O requisito fundamental na seleção do par doador-receptor em Transplantes de Medula Óssea (TMO) é regido pelo sistema do Complexo Principal de Histocompatibilidade, ou seja, pelos mecanismos imunológicos mediados pelas moléculas dos Antígenos Leucocitários Humanos (HLA). No entanto as incompatibilidades HLA, podem influenciar de forma negativa ou positiva os resultados dos transplantes, através da Doença do Enxerto versus Hospedeiro e o efeito do enxerto versus Leucemia (EvL) respectivamente. Ainda é desconhecido o impacto do locus HLA-DPB1* neste contexto. Assim o presente projeto tem como objetivo a avaliação do impacto do HLA-DPB1* em transplantes de pacientes consanguíneos e a ocorrência de DECH. Para a tal finalidade, tipificamos o locus em questão utilizando a metodologia PCR-SSO, onde após a reação de amplificação da cadeia pela polimerase, realizamos a hibridização com uma sequência específica de oligonucleotídeos para tipificação do Loco HLA-DPB1*. Foram analisadas 826 amostras, sendo 413 pares de receptores e seus respectivos doadores familiares, submetidos a Transplantes de Células Tronco Hematopoiéticas, realizados na Unidade de Transplante de Medula Óssea de Curitiba da Universidade Federal do Paraná e da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- USP. Observou-se que a presença de incompatibilidades HLA-DPB1* aumentam a chance dos receptores desenvolverem a doença do enxerto versus hospedeiro aguda, em graus mais graves. Assim, concluímos que a avaliação deste loco pode prevenir esta doença, e caso não haja outro doador, alerta o clínico quanto à utilização de medidas profiláticas. / The key requirement in the selection of the receptor-donor pair for bone marrow transplant is is defined by the Major Histocompatibility Complex, or by immunologic mechanisms mediated by molecules of the Human Leukocyte Antigens (HLA). However the post transplant complications due to HLA mismatches, as Graft versus Host Disease (GVHD) and graft failure are fundamental to the success of these transplants. Still unknown is the impact of loci HLA DPB1*, so this project aims to assess the impact of HLA - DPB1* in transplant patients consanguineous and assessing the impact of incompatibilities in HLA - DPB1 * GVHD. For this purpose, analyzed the loco in question using the PCR-SSO method, where after the amplification reaction polymerase chain, we performed hybridization with a sequence -specific primers for typing of HLA - DPB1* Loco. We analyzed 826 samples, 413 pairs of recipients and their respective donors, patients undergoing Hematopoietic Stem Cell Transplants performed in the Unit for Bone Marrow Transplantation in Curitiba, Federal University of Paraná and the Faculty of Medicine of Ribeirão Preto - USP. It was observed that the presence of mismatches HLA- DPB1* increase the chance of recipients develop chronic graft versus host disease, in more severe degrees. Thus, we conclude that the evaluation of this loci can prevent this disease and if no other donors alert the clinician to the use of prophylactic measures.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-04T13:00:39Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kaisson Ernane dos Santos - 2013.pdf: 2738475 bytes, checksum: 6c79ab9177dd126fa5cb677127debc2c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-04T13:01:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kaisson Ernane dos Santos - 2013.pdf: 2738475 bytes, checksum: 6c79ab9177dd126fa5cb677127debc2c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T13:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kaisson Ernane dos Santos - 2013.pdf: 2738475 bytes, checksum: 6c79ab9177dd126fa5cb677127debc2c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-11-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Major Histocompatibility Complex is mainly composed by genes of the adaptive immune response. In humans, part of this complex is known as the Human Leukocyte Antigens (HLA), whose genes are responsible for specific antigen presentation to effector immune cells. The classical class I HLA genes (HLA-A, -B and -C) are responsible for antigen presentation to T CD8+ cells and they constitute the most polymorphic genes in the human genome. This variability is maintained by selection mediated by microorganisms. In contrast to their classical counterparts, the non classical class I genes (HLA-G, -E and -F) present low variability and are associated with immune tolerance due to the interaction with NK and T cells inhibitor receptors. HLA-G is the most studied non classical gene, which is associated with immune response modulation, mainly during pregnancy. Considering that natural selection is acting on the HLA-G regulatory regions maintaining high heterozigosity in this region, we evaluated a nearby Alu insertion (AluyHG) correlating this Alu element with coding and 3’UTR HLA-G polymorphisms. The AluyHG insertion was particularly associated with the HLA-G haplotype known as G*01:01:01:01/UTR-1, considered a high-expressing HLA-G haplotype. The G*01:01:01:01/UTR-1/AluyHG haplotype would be the most recent HLA-G haplotypes, in spite of its high frequency in worldwide populations. / O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é formado principalmente por genes que participam da resposta imunológica adaptativa. Entre esses genes encontramos o grupo denominado de Antígenos Leucocitários Humanos (HLA), que são responsáveis pela apresentação de antígenos específicos às células efetoras do sistema imunológico. Os genes HLA de classe I clássicos (HLA-A, -B e -C), responsáveis pela apresentação antigênica aos linfócitos T citotóxicos, são considerado como os mais polimórficos do genoma humano e de outros vertebrados. A variabilidade desses genes e elevada heterozigose é mantida por seleção mediada por microrganismos. Diferentemente dos genes clássicos, os genes HLA de classe I não clássicos (HLA-G, -E e -F) apresentam variabilidade reduzida e como função principal a tolerância imunológica, por meio de sua interação com receptores inibitórios presentes nas células NK e T. O HLA-G é o mais estudado entre esses genes e, devido sua importância como molécula imunomoduladora e sua importância em situações como gestação, e considerando evidências anteriores de seleção natural mantendo uma elevada heterozigose nas regiões regulatórias do HLA-G, avaliamos a presença de uma inserção Alu (AluyHG) próxima a este gene correlacionando os achados com a variabilidade contida nas suas regiões codificadora e 3’ não traduzida. A inserção AluyHG mostrou-se em desequilíbrio de ligação (LD) com os polimorfismos do gene HLA-G. Especificamente, o elemento inserido apresentou-se em LD com um haplótipo denominado G*01:01:01:01/UTR-1, considerado como um haplótipo de alta produção da molécula de HLA-G. Esse haplótipo aparentemente é o mais jovem entre humanos, apesar de sua elevada frequência nas populações estudadas até o momento.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-15T11:33:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoCelulasTrofoblasta.PDF: 3484769 bytes, checksum: 0aeb5fff725718c30f9e19f2450b603e (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-16T17:31:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoCelulasTrofoblasta.PDF: 3484769 bytes, checksum: 0aeb5fff725718c30f9e19f2450b603e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-16T17:31:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoCelulasTrofoblasta.PDF: 3484769 bytes, checksum: 0aeb5fff725718c30f9e19f2450b603e (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / A perspectiva de aumentar a produtividade do gado bovino a partir da aplicação de melhoramento genético do rebanho é cada vez mais estudada. Dentre as regiões genômicas mais estudadas e promissoras têm-se o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), já que este reúne genes importantes na resposta imunológica do animal, sendo possível selecionar marcadores nesta região para maior resistência a enfermidades e, portanto, maior produção pecuária. A diversidade do MHC bovino, conhecido como BoLA (Bovine Leukocyte Antigens), foi estudada inicialmente investigando seus genes isoladamente. A maioria dos bovinos são heterozigotos em BoLA e apenas em ocasiões especiais (animais homozigotos ou que possuam informação de pedigree) seu haplótipo pode ser caracterizado. Portanto, este trabalho objetivou desenvolver uma nova abordagem para descrever haplótipos de BoLA de vacas heterozigotas, utilizando células do trofoblasto de embriões partenogenéticos bovinos. Dois métodos para validação desta abordagem foram utilizados: um painel de 445 SNPs em BoLA foi informativo acerca do efeito que a recombinação meiótica apresenta na zigose da região; e a comparação de alelos de BoLA-DRB3 entre a fêmea bovina e sua célula trofoblástica partenogenética (CTP) demonstrou ser um método confiável e prático para a investigação de homozigose em BoLA. A partir de ambos os métodos, a metodologia desenvolvida aqui foi validada, já que CTPs homozigotas em BoLA foram derivadas de vacas heterozigotas, permitindo a descrição de haplótipos de BoLA. A análise detalhada da região de Classe IIa de BoLA-DRB3-DQA-DQB revelou a presença de 18 haplótipos distintos, sendo 16 destes nunca antes descritos. Além disso, dois alelos de DQA e um de DQB presentes nestes haplótipos são novos. O método descrito aqui foi mais eficiente do que a investigação por fêmeas homozigotas ou inferir a composição haplotípica baseada em informação de pedigree, além de evitar ambiguidades nos resultados. Novas pesquisas buscando a otimização deste método podem aumentar a sua eficiência e torná-lo mais facilmente aplicável a uma variedade de estudos genéticos, usando espécies diferentes e com finalidades distintas. / The prospect of increasing the productivity of cattle by means of genetic improvement is increasingly investigated. Among the most studied and and promising genomic regions is the Major Histocompatibility Complex (MHC), since it includes key genes of the immune response of the animals, being able to select makers in this region for increased disease resistance and therefore greater production. The diversity of the cattle MHC, known as BoLA (Bovine Leukocyte Antigens), has been primarily studied using variants of serological specificities or sequencing some of its genes. Most cattle are heterozygous at BoLA and only in special occasions (homozygous animals or animals for which pedigree information is available) can the haplotypes be characterized. Therefore, this study aims to develop a novel approach to describe BoLA haplotypes from heterozygous cows, using trophoblast cells from parthenogenetic bovine embryos derived from slaughterhouse ovaries. Two methods for validating this approach were used: a panel of 445 SNPs spanning BoLA region was informative on the effect of meiotic recombination on the region zigosity; and the comparison of BoLA-DRB3 alleles between the dam and its parthenogenetic embryo derived trophoblast cells (PEDTC) proved to be a reliable and practical method for investigating BoLA homozigosity. Using both methods, the approach presented here was validated, since BoLA homozygous PEDTC were derived from heterozygous cows, allowing the description of BoLA haplotypes. Detailed analysis of the BoLA Class IIa region identified 18 different BoLA-DRB3-DQA-DQB haplotypes, including 16 novel haplotypes. Furthermore, two DQA and one DQB alleles included in these haplotypes were novel. This method was more efficient than to look for homozygous cows or infer haplotype composition based on pedigree information, in addition to avoid ambiguities on the results. New researches aiming for the improvement of this method can increase its efficiency and make it more easily applicable for a variety of genetic studies, using different species and for other purposes.

INTRODUÇÃO: O diabetes tipo 1 autoimune (DM1A) está associado a alterações na imunidade inata e adaptativa. A agressão autoimune, órgão específica, determina a destruição das células beta do pâncreas e a deficiência da produção de insulina. O infiltrado inflamatório do tipo linfomononuclear, configurando a insulite, e a escassez ou a ausência das células ?, definem o quadro histológico do DM1A. Os autoanticorpos contra antígenos das células beta, que geralmente se desenvolvem na fase pré-clínica, conferem predisposição para DM1A. No entanto, é difícil definir quando e quais indivíduos progredirão para o diabetes manifesto, justificando a busca de outros biomarcadores que auxiliem nas indicações de tratamentos preventivos. Nesse contexto, sabe-se que os microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs que atuam pós transcrição, desempenham papel crucial na regulação de genes, integrando fatores genéticos e ambientais e influenciando o funcionamento de órgãos e tecidos de maneira pontual ou sistêmica. OBJETIVOS: avaliar o envolvimento biológico e a relevância da expressão de miRNAs na resposta imunológica e na função das células ? na patogênese do DM1A. MÉTODOS: analisamos o perfil dos miRNAs séricos em 4 grupos, a saber: pacientes portadores de DM1A, até 6 meses do diagnóstico (DM1A recente), (n=30); pacientes portadores de DM1A com duração de 2-5 anos (DM1A 2-5)(n=26) e indivíduos com autoanticorpos pancreáticos positivos sem diabetes (AcP) (n=25), os quais foram comparados aos indivíduos controles saudáveis(n= 29). A expressão dos microRNAs foi obtida com ensaios individuais TaqMan® MicroRNA Assays 5x primers e TaqMan MicroRNA Human Array Card A, (Applied Biosystems- Forster City CA, USA) constituído por 377 alvos e 4 endógenos. Os dados de expressão foram analisados no Software Cloud, (Thermo Fisher Scientific) e no programa Limma (Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data). RESULTADOS: Não houve diferença nas características demográficas, como idade, cor auto referida e sexo entre os grupos (p > 0,05). Pacientes portadores de DM1A (recente e com duração de 2-5 anos), diferiram do grupo controle pelos valores elevados de glicose, hemoglobina glicada, títulos de autoanticorpos pancreáticos, e menores de peptídeo C (p < 0,05) e foram semelhantes entre si. Os portadores de autoanticorpos (AcP) tinham características intermediárias entre os grupos: menores valores de HbA1c e de anticorpo anti-tirosina-fosfatase (anti-IA2) e maiores de peptídeo C em relação aos dois grupos com diabetes. Diferiram dos controles apenas pelos maiores títulos de anticorpo anti-insulina (IAA) e anti-descarboxilase do ácido glutâmico 65 (anti-GAD65). A frequência dos alelos HLA de risco para diabetes (-DR3 ou -DR4 e -DQ2 ou DQ-8) decresceu dos grupos DM1A recente e DM 2-5 para AcP e controles. Foram avaliados 135 miRNAs que estavam expressos em 20% ou mais das amostras dos quatro grupos analisados. Maior expressão foi observada em 13, 4 e 33 miRNAs dos grupos AcP, DM1A recente e DM1A 2-5 respectivamente e menor em 11, 7 e 31 miRNAs destes grupos. Destes, 4 miRNAs foram diferencialmente expressos nos grupos AcP, DM1A recente e DM1A 2-5 em relação ao grupo controle. Os miRNAs: miR -16, miR-195 e miR-454, relacionados com regeneração endócrina do pâncreas, efeito anti-inflamatório e resposta à injúria da célula ? estavam diminuídos nestes 3 grupos. O miR-200a, implicado em apoptose das células beta, estava aumentado nos grupos AcP e DM1A recente e diminuído nos pacientes com maior duração do diabetes (DM1A 2-5), possivelmente devido à escassez destas células. Outros 8 miRNAs apresentaram expressão diferente da do grupo controle em dois dos grupos avaliados, e tendência semelhante no terceiro grupo, sendo 4 deles elevados (miR-193a-5p, miR- 323-3p, miR-423-5p, e miR-92a) e 4, diminuídos (miR-191, miR-19a, miR- 376a, miR-590-5p) ou neutralidade no 3º grupo (miR-15b, miR-100, miR-181a e miR-483-5p) Resposta antagônica foi observada para o miR-25 e miR-485- 3p, diminuídos no grupo AcP e aumentados no DM1A 2- 5. Tais miRNAs estão relacionados com resposta imunológica, secreção de insulina, lesão de células ? e glicotoxicidade, à semelhança do observado para o miR-101-3p, validado por ensaios individuais numa casuística maior. CONCLUSÃO: nossos dados sugerem que miRNAs circulantes podem estar envolvidos na patogênese do DM1A / INTRODUCTION: Autoimmune type 1 diabetes (T1D) is associated with changes in innate and adaptive immunity. The organ-specific autoimmune aggression determines the destruction of beta-cells in the pancreas and the deficient insulin production. The inflammatory infiltration of the lymphomononuclear type, configuring the insulite, and the scarcity or the absence of the beta cells, define the histological picture of T1D. Autoantibodies against beta-cell antigens, which usually develop in the preclinical phase, confer predisposition to T1D. However, it is difficult to define when and which individuals will progress to overt diabetes, justifying the search for other biomarkers that could be indicative of preventive treatments. In this context, it is known that the microRNAs (miRNAs) - small RNAs that act post transcription - play a crucial role in regulating genes and in integrating genetic and environmental factors, influencing the function of organs and tissues in a punctual or systemic way. OBJECTIVES: to evaluate the biological involvement and relevance of miRNA expression in the immune response and ?-cell function in the pathogenesis of T1D. METHODS: we analyzed the profile of serum miRNAs of 4 groups, namely: patients with T1D up to 6 months after diagnosis (recent T1D), (n = 30); patients with T1D lasting 2-5 years (T1D 2- 5) (n = 26) and individuals expressing pancreatic autoantibodies without diabetes (AbP) (n = 25), which were compared to healthy controls (n = 29). Expression of the microRNAs was obtained with individual assays TaqMan® MicroRNA Assays 5x primers and TaqMan MicroRNA Human Array Card A (Applied Biosystems-Forster City CA, USA), consisting of 377 targets and 4 endogenous. The expression data was analyzed in the Cloud Software (Thermo Fisher Scientific) and Limma (Linear Models for Microarray and RNASeq Data) program. RESULTS: There was no difference in demographic characteristics, such as age, self-reported color, and sex among groups (p > 0.05). Patients with T1D (both recent and 2-5 years), similar to each other, differed from the control group by high glucose, glycated hemoglobin levels, pancreatic autoantibody titers, and lower C peptide values (p < 0.05) . Pancreatic autoantibodies (AbP) carriers had intermediate characteristics among the groups: lower HbA1c and anti-tyrosine phosphatase antibody (anti- IA2) values and higher C-peptide levels than the two groups with diabetes. They differed from controls only by the higher titers of anti-insulin (IAA) and anti-decarboxylase of glutamic acid 65 (anti-GAD65) autoantibodies. The frequency of high risk HLA alleles for diabetes (-DR3 or -DR4 and -DQ2 or DQ- 8) decreased from the recent T1D and T1D 2-5 groups to the AbP and controls. We evaluated 135 miRNAs that were expressed in 20% or more of the samples from the four groups analyzed. Higher expression was observed in 13, 4 and 33 miRNAs of the Abp, recent T1D and T1D 2-5 groups respectively and lower in 11, 7 and 31 miRNAs of these groups. Of these, 4 miRNAs were differentially expressed in the AbP, recent T1D and T1D 2-5 groups in relation to the control group.The miRNAs: miR -16, miR-195 and miR-454, related to endocrine regeneration of the pancreas, anti-inflammatory effect and response to beta-cell injury were decreased in these 3 groups. miR-200a, implicated in beta-cell apoptosis, was increased in the recent and decreased AbP and T1D groups in patients with longer duration of diabetes (T1D 2-5y), possibly due to the shortage of these cells. Another eight miRNAs showed different expression of the control group in two of the evaluated groups, and a similar trend in the third group, four of them high (miR-193a-5p, miR-323-3p, miR-423-5p, and miR- 92a ) and four, decreased (miR-191, miR-19a, miR-376a, miR-590-5p) or neutrality in the 3rd group (miR-15b, miR-100, miR-181a and miR-483-5p) was observed for miR-25 and miR-485-3p, decreased in the AbP group and increased in T1D 2-5y. Such miRNAs are related to immune response, insulin secretion, ?-cell damage and glycotoxicity, similar to that observed for the miR- 101-3p, validated by individual trials in a larger cohort. CONCLUSION Our data suggests that circulating miRNAs may be involved in the pathogenesis of T1D

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T18:11:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Victorio_SheilaCristinadaSilva_D.pdf: 20891355 bytes, checksum: a0e7d9b08b387848f356367e4f3c8d86 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Na medula espinal, o estabelecimento das sinapses é, provavelmente, coordenado pelos próprios neurônios. Contudo, as células da glia circunjacentes e o microambiente formado entre neurônios/glia, desempenham papel importante na modulação da excitabilidade neural, influenciando na transmissão e plasticidade sináptica. Em situações de injúria ou inflamação, há um aumento da reatividade glial e mudança do estado funcional dos neurônios, levando a uma consequente cascata de eventos visando a homeostase do tecido. Neste sentido, o IFN? está envolvido na regulação da expressão do MHC I, o qual tem recentemente mostrado exercer um papel importante nos processos de plasticidade sináptica após axotomia. Além disso, existem evidências de que o IFN? pode interferir na diferenciação e sobrevivência das células neurais. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos da ausência do IFN? nos neurônios espinais após lesão. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar os fenômenos de plasticidade sináptica e da reatividade glial em camundongos mutantes para IFN?, a fim de analisar a dinâmica das sinapses na medula após a lesão do nervo isquiático em animais incapazes de regular a expressão de MHC I pela produção de IFN?. Para isso, camundongos mutantes para IFN? e do tipo selvagem C57BL/6J foram submetidos à transecção ou esmagamento unilateral do nervo isquiático (5animais/grupo/experimento) e o material foi processado para imunohistoquímica, Western blotting, microscopia de luz e de transmissão (MET). Além disso, a avaliação motora dos animais também foi investigada por meio do índice funcional do nervo isquiático. Secções da medula espinal de camundongos sem lesão foram também utilizados para análise de sobrevivência neuronal e presença de apoptose por TUNEL e imunomarcação para caspase 3. Camundongos neonatos foram utilizados para os experimentos com cultura primária de astrócitos. A ausência do IFN? nos animais mutantes levou à redução da expressão de MHC I após uma semana de lesão. Os motoneurônios encontrados no corno ventral destes animais exibiram menor tamanho do soma e maior número de células degeneradas comparado aos animais selvagens. A perda neuronal não foi agravada pela axotomia do nervo isquiático nos animais mutantes. A morte por apoptose foi sugerida baseado nos resultados positivos para TUNEL e caspase 3. A análise ultraestrutural mostrou menor retração de terminais sinápticos nos animais mutantes uma semana após lesão periférica. Além disso, a ausência do IFN? não prejudicou a recuperação motora dos animais mutantes. Em cultura, os astrócitos dos animais mutantes mostraram um atraso na taxa de proliferação provavelmente em razão da ausência do IFN?. Com base nestes resultados, sugerimos que o IFN? pode exercer um papel neuroprotetor e que sua ausência resulta na morte neuronal, a qual não é agravada pela lesão periférica. / Abstract: In the spinal cord, the establishment of synapses is probably coordinated by the neurons. However, the glial cells and surrounding microenvironment formed between neurons/glia play an important role in modulating neural excitability, influencing the transmission and synaptic plasticity. In situations of injury or inflammation, there is an increase in glial reactivity and changes in functional status of neurons, with a consequent cascade of events aimed at restoration of homeostasis. In this regard, IFN? is involved in regulating the expression of MHC I, which has recently been shown to play an important role in the synaptic plasticity processes following axotomy. Also, there is evidence that IFN? absence on spinal cord neurons after injury. The aim of this study was to investigate the phenomena of synaptic plasticity and glial reactivity in mice mutant for IFN? in order to analyze the dynamics of spinal synapses after injury of the sciatic nerve in animals unable to regulate the expression of MHC I due the absence of IFN?. In this sense, mutant mice for IFN? and wild type C57BL/6J were subjected to unilateral transection or crushing of the sciatic nerve (5animals/group/experiment), and the specimens were processed for immunohistochemistry, Western blotting, light and transmission electron microscopy (TEM). In addition, the motor evaluation of the mice was investigated by the sciatic functional index. Spinal cord sections from non-lesioned animals were also used to investigate neuronal survival and the presence of apoptosis with TUNEL and caspase 3 immunostaining. Astrocytes from mutant and wild type newborn mice were also investigated in primary cell culture. The absence of IFN? in the mutant animals produced reduced expression of MHC I after one week from injury. Motoneurons in the lower lumbar ventral horn exhibited a smaller soma size and increased number of degenerated cells?when compared to wild type mice. Sciatic nerve axotomy did not further aggravate the neuronal loss in the mutant mice. Apoptotic death is suggested on TUNEL and caspase 3 positive immunostaining. The electron microscopy showed a smaller retraction of pre-synaptic terminals apposing to motoneurons in mutant mice one week after lesion. The absence of IFN? did not impair motor recovery of the mutant animals. In culture, astrocytes from mutant animals showed a delay in the rate of proliferation probably due to the absence of IFN?. Altogether, these results suggest that IFN? may be neuroprotective and its absence results in neuronal death, which is not further increased by peripheral axotomy. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Fernando Lopes Gonçales Junior, Neiva Sellan Lopes Lopes Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T09:07:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Corghi_DanielaBrambila_M.pdf: 459057 bytes, checksum: 1b987bc8d3a81c9e46ae85afcfc30e75 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A hepatite pelo vírus C (HVC) é uma doença amplamente disseminada e de curso geralmente insidioso. Considera-se que 50 a 80% dos indivíduos com HVC aguda evoluirão para cronicidade. Cerca de 50% vão necessitar tratamento específico com algum tipo de interferon combinado, ou não, à ribavirina. O principal objetivo do tratamento da HVC crônica é obter-se uma resposta virológica sustentada (RVS). O interesse no estudo da hepatite C e alelos HLA classe II (loci DRB1 e DQB1) se deve ao fato de o Sistema HLA apresentar associação com várias patologias. Foram estudados 102 pacientes etnicamente miscigenados, não-aparentados, infectados pelo vírus da hepatite C (VHC), com anti-HIV e HBsAg negativos atendidos no Hospital das Clínicas da UNICAMP. Foi possível determinar o genótipo do VHC em 98 indivíduos e realizou-se a biópsia hepática em 83 pacientes. A genotipagem dos alelos HLA classe II (loci DRB1 e DQB1) foi realizada nos 102 pacientes pela técnica de PCR-SSP de baixa resolução. Os 102 pacientes foram tratados com IFN isolado ou associado à ribavirina ou PEG-IFN associado à ribavirina por 6 ou 12 meses de acordo com o genótipo do VHC. Destes 102, 51% dos pacientes apresentaram RVS ao tratamento. Correlacionando-se a presença dos alelos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 com o genótipo do VHC e resposta virológica observou-se associação entre menor porcentual de RVS com a presença dos alelos HLA-DQB1*03 e HLA-DQB1*06 em pacientes infectados pelo genótipo 3. Observou-se associação entre a presença do alelo HLA-DRB1*04 e maior freqüência de cirrose hepática nos pacientes com HVC crônica. Encontrou-se uma freqüência 2,7 vezes maior do alelo HLA-DRB1*07 nos indivíduos infectados pelo VHC do que na população geral. Observamos associação estatisticamente significante entre a presença do alelo HLA-DQB1*02 e infecção pelo VHC quando comparado ao grupo controle. Houve concomitância da presença dos alelos HLA-DRB1*13 e HLA-DQB1*02 nos pacientes que não apresentaram RVS. Não encontramos associação entre presença dos alelos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 quando comparamos pacientes com RVS e pacientes sem RVS. Este trabalho permitiu estabelecer relações entre o Sistema HLA e a hepatite C em pacientes brasileiros / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) infection becomes chronic in most cases, with only 10-20% of those infected not developing persistent viraemia. The knowledge of host factors that influence the course of the disease is still limited. The immune response to HCV may be an important determinant of disease resolution and can be influence by a number of host factors. We investigated the distribution of HLA class II alleles in patients with chronic hepatitis C using a low-resolution PCR-sequence-specific-primer method to assess whether MHC class II alleles are associated with HCV infection and with their response to interferon therapy. One hundred and two unrelated white Brazilian patients with confirmed chronic HCV infection were included in this study. Fifty-two patients with sustained viral response after therapy (responder) and 50 patients without sustained viral response (non-responder) after completion of therapy were included in this study. The HLA-DRB1*07 allele was significantly more frequent in chronic hepatitis C patients than in controls. The higher frequencies of HLA-DRB1*13 and HLA-DQB1*02 in these patients were not significantly different after P correction. There was no significant difference between the phenotype frequencies of HLA-DRB1 and HLA-DQB1 alleles in responder with non-responder patients. We found that HLA-DRB1*07 is associated with chronic HCV infection / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:59:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanon_RenataGraciele_D.pdf: 7966608 bytes, checksum: 79a55fb4c6226868859fa3daefc0adb2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) é uma molécula originalmente do Sistema Imunológico. A presença desses elementos no Sistema Nervoso Central (SNC) parece estar relacionada a diferentes funções, apresentando papel importante no refinamento sináptico durante o desenvolvimento do SNC e sendo fundamental no processo de eliminação sináptica após uma lesão nervosa no adulto. No intuito de investigarmos os processos de plasticidade sináptica e reatividade glial no microambiente da medula espinal foram utilizados dois imunomoduladores empregados no tratamento da Esclerose Múltipla, o interferon beta (IFN beta) e o acetato de glatirâmer (AG). O IFN beta, potencialmente capaz de influenciar a expressão de MHC I, foi utilizado in vivo, juntamente com axotomia periférica e in vitro, enquanto o AG foi utilizado para testes in vitro. Para tanto, camundongos C57BL/6J foram tratados com 10.000 UI de IFN beta durante 2 semanas, antes e depois da transecção unilateral do nervo isquiático. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e suas medulas espinais lombares processadas para imunohistoquímica (anti-MHC I, sinaptofisina, GFAP - glial fibrillary acidc protein, ezrina e iba1), hibridação in situ (sondas para GFAP e microglobulina beta-2), Western blotting (GFAP e MHC I) e microscopia eletrônica de transmissão. Grupos axotomizados, placebo e não tratado foram utilizados como controles. Adicionalmente ao estudo in vivo, foram estabelecidas culturas purificadas de astrócitos para o tratamento com diferentes doses de IFN beta (0, 100, 500 ou 1000 UI/ml) ou AG (0, 1.2, 2.5 ou 5.0µg/ml) durante 5 dias. As culturas tratadas com IFN beta foram submetidas à imunohistoquímica para MHC I, ezrina, GFAP, enquanto nas culturas tratadas com AG foi realizado o estudo para verificar a reatividade e proliferação através da marcação anti-GFAP e DAPI (para identificação dos núcleos das células). In vivo, os resultados mostraram um aumento do RNAm e da expressão protéica para MHC I após axotomia, sendo que este incremento foi maior no grupo tratado com INF. Observou-se a intensificação da expressão das proteínas que expressam a reatividade astrocitária, GFAP e ezrina, concomitantemente à diminuição da imunomarcação para sinaptofisina, especialmente no grupo tratado. O tratamento realizado não influenciou a reatividade da microglia. A análise do material in vitro também mostrou, após o tratamento com IFN beta, um aumento da expressão de MHC I e GFAP, bem como de ezrina. As doses que mais estimularam a elevação da expressão dos marcadores estudados foram as de 500 e 1000 UI/ml. Dado que não ocorreu para o tratamento com o acetato de glatirâmer. Assim, o tratamento com AG não alterou o nível de reatividade astrocitária, apesar de estimular a proliferação celular. A ultraestrutura das sinapses mostrou uma intensa retração dos terminais pré-sinápticos em contato com os motoneurônios alfa, induzida pela axotomia mais o tratamento com IFN beta. Em conjunto, esses resultados reforçam a importância da expressão de moléculas de MHC I em resposta à lesão nervosa e seu papel como mecanismo de comunicação entre neurônio e glia, além de reafirmar que os astrócitos são elementos ativos no processo de plasticidade sináptica. / Abstract: The class I main histocompatibility complex (MHC I) is a molecule originally restricted to Immune System. The presence of such element in the Central Nervous System (CNS) may indicate other functions, including an important role in the synaptic refinement during the development of the CNS as well as in the synaptic elimination process after a peripheral nerve injury in the adult. To investigate the synaptic plasticity and glial reactivity in the spinal cord, two immunomodulators, widely used for treating Multiple Sclerosis, were applied, namely the Interferon beta (IFN beta) and the glatiramer acetate (GA). The IFN beta was used in order to upregulate the MHC I expression in vivo, after a peripheral axotomy, and also in vitro. GA treatment was only used for in vitro experiments. C57BL/6J mice were injected with 10,000 IU of IFN beta for 2 weeks, before and after the nerve transection. The animals were sacrificed and the lumbar spinal cords were processed for immunohistochemistry (MHC I, synapthophysin, GFAP, ezrin and Iba-1 antisera), in situ hybridization (beta 2 immunoglobulin, a component of the MHC I molecule, and GFAP), Western blotting (GFAP and MHC I) and transmission electron microscopy. Placebo and non-treated axotomized groups were used as controls. Additionally to the in vivo study, primary cultures of astrocytes were established and treated during five consecutive days with different doses of IFN beta (0, 100 IU, 500 IU and 1000 IU/ml). In this case, some cultures were treated with GA (0, 1.2, 2,5 and 5.0 µg/ml). INF treated cultures were processed for immunocitochemistry (MHC I, GFAP and ezrin antisera). GA treated cultures were evaluated with anti-GFAP antibody and cell proliferation was accessed with DAPI staining. In vivo, the results showed an upregulation of MHC I mRNA and protein expression after axotomy, that was stronger in the IFN treated group. We observed a greater GFAP and ezrin expression, coupled with a decrease of synapthophysin immunoreactivity. Such alterations were more evident in the IFN treated group. Interestingly, the IFN beta treatment did not interfere in the microglial reactivity. The in vitro analysis also showed a sharp upregulation of MHC I, GFAP and ezrin, mostly when the cultures were subjected to 500 and 1000 IU/ml of IFN beta. Regarding the GA treatment, the results showed that treatment did not change the level of astroglial reactivity despite stimulating cellular proliferation. The ultrastructural analysis of synapses showed a larger pruning of presynaptic terminals in contact with alpha motoneurons, induced by axotomy plus IFN beta treatment. Together, our results reinforce the importance of the MHC I expression as a response to nerve injury and its role as a communication mechanism between neurons and surrounding glial cells. Furthermore, the present data confirm that astrocytes are active elements during the synaptic plasticity process. / Doutorado / Anatomia / Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Manoel Barros Bertolo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T03:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pina_FabianaPompeode_M.pdf: 947949 bytes, checksum: 7e9310579d25142d2d37758ff60f7796 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A associação de antígenos de histocompatibilidade com a Artrite Reumatóide (AR) vem sendo demonstrada em inúmeros estudos. No entanto, a avaliação em populações afro-descendentes ainda foi pouco estudada. Os propósitos deste estudo foram os de determinar a freqüência dos alelos HLA-DRB1 e as contribuições do polimorfismo desses alelos na susceptibilidade da AR na população afrobrasileira. Este estudo avaliou também, se a teoria do epitopo semelhante (SE) e o modelo de proteção da Artrite Reumatóide (RAP Model) se aplicam aos pacientes afro-brasileiros com AR. Os alelos HLA-DRB1 de 72 pacientes afro-brasileiros com AR, diagnosticados pelos critérios do American College of Rheumatology (ACR), e de 75 indivíduos saudáveis foram tipados e subtipados utilizando-se a técnica de reação em cadeia de polimerase de DNA amplificado hibridizado, com seqüência de primers específicos de alta e baixa resolução, e depois comparados. Os alelos HLADRB1 *0404 e *0405 apresentaram freqüência maior nos pacientes do que no grupo controle. Já, alelo HLA-DRB1*0102 apresentou uma freqüência aumentada no grupo controle (9,3%), quando comparada com a freqüência nos pacientes. Os alelos DRB1 considerados como pertencentes ao grupo do epitopo semelhante estavam presentes em 39 pacientes (54,2%) e em 20 controles (26,7%), indicando que teoria do epitopo semelhante se aplica à população afro-brasileira com Artrite Reumatóide. Os alelos HLA-DRB1 que apresentavam a sequência DERAA (alelos protetores) reduziram, de forma independente, o risco de desenvolver AR. Os dados obtidos apontam para uma intensa miscigenação racial presente no Brasil. Assim, como nos faz concluir que a susceptibilidade da Artrite Reumatóide em afro-brasileiros é, provavelmente, mediada pela interação de fatores genéticos e étnicos / Abstract: The association of histocompatibility antigens with Rheumatoid Arthritis (RA) comes being demonstrated in innumerable studies. However, the evaluation in afrodescendents populations still little was studied. The aim of this study has been to determine the frequency of HLA-DRB1 alleles, and the contributions of the polymorphism of these alleles in the susceptibility of RA in the Afro-Brazilian population as well. This study, also evaluated, if the theory of the shared epitope (SE) and the model of protection of the Rheumatoid Arthritis (RAP Model) can also be applied to the Afro-Brazilian patients suffering RA. The HLA-DRB1 alleles in 72 Afro-Brazilian patients suffering RA, diagnosed in accordance to the criteria of the American College of Rheumatology (ACR), and of 75 healthful volunteers had been typed and sub-typed using the technique of the polymerase chain reaction of the amplified hybridized DNA, with specific sequence of primers of high and low resolution, were then compared. The HLA-DRB1 *0404 and *0405 alleles had presented higher frequency in the patients group than in the control group. The HLADRB1 *0102 alleles presented a frequency increased (9,3%) in the control group, when compared with the patients group. The DRB1 alleles considered as pertaining to the group of shared epitope were present in 39 patients (54.2%) and in 20 members of the control group(26.7%), indicating that the theory of the shared epitope it is also applied to the Afro-Brazilian population with Rheumatoid Arthritis. The HLADRB1 alleles that presented DERAA sequence (protectors alleles), had reduced, of independent form, the risk to develop RA. The gotten data point to an intense racial miscegenation in Brazil. Thus, as in it makes them to conclude that the susceptibility of the Rheumatic Arthritis in Afro-Brazilian is, probably, determined by the interaction of genetic and ethnic factors / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T03:01:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SabhaJunior_MarioJoseJorge_D.pdf: 14971588 bytes, checksum: 25740c7d964d2a5c4eb70c84cb462b08 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o estabelecimento das redes nervosas que compõem o Sistema Nervoso Central (SNC) é um processo imensamente complexo dependente, não somente da formação de novos pontos de comunicação, as sinapses, mas também da eliminação de sinapses supranumerárias ou incorretas durante o desenvolvimento. Recentemente, foi descrito um mecanismo demonstrando que a ausência da expressão do complexo de histocompatibilidade principal (MHC classe I) no SNC, diminui a remoção de conexões sinápticas extranumerárias durante o desenvolvimento e aumenta a retração sináptica no animal adulto. Interessantemente, a transecção do axônio induz uma extensa retração dos terminais pré-sinápticos da superfície do corpo celular e dendritos dos neurônios axotomizados. No presente trabalho, investigamos as alterações sinaptológicas nos motoneurônios alfa da intumescência lombar em três linhagens de camundongos isogênicos (C57BL/6J, A/J e Balb/cJ), após 1 e 3 semanas da transecção do nervo ciático. Nesse sentido, estudamos a cobertura sináptica dos corpos celulares dos motoneurônios após a lesão. Foram utilizadas medulas espinhais de camundongos machos adultos, as quais foram processadas e analisadas para imunohistoquímica (lH) e microscopia eletrônica de transmissão . (MET). Para IH, foram utilizados anticorpos anti-MHC e anti-sinaptofisina conjugados com anticorpos secundários CY-2 ou CY-3 e analisados em microscópio confocal. Os resultados mostraram aumento significativo da expressão de MHC I na linhagem AIJ, comparativamente à Balb/cJ e C57BL/6J, 1 semana após axotomia. Contudo, mostraram níveis similares de expressão desta molécula 3 semanas após axotomia. Adicionalmente, observamos uma diminuição significativa da expressão de sinaptofisina na linhagem AIJ, após 1 semana da transecção do nervo ciático. Após 3 semanas da lesão nervosa, todas as linhagens, apresentaram níveis similares de expressão de sinaptofisina. Os resultados da MET, após 1 semana da transecção do nervo ciático, mostraram menor cobertura sináptica na linhagem A/J, comparada à Balb/cJ e C57BL/6J. Contudo, 3 semanas após a lesão a linhagem C57BL/6J apresentou menor cobertura sináptica, enquanto AIJ e Balb/cJ recuperam suas aferências. Concluímos que a expressão de MHC I influencia o processo de eliminação sináptica e, possivelmente contribui para o potencial regenerativo dos neurônios axotomizados / Abstract: The wiring of the Central Nervous System (CNS) is an immensely complex process, not only dependent on new communication points, the synapses, but also on the elimination of exuberant or inappropriate synapses during development. Earlier studies have shown that the abscence of class I major histocompatibility complex (class I MHC) in the CNS decreases synaptic elimination during CNS development and increases synaptic retraction in adult. Thus, an axon transection has been shown to induce an extensive detachment of presynaptic terminais from perikarya and dendrites ofaxotomized neurons. In the present work, we investigated synaptological changes in alpha motoneurons from lumbar intumescence in three mice isogenic strains (C57/BL6J, AIJ and Balb/cJ), 1 and 3 weeks after sciatic nerve transection. For this purpose we studied ultrastructurally the synaptic covering of the cell soma of sciatic motoneurons after the lesion. Therefore, spinal cords from adult male mice were processed for transmission electron microscopy (TEM) and imunohistochemistry (IH). For IH, anti-MHC I and anti-synaptofisin antibodies were used, conjugated with CY2 or CY3 secondary antibodies and analyzed with a confocal microscope. The results showed a significant increased expression of MHC I in AIJ strain in comparison to Balb/cJ and C57BL/6J, 1 week after axotomy. Nevertheless, the immunoreactivity levels of this molecule 3 weeks after axotomy did not differ among the studied mice strains. Additionally, a conspicuous decrease of synaptofisin expression in A/J mice was observed 1 week after sciatic transection. Similarly to the MHC I immunolabelirlg, 3 weeks after lesion, ali mice strains showed similar levels of synaptofisin expression. The results from TEM 1 week after lesion showed a lower synaptic covering in AIJ mice in comparison to Balb/cJ and C57BL/6J, although 3 weeks after axotomy C57BL/6J displayed a lower synaptic covering, while AIJ and Balb/cJ strains recovered their afferents, We conclude that the levei of MHC I expression influences the synaptic elimination process and possibly contributes to the regenerative potencial of the axotomized neurons / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

O requisito fundamental na seleção do par doador-receptor em Transplantes de Medula Óssea (TMO) é regido pelo sistema do Complexo Principal de Histocompatibilidade, ou seja, pelos mecanismos imunológicos mediados pelas moléculas dos Antígenos Leucocitários Humanos (HLA). No entanto as incompatibilidades HLA, podem influenciar de forma negativa ou positiva os resultados dos transplantes, através da Doença do Enxerto versus Hospedeiro e o efeito do enxerto versus Leucemia (EvL) respectivamente. Ainda é desconhecido o impacto do locus HLA-DPB1* neste contexto. Assim o presente projeto tem como objetivo a avaliação do impacto do HLA-DPB1* em transplantes de pacientes consanguíneos e a ocorrência de DECH. Para a tal finalidade, tipificamos o locus em questão utilizando a metodologia PCR-SSO, onde após a reação de amplificação da cadeia pela polimerase, realizamos a hibridização com uma sequência específica de oligonucleotídeos para tipificação do Loco HLA-DPB1*. Foram analisadas 826 amostras, sendo 413 pares de receptores e seus respectivos doadores familiares, submetidos a Transplantes de Células Tronco Hematopoiéticas, realizados na Unidade de Transplante de Medula Óssea de Curitiba da Universidade Federal do Paraná e da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- USP. Observou-se que a presença de incompatibilidades HLA-DPB1* aumentam a chance dos receptores desenvolverem a doença do enxerto versus hospedeiro aguda, em graus mais graves. Assim, concluímos que a avaliação deste loco pode prevenir esta doença, e caso não haja outro doador, alerta o clínico quanto à utilização de medidas profiláticas. / The key requirement in the selection of the receptor-donor pair for bone marrow transplant is is defined by the Major Histocompatibility Complex, or by immunologic mechanisms mediated by molecules of the Human Leukocyte Antigens (HLA). However the post transplant complications due to HLA mismatches, as Graft versus Host Disease (GVHD) and graft failure are fundamental to the success of these transplants. Still unknown is the impact of loci HLA DPB1*, so this project aims to assess the impact of HLA - DPB1* in transplant patients consanguineous and assessing the impact of incompatibilities in HLA - DPB1 * GVHD. For this purpose, analyzed the loco in question using the PCR-SSO method, where after the amplification reaction polymerase chain, we performed hybridization with a sequence -specific primers for typing of HLA - DPB1* Loco. We analyzed 826 samples, 413 pairs of recipients and their respective donors, patients undergoing Hematopoietic Stem Cell Transplants performed in the Unit for Bone Marrow Transplantation in Curitiba, Federal University of Paraná and the Faculty of Medicine of Ribeirão Preto - USP. It was observed that the presence of mismatches HLA- DPB1* increase the chance of recipients develop chronic graft versus host disease, in more severe degrees. Thus, we conclude that the evaluation of this loci can prevent this disease and if no other donors alert the clinician to the use of prophylactic measures.