Le fer (Fe) est un élément indispensable à la vie. Sa capacité à perdre ou à gagner un électron lui permet d’être un cofacteur de choix pour de nombreuses réactions enzymatiques telles que la photosynthèse, la synthèse d’ADN ou la respiration. Cependant, le fer est très réactif et potentiellement toxique pour la cellule. Les plantes doivent donc strictement réguler leur homéostasie en fer afin d’éviter toute carence ou tout excès préjudiciable pour leur organisme. Parmi les acteurs du maintien de l’équilibre ferrique, les ferritines jouent un rôle majeur. Chez les végétaux, elles sont principalement régulées transcriptionnellement. Le gène modèle des ferritines, AtFER1, est régulé par au moins trois voies indépendantes (l’excès de fer, la carence en phosphate, et l’alternance jour/nuit). Toutefois, la façon dont ces signaux s’intègrent au niveau de son promoteur n’est pas formellement établie. Mon travail a consisté à mettre en place une étude fonctionnelle du promoteur d’AtFER1 en caractérisant des lignées stables d’Arabidopsis thaliana exprimant le gène rapporteur GUS (β-glucuronidase) sous le contrôle de différentes versions du promoteur d’AtFER1 (délétions en 5’ et en 3’, mutagenèse dirigée) selon différents traitements (e.g. disponibilité en fer). Cette approche a mis en évidence le rôle clef de certains éléments cis du promoteur. Des cribles simple hybride chez la levure sur ces éléments ont permis l’identification du facteur de transcription bHLH105/ILR3 comme régulateur potentiel d’AtFER1. Une caractérisation moléculaire et physiologique des mutants ilr3 a démontré l’implication de ce facteur dans la réponse des plantes à l’excès de fer. Elle a aussi mis en évidence qu’ILR3 avait un rôle central d’intégrateur dans l’homéostasie du fer chez les plantes. D’autre part, des données suggéraient qu’un long ARN non codant (At5g01595) pouvait potentiellement réguler AtFER1. Une caractérisation des mécanismes potentiellement impliqués a démontré que cette régulation n’était pas avérée.Les mécanismes moléculaires et physiologiques mis en place par les végétaux en réponse à une carence en fer sont relativement bien décrits. A l’inverse, peu d’informations sur la réponse des plantes à un « excès » de fer sont disponibles. Dans ce contexte, une expérience visant à décrypter, au niveau du transcriptome (puces à ADN), la dynamique de la réponse précoce (de quelques minutes à 2 heures) à un excès de fer a été mise en place. Une analyse de variance a été réalisée sur les données d’expression générées afin d’identifier les gènes dont l’expression est affectée par le traitement. Nous nous sommes plus particulièrement focalisés sur l’identification de facteurs de transcription, acteurs majeurs du maintien de l’homéostasie du fer. Parmi eux, WRKY33, WRKY40, ZAT10 et MYB51, tous liés à la réponse au ROS, semblent avoir un rôle clé dans la réponse précoce au fer.D’autre part, un mécanisme clé de l’homéostasie du fer est le prélèvement. Une précédente étude a montré que la nutrition en fer était facilitée par la synthèse et la sécrétion de composés phénoliques via le transporteur PDR9. Une caractérisation des mutants pdr9 a permis d’établir que d’une part (i) ses composés pouvaient être stockés dans les vacuoles des cellules racinaires, et d’autre part (ii) qu’ils permettaient l’entrée de fer via le système de prélèvement gouverné par le mécanisme FRO2/IRT1.Mes travaux de thèse ont permis d’apporter des éléments nouveaux sur les mécanismes moléculaires et physiologiques impliqués dans le contrôle de l’homéostasie du fer chez Arabidopsis. / Iron (Fe) is an essential micronutrient required for life. Since it can transfer electrons, Fe is a crucial cofactor for several enzymatic reactions such as photosynthesis, DNA synthesis or respiration. However, Fe is potentially toxic for the cells as it can react with oxygen and generate ROS (Reactive Oxygen Species). Therefore plants have evolved robust strategies to monitor Fe homeostasis in order to avoid Fe deficiency or excess that could be detrimental for their growth and development. Among the molecular actors involved in Fe homeostasis sensing, ferritins are central actors. In plants, ferritins are mainly transcriptionally regulated. AtFER1 (model of ferritin genes in Arabidopsis thaliana) is regulated by at least three independent environmental pathways (Fe excess, phosphate deficiency and diurnal/circadian rhythms). However, how these environmental signals are integrated at AtFER1 promoter remains elusive. During my PhD, I have functionally characterized the AtFER1 promoter in different growth conditions (i.e. Fe availability), using GUS as a reporter gene. This approach leads to the identification of specific cis-regulatory sequences within the AtFER1 promoter. Yeast one-hybrid screens using these cis-regulatory elements allowed the identification of the transcription factor bHLH105/ILR3 as putative transcriptional regulator of AtFER1 expression. In addition, molecular and physiological characterization of ilr3 mutants (gain- and loss-of-function mutations) brought out the involvement of ILR3 in plant responses to Fe excess and confirmed that ILR3 is a central integrator of Fe homeostasis in plants. I have also investigated the potential role of a long non-coding RNA in controlling AtFER1 expression. A deep characterization of the mechanisms potentially involved in this process demonstrated that this long non-coding RNA is most probably not involved in the control of AtFER1 expression. The molecular mechanisms by which plants face and adapt against Fe deficiency are well documented, however, very few data are available with regard to Fe excess. In this context, we set up a transcriptome analysis (microarrays) aiming at deciphering the dynamics of the early response (i.e. prior AtFER1 expression is induced) to an excess of Fe in A. thaliana. An analysis of variance was performed on the expression data generated in order to identify genes whose expression is affected by the treatment. We particularly focused on the identification of transcription factors that are major players in the regulation of gene expression in response to Fe and ROS excess. Among them, WRKY33, WRKY40, ZAT10 and MYB51 have been identified. Finally, I have been investigating the mode of action of PDR9, a transporter involved in the secretion of phenolic compounds in response to Fe deficiency. Through the characterization of pdr9 mutants, I have shown that the secreted phenolic compounds (i) allow the entrance of Fe via the FRO2 / IRT1 mechanism and (ii) that these compounds are stored in the vacuoles of the root cells before secretion.In conclusion, my PhD brings new elements on the molecular and physiological mechanisms involved in maintaining Fe homeostasis in Arabidopsis.

Bacillus cereus est une bactérie aéro-anaérobie facultative à Gram positif ubiquiste pouvant s’adapter à de nombreux environnements et s’y développer. C’est un agent pathogène de l’homme capable de produire tout un éventail de protéines extracellulaires et de toxines jouant un rôle majeur dans la pathogénicité de ce micro-organisme. B. cereus croit suivant un métabolisme de type respiratoire en aérobiose et fermentaire en anaérobiose en l’absence d’accepteur final d’électrons. En aérobiose, la chaine respiratoire est une source majeure des dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) endogènes. En anaérobiose, les ROS endogènes sont générés en réponse au stress oxydant secondaire au stress nutritionnel et au stress réducteur, lorsque les cultures sont réalisées à bas potentiel d’oxydo-réduction (POR). Les résidus méthionines (Met) sont particulièrement sensibles à l’oxydation par les ROS. L’oxydation des Met conduit à la formation de méthionine sulfoxyde (Met(O)), un dérivé oxydé stable détectable par spectrométrie de masse (MS). L'oxydation des résidus Met est réversible : leur réduction est catalysée par des méthionines sulfoxyde réductases (Msr). Pour déterminer le rôle de l’oxydation des résidus Met, nous avons réalisé une étude exhaustive par MS de la dynamique de l’exoprotéome de la souche ATCC 14579 (pBClin 15) de B. cereus en aérobiose (pO2 = 100%) et en anaérobiose (pO2 = 0%) à haut (POR initial = +140 mV) et bas potentiel redox (PORi= -350 mV). Les résultats ont montré que la dynamique des toxines était représentative de la dynamique de l’exoprotéome à la fois en termes d’abondance relative de protéines et d’oxydation des Met dans les trois conditions testées. L’analyse des résultats suggèrent que (i) l’abondance des toxines et leur taux de méthionines oxydés reflètent le niveau d’oxydation cellulaire et (ii) la sécrétion de toxines au cours de la croissance cellulaire contribue au maintien de l'homéostasie redox intracellulaire en piégeant les ROS endogènes, en particulier en phase active de croissance en aérobiose et en fin de croissance en anaérobiose. Pour étayer l’hypothèse selon laquelle, les Met des protéines extracellulaires, et des toxines en particuliers sont des composants de la machinerie cellulaire antioxydante, nous avons construit une souche mutante ne synthétisant plus MsrAB et comparer le protéome et l’exoprotéome de cette souche mutante avec celle de la souche parentale en aérobiose et anaérobiose à haut POR. Cette étude a mis en évidence l’implication de MsrAB mais également du plasmide cryptique pBClin15 dans la sécrétion des toxines et le maintien de l'homéostasie redox intracellulaire / Bacillus cereus is a Gram-positive aerobic or facultative anaerobic worldwide-distributed bacterium. In addition, B. cereus is a human pathogen able to produce a range of extracellular enzymes and toxins playing a major role in the virulence of the bacteria. In presence of oxygen, B. cereus performs respiration. Without oxygen or other electron acceptors, it performs mixed-acid fermentation. Under aerobiosis, the respiratory electron transport chain is a major source of endogenous reactive oxygen species (ROS). Under anaerobiosis, endogenous ROS are generated in response to reductive stress (mainly under high-reductive anaerobiosis) and to starvation (nutrient stress), i.e. in response to secondary oxidative stresses. Methionine residues (Met) of proteins are vulnerable to oxidation by free radicals. Oxidation of Met leads to the formation of methionine sulfoxide (Met (O)), a stable by-product detectable by mass spectrometry (MS). Met(O) can be reduced back to Met by the action of methionine sulfoxide reductase (Msr). To determine the role of oxidation of Met residues, B. cereus exoproteome time courses were monitored by MS under low oxidation-reduction potential (ORP) anaerobiosis (initial ORP = +140 mV and pO2 = 0%), high-ORP anaerobiosis (iORP = -350 mV and pO2 = 0%), and aerobiosis (pO2 = 100%). The results indicated that toxin-related proteins were the most representative of the exoproteome changes, both in terms of protein abundance and their Met(O) content in the presence and in the absence of oxygen. The analysis results suggest that (i) the abundance of toxins and their oxidized methionines rates reflect the cellular oxidation level and (ii) the secretion of toxins during growth helps to maintain redox homeostasis by keeping endogenous ROS at bay, during the exponential growth phase under aerobic conditions and at the end of growth under anaerobiosis. To support our hypothesis that Met residues of extracellular proteins, particulars of toxins are components of the cellular machinery antioxidant, we constructed a mutant strain by deleting the gene of MsrAB and compare the cellular proteome and exoproteome of this mutant strain with the wild-type strain under aerobiosis and high-ORP anaerobiosis. This study highlighted the involvement of MsrAB but also pBClin15 plasmid in the secretion of toxins and maintain of the intracellular redox homeostasis.

Le contrôle de l'expression des programmes géniques orchestrant le développement précoce et l'homéostasie des cellules souches fait l'objet de recherches intenses. En effet, les cellules souches embryonnaires (CSE) sont caractérisées par des propriétés comme leur clonogénicité (la capacité à proliférer dans le même état indifférencié) et leur pluripotence (la capacité à se différencier et à former les tissus embryonnaires et adultes). Au niveau moléculaire, l'identité des CSE est orchestrée par le contrôle de l'expression génique aux niveaux épigénétique, transcriptionnel, post- transcriptionnel et traductionnel en réponse à l'activation de voies de signalisation spécifiques. Dans ce contexte, des données récentes suggèrent un rôle de la machinerie traductionnelle les ribosomes et de la régulation de leur biogenèse, dans le maintien de l'homéostasie de cellules souches de différentes espèces. À partir de l'analyse de données transcriptomiques à haut débit (RNAseq), mon équipe d'accueil a ainsi identifié un ensemble de protéines associées aux ribosomes (PaR) significativement enrichies dans les cellules souches embryonnaires murines (CSEm) en comparaison à des lignées cellulaires murines différenciées et à des tissus. Parmi ces candidats, mes travaux de thèse ont consisté à la caractérisation d'une PaR particulièrement enrichie : Rsl24d1. Rsl24d1 est une protéine de biogenèse des ribosomes décrites exclusivement chez la levure. Son profil d'expression dans différentes lignées de CSEm suggère une fonction spécifique: enrichissement au niveau transcriptionnel et protéique dans les CSE à l'état de pluripotence naïf et diminution importante au cours de la différenciation. En effet, des approches de perte d'expression de Rsl24d1 m'ont permis d'établir l'importance de cette PaR dans l'homéostasie des CSEm. Rsl24d1 contribue au maintien de la prolifération cellulaire des CSE, de leur clonogénicité et plus modérément à leur pluripotence. Rsl24d1 semble être une protéine majoritairement nucléaire mais également associée aux sous- unités 60S libres des ribosomes cytoplasmiques. D'autre part, la perte d'expression de Rsl24d1 affecte spécifiquement la biogenèse des particules ribosomiques 60S. Ainsi, comme chez la levure, dans les CSEm, Rsl24d1 est un facteur navette orchestrant la maturation des particules ribosomiques pré-60S. Par ailleurs, Rsl24d1 semble permettre le maintien d'un taux de synthèse protéique élevé permettant notamment le renouvellement des protéines ayant une demi-vie courte parmi lesquels on recense des facteurs de transcription de la pluripotence comme Oct4 (Oct3/4), Nanog et Esrrb. Mes travaux de thèse ont donc permis d'identifier et de caractériser un facteur de biogenèse de la sous-unité 60S, Rsl24d1, impliqué dans l'homéostasie des CSEm / Embryonic stem cells (ESC) possess clonogenic and pluripotency abilities i.e. they are able to self-renew indefinitely in the same developpemental state and to differentiate in all the cell types composing embryonic and adult tissues. ESC homeostasis is coordinated by complex networks which are regulated at different levels of gene expression regulation, including epigenetic, transcriptional and post-transcriptional levels. Furthermore, emerging evidences point out that the translational machinery, ribosomes, are directly implicated in the control of adult and embryonic stem cell homeostasis in different model organisms. Along this line, we have identified Rsl24d1, a ribosomal associated protein (RaP), which is strongly expressed in naïve murine ESCs compared to their differentiated progenies. We demonstrated that Rsl24d1 actively contributes to ESC homeostasis and its expression is essential for ESC proliferation and clonogenic capacities. Finally, we have also demonstrated that Rsl24d1, like Rlp24 its yeast ortholog, is associated to pre-ribosomes in ESCs from the nucleus to the cytoplasm and is required for the biogenesis of the large ribosomal subunit

Les microARNs sont de petits ARN non codants régulant négativement l'expression génique au niveau post-transcriptionnel. Ils interviennent dans de nombreux processus biologiques et leur rôle dans la régulation de l'homéostasie cutanée est clairement démontrée. Cependant, leur fonction durant le vieillissement épidermique n'a jamais été étudiée. Nous avons donc réalisé une analyse exhaustive du miRnome épidermique durant son vieillissement afin d'identifier les microARNs différentiellement exprimés avec l'âge dans ce tissu. Plusieurs microARNs significativement modulés dans des kératinocytes âgés, nous ont permis d'établir une signature du vieillissement épidermique. Parmi eux, les deux brins du microARN miR-30a sont induits dans les épidermes âgés. La construction d'un lentivirus permettant la surexpression stable et inductible de ce microARN a facilité son étude fonctionnelle dans un modèle organotypique d'épiderme reconstruit. Nous avons observé que la surexpression de ce microARN dans un modèle de culture tridimensionnelle induit un phénotype épidermique présentant des similitudes avec celui observé durant son vieillissement chronologique et caractérisé par une forte altération de la différenciation des kératinocytes, par une perturbation de sa fonction barrière et par une augmentation de l'abondance des cellules apoptotiques. Ce projet de thèse a permis l'identification de 3 cibles directes de miR-30a dans les kératinocytes. Il s'agit de LOX, codant pour la lysyl oxydase qui intervient dans la balance prolifération/différenciation des kératinocytes, d'AVEN, un inhibiteur de caspase et d'IDH1, codant pour l'isocitrate déshydrogénase, enzyme du métabolisme énergétique. Ainsi, ce projet de thèse a révélé un nouveau microARN acteur du vieillissement épidermique et a permis de de mettre à jour de nouveaux mécanismes moléculaires expliquant certaines altérations phénotypiques observées dans l'épiderme avec l'âge / MicroRNAs are small non-coding RNA that negatively regulate gene expression at the post-transcriptional level. There are involved in many biological processes and play a key role in the regulation of skin homeostasis. However, their function during epidermal aging has never been studied. We performed an exhaustive analysis of the epidermal miRnome during its aging in order to identify microRNAs differentially expressed with age in this tissue. Several microRNAs significantly modulated in elderly keratinocytes, allowed us to establish a signature of epidermal aging. Among them, the two strands of the microRNA miR-30a are induced in aged epidermis. The construction of a lentivirus allowing inducible and stable overexpression of this microRNA facilitated its functional study in an organotypic model of reconstructed epidermis. We observed that the overexpression of this microRNA in a three-dimensional culture model induces an epidermal phenotype similar of those observed during its chronological aging characterized by a strong alteration of keratinocyte differentiation, by a disturbance of its barrier function and by an increase in the abundance of apoptotic cells. This thesis project allowed the identification of three miR-30a targets in keratinocytes : LOX encoding lysyl oxidase, which plays a role in proliferation/differentiation balance of keratinocytes, AVEN encoding a caspase inhibitor and IDH1 encoding isocitrate deshydrogenase, a key enzyme of cellular metabolism.Our work revealed a new miRNA actor and deciphered new molecular mechanisms to explain some alterations observed in epidermis during aging, especially those concerning keratinocytes differentiation and apoptotic death

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est une maladie clonale caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie codant pour Bcr-Abl, une tyrosine kinase constitutivement active responsable de la leucémogenèse. Bien que très efficaces, les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) restent cependant inactifs sur les cellules souches leucémiques. Ce travail de thèse montre que la signalisation calcique, connue pour réguler de nombreux processus dans les cellules saines et cancéreuses, est importante dans la signalisation cellulaire au décours de la LMC. Le rôle des entrées calciques dépendantes des stocks (SOCEs) médiées par STIM1 (STromal Interaction Molecule 1) et les canaux Orai1 et TRPC1 ainsi que des entrées calciques induites par la thrombine a été étudié dans la leucémogenèse. Nous avons observé une diminution de ces entrées dans les cellules exprimant Bcr-Abl pouvant être expliquée par le changement de stœchiométrie Orai1/STIM1. Ceci entraîne la diminution de l'activation de NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) ainsi que des conséquences sur la prolifération et la migration cellulaire mais pas sur l'apoptose. De plus, les SOCEs sont restaurées dans les cellules cancéreuses après traitement à l'Imatinib, le principal ITK. Nous proposons alors que l'expression de Bcr-Abl joue un rôle sur l'homéostasie calcique en entraînant une dérégulation générale des fonctions cellulaires dans les cellules leucémiques notamment via la voie PKC (Protein Kinase C). Ainsi, ces résultats montrent une dérégulation des entrées calciques dans les cellules exprimant Bcr-Abl, suggérant que la signalisation calcique puisse être une cible thérapeutique en parallèle avec les ITKs. / Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal disease characterized by the presence of the Philadelphia chromosome encoding for Bcr-Abl, a constitutively active tyrosine kinase responsible for leukemogenesis. Although Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have revolutionized the therapy of Ph+ leukemia, the complete eradication of CML is limited by the emergence of resistance in hematopoietic stem cells. This thesis proposes that calcium (Ca2+) signaling pathways, known to govern a large number of functions in normal and cancer cells, may be important in CML cell signaling. Therefore, we studied the role of Store Operated-Calcium entry (SOCE) (i.e. STromal Interaction Molecule 1 (STIM1), Orai1 and TRPC1 channels) and thrombin induced Ca2+ entry in leukemogenesis. We found a decrease in both calcium entries in Bcr-Abl-expressing cells compared to normal cells. The reduced SOCE seems related to a change in stoichiometry of Orai1/STIM1. This leads to a reduction of the Nuclear Factor of Activated T-cells (NFAT) translocation and functional consequences on cell proliferation and migration but not on apoptosis. Moreover, we showed that SOCE is restored in malignant cells after treatment with Imatinib, the main TKI. We proposed that Bcr-Abl expression could impact on Ca2+ homeostasis enhancing a general disorganization of cell functions in leukemia cells notably via Protein Kinase C (PKC) pathway. Altogether this work shows a deregulation of Ca2+ entry in Bcr-Abl-expressing cells, suggesting that the Ca2+ signaling pathway could be a therapeutic target in parallel with TKIs.

Le muscle squelettique est un tissu hétérogène et dynamique jouant un rôle important dans la mobilité et le métabolisme d’un organisme. C’est un organe actif qui sécrète de nombreuses cytokines participant au « crosstalk » entre tous les tissus impliqués dans ce métabolisme. Parmi ces myokines, la myostatine agit à la fois comme un régulateur négatif du développement musculaire et un médiateur dans l’homéostasie du glucose. En effet, les souris déficientes pour le gène de la myostatine (Mstn-/-) présentent une augmentation de leur masse musculaire associée à une hyperplasie et une hypertrophie des myofibres. Elles présentent également une diminution de leur masse adipeuse. L’expression de la myostatine est finement régulée par des inhibiteurs comme la follistatine, FSTL3 ou les protéines GASP-1 et GASP-2. Si de nombreuses études ont déjà été réalisées sur les autres inhibiteurs, les protéines GASPs sont à l’heure actuelle encore peu étudiées. Le modèle murin surexprimant Gasp-1 (Tg(Gasp-1) généré dans le laboratoire présente un phénotype hypermusclé associé à une hypertrophie mais sans hyperplasie et ne présentent pas de diminution de leur masse adipeuse. Afin de mieux comprendre les conséquences fonctionnelles de la surexpression de Gasp-1, nous avons analysé des cellules musculaires dérivées de cellules satellites de souris Tg(Gasp-1). Cette étude a révélé une dérégulation de l’expression de plusieurs gènes dont une surexpression de la myostatine qui pourrait expliquer l’absence d’hyperplasie. Nous avons voulu également expliquer l’absence de variation de masse adipeuse dans les souris Tg(Gasp-1) en réalisant des analyses métaboliques sur des souris jeunes et âgées. Ces travaux ont révélé une dérégulation globale de l’homéostasie du glucose dans les souris Tg(Gasp-1) associé à une dérégulation du sécrétome musculaire. Enfin nous avons voulu appréhender le rôle de GASP-2 dans le contexte musculaire. / Skeletal muscle is a heterogeneous and dynamic tissue which plays an important role in mobility and metabolism of organisms. It is an active organ that secretes numerous cytokines involved in "crosstalk" between all tissues implicated in metabolism. Among these myokines, myostatin acts both as a negative regulator of muscle development and a mediator in glucose homeostasis. Indeed, mice deficient for the myostatin gene (Mstn-/-) have an increase of muscle mass associated with hyperplasia and hypertrophy of myofibers. Mstn-/- mice also exhibit a decrease of fat mass. Expression of myostatin is tightly regulated by inhibitors such follistatin, FSTL-3 or GASP-1 and GASP-2 proteins. While many studies have already been performed on the other inhibitors, GASPs proteins are still poorly studied. The mouse model overexpressing Gasp-1 (Tg (Gasp-1)) generated in our lab presents a hypermuscular phenotype associated with hypertrophy without hyperplasia and exhibit no decrease in fat mass. To better understand the functional consequences of Gasp-1 overexpression, we analyzed muscle cells derived from Tg(Gasp-1) satellite cells This study revealed a deregulation of the expression of several genes with an upregulation of myostatin which could explain the absence of hyperplasia in the Tg(Gasp-1) mice. We then want to explain the absence of fat mass changes by performing metabolic assays in young and aged mice. These studies have revealed an overall dysregulation of glucose homeostasis and deregulation of muscle secretome in Tg(Gasp-1) mice. Finally we wanted to capture the role of GASP-2 in a muscular context.

La réponse au stress oxydatif joue un rôle important dans de nombreux processus d’adaptation biologique. Les sélénoprotéines jouent un rôle clef dans le contrôle du stress oxydatif. Des mutations du gène codant pour la sélénoproteine N (SelN) sont la cause de différentes formes de dystrophies musculaires chez l’Homme mais la fonction moléculaire de SelN reste inconnue. Au cours de ma thèse j’ai cherché à déterminer la fonction moléculaire de SelN, et son rôle dans les mécanismes de régulation Rédox. Le modèle de souris Sepn1-/- a constitué l’outil central permettant de répondre à ces objectifs.Les principaux résultats ont révélé une sensibilité particulière des souris Sepn1-/- à certains agents inducteurs de stress oxydatif ou réticulaire. J’ai également caractérisé le modèle Sepn1-/- par séquençage haut débit, en comparant les muscles paravertébraux d’animaux Sepn1-/- et sauvages. Les résultats montrent que malgré l’absence de phénotype musculaire, il y a activation de 580 gènes codant pour des protéines secrétées et mettent en avant l’activation d’un certain nombre de voies métaboliques. Ces résultats participent à une meilleure caractérisation du rôle de la sélénoprotéine N dans le réticulum endoplasmique. / Oxidative stress response plays a major function in the adaptation of biological systems. Selenoproteins have a main role in oxidative stress control. Mutations in the gene coding for the selenoprotein N (SelN) cause different muscular dystrophies in Humans but the molecular function of SelN is still unknown. The main objective of my PhD was to determine the molecular function of SelN, and its role in Redox regulation mechanisms. The Sepn1-/- mouse model was a central tool to reach those objectives.The key results revealed a higher sensibility of Sepn1-/- mice to specific oxidative or reticular stress inducers. Moreover, the Sepn1-/- mouse model was characterized by high throughput sequencing, comparing gene expression of paravertebral muscle of Sepn1-/- and wild type animals. Results showed activation of 580 genes in Sepn1-/- mice despite the absence of muscular phenotype in those conditions. Activated genes are coding for secreted proteins and indicated the activation of several metabolic pathways. Those results participated to Sel N function determination in the endoplasmic reticulum.

La peau est un organe très exposé à l’environnement et fournit la première ligne de défense contre de nombreux pathogènes. Cette fonction est remplie dans l’épiderme murin par les cellules de Langerhans (LCs) et les cellules T dendritiques de l’épiderme (DETCs). Alors que le développement de ces cellules a bien été étudié, peu d’expériences ont été effectuées sur leur renouvellement en condition homéostatique chez des animaux adultes sans manipulations. Nous avons alors développé un système de traçage cellulaire par fluorescence multicolore pour étudier l’homéostasie des LCs et des DETCs. Cette approche de «fate mapping» m’a permis de mettre en évidence un modèle dans lequel le réseau adulte des LCs est formé d’unités prolifératives adjacentes composées de LCs en division et leurs cellules filles. Nous avons identifié que les cellules en division étaient majoritairement représentées par la fraction la plus immature des LCs, suggérant que ces LCs peuvent régénérer leur réseau grâce à une capacité de prolifération limitée. Lors d’une inflammation importante, les LCs sont renouvelées par des progéniteurs issus de la moelle osseuse et s’organisent également en unités de prolifération. Je me suis ensuite intéressé à l’homéostasie des DETCs. Ce réseau est formé de la même manière par des unités prolifératives de DETCs. Un modèle de greffe de peau nous a permis de montrer que les DETCs semblent renouveler les cellules disparues dans une zone restreinte. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de révéler les dynamiques cellulaires qui régissent l’homéostasie des cellules immunitaires de l’épiderme. / The skin is an organ very much exposed to the environment and supplies the primary line of defence against several pathogens. In the mouse model epidermis, this function is fulfilled by Langerhans’ cells (LCs) and dendritic T cells (DETCs). While LCs and DETCs development have thoroughly been studied, few experiences have been carried out concerning the renewal of these cells through homeostatic conditions in adult “nonmanipulated” animals. Then we have designed a new system of fate mapping, by way of multi-coloured fluorescence to study the LCs and DETCs homeostasis. This method of fate mapping allowed me to highlight a model in which the adult network of LCs is made up of adjacent proliferating units, made of dividing LCs and of their daughter cells. We have identified that the dividing cells were mainly represented by the most immature fraction of LCs, suggesting that these LCs can renew their network thanks to a limited ability to proliferate. During significant inflammation, LCs are renewed by progenitors coming from the bone marrow and organize themselves in proliferation units as well. I also took an interest in the homeostasis of DETCs. In the same way as for the LCs, this network seems to be made up of DETCs proliferating units. A model of skin graft led us to show that the DETCs seem to renew the missing cells in a restricted area. As a conclusion, my research work allowed me to reveal the cellular dynamism which governs the homeostasis of the epidermis’ immune cells.

L’augmentation transitoire de la concentration calcique intracellulaire constitue l’élément déclencheur de nombreux processus physiologiques tels que la fertilisation de l’ovocyte, la contraction ou la mort cellulaire. L’influx de calcium à la suite de l’activation des récepteurs de l’acétylcholine (RACh) dans les muscles ou les neurones est un événement bref et localisé. Le recrutement, direct ou indirect, des canaux calciques voltage-dépendants permet de convertir cette stimulation aigue en un événement prolongé dans l’espace et le temps, menant à la contraction musculaire, à l’exocytose des neurotransmetteurs ou à la régulation de l’expression des gènes. Les RACh et les canaux de type L étant conservés au cours de l’évolution, nous utilisons la cellule musculaire du nématode Caenorhabditis elegans comme modèle d’étude afin de mieux caractériser la biologie et les mécanismes de régulation de ces protéines. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur deux situations indépendantes de suractivation de l’homéostasie calcique impliquant ces acteurs, i) l’hyperactivation des canaux calciques voltage-dépendants par des mutations gain-de-fonction, ii) la suractivation pharmacologique des RACh à l’aide d’un agoniste cholinergique, le lévamisole. La première étude a consisté en la caractérisation de trois mutations gain-de-fonction dans le gène codant la sous-unité a1 du canal calcique de type L. Ce travail s’inscrivait dans un projet visant à isoler des mutants supprimant les défauts d’excitabilité engendrés par l’hyperactivité des canaux de type L, afin d’identifier de nouveaux partenaires fonctionnels de ces canaux. Ce projet a été interrompu par la mise en place de la deuxième étude, dans laquelle j’ai utilisé l’exposition au lévamisole pour explorer la réponse cellulaire face à une suractivation cholinergique. J’ai montré que la signalisation cholinergique était contrôlée par un inhibiteur associé aux récepteurs, et que les RACh subissaient des modifications quantitatives à court ou long terme. Enfin, j'ai exploité le phénotype de résistance partielle au lévamisole pour réaliser un crible génétique à grande échelle visant à identifier de nouveaux régulateurs des récepteurs / Calcium transients trigger various physiological processes, including oocyte fertilization, contraction or cell death. In neurons or muscles, calcium influx following acetylcholine receptor (AChR) opening is a brief and confined event. By recruiting, directly or not, voltage-dependent calcium channels, this calcium entry is amplified through space and time and leads to muscle contraction, neurotransmitter exocytosis or gene regulation.As AChRs and L-type voltage-gated calcium channels are evolutionarily conserved, we use Caenorhabditis elegans striated muscle cells as a model to characterize the biology and regulation mechanisms of these proteins. During my PhD I worked on two independent situations involving overactivation of calcium homeostasis, i) hyperactivation of L-type calcium channels by gain-of-function mutations within the main subunit, ii) pharmacological overactivation of AChRs using the cholinergic agonist levamisole. The functional characterization of three gain-of-function mutations was the first step of a project aiming to identify new molecular partners of L-type channels, by isolating mutants suppressing excitability troubles introduced by these gain-of-function mutations. This work was interrupted when I started the second study: I used levamisole exposure as an experimental paradigm to investigate how muscle cells are coping with cholinergic overstimulation. I showed that cholinergic signaling is regulated by an inhibitor associated with the receptors, and that AChRs undergo quantitative changes at short or long term. Finally I took advantage of partial levamisole resistance phenotype to undertake a genetic screen in order to identify new regulators of AChRs

Au cours de l'obésité, le Tissu Adipeux blanc (TAB) est le siège d'un important remaniement de sa Matrice Extracellulaire avec des amas fibrotiques autour des adipocytes et des vaisseaux. Cette organisation caractéristique semble avoir une incidence dans la physiopathologie de l'obésité. Les composés spécifiques à la Membrane Basale ont été mis en évidence autour des adipocytes et des cellules endothéliales et leur expression est fortement induite dans l'adipocyte obèse. L'expression de COL4A1 est positivement corrélée à l'insulino-résistance de sujets présentant une obésité modérée. De plus, dans un autre groupe de sujets massivement obèses candidats à la chirugie bariatrique, la diminution de l'expression génique de COL4A1 est à relier avec l'amélioration de l'insulino-résistance après l'intervention. Enfin, nous observons que, dans le TAB, l'expression de COL4A1 est positivement associée à l'expression génique de deux facteurs de croissance pro-fibrotiques, le TGF 1 et le TGF 3, dans le TAB. La culture tridimensionnelle d'adipocytes ou de cellules endothéliales exposés à ces deux facteurs induit un phénotype fibro-inflammatoire dans ces types cellulaires. Néanmoins, le traitement par le TGF 1 ou TGF 3 induit uniquement dans les cellules endothéliales une sur-expression de COL4A1 et non dans les adipocytes.En conclusion, nos données proposent un nouvel acteur de la fibrose du TAB au cours de l'obésité, la Membrane Basale adipocytaire et vasculaire, participant ainsi à la dysfonction tissulaire et métabolique. / During obesity, White Adipose Tissue (WAT) undergoes an important remodeling of its Extracellular Matrixwith fibrotic depots around adipocytes and vessels. This typical organization seems to have an impact in the pathophysiology of obesity. Basement Membrane components were detected around adipocytes and endothelial cells and their expression were significantly increased in obese adipocytes. COL4A1 expression in WAT is positively correlated to insulin-resistance parameters in moderate obese subjects, and its reduction is associated to insulin-resistance improvement after gastric bypass in a group of morbidly obese subjects. Finally, we demonstrated a postive correlation between COL4A1 expression and two pro-fibrotic growth factor (TGF1 and TGF3) in obese WAT. In vitro treatment of isolated adipocytes and endothelial cells with these TGF isoforms induced inflammatory and fibrotic phenotype. However, TGF1 and TGF3 exposure only provoked COL4A1 over-expression in endothelial cells, and not in adipocytes. In conclusion, our work have highlighted a new actor in WAT fibrosis during obesity, adipocytes and endothelial cells Basement Membrane, participating in the pathological alterations of obese adipose tissue and metabolism.