L’immunologie anti-tumorale et l’immunothérapie ont connu dernièrement de grandes avancées avec la mise en évidence du processus d’immuno-surveillance et le développement de plusieurs approches vaccinales. Il n’en demeure pas moins que l’induction d’une réponse immunitaire anti-tumorale se traduit peu par l’éradication de la tumeur. Comme phénomène dynamique et interactif, la réponse cytotoxique anti-tumorale implique les effecteurs cytotoxiques et les cibles tumorales; pourtant, le microenvironnement tumoral et sa plasticité influent largement sur l’efficacité de celle-là. Avec l’appui de récentes données expérimentales, il apparaît crucial de prendre en compte la susceptibilité tumorale à la lyse par les effecteurs cytotoxiques anti-tumoraux, notamment les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs), et plus particulièrement dans un contexte de plasticité cellulaire. Ainsi, le principal objectif de mes travaux de thèse est de saisir le rôle de la Transition Épithélio-Mésenchymateuse (EMT) dans la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les CTLs dans des modèles cellulaires de cancer du sein. Nos résultats montrent que l’EMT est capable d’induire une diminution de la susceptibilité des cellules mésenchymateuses à la lyse spécifique. Elle engage de ce fait de multiples acteurs. Tout d’abord, dans les deux modèles d’étude, il s’avère que l’EMT est capable de réguler négativement l’expression de la molécule HLA-A2. Ensuite, dans le premier modèle expérimental, nous avons établi que l’EMT induit une altération de la signalisation au niveau de la synapse immunologique. De plus, le régulateur de l’autophagie, Becline 1, joue un rôle crucial dans l’induction de la diminution de la sensibilité à la lyse par les lymphocytes T-CD8+ suite à l’induction de l’EMT. Dans le deuxième modèle d’étude, le mécanisme mis en jeu par l’EMT pour réguler la susceptibilité des cellules mésenchymateuses à la lyse par les CTLs se manifeste dans l’induction du facteur de transcription inducteur des propriétés de cellules souches cancéreuses, le KLF4 ainsi que via la régulation négative de l’expression du miR-7. Ensemble, ces résultats élucident de nouveaux mécanismes d’échappement des cellules tumorales malignes à la lyse par les lymphocytes T-CD8+ suite à l’induction de l’EMT. Cette étude soutient ainsi l’importance du ciblage des facteurs de transcription inducteurs de l’EMT et responsables de la plasticité cellulaire afin de neutraliser leur fonction. Cela pourrait aider à construire une nouvelle stratégie pour mieux contrôler l’échappement des cellules tumorales invasives à la lyse spécifique et in fine pour garantir une immunothérapie plus efficace contre le cancer. / The anti-tumor immunology and immunotherapy have recently undergone major breakthroughs, with the identification of immune surveillance process and the development of several vaccine approaches. However, the fact remains that the induction of an antitumor immune response is still not effective enough. Certainly, the antitumor cytotoxic response is a dynamic and interactive phenomenon, involving cytotoxic effectors and tumor targets, but its effectiveness is considerably influenced by the tumor microenvironment and its plasticity. Recent studies support the importance of taking into account the tumor susceptibility to lysis by anti-tumor cytotoxic effectors, notably Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs), especially in a context of cellular plasticity. On the grounds of these studies, this research aims at understanding the role of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) in the susceptibility of tumor cells to CTLs mediated lysis in different models of breast cell carcinoma. Our results reveal that EMT is able to induce a decrease in the susceptibility of mesenchymal cells to specific lysis. It calls therefore multiple actors. First, in both study models, it turns out that the EMT is able to downregulate the expression of HLA-A2 molecule. Then, in the first experimental model, we show that EMT induces an alteration of signalling at the immunological synapse. Moreover, the regulator of autophagy, Beclin 1, plays a crucial role in the induction of reduced susceptibility to lysis by T-CD8+ lymphocytes following induction of EMT. In the second experimental model, we show that the mechanisms used by EMT to regulate the susceptibility of mesenchymal cells to lysis by CTLs involve the induction of the transcription factor inducing cancer stem cells properties, KLF4, as well as the downregulation of miR-7 expression. Together, these results shed light on new mechanisms used by malignant tumor cells to escape to lysis by T-CD8+ lymphocytes following the induction of EMT. Thus, this study advocates the importance of targeting transcription factors, which are inducers of EMT and responsible for cellular plasticity, in order to neutralize their function. These insights may prove useful for the development of new strategies aimed at better controlling the escape of invasive tumor cells to specific lysis, and ultimately ensuring a more effective immunotherapy against cancer.

Genetic as well as environmental factors are believed to be of importance in the etiology of rheumatoid arthritis (RA). There are a number of previous studies of genetic markers in RA, but so far no genetic linkage and only a few associations have been found. Of the associations only one (with the HLA antigen DR4) appears to be well documented. In most previous association studies the patients have not been divided according to sex and family history of RA. In this investigation the HLA antigens A, B and DR and five serum protein systems (Bf, C3, Pi, Hp and Tf) were studied in patients with erosive rheumatoid arthritis (RA), from northern Sweden. Special attention was paid to variations in the strength of associations accord­ing to sex and family history of polyarthritis. The following results were found:  The frequency of the HLA antigen B27 was significantly increased in the North-Swedish population (16.6%) and among patients with a family history of polyarthritis (42.6%). In agree­ment with previous investigations a significantly increased frequency of the DR4 antigen was found in the RA patients.  In the properdin factor B (Bf) system the S phenotype was found to be significantly in­creased in male patients and in patients with a family history of polyarthritis, more severe form of RA and high titres of rheumatoid factor.  No significant differences with respect to phenotype or gene frequencies were found in the C3 complement system. Thus, the association between RA and C3 found in previous investiga­tions was not confirmed.  A significant increase of rare alpha-1-antitrypsin (Pi) types (MS, MZ, MF and SZ) was found among RA patients. However, the increase concerned mainly Z heterozygotes and was more strongly pronounced among male patients.  In the haptoglobin system a significant increase of the Hp^ gene and the Hp2-2 type was found among patients with a family history of polyarthritis, more pronounced among males.  A significant increase of the transferrin gene and of the 2 type was found among male RA patients, more pronounced among patients with a family history of polyarthritis. In 6 out of 8 gene loci studied significant associations were found, which is in agreement with a multifactorial etiology of RA. The results were largely in agreement with the hypothesis that associations would be expected to be stronger in males and in patients with a family history of polyarthritis. A notable finding was the high frequency of first degree relatives (around 40%) with symmetric peripheral polyarthritis of which more than 70% had a diagnosis of RA verified by hospital records. / <p>Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 1985, härtill 6 uppsatser.</p> / digitalisering@umu

Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Cláudio Tadeu Daniel Ribeiro / Banca: Érika Martins Braga / Banca: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Érika Cristina Pavarino Bertelli / Resumo: O presente estudo avaliou a resposta de anticorpos contra diferentes antígenos de merozoíto e esporozoíto de Plasmodium vivax, relacionando com as variantes da porção repetitiva do domínio central do gene da Proteína Circunsporozoítica (CSP) do parasito (VK210, VK247 e P. vivax-like) e com os polimorfismos do HLA-DRB1 no hospedeiro humano. A resposta de anticorpos foi avaliada para peptídeos das regiões conservadas e centrais variáveis da CSP, da porção N-terminal da Proteína de Superfície do Merozoíto 1-MSP1 (Pv200L), e recombinante do Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) e a Proteína de ligação ao Duffy (DBP) por ELISA, em amostras de plasma de pacientes naturalmente infectados com P. vivax. Inicialmente nós avaliamos a distribuição destas variantes da CSP em cinco diferentes áreas da Amazônia a fim de entender sua atual dinâmica de transmissão. A variante VK210 continua sendo a mais prevalente em todas as áreas estudadas. No entanto, pela primeira vez documentamos a presença das variantes VK247 e P. vivax-like como infecções simples na Amazônia brasileira evidenciando um novo perfil distribuição destas, o que possa sugerir um processo de adaptação das mesmas. Quando comparamos a resposta de anticorpos e a infecção pelas variantes de P. vivax, não foram observadas associações significativas entre a presença de determinada variante da CSP e a freqüência de resposta de anticorpos contra os três peptídeos do merozoíto analisados, MSP1 (Pv200L), AMA-1 e DBP e nem contra as frações conservadas da CSP no esporozíto, N-terminal [N] e C-terminal [C]. A falta de associações significativas entre resposta sorológica contra esses peptídeos fornece informações promissoras quanto à utilização destes antígenos para o desenvolvimento de uma vacina contra malária. Todavia, a variação na porção central da CSP deve ser considerada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study evaluated the antibody response against merozoite and sporozoite antigens of Plasmodium vivax and its relationship with the variants of the repetitive central region of the gene for Circunsporozoite protein (CSP) in parasite (VK210, VK247 and P. vivax-like) and, with the HLA-DRB1 polymorphisms in human host. The antibody response to synthetic peptides of the CSP conserved and variable regions and of the N-terminal portion of Merozoite surface protein - MSP1 (Pv200L), and, to recombinants peptides of the Apical Membrane Antige 1 (AMA-1) and of the Duffy Binding Protein (DBP) was evaluable by ELISA in plasma samples of malaria patients naturally infected with P. vivax. Firstly, we evaluated the CSP variants distribution among five different areas from Brazilian Amazon, in order to understand their current dynamic of transmissions. VK210 variant remains the most prevalent in all study areas. However, it is the first detection of VK247 e P. vivax-like variants as simple infection in the Brazilian Amazon, showing a new distribution profile, which may suggest an adaptation process of them. When comparing the antibody response and infection by variants of P. vivax, there were no significant associations between the presence of particular CSP variant and the frequency of antibody response against all three merozoite peptides analyzed, MSP1 (Pv200L), AMA-1, DBP and against the CSP conserved fractions in the sporozoite, N-terminal and C-terminal. The lack of significant associations among immune response against these peptides provides promising information regarding the use of these antigens for malaria vaccine development. On the other hand, the central variability of CSP should be considered to employment of this region as an immunogen, since the antibody response appears to be variant-specific. In order to evaluate the polymorphisms... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: A relevância clínica da presença de anticorpos anti-HLA após o transplante renal tem sido foco de recente atenção para os estudiosos da histocompatibilidade. Pacientes que possuem anticorpos anti-HLA no póstransplante apresentam maior incidência de rejeição aguda (RA) e de nefropatia crônica do enxerto (NCE). Como conseqüência, alguns perdem o órgão transplantado ou sofrem com as reações imunopatológicas correspondentes. Entretanto, existem algumas controvérsias sobre o grau de valorização da presença desses anticorpos na etiopatogenia da RA e da NCE, pois nem todos os pacientes com anticorpos evoluem mal. Objetivo: Avaliar a presença de anticorpos anti-HLA no primeiro ano do transplante renal e verificar sua associação com a ocorrência de RA e NCE. Pacientes e Método: Este estudo incluiu consecutivamente 88 pacientes submetidos a transplante renal no Serviço de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, entre outubro de 2002 a outubro de 2004. Amostras de sangue foram colhidas no 1º, 3º, 6º e 12º meses pós-transplante renal, visando à pesquisa de anticorpos IgG anti-HLA de classes I e II. Nos pacientes que consentiram, biópsias renais de protocolo foram realizadas entre o 2º e o 3º mês e no 12º mês póstransplante. A detecção dos anticorpos foi realizada através de ensaio ELISA (LATM e LAT-1240, One Lambda Inc., USA). Rejeição aguda e a NCE foram diagnosticadas por critérios clínicos, laboratoriais e histopatológicos. Resultados: Oitenta e oito pacientes foram avaliados, sendo 40 (45,5%) do sexo feminino e setenta e dois (81,8%) de etnia caucasóide. Setenta e um (80,6%) receberam rins de doador falecido. Foi detectada a presença de anticorpos anti-HLA em vinte pacientes (22,7%). Desses, somente 3 (4,4%) desenvolveram anticorpos anti-HLA (classe I) no período pós-transplante; os demais (17) já os apresentavam no período prétransplante. No seguimento até um ano, 23 pacientes (26,1%) apresentaram RA e 43 (51,2%) desenvolveram NCE. Nove (45%) pacientes com anticorpos no póstransplante desenvolveram RA contra 14 (20,6%) dos sem anticorpos (P=0,058). Entre os pacientes com anticorpos no pós-transplante, 11 (64,7%) desenvolveram NCE contra 32 (47,8%) dos sem anticorpos (P=0,329). Na análise histológica, os anticorpos anti-HLA foram associados à RA IIA (P=0,001) e à NCE grau II (P= 0,012). As variáveis preditoras para a RA e NCE foram, respectivamente, presença de anticorpos anti-HLA de classe I no 1º mês pós-transplante (OR= 4,30; IC 95%= 1,32-14,1; P= 0,016) e transplante com órgão de doador-limítrofe (OR= 4,81; IC 95%= 1,18-20,3; P= 0,028). Setenta por cento (70%) dos pacientes com RA desenvolveram NCE, contra 45,3% dos pacientes sem RA (P= 0,054). Conclusão: Os anticorpos anti-HLA presentes no primeiro ano do transplante renal foram associados a RA e NCE. A pesquisa de anticorpos anti-HLA no pós-transplante renal realizada por outros pesquisadores e aqui também avaliada, se adotada como rotina, possibilitaria a identificação de casos de mau prognóstico e a escolha de planos terapêuticos mais adequados. A correlação entre anticorpos anti-HLA e rejeição deverá se tornar mais evidente com o passar dos anos, sendo que nossos resultados fortalecem a convicção da necessidade de continuidade desses estudos. / Introduction: The clinical relevance of the presence of anti-HLA antibodies following kidney transplant has been the recent focus of attention of histocompatibility researchers. Patients who present anti-HLA antibodies in the post-transplant period have shown higher incidence of acute rejection (AR) and of chronic allograft nephropathy (CAN). As a result, some lose the transplanted organ or suffer from the corresponding immunopathological reactions. However, there has been some controversy as to the importance of the presence of these antibodies in the ethiopathology of AR and CAN, since not all patients who have these antibodies present the same outcome. Objective: To evaluate the presence of anti-HLA antibodies during the first year of kidney transplantation and to check its association with the occurrence of AR and CAN. Patients and Method: This research included consecutively 88 patients who had undergone kidney transplants in the Hospital de Clínicas de Porto Alegre Nephrology Service between October 2002 and October 2004. Blood samples were taken during the 1st, 3rd, 6th and 12th months post kidney transplant, aiming at researching for Class I and II IgG anti-HLA antibodies. In consenting patients, protocol kidney biopsies were carried out between the 2nd and 3rd months and in the 12th month after the transplant. Detection of antibodies was done through ELISA test (LAT-M and LAT-1240, One Lambda Inc., USA). Acute rejection and CAN were diagnosed through clinical, laboratorial and histopathological criteria. Results: Eighty-eight patients were evaluated, among which 40 (45.5%) were female and seventy-two (81.8%) were Caucasian. Seventy-one (80.6%) received kidneys from deceased donors. The presence of anti-HLA antibodies was found in 20 patients (22.7%). Among these, only 3 (4.4%) developed anti-HLA antibodies (class I) during the post-transplant period; the remaining (17) already presented these antibodies during the pre-transplant period. In the follow-up up to one year, 23 patients (26.1%) presented AR and 43 (51.2%) developed CAN. Nine patients (45%) with antibodies in the post-transplant period developed AR as opposed to 14 (20.6%) patients without antibodies (P=0.058). Among the patients with antibodies in the post-transplant period, 11 (64.7%) developed CAN as opposed to 32 (47.8%) of those without antibodies (P=0.329). In the histological analysis, the anti-HLA antibodies were associated to AR IIA (P=0.001) and to CAN degree II (P= 0.012). The predictive variables for AR and CAN were, respectively, the presence of Class I anti-HLA antibodies in the first month post-transplant (OR= 4.30; IC 95%= 1.32-14.1; P= 0.016) and transplant with expanded criteria donors (OR= 4.81; IC 95%= 1.18-20.3; P= 0.028). Seventy per cent of the patients presenting AR developed CAN, as opposed to 45.3% of the patients without AR (P= 0.054). Conclusion: The anti-HLA antibodies present in the first year of the kidney transplant were associated to AR and CAN. The research of anti-HLA antibodies in the kidney post-transplant period carried by other researchers, as well as in this study, if done routinely, would allow the identification of cases with a poor prognosis and the choice of more adequate treatments. The correlation of anti-HLA antibodies and rejection will become more evident with time, and our results reinforce the certainty that these studies must continue.

Introdução: O polimorfismo de inserção/deleção de 14 pb no éxon 8 do gene HLA-G é uma variante funcional com propriedades anti-inflamatórias, que tem sido associada a melhores respostas à monoterapia ou ao tratamento combinado com metrotexato (MTX) em pacientes com artrite reumatóide (AR). Objetivo: Determinar se o polimorfismo de 14 pb do gene HLA-G está associado com maior suscetibilidade à doença, com características clínicas e como fator preditivo da resposta à terapia em pacientes portadores de AR tratados com uma estratégia de tratamento intensivo com MTX. Métodos: Uma coorte prospectiva composta de 309 pacientes consecutivos foi estabelecida entre Junho de 2007 e Dezembro de 2009. Controles caucasianos saudáveis da mesma área geográfica e antecedentes étnicos foram selecionados. Um subgrupo de 188 pacientes com AR anteriormente não submetidos a decisões terapêuticas baseadas em escores de atividade da doença e sem critérios de doença em remissão pelo CDAI (>2.8) foram incluídos na análise de resposta clínica ao MTX (baseada em estratégia intensiva) e seguidos por um período de 14 meses (±5.29). Pacientes e controles foram genotipados para o polimorfismo de 14 pb por PCR com primers específicos para o éxon 8 do gene HLA-G. Uma análise multivariada foi realizada para investigar o efeito da homozigose para a deleção no polimorfismo 14bp do HLA-G sobre as mudanças no DAS28. Resultados: Entre os 309 pacientes com AR (média de idade 60.6 ±12.4 anos), não foram observadas diferenças nas freqüências alélicas em relação às características clínicas, incluindo escores de atividade e funcionais. Também não foram observadas diferenças significativas nas freqüências genotípicas e alélicas entre pacientes com AR e controles. Na análise de resposta clínica do subgrupo de 188 pacientes, medianas e médias dos escores de atividade da doença melhoraram ao final do estudo (DAS28: 5.0 vs. 4.2, p<0.001; respectivamente). A média de incremento da dose de MTX comparado ao baseline foi respectivamente 14.7 mg ±4.8 vs. 17.4 mg ± 4.7 (p<0.001). Em análise multivariada, o modelo foi significativamente associado às mudanças no DAS28 (R2ajustado=0.353; p<0.001) ou seja os fatores clínicos incluídos na análise explicaram 35% da variação do DAS28. O modelo apontou os fatores estatisticamente significativos na predição de resposta: valor do DAS28 basal (R2 semi parcial =0.261; p<0.001), gênero (R2 semi parcial = 0.034; p=0.003) e a interação entre a homozigose da deleção para 14 pb e o uso do MTX (R2semi-parcial = 0.017; p=0.031) como fatores preditivos independentes de resposta. Na análise estratificada pela presença de homozigose para a deleção ou outros genótipos, houve uma tendência para maior variação no DAS28 nos pacientes que utilizaram MTX no subgrupo -/-14-bp HLA-G (-1.4±0.3 vs. -0.4±0.5; p=0,071), o que não foi observado entre outros genótipos (-1,1 ±0,2 vs. -1,3 ±0,4; p=0,496). Conclusão: A ocorrência de homozigose para deleção de 14 pb no gene HLA-G foi independentemente associada com melhor resposta ao MTX em uma coorte prospectiva de pacientes com AR. Os achados trazem à luz um promissor marcador genético que precisa ser replicado em coortes independentes maiores. Maior número de estudos são necessários para que se possa identificar perfis genéticos capazes de selecionar individualmente os pacientes mais propensos a respostas ótimas ao MTX. / Background: 14-bp insertion/deletion in exon 8 of the HLA-G gene is a potentially functional polymorphism that has been implicated in the response to MTX monotherapy or combination in rheumatoid arthritis (RA) patients. Objectives: We sought to determine whether the 14-bp insertion/deletion polymorphism in exon 8 of the HLA-G gene is associated with susceptibility to RA, clinical features, or response to MTX therapy. Methods: We determined the HLA-G 14-bp insertion/deletion polymorphism genotypes in a prospective cohort of 309 consecutive RA patients and 294 healthy controls, and looked for associations between genotype and clinical features of RA. Multivariate analyses were performed to investigate the effect of homozygosity for the -14/-14 bp genotype on changes in DAS28 in response to MTX therapy in a subgroup of 188 RA patients. Results: Among the 309 RA patients, no correlations were observed between allele or genotype frequencies of the HLA-G gene polymorphism and clinical features, including disease activity scores and functional scores. No significant differences were observed in the genotype and allele frequencies between RA patients and controls. In the subgroup evaluated for clinical response to MTX, we observed a decrease in mean DAS28 over the course of the study. Furthermore, a better response to MTX treatment, measured by adjusted mean of DAS28 change, was observed in those patients with the HLA-G -14/-14-bp genotype, which was not observed among other genotypes. Conclusion: Homozygosity for the 14 bp deletion polymorphism within exon 8 of the HLA-G gene was associated with a better response to MTX in a prospective cohort of patients with RA. This is a promising genetic marker for predicting response to MTX therapy in RA.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27 / Objetivos: O estudo teve como objetivo determinar a prevalência e a especificidade de anticorpos anti-HLA e a prevalência de anti-neutrófilos em doadoras de sangue brasileiras e avaliar o impacto da exclusão de doadoras multíparas positivas da doação de sangue. Métodos: Foram estudadas amostras de soro de 350 doadoras distribuídas em quatro grupos de acordo com o número de gestações que tiveram (50 nulíparas, 100 com uma gestação, 100 com duas gestações, e 100 multíparas). Para a pesquisa de anticorpos foi utilizada a metodologia do ELISA pelos kits LAT-M e LAT-1240 (One Lambda, Inc, EUA) que detectam e identificam anticorpos anti-HLA, classe I e II, respectivamente. Sessenta e cinco doadoras multíparas, com resultados positivos e negativos no ELISA também foram testadas pela metodologia do LABScreen (One Lambda, Inc, EUA) que fornece a especificidade de anticorpos anti-HLA. Além disso, foi utilizado o teste de Aglutinação de Granulócitos (GAT) e Imunofluorescência de Granulócitos (GIFT) para detectar anticorpos anti-neutrófilos específicos. Resultados: Oitenta doadoras das 350 mulheres estudadas (22,9%) foram positivas para anticorpos anti-HLA, sendo que 37% eram multíparas, 26% mulheres que tiveram duas gestações e 17% que tiveram uma gestação. Todas as amostras de doadoras nulíparas foram negativas para anti-HLA. A diferença de doadoras positivas em cada grupo foi estatisticamente significante na prevalência de anti-HLA entre o grupo de nulíparas e de doadoras que tiveram no mínimo uma gestação (p < 0,001). Os soros de doadoras positivas pelo teste LAT-M foram também testados pelo LAT-1240, e em sete casos os anticorpos não puderam ser identificados. Dezessete doadoras (28,3%), consideradas negativas pelo LAT-M, apresentaram resultados positivos pelo LABScreen. O GAT foi aplicado para investigação do soro de doadoras negativas para anti-HLA, sendo positivo em duas de 264 doadoras (0,8%). Entre as doadoras com GAT positivo uma entre 62 (1,6%) era multípara e uma doadora entre 71 (1,4%) teve duas gestações. O GIFT também foi aplicado para doadoras negativas para anti-HLA e apresentou positividade em quatro mulheres de 264 (1,5%), sendo que duas entre 62 (3,2%) eram multíparas e duas entre 71 (2,8%) tiveram duas gestações. Conclusões: Anticorpos anti-HLA são encontrados freqüentemente em plasma de doadoras de sangue brasileiras (22,9%), e se correlacionam estatisticamente com o maior número de gestações (p < 0,001), aumentando a porcentagem de positividade com o aumento do xvi número de gestações. Apesar de apresentar uma menor freqüência (1,9% do total de doadoras nos testes GAT e GIFT), os anticorpos anti-neutrófilos também são encontrados em doadoras, podendo este valor ser maior uma vez que as doadoras positivas para anti-HLA não foram testadas. O impacto da exclusão de doadoras multíparas da doação de sangue corresponde a 4% do total de doadores. Em conclusão, anticorpos anti-HLA e anti-neutrófilos estão presentes no plasma de doadoras brasileiras e constituem fator de risco para desencadear TRALI em receptores de sangue com antígenos correspondentes. / Purpose: The aim of this study were to determine the prevalence and the specificity of anti-HLA, class I and II, antibodies and the prevalence of anti-neutrophil antibodies in Brazilians female blood donors and to assess the impact of excluding the positive multiparous blood donors from the blood donation. Methods: Serum samples from 350 Brazilians female blood donors, distributed according to the number of previous pregnancy (50 nuliparous, 100 one pregnancy, 100 two pregnancies,100 multiparous), has been examined to detect and to identify anti-HLA, class I and II, antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), by LAT-M and LAT-1240 Kits (ONE LAMBDA, INC, EUA). Sixty-five multiparous female blood donors, between positive and negative by LAT-M, were tested by flow cytometry, by LABScreen Kit (ONE LAMBDA, INC, EUA), that provide the specificity of anti-HLA antibodies. Furthermore, the Granulocyte Agglutination (GAT) and Granulocyte Immunofluorescence (GIFT) Test were used to detect specific anti-neutrophil antibodies. Results: Anti-HLA antibodies, class I and/or II, have been found in 80 of 350 female blood donors (22.9%), from whom 37% were multiparous donors, 26% woman with two previous pregnancies, and 17% woman with one previous pregnancy. All the nuliparous blood donors were negative to anti-HLA antibodies. The difference among positive female blood donors in pregnancy groups was significant statistically in prevalence between nuliparous group and woman with at least one previous pregnancy (p < 0.001). The serum of positive female blood donors by LAT-M test were also tested by LAT-1240 Test and in seven women the anti- HLA antibodies can not be identified. Seventeen female blood donors, that were considered negative by LAT-M, were positive for anti-HLA antibodies by LABScreen. The GAT was applied to investigate the serum of negative female blood donors to anti- HLA. Two women of 264 female blood donors (0.8%) were positive to anti-neutrophil, from whom 1.6% were multiparous (one of 62) and 1.4% were women with two previous pregnancies (one of 71). The GIFT was also applied to negative female blood donors to anti-HLA and the women were positive to anti-neutrophil in four of 264 female blood donors (1.5%), from whom two multiparous of 62 (3.2%) and two of 71 (2.8%) women with two previous pregnancy. Conclusion: Anti-HLA antibodies have often been found in plasma of Brazilian female blood donors (22.9%), and are statistically associated with the number of pregnancy (p < 0,001). The percentage of positive women increases with xviii the number of pregnancy. Although the anti-neutrophil antibodies had less prevalence (1.9% of all women tested by GAT and GIFT), they are found in female blood donors. This value can be higher because the positive women to anti-HLA antibodies were not tested. The impact to exclude the positive multiparous blood donors to the blood donate is 4% of all blood donors. In conclusion, anti-HLA and anti-neutrophil antibodies are found in plasma of Brazilian female blood donors and they are considered risk factor to trigger TRALI in blood receptors with cognate antigen. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Apesar de uma diversidade de estudos científicos, em que dezenas de milhares de pacientes foram analisados e tratados, a sepse continua sendo um grande desafio para a medicina contemporânea. Investigações bem conduzidas levaram a uma reavaliação do modelo clássico da sepse, tradicionalmente vista como um processo descontrolado de hiperinflamação sistêmica, uma vez que se observou a existência de uma atividade antiinflamatória ao longo do seu curso evolutivo. Nesse contexto, o comportamento do sistema imune inato se assemelha ao de indivíduos idosos submetidos ao fenômeno da imunossenescência, interseção ainda mais relevante ao considerarmos o crescente incremento na faixa etária média dos pacientes internados em UTI. O presente estudo visou a estabelecer a epidemiologia da sepse em um hospital público de um país de renda media, como é o caso do Brasil. Ademais, através de citometria de fluxo, buscamos definir a cinética da expressão monocitária de moléculas HLA-DR e CD64 ao longo do processo de envelhecimento humano. Comparamos essas observações com o comprometimento do sistema imune inato visto na sepse visando discriminar as alterações da senescência do sistema imune associada ao envelhecimento daquelas associadas ao fenômeno da imunoparalisia da sepse. Na investigação epidemiológica, nós encontramos uma taxa de ocorrência de 5,9 casos de sepse por 100 pacientes e uma densidade de incidência de 6,4 casos por 1000 pacientes-dia. Documentamos ainda sua associação com uma elevada incidência de sepse e documentamos sua associação com uma elevada taxa de comordidades crônicas. A sepse foi diagnosticada tardiamente (72% dos casos após 12 horas de evolução) e em estágio avançado como atestado pelos elevados escores de gravidade de doença e de disfunção orgânica. O presente estudo identificou vários obstáculos à efetiva implementação das recomendações da Surviving Sepsis Campaign. No segundo estudo, observamos correlações negativas significativas entre idade e intensidade de expressão dos biomarcadores avaliados. Durante a sepse, a expressão de mHLA-DR foi ainda mais reduzida, enquanto a expressão de CD64 foi majorada. Para melhor discriminar imunossenescência de imunoparalisia, valores de cutoff de 9.700 m/c para mCD64 e de 7.000 m/c para mHLA-DR forneceram as melhores combinações de sensibilidade e especificidade. / Despite a multiplicity of trials enrolling several thousands of treated patients, sepsis still represents a major challenge to contemporary medicine. Since several well-conducted investigations have consistently indicated the existence of an anti-inflammatory activity during sepsis evolution, there has been a reappraisal of the classic sepsis model in which the condition was traditionally seen as an uncontrolled systemic hyper-inflammatory process. During sepsis, the innate immune system behavior has some similarities to the immunosenescence process experienced by elderly people; something that is even more relevant when considering the progressive increase of the mean age of the patients admitted to ICUs along the last decades. This study investigated the epidemiology of sepsis in a public university hospital from a middle-income country, as is the case of Brazil. Also, applying a flow cytometry methodology, we tried to establish the kinetics of the molecular expression of HLA-DR and CD64 on monocytes during human aging. To put it in context, we compared such findings with those obtained from septic patients aiming at the discrimination between changes related to the normal aging process from those of the immunoparalysis phenomenon seen in sepsis. In the epidemiological arm of this study, we found an occurrence rate of 5.9 cases of sepsis per 100 patients, and an incidence density of 6.4 cases per 1000 patient-days. We documented the association of sepsis with an elevated rate of chronic comorbid conditions. Sepsis was detected late (72% evolving for more than 12 hours) and in advanced stages as indicated by severity and organ failure scores. The study detected several obstacles to the effective implementation of the Surviving Sepsis Campaign recommendations. In the second study, we observed significant negative correlations between age and the levels of HLA-DR and of CD64 expression on monocytes. During sepsis, HLA-DR expression decreased further while CD64 expression was upregulated. To better discriminate immunosenescence from immunoparalysis, cutoff values of 9,700 m/c for mCD64 and of 7,000 m/c for HLA-DR provided the best combination of sensitivity and specificity.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aproximadamente 20% dos pacientes infectados pelo vírus da hepatite C (HCV) evoluem com clareamento viral espontâneo [3]. Variáveis como etnia e forma de contaminação tornam ainda mais difícil entender os fatores genéticos do hospedeiro que influenciam a evolução da hepatite C. Objetivo: Avaliar a relação entre o perfil de HLA e o clareamento espontâneo da infecção pelo vírus da hepatite C na população brasileira. Métodos: Foi realizada genotipagem dos HLAs -A, -B, -Cw, -DRB1 e -DQB1 em uma amostra de 135 pacientes infectados pelo HCV, sendo 45 pacientes com clareamento viral espontâneo (casos) e 90 pacientes com infecção crônica (controles). Os controles foram pareados por sexo, etnia (branco e não branco) e forma provável de contaminação (alta dose infectante ou baixa dose infectante). Foi realizada correção do p (pc) para múltiplas comparações usando a correção de Bonferroni. Resultados: quando analisamos os doentes em geral, nenhum alelo obteve significância estatística após a correção do p. Entretanto, uma nova associação protetora do HLA-DQB1*04 (p= 0,006; pc= 0,030) e uma associação protetora raramente descrita do HLA-DRB1*08 (p= 0,004; pc= 0,048) foram encontradas entre pacientes brancos, mas não entre não brancos. O alelo DRB1*11, previamente relatado em populações homogêneas, foi associado ao clareamento do HCV (p= 0,020) apenas entre pacientes com forma de contaminação provável por alta dose infectante. Conclusão: As bases imunogenéticas do clareamento do HCV diferem entre os grupos étnicos e as vias de contaminação. Mesmo em uma população etnicamente complexa como a brasileira é importante a realização de uma classificação étnica para parear os pacientes e para permitir uma análise estratificada para identificar diferentes associações para cada etnia. / Approximately 20% of Hepatitis C virus (HCV) infected individuals clear the virus [3]. The knowledge of host factors that influence the course of HCV infection is still limited. Factors such as ethnicity and route of infection make even more difficult to understand which host-dependent genetic factors influence the hepatitis C outcome. Aims: To investigate whether HLA alleles are associated with clearance of HCV infection in a highly admixed Brazilian population. Methods: HLA-A, -B, -Cw, -DRB1 and DQB1 genotyping were performed in a Brazilian cohort of 135 HCV infected subjects among which 45 cleared HCV infection (cases) and 90 had persistent viral infection (controls). Controls were matched by sex, ethnicity (withes and non whites) and expected route of infection (high infectious dose or low infectious dose). P-values were corrected for multiple comparisons using Bonferronis correction. Results: We didnt identify any significant association between HLA alleles and the outcome of HCV infection of all ethnic population. However, a new protective association of HLA-DQB1*04 (p= 0,006; pc= 0,030) and a rarely described protective association of HLA-DRB1*08 (p= 0,004; pc= 0,048) were found only among whites, but not among non whites patients. The DRB1*11 allele, previously reported in homogeneous population, was associated with HCV clearance (p= 0,020) only among patients with expected high-dose exposure. Conclusion: We conclude that the immunogenetic basis for HCV clearance differs between ethnic groups and route of infection. Even in an ethnically complex population it is important to establish an ethnic classification to match patients and homogenize groups and to allow stratified analysis to identify different associations for each ethnicity.

Introdução: O polimorfismo de inserção/deleção de 14 pb no éxon 8 do gene HLA-G é uma variante funcional com propriedades anti-inflamatórias, que tem sido associada a melhores respostas à monoterapia ou ao tratamento combinado com metrotexato (MTX) em pacientes com artrite reumatóide (AR). Objetivo: Determinar se o polimorfismo de 14 pb do gene HLA-G está associado com maior suscetibilidade à doença, com características clínicas e como fator preditivo da resposta à terapia em pacientes portadores de AR tratados com uma estratégia de tratamento intensivo com MTX. Métodos: Uma coorte prospectiva composta de 309 pacientes consecutivos foi estabelecida entre Junho de 2007 e Dezembro de 2009. Controles caucasianos saudáveis da mesma área geográfica e antecedentes étnicos foram selecionados. Um subgrupo de 188 pacientes com AR anteriormente não submetidos a decisões terapêuticas baseadas em escores de atividade da doença e sem critérios de doença em remissão pelo CDAI (>2.8) foram incluídos na análise de resposta clínica ao MTX (baseada em estratégia intensiva) e seguidos por um período de 14 meses (±5.29). Pacientes e controles foram genotipados para o polimorfismo de 14 pb por PCR com primers específicos para o éxon 8 do gene HLA-G. Uma análise multivariada foi realizada para investigar o efeito da homozigose para a deleção no polimorfismo 14bp do HLA-G sobre as mudanças no DAS28. Resultados: Entre os 309 pacientes com AR (média de idade 60.6 ±12.4 anos), não foram observadas diferenças nas freqüências alélicas em relação às características clínicas, incluindo escores de atividade e funcionais. Também não foram observadas diferenças significativas nas freqüências genotípicas e alélicas entre pacientes com AR e controles. Na análise de resposta clínica do subgrupo de 188 pacientes, medianas e médias dos escores de atividade da doença melhoraram ao final do estudo (DAS28: 5.0 vs. 4.2, p<0.001; respectivamente). A média de incremento da dose de MTX comparado ao baseline foi respectivamente 14.7 mg ±4.8 vs. 17.4 mg ± 4.7 (p<0.001). Em análise multivariada, o modelo foi significativamente associado às mudanças no DAS28 (R2ajustado=0.353; p<0.001) ou seja os fatores clínicos incluídos na análise explicaram 35% da variação do DAS28. O modelo apontou os fatores estatisticamente significativos na predição de resposta: valor do DAS28 basal (R2 semi parcial =0.261; p<0.001), gênero (R2 semi parcial = 0.034; p=0.003) e a interação entre a homozigose da deleção para 14 pb e o uso do MTX (R2semi-parcial = 0.017; p=0.031) como fatores preditivos independentes de resposta. Na análise estratificada pela presença de homozigose para a deleção ou outros genótipos, houve uma tendência para maior variação no DAS28 nos pacientes que utilizaram MTX no subgrupo -/-14-bp HLA-G (-1.4±0.3 vs. -0.4±0.5; p=0,071), o que não foi observado entre outros genótipos (-1,1 ±0,2 vs. -1,3 ±0,4; p=0,496). Conclusão: A ocorrência de homozigose para deleção de 14 pb no gene HLA-G foi independentemente associada com melhor resposta ao MTX em uma coorte prospectiva de pacientes com AR. Os achados trazem à luz um promissor marcador genético que precisa ser replicado em coortes independentes maiores. Maior número de estudos são necessários para que se possa identificar perfis genéticos capazes de selecionar individualmente os pacientes mais propensos a respostas ótimas ao MTX. / Background: 14-bp insertion/deletion in exon 8 of the HLA-G gene is a potentially functional polymorphism that has been implicated in the response to MTX monotherapy or combination in rheumatoid arthritis (RA) patients. Objectives: We sought to determine whether the 14-bp insertion/deletion polymorphism in exon 8 of the HLA-G gene is associated with susceptibility to RA, clinical features, or response to MTX therapy. Methods: We determined the HLA-G 14-bp insertion/deletion polymorphism genotypes in a prospective cohort of 309 consecutive RA patients and 294 healthy controls, and looked for associations between genotype and clinical features of RA. Multivariate analyses were performed to investigate the effect of homozygosity for the -14/-14 bp genotype on changes in DAS28 in response to MTX therapy in a subgroup of 188 RA patients. Results: Among the 309 RA patients, no correlations were observed between allele or genotype frequencies of the HLA-G gene polymorphism and clinical features, including disease activity scores and functional scores. No significant differences were observed in the genotype and allele frequencies between RA patients and controls. In the subgroup evaluated for clinical response to MTX, we observed a decrease in mean DAS28 over the course of the study. Furthermore, a better response to MTX treatment, measured by adjusted mean of DAS28 change, was observed in those patients with the HLA-G -14/-14-bp genotype, which was not observed among other genotypes. Conclusion: Homozygosity for the 14 bp deletion polymorphism within exon 8 of the HLA-G gene was associated with a better response to MTX in a prospective cohort of patients with RA. This is a promising genetic marker for predicting response to MTX therapy in RA.

Apesar de uma diversidade de estudos científicos, em que dezenas de milhares de pacientes foram analisados e tratados, a sepse continua sendo um grande desafio para a medicina contemporânea. Investigações bem conduzidas levaram a uma reavaliação do modelo clássico da sepse, tradicionalmente vista como um processo descontrolado de hiperinflamação sistêmica, uma vez que se observou a existência de uma atividade antiinflamatória ao longo do seu curso evolutivo. Nesse contexto, o comportamento do sistema imune inato se assemelha ao de indivíduos idosos submetidos ao fenômeno da imunossenescência, interseção ainda mais relevante ao considerarmos o crescente incremento na faixa etária média dos pacientes internados em UTI. O presente estudo visou a estabelecer a epidemiologia da sepse em um hospital público de um país de renda media, como é o caso do Brasil. Ademais, através de citometria de fluxo, buscamos definir a cinética da expressão monocitária de moléculas HLA-DR e CD64 ao longo do processo de envelhecimento humano. Comparamos essas observações com o comprometimento do sistema imune inato visto na sepse visando discriminar as alterações da senescência do sistema imune associada ao envelhecimento daquelas associadas ao fenômeno da imunoparalisia da sepse. Na investigação epidemiológica, nós encontramos uma taxa de ocorrência de 5,9 casos de sepse por 100 pacientes e uma densidade de incidência de 6,4 casos por 1000 pacientes-dia. Documentamos ainda sua associação com uma elevada incidência de sepse e documentamos sua associação com uma elevada taxa de comordidades crônicas. A sepse foi diagnosticada tardiamente (72% dos casos após 12 horas de evolução) e em estágio avançado como atestado pelos elevados escores de gravidade de doença e de disfunção orgânica. O presente estudo identificou vários obstáculos à efetiva implementação das recomendações da Surviving Sepsis Campaign. No segundo estudo, observamos correlações negativas significativas entre idade e intensidade de expressão dos biomarcadores avaliados. Durante a sepse, a expressão de mHLA-DR foi ainda mais reduzida, enquanto a expressão de CD64 foi majorada. Para melhor discriminar imunossenescência de imunoparalisia, valores de cutoff de 9.700 m/c para mCD64 e de 7.000 m/c para mHLA-DR forneceram as melhores combinações de sensibilidade e especificidade. / Despite a multiplicity of trials enrolling several thousands of treated patients, sepsis still represents a major challenge to contemporary medicine. Since several well-conducted investigations have consistently indicated the existence of an anti-inflammatory activity during sepsis evolution, there has been a reappraisal of the classic sepsis model in which the condition was traditionally seen as an uncontrolled systemic hyper-inflammatory process. During sepsis, the innate immune system behavior has some similarities to the immunosenescence process experienced by elderly people; something that is even more relevant when considering the progressive increase of the mean age of the patients admitted to ICUs along the last decades. This study investigated the epidemiology of sepsis in a public university hospital from a middle-income country, as is the case of Brazil. Also, applying a flow cytometry methodology, we tried to establish the kinetics of the molecular expression of HLA-DR and CD64 on monocytes during human aging. To put it in context, we compared such findings with those obtained from septic patients aiming at the discrimination between changes related to the normal aging process from those of the immunoparalysis phenomenon seen in sepsis. In the epidemiological arm of this study, we found an occurrence rate of 5.9 cases of sepsis per 100 patients, and an incidence density of 6.4 cases per 1000 patient-days. We documented the association of sepsis with an elevated rate of chronic comorbid conditions. Sepsis was detected late (72% evolving for more than 12 hours) and in advanced stages as indicated by severity and organ failure scores. The study detected several obstacles to the effective implementation of the Surviving Sepsis Campaign recommendations. In the second study, we observed significant negative correlations between age and the levels of HLA-DR and of CD64 expression on monocytes. During sepsis, HLA-DR expression decreased further while CD64 expression was upregulated. To better discriminate immunosenescence from immunoparalysis, cutoff values of 9,700 m/c for mCD64 and of 7,000 m/c for HLA-DR provided the best combination of sensitivity and specificity.