La pollinisation entomophile est essentielle pour la production de 70% des cultures à travers le monde. Cependant la contribution des pollinisateurs dans la production agricole reste peu renseignée ainsi que les insectes qui sont impliqués. De plus, lorsque la contribution des pollinisateurs est quantifiée, le bénéfice est calculé à des échelles biologiques ou dans des conditions simplifiées qui peuvent être non représentatifs des bénéfices à l’échelle de la parcelle. Par ailleurs, les possibles interactions entre les pollinisateurs et les pratiques agricoles ne sont généralement pas pris en compte. L’objectif général de cette thèse était donc de quantifier la contribution des pollinisateurs directement dans les parcelles agricoles dans deux cultures fréquemment retrouvées en Europe, le colza et le tournesol. Ces estimations sont réalisées à l’échelle de la parcelle ainsi qu’à l’échelle de la plante pour comprendre les mécanismes qui permettent l’augmentation de la production agricole. Ces études nous ont permis aussi d’identifier les principaux pollinisateurs de ces deux cultures.Dans un premier temps, nous avons quantifié le bénéfice des pollinisateurs dans les rendements de tournesol et de colza. Nous montrons que le colza et le tournesol partagent une même guilde de pollinisateurs, les abeilles domestiques. Les abeilles sauvages sont aussi d’importants pollinisateurs pour le colza. Les pollinisateurs augmentent les rendements de colza de plus de 35% et ceux du tournesol de 40%, à l’échelle de la parcelle. A l’échelle de la plante, que ce soit pour le colza et le tournesol, les pollinisateurs augmentent le succès de pollinisation et donc le nombre de graines par plante.Dans un deuxième temps, nous avons comparé le bénéfice des pollinisateurs par rapport à ceux des pratiques agricoles en termes de rendement et de gain monétaires dans les parcelles de colza, tout en regardant plus précisément leurs possibles interactions. Nous montrons que le bénéfice des pollinisateurs dans les rendements s’additionnent à ceux des pratiques agricoles excepté avec les insecticides qui réduisant la contribution des pollinisateurs. De plus, nous montrons que les pollinisateurs sont d’importants contributeurs du rendement et des revenus agricoles en augmentant le bénéfice des agriculteurs de 250 € par hectare alors qu’au contraire plusieurs pratiques peuvent être très couteuses pour ces mêmes agriculteurs. Finalement, nous étudions l’effet des pollinisateurs sur la qualité lipidique des graines de colza qui est une autre facette de la production agricole. Nous montrons que les abeilles domestiques améliorent la qualité des graines en augmentant le pourcentage d’acides gras insaturés tout en réduisant les acides gras trans- et saturés. Pour certaines années, les abeilles domestiques augmentent aussi le pourcentage de lipide par graine.En conclusion, nous montrons que les pollinisateurs sont essentiels à la production agricole à la fois sur le rendement, les revenus agricoles et sur la qualité. Plusieurs mesures doivent être mises en place pour promouvoir les pollinisateurs dans les milieux agricoles dans le but de les préserver et d’assurer une production agricole durable pour ces deux cultures. / Insect pollination is essential for over 70% of crops around the world. However, the contribution of pollinators to crop production and the insects involved in crop pollination have rarely been studied. Moreover, assessments of pollinator contributions have mostly been conducted on a small scale or under simplified conditions, which do not represent the real contributions at the field scale and do not take into account possible interactions between pollinators and farming practices. The aim of this study is to quantify directly under field conditions, the contribution of pollinators in two crops frequently cultivated in Europe: oilseed rape and sunflower. Estimations are realized both at the plant and at the field scale to understand mechanisms that increase crop production. Our studies identify also these crops’ pollinators.In a first step, we quantified the contributions of pollinators to oilseed rape and sunflower yield. Oilseed rape and sunflower share a pollinator guild - the honeybee. Wild bees also increase oilseed rape yield. Pollinators increase the yield of oilseed rape by up to 35% and of sunflower by up to 40%. At the plant scale, pollinators increase pollination success and consequently the number of seeds per plant.In a second step, we compared for oilseed rape the yield and the monetary contributions of pollinators and farming practices by taking their potential interactions more accurately into account. We show that the benefits of pollinators and farming practices on yield were additive except for insecticide use, which decreased the contribution of pollinators. In addition, we show that pollinators were important contributors to the farmers’ incomes by increasing gain by 250 € per hectare while some practices were very expensive for farmers.Finally, the effect of pollinators was studied on oilseed rape seed quality - another component of crop production. We show that honeybees improve seed quality by increasing the percentage of unsaturated fatty acids in seeds and decreasing trans-saturated and saturated fatty acids. In some years, honeybees increased also the percentage of lipids per seed.We conclude, pollinators are essential for crop production by increasing both yield, monetary gain and quality. Several measures must be taken to promote pollinators in agricultural land in order to conserve them and ensure sustainable crop production for these two crops.

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

Die Honigbiene <i>Apis mellifera</i> gilt seit langem als Modell-Organismus zur Untersuchung von Lern- und Gedächtnisvorgängen sowie zum Studium des Sozialverhaltens und der Arbeitsteilung. Bei der Steuerung und Regulation dieser Verhaltensweisen spielt das Indolalkylamin Serotonin eine wesentliche Rolle. Serotonin entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der vorliegenden Arbeit wird der erste Serotonin-Rezeptor aus der Honigbiene molekular charakterisiert. <br><br> Durch die Anwendung zwei verschiedener Klonierungsstrategien konnten drei cDNA-Sequenzen isoliert werden, die für potentielle Serotonin-Rezeptoren kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu dem 5-HT7- und 5-HT2-Rezeptor von Drosophila melanogaster bzw. dem 5-HT1-Rezeptor von <i>Panulirus interruptus</i> auf. Die isolierten Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene wurden dementsprechend Am(<i>Apis mellifera</i>)5-HT1, Am5-HT2 und Am5-HT7 benannt. <br><br> Das Hydropathieprofil des Am5-HT1-, Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptors deutet auf das Vorhandensein des charakteristischen heptahelikalen Aufbaus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hin. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale biogener Amin-Rezeptoren. Aminosäuren, die eine Bedeutung bei der Bildung der Liganden-Bindungstasche, der Rezeptor-Aktivierung und der Kopplung eines G-Proteins an den Rezeptor haben, sind in allen drei Rezeptoren konserviert. Interessanterweise ist jedoch das in den meisten biogenen Amin-Rezeptoren vorhandene DRY-Motiv in dem Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptor nicht konserviert. Das Vorhandensein einer PDZ-Domäne in dem Am5-HT1- und Am5-HT7-Rezeptor lässt vermuten, dass diese Rezeptoren als Adapterproteine fungieren, die Signalmoleküle zu einem Signaltransduktionskomplex vereinigen. <br><br> RT-PCR-Experimente zeigen die Expression der Rezeptoren in verschiedenen Geweben der Honigbiene. Auffallend ist die hohe Expression im Zentralgehirn. Des Weiteren konnte die Expression der Serotonin-Rezeptoren in den optischen Loben, Antennalloben sowie in der Peripherie, d.h. in der Flugmuskulatur und den Malpighischen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch in situ Hybridisierungen wurde die Expression in Gefrierschnitten von Gehirnen adulter Sammlerinnen im Detail untersucht. Transkripte der Rezeptoren sind in den Somata von intrinsischen Pilzkörperzellen, Neuronen der optischen Loben und Neuronen der Antennalloben vorhanden. <br><br> In einem heterologen Expressionssystem wurde der intrazelluläre Signalweg des Am5-HT7-Rezeptors untersucht. Die Aktivierung des stabil exprimierten Rezeptors durch Serotonin führt zur Bildung von cAMP. Der 5-HT7-Rezeptor spezifische Agonist 5-CT zeigt eine mit Serotonin vergleichbare Fähigkeit, die intrazelluläre cAMP-Konzentration zu erhöhen. Am5-HT7 gehört daher funktionell zu der Gruppe der 5-HT7-Rezeptoren. Der EC50-Wert von 1,06~nM (5-HT), ist im Vergleich zu anderen 5-HT7-Rezeptoren äußert niedrig. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das basale cAMP-Niveau in den transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen deutlich erhöht ist. Das heißt, dass der Rezeptor auch in der Abwesenheit eines Liganden aktiv ist. Diese konstitutive Aktivität ist auch von anderen biogenen Amin-Rezeptoren bekannt. Methiothepin wurde als wirksamer inverser Agonist des Am5-HT7-Rezeptors identifiziert, da es in der Lage ist, der konstitutiven Aktivität entgegenzuwirken.<br><br> Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Serotonin-Rezeptoren in verschiedenen Regionen des ZNS der Honigbiene an der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Es kann eine Beeinflussung von Lern- und Gedächtnisprozessen sowie des olfaktorischen und visuellen Systems durch diese Rezeptoren vermutet werden. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung des ersten Serotonin-Rezeptors der Honigbiene ist eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der serotonergen Signaltransduktion geschaffen worden. / The honeybee <i>Apis mellifera</i> is a model organism for studying insect division of labor, learning and memory. An important substance that has been implicated in the control and regulation of these phenomena is the indolalkylamine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) Pharmacological and functional studies indicate, that serotonin activates various receptor subtypes which predominantly belong to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs).<br><br> Using a homology based screening approach on a brain-specific cDNA library of the honeybee and a PCR-based strategy we have isolated cDNAs encoding three putative serotonin receptors. The deduced amino acid sequences of these putative honeybee serotonin receptors show the highest homology to a 5-HT7 and a 5-HT2 receptor from <i>Drosophila melanogaster</i> and a 5-HT1 receptor from <i>Panulirus interruptus</i>, respectively. We have studied the distribution of the respective 5-HT receptor mRNAs in several tissues of the honeybee by RT-PCR. The analysis revealed a high amount in the central brain. By using in situ-hybridization we detected receptor encoding mRNA in cryostat sections of honeybee brain. We could prove receptor transcripts in neurons of the optic lobes, intrinsic mushroom body neurons, and deutocerebral neurons. <br><br> In a HEK 293 cell line, stably expressing the 5-HT7 receptor protein, we investigated the intracellular signalling pathway. When activated by serotonin, the heterologous expressed 5-HT7 receptor induces an increase in intracellular cAMP levels ([cAMP]i). The stimulation with other biogenic amines (octopamine, tyramine, and dopamine) did not induce a significant change in [cAMP]i Furthermore, Am5-HT7 causes a significant increase in the non-agonist stimulated cAMP levels relative to those of non-transfected cells. Therefore, the Am5-HT7 receptor displays agonist-independent (constitutive) activity which has also been demonstrated for many other GPCRs. <br><br> A specific affinity-purified anti-Am5-HT7 antibody detected a protein band of the expected size of ~66 kDa in homogenates of honeybee brains and HEK 293 cells expressing the Am5-HT7 receptor.

Honeybees are used as a major agricultural input around the world and their pollination services have been valued at US$14.6 billion to the United States alone. Dramatic declines in honeybee populations around the globe, however, questioned the sustainability of this reliance on a single pollinator species. In this study, I investigated the response of wild pollinator communities to declining honeybee density and changing land use intensity to determine the potential of wild pollinators to compensate for honeybee loss in an increasingly human-modified environment. I generated a gradient of declining honeybee density using increasing distances from commercial bee hives, and conducted flower observations on experimentally-grown plants across this gradient. I investigate how declining honeybee densities and intensifying land use combine to influence the composition of the pollinator community as a whole, then go on to explore individual trends in the most common pollinator species. I then analyze how this impacts the transport of viable pollen by the pollinator community and determine how these changes alter seed set in several common plant species. I then change my focus away from the composition of the pollinator community, and instead investigate how declining honeybee densities and land-use intensification influence the structuring of interactions between plants and pollinators within the community. I identify the pollen species carried by pollinators, and use this to construct a network of pollination interactions. I then use this network to analyze how changes in the way species interact influences the pollination services delivered by the pollinator community to different plant groups (weeds, native plants, and crop species). My findings show that honeybee declines may have a large impact on community structure and interactions within pollination systems. I observed a significant shift in the wild pollinator community composition as honeybee densities declined, from a generally bee/hoverfly dominated community to one more dominated by large flies. This was associated with a significant decline in the total pollen load transported by the community, indicating that pollination services may suffer in the absence of honeybees. As honeybee densities declined, however, I also observed a shift toward greater specialisation of pollinators on abundant resources, increased pollinator constancy, and a higher viability rate of the pollen transported. These findings show that although the total amount of pollen transported by the community declined as honeybee densities decreased, the probability of this pollen transport resulting in effective pollination likely increased. Thus, I observed no decrease in seed set with honeybee declines in any of the three plant species tested, and one of these even showed a significant increase. Finally, I also demonstrated that this change differentially affected different plant types, and that the extent of changes to each plant species differed between land-use types. This reflected changes in the relative abundance of pollen types in different land uses, with greater specialisation in the absence of honeybees disproportionately benefiting common species. These findings have strong implications for several contemporary issues in pollination biology, both locally within New Zealand and on a global scale. These are discussed in the following sections. Finally, I conclude by discussing the implications of this research on several contemporary issues in pollination biology, namely the ability for wild pollinators to compensate for honeybee declines, the impact of honeybees on natural new Zealand ecosystems, the contribution of honeybees to invasive weed pollination and finally the management of surrounding land use types to maximize the effectiveness of wild pollinators.

Bibliography: leaves 129-137 / viii, 137 leaves, [27] leaves of plates : ill. (some col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--Dept. of Entomology, Waite research Institute, University of Adelaide, 1986

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-05-24T14:43:41Z No. of bitstreams: 1 MicheleDFC_DISSERT.pdf: 920263 bytes, checksum: 53a2a3e4da4623de921e854a9507225d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-24T14:43:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MicheleDFC_DISSERT.pdf: 920263 bytes, checksum: 53a2a3e4da4623de921e854a9507225d (MD5) Previous issue date: 2009-08-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Honeybees managed in semi-arid region were observed with the objective to determine the individual body surface temperature in different places, as well the heat loss by convection. The body surface temperature was measured with micro thermocouple type T touching in three different body region (the head, thorax and abdomen), its collected from four different places (beehive, hive entrance, foraging and watering place) in which they was arrested by the wings between thumb and forefinger for a few seconds, without causing any injury to the animal. The same time was made measurements of climatic variables. The convective heat transfer was estimated by the theory of convection from a horizontal cylinder. The results showed that had different among temperature surface in parts of the body and in different places. The thorax showed the hottest part of the body, then the head and abdomen was the coldest. In hive entrance the bee had the highest thorax temperature (36.6°C) due the shivering caused for flight muscles. Already, in watering place the surface temperature was the lowest in all parts of the body probably because almost always the body surface had wet by water, if not, at the time of measuring the bee regurgitated the liquid ingest in your body. When the bee was in beehive and in hive entrance (in conditions of low wind) the heat loss by convection increases from 0 to 7.5 W m-2 while increase in the gradient temperature from 0 to 10ºC, but when the wind was 1.0 ms-1 the heat loss by convection increases from 0 to 27.5 W cm-2. In bee hive when the black globe showed a temperature of 43°C, the body surface temperature of bee was 46°C, but when the black globe temperature increased 6°C, the body surface temperature lowered 3°C. These results clearly explain that the bee in a semi-arid region in individual or society has physiological and behavioral mechanisms to regulate their body temperature, but more studies are requires know the most efficient thermoregulatory processes. And climatic variations of the environment are crucially to their thermoregulatory behavior / Abelhas criadas em uma região semi-árida foram observadas com o objetivo de determinar qual a temperatura da superfície corpórea do individuo em diferentes lugares, além da sua perda de calor por convecção. A temperatura da superfície corporal foi medida com micro-termopar tipo T tocando em três diferentes regiões do corpo (cabeça, tórax e abdome) da abelha, sendo estas coletadas em quatro diferentes lugares: dentro da colméia, no alvado, forrageando e no bebedouro. Para a medição da temperatura da superfície corpórea, as abelhas tinham as asas presas pelo dedo polegar e indicador por alguns segundos e logo após eram soltas, sem causar nenhuma injúria ao animal. Ao mesmo tempo era feitas as medições das variáveis climáticas. A transferência de calor por convecção foi estimada aplicando-se a teoria da convecção em cilindros horizontais. Os resultados mostraram que houve diferença de temperatura de superfície entre as partes do corpo e nos diferentes lugares. O tórax apresentou a parte mais quente do corpo, seguido da cabeça e abdômen. A abelha no alvado apresentou a maior temperatura de superfície do tórax (36,6°C). Já, no bebedouro a temperatura de superfície foi a mais baixa em todas as partes do corpo. Provavelmente por apresentarem quase sempre a superfície do corpo molhada, se não, na hora da medição a abelha regurgitava a água ingerida no seu próprio corpo. Quando a abelha se encontrava dentro da colméia e no alvado a perda de calor por convecção aumentou de 0 a 7,5 W m-2 com o aumento no gradiente de temperatura de 0 a 10ºC, mas quando o vento foi de 1,0 m s-1 a perda de calor por convecção aumentou de 0 a 27,5 W m-2. Quando a abelha estava no interior da colméia e o globo negro apresentou uma temperatura de 43°C, a temperatura de superfície corpórea desta foi de 46°C, mas quando a temperatura de globo negro aumentou 6°C, a temperatura de superfície corporal da abelha baixou 3°C. Estes resultados explicam claramente que as abelhas em uma região semi-árida como indivíduo ou em colônia possuem mecanismos fisiológicos e comportamentais para regular sua temperatura corporal. E que as variações climáticas do meio ambiente são determinantes para o seu comportamento termorregulatório / 2017-05-16

Fundação Araucária / Escassas são as informações sobre os efeitos dos entomopatógenos e extratos vegetais sobre organimos não alvos, como os polinizadores, em especial as abelhas Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de micro-organismos entomopatogênicos e extratos vegetais sobre A. mellifera. Para isto, os entomopatógenos Metarhizium anisopliae (Metarril® WP) Beauveria bassiana (Boveril® WP) e Bacillus thuringiensies subespécie Kurstaki (Thuricide® WP) e os extratos vegetais de Romã (Punica granatum L.), Chapéu-de-couro (Echinodorus grandiflorus), Manjerona (Origanum majorana L.), Camomila (Matricaria recutita L.) foram avaliados sobre as operárias de A. mellifera em quatro diferentes formas de aplicação: 1- pulverização direta dos tratamentos sobre as abelhas operárias ; 2- contato em superfície vítrea pulverizada com os tratamentos; 3- contato com as folhas de soja imersas na solução dos tratamentos e 4- misturando-se os tratamentos na pasta Cândi. Para as respectivas testemunhas utilizou-se água destilada esterilizada e pasta Cândi pura. Cada tratamento foi composto por cinco repetições, com 20 abelhas por repetição, estas foram acondicionadas em caixa gerbox e posteriormente em câmara climatizada tipo B.O.D. (27 ± 2 °C, U.R. 60% ± 10%, fotofase de 12 h). A mortalidade/sobrevivência das operárias foi avaliada a partir da uma hora até ás 240 horas, sendo os dados submetidos ao procedimento Bayesiano. As operárias mortas pela ingestão de pasta Cândi contaminada foram separadas e selecionadas aleatoriamente para a retirada do mesêntero (ventrículo) e posterior análise histológica. Os mesmos foram avaliados quanti e qualitativamente.Os produtos Boveril®, Metarril® e Thuricide® e os extratos vegetais de Manjerona, Camomila, Romã e Chapéu-de-couro reduziram a sobrevivência das operárias de A. mellifera. Verificou-se que o produto Boveril® e o extrato vegetal de Manjerona reduziram a sobrevivência das operárias de A. mellifera em todos os bioensaios realizados. Os tratamentos com os produtos biológicos comerciais Boveril® e Thuricide® provocaram alterações morfológicas no mesêntero de A. mellifera, quando alimentadas com pasta Cândi incorporada com esses produtos. Os extratos vegetais Manjerona e Romã causaram modificações morfométricas, reduzindo o comprimento de células do mesêntero de A. mellifera,mas sem causar alterações morfológicas.Estes resultados fornecem informações importantes para o manejo dos insetos-pragas com o intuito de preservar os agentes polinizadores. / Information on the effects of plant extracts and entomopathogens on non-target organisms such as pollinators, especially bees Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) are scarce. In this sense, the present work aimed to evaluate the effect of entomopathogenic microorganisms and plant extracts on A. mellifera. For this, the entomopathogenic Metarhizium anisopliae (Metarril® WP), Beauveria bassiana (Boveril® WP) and Bacillus thuringiensies subspecies Kurstaki (Thuricide® WP) and plant extracts of Romã (Punica granatum L.), Chapéu-de-couro (Echinodorus grandiflorus), Manjerona (Origanum majorana L.), Camomila (Matricaria recutita L.) were evaluated on the workers of A. mellifera in four different forms of application: 1 - direct spray of treatments on the worker bees; 2- contact in a glass surface sprayed with the treatments; 3- contact with soybean leaves immersed in the solution treatments and 4- mixing the treatments in a paste Candi pure. For the respective controls it has been used sterile distilled water and paste Candi pure. Each treatment consisted of five replicates, with 20 bees per replication, and these were placed in Gerboxes and later in a climate chamber type B.O.D. (27 ± 2 °C, U.R. 60% ± 10%, photoperiod of 12 h). The mortality / survival of the workers were assessed from one hour to 240 hours, and the data submitted to the Bayesian procedure. The workers bee killed by the ingestion of contaminated Candi paste were separated and randomly selected for the withdrawal of the midgut (ventricle) and subsequent histological analysis. The same quality and quantity have been assessed. The products Boveril®, Metarril® and Thuricide® and the plant extract of Manjerona, Camomila, Romã e Chapéu-de-couro have decreased the survival of A. mellifera workers. It has been found that the product Boveril® and the plant extract of Manjerona have reduced the survival of A. mellifera workers in all bioassays performed. The treatments with the biological commercial products Boveril® and Thuricide® caused morphological changes in the midgut of A. mellifera, when they were fed with Candi paste incorporated to these products.The plant extracts of Manjerona and Romã caused morphological changes, reducing the length of the midgut cells of A. mellifera, but without causing morphological changes. These results provide important information for the management of insect pests in order to conserve pollinator’s agents.

Fundação Araucária / Escassas são as informações sobre os efeitos dos entomopatógenos e extratos vegetais sobre organimos não alvos, como os polinizadores, em especial as abelhas Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de micro-organismos entomopatogênicos e extratos vegetais sobre A. mellifera. Para isto, os entomopatógenos Metarhizium anisopliae (Metarril® WP) Beauveria bassiana (Boveril® WP) e Bacillus thuringiensies subespécie Kurstaki (Thuricide® WP) e os extratos vegetais de Romã (Punica granatum L.), Chapéu-de-couro (Echinodorus grandiflorus), Manjerona (Origanum majorana L.), Camomila (Matricaria recutita L.) foram avaliados sobre as operárias de A. mellifera em quatro diferentes formas de aplicação: 1- pulverização direta dos tratamentos sobre as abelhas operárias ; 2- contato em superfície vítrea pulverizada com os tratamentos; 3- contato com as folhas de soja imersas na solução dos tratamentos e 4- misturando-se os tratamentos na pasta Cândi. Para as respectivas testemunhas utilizou-se água destilada esterilizada e pasta Cândi pura. Cada tratamento foi composto por cinco repetições, com 20 abelhas por repetição, estas foram acondicionadas em caixa gerbox e posteriormente em câmara climatizada tipo B.O.D. (27 ± 2 °C, U.R. 60% ± 10%, fotofase de 12 h). A mortalidade/sobrevivência das operárias foi avaliada a partir da uma hora até ás 240 horas, sendo os dados submetidos ao procedimento Bayesiano. As operárias mortas pela ingestão de pasta Cândi contaminada foram separadas e selecionadas aleatoriamente para a retirada do mesêntero (ventrículo) e posterior análise histológica. Os mesmos foram avaliados quanti e qualitativamente.Os produtos Boveril®, Metarril® e Thuricide® e os extratos vegetais de Manjerona, Camomila, Romã e Chapéu-de-couro reduziram a sobrevivência das operárias de A. mellifera. Verificou-se que o produto Boveril® e o extrato vegetal de Manjerona reduziram a sobrevivência das operárias de A. mellifera em todos os bioensaios realizados. Os tratamentos com os produtos biológicos comerciais Boveril® e Thuricide® provocaram alterações morfológicas no mesêntero de A. mellifera, quando alimentadas com pasta Cândi incorporada com esses produtos. Os extratos vegetais Manjerona e Romã causaram modificações morfométricas, reduzindo o comprimento de células do mesêntero de A. mellifera,mas sem causar alterações morfológicas.Estes resultados fornecem informações importantes para o manejo dos insetos-pragas com o intuito de preservar os agentes polinizadores. / Information on the effects of plant extracts and entomopathogens on non-target organisms such as pollinators, especially bees Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) are scarce. In this sense, the present work aimed to evaluate the effect of entomopathogenic microorganisms and plant extracts on A. mellifera. For this, the entomopathogenic Metarhizium anisopliae (Metarril® WP), Beauveria bassiana (Boveril® WP) and Bacillus thuringiensies subspecies Kurstaki (Thuricide® WP) and plant extracts of Romã (Punica granatum L.), Chapéu-de-couro (Echinodorus grandiflorus), Manjerona (Origanum majorana L.), Camomila (Matricaria recutita L.) were evaluated on the workers of A. mellifera in four different forms of application: 1 - direct spray of treatments on the worker bees; 2- contact in a glass surface sprayed with the treatments; 3- contact with soybean leaves immersed in the solution treatments and 4- mixing the treatments in a paste Candi pure. For the respective controls it has been used sterile distilled water and paste Candi pure. Each treatment consisted of five replicates, with 20 bees per replication, and these were placed in Gerboxes and later in a climate chamber type B.O.D. (27 ± 2 °C, U.R. 60% ± 10%, photoperiod of 12 h). The mortality / survival of the workers were assessed from one hour to 240 hours, and the data submitted to the Bayesian procedure. The workers bee killed by the ingestion of contaminated Candi paste were separated and randomly selected for the withdrawal of the midgut (ventricle) and subsequent histological analysis. The same quality and quantity have been assessed. The products Boveril®, Metarril® and Thuricide® and the plant extract of Manjerona, Camomila, Romã e Chapéu-de-couro have decreased the survival of A. mellifera workers. It has been found that the product Boveril® and the plant extract of Manjerona have reduced the survival of A. mellifera workers in all bioassays performed. The treatments with the biological commercial products Boveril® and Thuricide® caused morphological changes in the midgut of A. mellifera, when they were fed with Candi paste incorporated to these products.The plant extracts of Manjerona and Romã caused morphological changes, reducing the length of the midgut cells of A. mellifera, but without causing morphological changes. These results provide important information for the management of insect pests in order to conserve pollinator’s agents.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The royal jelly (RJ), a secretion produced by the hipopharingeal and mandibular glands of the nurse honeybees, have a variety of pharmacological activities, aside of being necessary for the castes differentiation and the queen Apis mellifera longevity. To identify the N-glycoproteins of two samples of RJ provinient from distinct origin and conditions, we used the concanavalin A affinity chromatography (ConA) associated to the mass spectrometry. The investigated samples of RJ were the brazilian RJ (GRB), produced experimentally in local apiary, and the Chinese RJ (GRC), mattered from China and commercially available. The protein profile in SDS-PAGE 1D was characteristic for GRB and GRC. The N-glycoproteins fractions eluted from the ConA column had presented nine polypeptides for GRB and 12 for GRC, with relative molecular mass (Mr) varying between 130 and 15 kDa. It was observed that the immediately aftercollects freezing of the GRB did not inhibited the appearance of bands with Mr lesser than 49 kDa. A total of 21 bands was excised from gel and digested with tripisin for analysis in MALDI-TOF MS. The bioinformatic analysis revealed that all the 16 proteins identified in the GRB and GRC samples belong to the A. mellifera apalbumins family (Apa-1, Apa-2 and Apa-3). The Apa-2 was the protein that had greater prevalence between the N-glycoproteins of the RJ, presenting Mr varying between 110 and 25 kDa. The fact that the Apa-2 had been identified with distinct Mrs can be related to glycosilation, oligomerization or degradation of this apalbumin. Therefore, the ConA affinity chromatography associated with the proteomic analysis made possible the identification of three members of the family of RJ main proteins (Apa-1, Apa-2 and Apa-3). Moreover, the comparative study of the GRB and GRC glycoprotein composition suggests similar standard between these samples and can be useful in future studies that evaluate the biological functions of the apalbumins pos-translational modifications. / A geléia real (GR), uma secreção produzida pelas glândulas hipofaringeal e mandibular das abelhas operárias, possui uma variedade de atividades farmacológicas, além de ser fundamental para a diferenciação das castas e longevidade da rainha de Apis mellifera. Com o objetivo de identificar alguns dos componentes bioativos deste produto da colméia, utilizou-se a cromatografia de afinidade de concanavalina A (ConA) associada à espectrometria de massa para identificar as N-glicoproteínas de duas amostras de GR obtidas de origem e condições distintas. As amostras de GR investigadas foram a GR brasileira (GRB), produzida experimentalmente em apiário local, e a GR chinesa (GRC), importada da China e disponível comercialmente. O perfil de proteínas em SDSPAGE 1D foi característico para GRB e GRC, com um maior número de polipeptídeos para GRC. As frações das N-glicoproteínas eluídas da coluna de ConA apresentaram nove polipeptídeos para GRB e 12 para GRC, com massa molecular variando entre 130 e 15 kDa. Observou-se que o congelamento imediatamente pós-coleta da GRB não impediu o aparecimento de polipeptídeos com Mr menor que 49 kDa. Um total de 21 bandas foi excisado do gel e digerido por tripsina para análise em MALDI-TOF MS. Para cada perfil de massa dos peptídeos (PMF) obtido, realizou-se a busca em banco de dados utilizando-se o software Mascot. Esta análise revelou que as 16 proteínas identificadas nas amostras de GRB e GRC pertencem à família das apalbuminas (Apa-1, Apa-2 e Apa-3) da abelha A. mellifera. A Apa-2 foi a proteína que teve maior prevalência entre as N-glicoproteínas da GR, apresentando Mr variando entre 110 e 25 kDa. O fato da Apa-2 ter sido identificada com Mrs distintas pode estar relacionado a fenômenos de glicosilação, oligomerização ou degradação desta apalbumina. Portanto, a cromatografia de afinidade de ConA associada a análise proteômica possibilitou a identificação de três membros da família das principais proteínas da GR (Apa-1, -2 e -3). Além disso, o estudo comparativo da composição de glicoproteínas da GRB e GRC sugere padrão similar entre estas amostras e pode ser útil em estudos futuros que avaliem as funções biológicas das modificações pós-traducionais das apalbuminas. / Mestre em Genética e Bioquímica

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies