: The whey protein offers various physiological, functional and nutritional properties that result in the modulation or improvement of physiological and biochemical functions, thus protecting the body against infections and delaying the onset of certain pathological processes, as well as improving the physical performance. Researchers have attributed to these proteins benefits such as the improvement of biochemical and physical parameters of the exercising animal. Therefore, it was considered of interest investigate some of the possible alterations resulting from the ingestion of the milk whey proteins (whey protein isolate) as the only source of high-molecular weight protein, as compared to an intermediate-degree enzymatic hydrolyzate of this protein and the casein standard. Moreover, the effect of the physical activity on the catalytic activity of the intestinal proteases glutaminase, leucine-aminopeptidase, chymotrypsin and trypsin, of rats trained in the treadmill was taken as an additional variable. Moreover, the possible absorption of constituent peptides of the hydrolyzate from the small intestine was investigated. In the analysis of the enzymatic activities it was observed that the consumption of the hydrolyzed protein prompted a reduction of the activity of the intestinal enzyme glutaminase by 25 to 29%, in relation to the activity produced by the unbroken proteins (isolate and casein). Physical training, however, had the effect of increasing the activity of glutaminase between 27 and 32% for each one of the diets, except for the hydrolyzate, which remained unaltered. Exhaustion, on the other hand, resulted in the reduction of the intestinal activity glutaminase for most of the diets (mean of ~30%). Assessment of the enzymes present in the intestinal lumen, the activities of three proteases, leucine-aminopeptidase, chymotrypsin and trypsin, were higher in the jejunal fraction, in comparison to the ileum. An apparent enzymatic inhibition of trypsin occurred in the jejunal fraction in the presence of casein. In order to verify the possibility of absorption of whole peptides, fresh intestinal fractions were infused with suspensions of each protein and incubated in physiological solution for two hours, at 37°C. After, such process the amino acid and peptide profiles were determined by chromatographic procedures. It was observed that a greater outflow amino acids occurred in the intestines sedentary-exhaust and trained group that were infused with the hydrolyzate, and in the sedentary and trained group that were infused with whey protein isolate. With regard to the effect of the different levels of physical activity, the animals that underwent training, fed with either of the diets, isolate or its hydrolyzate, had greater amino acid outflow than the sedentary animals. It is concluded that consumption of the hydrolyzate did not affect equally the activity of the three proteases, trypsin, chymotrypsin and leucine-aminopeptidase, noticing that a combination between training and the hydrolyzate caused a decrease of the activity of chymotrypsin, whereas the activity of glutaminase was clearly diminished by a combination between exhaustion and consumption of the hydrolyzate. Evidence has been presented showing that infusion of the hydrolyzate into the small intestine of the rat results in the passage of peptides from the interior to the exterior of the intestinal wall / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Fabio Marcio Squina, Roberto Ruller / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:46:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hoffmam_ZairaBruna_M.pdf: 4922807 bytes, checksum: df6edae9e54a10424f07783fcf889151 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose devem ser hidrolisadas a açúcares monoméricos fermentescíveis para produzir etanol. Entretanto, a tarefa de propor um processo enzimático de hidrólise eficiente e de baixo custo com a finalidade de sacarificar a biomassa é desafiadora, pois os polissacarídeos que a compõem são complexos e recalcitrantes. Embora as hemiceluloses representem cerca de 30% dos açúcares do bagaço da cana-de-açúcar, uma das biomassas mais promissoras para a produção de etanol de segunda geração no Brasil, ainda poucos estudos são direcionados ao estudo da sacarificação dessa fração de polissacarídeos. Hemicelulases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise dos polissacarídeos hemicelulósicos, e que em atuação sinérgica com celulases promove a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de maneira mais eficiente que as classes de enzimas isoladamente. A primeira parte dessa dissertação apresenta a caracterização bioquímica e biofísica de uma arabinofuranosidase GH51 do micro-organismo Bacillus subtilis 168. ?-L-arabinofuranosidases são hemicelulases que hidrolisam terminais não redutores de polissacarídeos contendo arabinose. A AbfA mostrou-se robusta, atuando numa ampla faixa de temperatura, e capaz de liberar monômeros de arabinose hidrolisando 1,5-?-L-arabinoheptaose a partir da extremidade não-redutora. A análise dos dados de SAXS combinada com simulações de dinâmica molecular mostrou que a AbfA em solução é hexamérica, com cada subunidade contendo uma molécula com domínio catalítico em enovelado na forma de barril (?/?)8 seguido por um domínio acessório ?-sandwich. Esses dados evidenciam que a estrutura quaternária pode ser importante para o desempenho de atividade das arabinofuranosidases da família 51. A segunda parte da dissertação aborda uma avaliação da influência dos domínios de ligação a carboidratos na atividade de xilanases mesofílicas e termofílicas. Xilanases são hemicelulases que catalisam a hidrólise de ligações endo-1,4-?-D-xilosídicas na molécula de xilano. Fusões gênicas uniram end-to-end um CBM6 de Clostridium thermocellum aos domínios catatalíticos xilanásicos das enzimas GH10 termofílica (de Thermotoga petrophila) e GH11 mesofílica (de Bacillus subtilis 168). O CBM6 alterou o padrão de hidrólise das quimeras termofílicas e aumentou a constante de eficiência da quimera mesofílica, quando comparadas as enzimas nativas respectivas. Além disso, na hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar a xilanase quimérica mesofílica suplementou o coquetel comercial Accellerase 1500, liberando mais açúcares redutores. Dessa forma a fusão ao CBM6 mostrou-se uma alternativa para construir enzimas com melhor desempenho cinético / Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose must be hydrolyzed in fermentable monomeric sugars to produce ethanol. However, the task of proposing a process for enzymatic hydrolysis efficient and low cost in order to saccharify the biomass is challenging because its polysaccharides are complex and recalcitrant, so it requires the presence of several different catalytic activities for hydrolysis. Although hemicelluloses represent about 30% of sugars from sugarcane bagasse, one of the most promising biomass for the production of second generation ethanol in Brazil, few studies are directed to the saccharification study of this polysaccharidic fraction. Hemicellulases are glycoside hydrolases that catalyze the hydrolysis of hemicellulosic polysaccharides and works synergistically with cellulases promoting the hydrolysis of sugarcane bagasse more efficiently than each one class of enzymes alone. The first part of this dissertation presents the biochemistry and biophysics characterization of a GH51 arabinofuranosidase from microorganism Bacillus subtilis 168. ?-Larabinofuranosidases are hemicellulases that hydrolyze linkages in terminal nonreducing ends of polysaccharides containing arabinose. The AbfA showed itself robust, working in a wide temperature range, and able to release arabinose monomers hydrolyzing 1,5-?-L-arabinoheptaose from the non-reducing end. The analysis of SAXS data in combination with molecular dynamics simulations showed that AbfA solution is hexameric, with each subunit containing a molecule with catalytic domain coiled in the form of barrel (?/?)8 followed by a ?-sandwich domain accessory. These results evidence and corroborate data that the quaternary structure may be important for the activity of GH51 arabinofuranosidases family. The second part of the thesis adresses an evaluation of the influence of carbohydratebinding modules, non-catalytic domains of polysaccharides recognition, in the activity of mesophilic and thermophilic xylanases. Xylanases are hemicellulases that catalyze the hydrolysis of endo-1 ,4-?-D-xylosidic linkages in xylan molecule. Gene fusions joined end-to-end a CBM6 from Clostridium thermocellum to catalytic xylanasic domains of enzymes thermophilic GH10 (from Thermotoga petrophila) and mesophilic GH11 (from Bacillus subtilis 168). The CBM6 changed the hydrolysis pattern of thermophilic chimeras increased the efficiency constant of mesophilic chimera, when compared to the respective native enzymes. Furthermore, in the sugarcane biomass hydrolysis mesophilic chimeric xylanase supplemented the commercial cocktail Accellerase 1500, releasing more reducing sugars. In conclusion, the CBM6 fusion proved itself an alternative to construct enzymes with better kinetic performance / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Glaucia Maria Pastore, Fábio Márcio Squina / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T10:16:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JunioCota_D.pdf: 6755717 bytes, checksum: 8ce3ba1fb6b01179b70462bf26349499 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Atualmente há uma crescente demanda para o desenvolvimento de combustíveis não-fósseis alternativos. Assim, como a biomassa lignocelulósica é uma das fontes de energia mais abundantes na natureza, pode ser estabelecida uma economia verde e sustentável, com o objetivo de processar a grande quantidade de energia estocada nessas matérias-primas. O etanol de cana-de-açúcar é uma das melhores opções em biocombustíveis e sua produção pode mais que dobrar, se os açúcares constituintes da parede celular vegetal forem utililizados. No entanto, o alto custo de produção das enzimas para hidrolisar e processar os materiais lignocelulósicos é um fator altamente limitante para o uso de tecnologias verdes. Este trabalho se propôs a avaliar novos biocatalisadores e construir uma enzima quimérica na tentativa de obter glicosidases com melhor desempenho que as já relatadas. Enzimas despolimerizadoras de ß-1,3-glucanos têm consideráveis aplicações biotecnológicas, incluindo produção de biocombustíveis, insumos químicos e farmacêuticos. No segundo capítulo, mostramos a caracterização funcional e a estrutura de baixa resolução da laminarase hipertermofílica de Thermotoga petrophila (TpLam), além de seu modo de operação por eletroforese capilar de zona, mostrando que ela cliva especificamente ligações ß-1,3-glucosídicas internas. O dicroismo circular (CD) UV-distante demonstrou que TpLam é formada principalmente por elementos estruturais do tipo beta, e a estrutura secundária é preservada após incubação por 16 horas a 90 º C. A forma determinada pelo pequeno espalhamento de raios-X a baixo ângulo revelou uma arquitetura de multi-domínio da enzima, com um arranjo de envelope em forma de V, no qual os dois módulos de ligação de carboidrato estão ligados ao domínio catalítico. A engenharia de enzimas multifuncionais pode melhorar coquetéis enzimáticos para tecnologias emergentes de biocombustíveis. Dinâmica molecular através de modelos baseados em estrutura (SB) é uma ferramenta eficaz para avaliar a disposição tridimensional das enzimas quiméricas, bem como para inferir a viabilidade funcional antes da validação experimental. No terceiro capítulo, descrevemos a montagem computacional de uma quimera bifuncional xilanase-liquenase (XylLich), usando os genes xynA e bglS de Bacillus subtilis. As análises in silico da área de superfície acessível ao solvente (SAS) e da raiz quadrada média das flutuações (RMSF) previram uma quimera completamente funcional, ou seja, uma enzima cujo substrato tem acesso ao seu sítio catalítico com pequenas flutuações e variações ao longo das cadeias polipeptídicas. A quimera preservou as características bioquímicas das enzimas parentais, com exceção de uma pequena variação na temperatura de operação e na eficiência catalítica (kcat / Km). Também foi verificado ausência de mudanças significativas no modo de operação catalítico. Além disso, a produção de enzimas quiméricas pode ser mais rentável do que a produção de uma única enzima separadamente, comparando-se o rendimento da produção de proteína recombinante e a atividade hidrolítica da enzima quimérica com as enzimas parentais. ß-Glicosidases (BGLs) são enzimas muito úteis e com grande potencial para serem empregadas em diversos processos industriais. Entretanto, algumas características são essenciais para tornar viáveis as aplicações, como por exemplo estabilidade à temperatura e ao pH, bem como baixa inibição por íons e outros compostos químicos. Assim, no quarto capítulo buscamos estudar três BGLs dos organismos extremófilos Pyrococcus furiosus e Thermotoga petrophila. Os genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 foram clonados no vetor pET28a e as proteínas expressadas em Escherichia coli e posteriormente purificadas em duas etapas cromatográficas. As enzimas purificadas foram avaliadas quanto ao pH e temperatura de atividade, sendo que as BGLs da família GH1 (PfBgl1 e TpBgl1) apresentaram faixas mais largas de pH e temperatura de operação do que a família GH3 (TpBgl3). As BGLs mostraram grande estabilidade ao pH e o maior tempo de meia-vida (a 99 ° C) foi verificado no pH 6, e além disso, não foram significativamente afetadas pela presença de EDTA ou de íons, exceto a TpBgl1 que foi inibida por Hg2+ e Fe2+. As atividades específicas para um conjunto de diferentes substratos sugeriram que TpBgl3 é mais específica que as BGLs GH1. O kcat e kcat / Km em 4-nitrofenol-ß-D-glicopiranosídeo (pNPG) indicam que TpBgl3 é a mais eficiente para hidrólise do substrato, embora seja a enzima que foi inibida com a menor concentração de glicose (30.1 mM). Além disso, as BGLs foram analisadas quanto à influência de seis monossacarídeos na catálise, e demonstraram serem fracamente inibidas pela maioria dos açúcares testados. Os ensaios de CD UV-distante revelaram que a estrutura secundária das BGLs não é afetada pelas variações de pH, e os estudos de desnaturação térmica evidenciaram que as BGLs são proteínas hipertermofílicas / Abstract: There is an increasing demand for the development of alternative non-fossil fuels. Thus, since the lignocellulosic biomass is the most abundant source in nature, it may be settled a green and sustainable economy, aiming to process the great amount of energy stocked in these raw materials. The ethanol from sugarcane is one of the best options concerning biofuels and its productivity could be raised more than double if the use of sugars constituents of plant cell wall is considered. However the high production cost of the enzymes to hydrolyze and process lignocellulose is a great limiting factor for green technologies. In this way, this work proposed to evaluate new enzymes and engineer a chimeric enzyme in the attempt to prospect glycosyl hydrolases with better performance than those reported up to date. 1,3-ß-Glucan depolymerizing enzymes have considerable biotechnological applications including the production of biofuels, feedstock-chemicals and pharmaceuticals. In the first chapter we showed the comprehensive functional characterization and low-resolution structure of hyperthermophilic laminarase from Thermotoga petrophila (TpLam), besides its mode of operation through capillary zone electrophoresis, which specifically cleaves internal ß-1,3-glucosidic bonds. Far-UV circular dichroism demonstrated that LamA is formed mainly by beta structural elements, and the secondary structure is maintained after incubation up to 16 hours at 90ºC. The structure determined by small angle X-ray scattering revealed a multi-domain structural architecture of the enzyme with a V-shape envelope arrangement of the two carbohydrate binding modules in relation to the catalytic domain. Multifunctional enzyme engineering can improve enzyme cocktails for emerging biofuel technology. Molecular dynamics through structure-based models (SB) is an effective tool for assessing the tridimensional disposal of chimeric enzymes as well as for inferring the functional practicability before experimental validation. In the second chapter we describe the computational design of a bifunctional xylanase-lichenase chimera (XylLich) using the xynA and bglS genes from Bacillus subtilis. In silico analysis of the average surface accessible area (SAS) and the root mean square fluctuation (RMSF) predicted a fully functional chimera, i.e. the substrate has access to the catalytic pocket with minor fluctuations and variations along the polypeptide chains. The chimera preserved the biochemical characteristics of the parental enzymes, with the exception of a slight variation in the temperature of operation and the catalytic efficiency (kcat/Km). The absence of substantial shifts in the catalytic mode of operation was also verified. Furthermore, the production of chimeric enzymes could be more profitable than producing a single enzyme separately, based on comparing the recombinant protein production yield and the hydrolytic activity achieved for XylLich with that of the parental enzymes. ß-Glucosidases (BGLs) are very useful enzymes with a great potential to be employed in several industrial processes. However, some features are required to become viable the enzyme applications, such as temperature and pH stability as well, low ions and chemicals inhibition. Thus this work aimed to study three BGLs from the extremophiles organisms Pyrococcus furiosus and Thermotoga petrophila. The genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 were cloned into pET28a vector and the proteins were expressed in Escherichia coli and further purified in two chromatographic steps. The purified enzymes were evaluated for pH and temperature of activity, which showed that BGLs from the glycosyl hydrolases family 1 (PfBgl1, TpBgl1) presented a wider range of pH and temperature operation than BGL from family 3 (TpBgl3). The BGLs showed great stability to a range of pH (4-10) and the highest time of half-life (at 99 °C) was at pH 6, besides they were not significantly affected by the presence of EDTA or ions, except TpBgl1 that was inhibited by Hg2+ and Fe2+. The specific activities in a set of different substrates suggested that TpBgl3 is more specific than GH1 BGLs. The kcat and kcat/Km in pNPG indicate that TpBgl3 is the most efficient among BGLs characterized herein, although this enzyme is inhibited with the lowest glucose concentration (30.1 mM). Furthermore, the BGLs were assayed for influence of six monosaccharides in catalysis, which the results suggested a weak inhibition by the most of those carbohydrates tested. The CD experiments revealed that the secondary structure of BGLs is not affected by the pH variations and the denaturation studies evidenced that the BGLs are indeed hyperthermophilic / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Marcelo Cristianini, Alline Artigiani Lima Tribst / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:58:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeiteJunior_BunoRicardodeCastro_M.pdf: 4205771 bytes, checksum: 2ccdbecbd8ae2dc92dd1978fbf86b48b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A homogeneização à alta pressão (HAP) é um processo capaz de alterar a conformação e funcionalidade de enzimas. Os objetivos deste trabalho foram: (i) avaliar a influência da HAP até 190 MPa nas atividades proteolítica e de coagulação do leite bem como na estabilidade de quatro enzimas coagulantes do leite, (ii) acompanhar o processo de coagulação por ensaios reológicos e (iii) avaliar o desenvolvimento dos géis por 24 horas por meio das análises de proteólise, sinérese, reologia e microscopia. As avaliações foram feitas comparando-se os resultados obtidos com as enzimas processadas e não processadas. O coalho de vitelo processado a 190 MPa apresentou redução de 52% na atividade proteolítica, aumento da taxa de coagulação do leite e gel formado mais consistente. A avaliação deste gel por 24h indicou a formação de uma rede proteica com menor proteólise, maior sinérese, maior consistência e menor porosidade. Após processamento a 150 MPa, o coalho de bovino adulto apresentou redução da atividade proteolítica, aumento da atividade e estabilidade de coagulação do leite, maior taxa de coagulação do leite e formação de gel com maior consistência. O gel se mostrou mais compacto, firme e com maior expulsão do soro da matriz proteica nas 24h em que foi avaliado. A protease fúngica do Rhizomucor miehei foi a enzima mais resistente ao processo de HAP, sofrendo mínima ou nenhuma alteração na atividade proteolítica e de coagulação do leite quando processada até 190 MPa em diferentes concentrações e em múltiplos processos consecutivos. Entretanto, na avaliação reológica da coagulação do leite utilizando-se a protease fúngica homogeneizada a 190 MPa por até 3 ciclos ou quando homogeneizada a 190 MPa em soluções com concetração de 20 % foi observado aumento da consistência do gel. Para pepsina suína, as alterações na atividade proteolítica e de coagulação do leite só foram observadas durante a estocagem, com redução na atividade proteolítica e um aumento na atividade de coagulação do leite para enzima processada a 150 MPa. No entanto, esta enzima processada promoveu uma coagulação do leite mais rápida formando um gel mais consistente, mesmo imediatamente após o processamento por HAP. Durante a observação deste gel por 24h, este se mostrou mais compacto, firme, menos poroso e com maior liberação de soro da matriz proteica. De uma forma geral foi possível concluir que as maiores pressões aplicadas (150 MPa e 190 MPa) afetaram positivamente as enzimas avaliadas, com redução da atividade proteolítica inespecífica e aumento da atividade de coagulação de leite, com consequente formação de géis com menores níveis de proteólise, o que favorece a manutenção da rede proteica rígida, firme e coesa. Desta forma, conclui-se que a HAP é um processo promissor que pode ser aplicado como uma tecnologia para melhorar as características hidrolíticas das enzimas coagulantes do leite, especialmente quando se deseja diminuir atividade proteolítica e aumentar sua atividade de coagulação do leite. Além disso, a menor proteólise no gel pode resultar numa extensão da vida de prateleira de queijos frescos, por, possivelmente, reduzir a formação de compostos de sabor indesejável / Abstract: High pressure homogenization (HPH) is a process that can alter the conformation and functionality of enzymes. The objectives of this study were: (i) evaluate the influence of HPH up to 190 MPa on the proteolytic and milk-clotting activities and stability of four milk-clotting enzymes, (ii) monitor the coagulation process by rheological assays and (iii) evaluate the gel development for 24 hours analyzing proteolysis, syneresis, rheological and microstructural behavior. The evaluations were performed by comparing the results between the processed and non-processed enzymes. The calf rennet processed at 190 MPa decreased 52 % its proteolytic activity, increased the rate of milk-clotting and a more consistent gel was formed. The evaluation of the gel for 24 hours indicated the formation of a protein network with lower proteolysis, higher syneresis, higher consistency and lower porosity. After processing at 150 MPa adult bovine rennet showed a reduction proteolytic activity, increase activity and stability of milk-clotting, higher milk-clotting rate and formed more consistent gels. This gel was more compact, firm and higher whey separation of protein matrix during the 24 hours of evaluation. The fungal protease from Rhizomucor miehei was the most resistant enzyme to the HPH process, showing minimal or no change in proteolytic activity and milk coagulation when processed up to 190 MPa at different concentrations and multiple consecutive processes. However, in the rheological evaluation of milk coagulation using fungal protease homogenized to 190 MPa for up 3 cycles or when homogenized in a solution with a concentration of 20% observed increase in the consistency of the gel. For porcine pepsin, changes on proteolytic activity and milk coagulation were only observed during storage, with reduction of proteolytic activity and an increase on the milk-clotting activity for the enzyme processed at 150 MPa. However, this enzyme promoted a faster coagulation of milk forming more consistent gel immediately after the processing by HPH. During the observation of this gel for 24 hours, this was more compact, firm, less porous and more release of whey of the protein matrix. Overall it was concluded that the highest applied pressures (150 MPa and 190 MPa) positively affected the enzymes with reduced nonspecific proteolytic activity and increased milk-clotting activity, with consequent formation of gels with lower levels of proteolysis, which favors the maintenance of a network of protein rigid, firm and cohesive. Thus, it is concluded that HPH is a promising process that can be applied as a technology to improve the hydrolytic characteristics of milk coagulating enzymes, especially to reduce proteolytic activity and increase the milk-clotting activity. Furthermore, the lower proteolysis in the gel may result in an extension of the shelf life of fresh cheese, by possibly reducing the formation of bitterness flavor / Mestrado / Tecnologia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos