Les canaux calciques dépendants du voltage (CCVD) sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la libération de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou encore la régulation de l'expression génique. Les CCVD sont constitués d'une sous-unité canalaire (alpha1 ou Cav) par laquelle les ions Ca2+ entrent dans le milieu intracellulaire, associée à différentes sous-unités auxiliaires, alpha2delta, beta et gammaqui régulent leur fonction. Ma thèse a contribué à la mise en évidence d'une nouvelle voie de régulation du couplage excitation-transcription impliquant la sous-unité beta4 des CCVD. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à la compréhension des déterminants de l'entrée de beta4 dans le noyau et aux mécanismes de régulation de l'expression génique par cette sous-unité des CCVD. Un modèle animal nous a été particulièrement utile, la souris léthargique (lh), déficiente pour la sous-unité beta4 et considérée comme un modèle d'étude de l'épilepsie-absences. Une translocation de beta4 du cytoplasme vers le noyau est observée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l'intégrité structurale de beta4 et plus précisément de l'interaction de ses domaines SH3 (Src Homology 3) et GK (Guanylate Kinase). La translocation de beta4 au noyau nécessite son association avec un partenaire : la sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 2A (PP2A), B56delta. La dépolarisation membranaire permet un décrochage de beta4 du canal et son association à B56delta. beta4 migre donc vers le noyau sous forme de complexe avec B56delta/PP2A. Une étude transcriptomique réalisée pour comparer le profil d'expression dans le cervelet de souris lh par rapport aux souris wild-type a montré l'implication de beta4 dans la répression et l'activation d'un certain nombre de gènes. Particulièrement beta4 réprime fortement l'expression du gène qui code pour la tyrosine hydroxylase (TH). Dans le noyau, beta4 interagit avec un facteur de transcription, le récepteur aux hormones thyroïdiennes alpha(TRalpha). Cette association permet au complexe beta4/B56delta/PP2A de cibler la région promotrice du gène TH comme cela a été montré par des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le complexe beta4/B56delta/PP2A est capable de s'associer aux histones et de déphosphoryler spécifiquement les histones H3 en Ser10 au niveau de la région promotrice du gène TH. Cette modification de la chromatine est corrélée avec le recrutement de Heterochromatin Protein 1 gamma (HP1gamma au niveau du promoteur du gène TH. HP1gamma est impliquée dans la formation d'hétérochromatine et pourrait expliquer la répression de l'expression du gène TH. Ainsi dans le cervelet de souris lh, l'absence de beta4 déclenche un dérèglement de cette voie de signalisation qui entraîne la sur-expression du géne TH. La mutation humaine R482X à l'origine de la délétion d'une partie du domaine C-terminal de beta4 et responsable d'une forme d'épilepsie juvénile myoclonique, perturbe la localisation nucléaire de beta4. En effet, le mutant beta1-481 incapable de s'associer à B56delta/PP2A et de migrer au noyau n'interagit pas avec les histones. La voie de signalisation permettant la régulation de l'expression génique par beta4 n'est donc plus assurée par le mutant. Ainsi, la fonction debeta4 ne se limite pas à son action cytoplasmique en tant que sous-unité auxiliaire des CCVD. En effet, ce travail montre combien dans le noyau,beta4, joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique.

Chez les hamsters, les jours longs activent la reproduction. Cette activation photopériodique (AP) impliquerait la mélatonine, l’hormone thyroïdienne (HT) et les RFamides hypothalamiques. Si les jours courts inhibiteurs sont maintenus au-delà de 20 semaines, une réactivation photoréfractaire (RP) de l’axe hypothalamo pituitaire gonadotrope (HPG) est déclenchée. Les mécanismes de cette RP sont inconnus. Notre analyse de la cinétique des changements moléculaires induits par l’AP et la RP montre dans les deux cas une inhibition précoce de l’expression de la Désiodinase 3 (Dio3), l’enzyme catabolisant les HT, dans les tanycytes. Associée à une inhibition tardive du transporteur MCT8 des HT, la diminution de Dio3 pourrait créer un pic d’HT dans l’hypothalamus. Dans les 2 activations, Kisspeptine et RFRP3 augmentent plusieurs semaines après l’inhibition de Dio3 et l’activation de l’HPG. Aussi, une inhibition d’RFRP3 lors de l’AP n’affecte pas l’HPG, mettant en cause le rôle du RFRP3. Nous avons donc découvert une inhibition précoce de Dio3 pouvant induire l’activation saisonnière de l’HPG. Le régulateur saisonnier précoce de Dio3 reste à découvrir. / In hamsters, reproduction is activated by long days. This photoactivation (PA) supposedly involves melatonin, hypothalamic thyroid hormones (TH) and RFamide peptides. Maintaining inhibitory short days for over 20 weeks triggers a photorefractory reactivation of the hypothalamo pituito gonadotropic axis (HPG) The mechanisms of this PR are so far unknown. Our cinetic analysis of the dynamic molecular changes in PA and PR revealed a conserved early inhibition of tanycytic deiodinase 3 (Dio3), which catabolizes TH, in both activation mechanisms. Associated with a late decrease of the TH transporter MCT8, the inhibition of Dio3 could generate an early peak of hypothalamic TH. In both activations, RFamide upregulation occurs several weeks after the initial Dio3 inhibition. Also, pharmacological inhibition of RFRP3 during PA does not influence the HPG activity, questioning the role of RFRP3 in HPG activation. We have thus uncovered a so far unreported early Dio3 inhibition that could be sufficient to seasonally reactivate the gonadotropic axis. The seasonal regulator of Dio3 remains to be discovered.

Le cerveau adulte des mammifères conserve sa capacité à générer de nouvelles cellules cérébrales à partir de cellules souches neurales (CSNs), principalement localisées dans deux régions cérébrales spécifiques, l'hippocampe et la zone sous-ventriculaire (SVZ). Ce processus, appelé neurogenèse, permet la formation de nouveaux neurones et de nouvelles cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes). Différents signaux contrôlent la prolifération et la différenciation des CSNs. Parmi ces signaux, les hormones thyroïdiennes (HTs) sont impliquées dans la prolifération des CSNs de la SVZ et dans la différenciation neuronale. À l’inverse des cellules différenciées, telles que les neurones ou les glies, les CSNs ont un fonctionnement – ou métabolisme – principalement basé sur la glycolyse et sur une faible respiration mitochondriale. Or l'évolution du métabolisme des CSNs peut influencer leur choix de destin cellulaire. Les HTs jouant un rôle important dans l'activation du métabolisme mitochondrial, j'ai testé l'hypothèse selon laquelle le choix du destin des CSNs de la SVZ adulte se ferait grâce à l'influence de la signalisation thyroïdienne sur l'activité mitochondriale. J'ai tout d'abord montré in vivo et in vitro que les HTs permettent la détermination des CSNs en précurseurs neuronaux dans la SVZ, tandis qu'une période d'hypothyroïdisme favorise la détermination gliale. La transthyrétine, protéine de liaison des HTs, est spécifiquement présente dans les cellules de la SVZ ayant un destin neuronal, alors que la désiodase de type 3, inactivatrice des HTs, est exprimée par les précurseurs oligodendrocytaires (OPCs), indiquant une activationdifférentielle de la signalisation thyroïdienne dans les deux lignages cellulaires. Par ailleurs j'ai pu observer que les cellules s'engageant vers un destin neuronal possèdent une plus grande activité mitochondriale que les OPCs. La présence d'HTs favorise de plus la respiration mitochondriale, ainsi que la production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) issus de l'activité des mitochondries, dans les cellules de la SVZ. Un blocage des protéines de la chaîne respiratoire empêche les HTs de promouvoir la détermination neuronale, montrant la nécessité de l'activation mitochondriale pour l'engagement des CSNs en précurseurs neuronaux. On sait d'autre part que les modifications morphologiques (ou dynamiques) mitochondriales sont nécessaires à l'augmentation de la respiration. La division (ou fission) des mitochondries est en particulier essentielle à une bonne répartition intracellulaire de la production de l'énergie issue de la respiration, ainsi qu'à la migration cellulaire. Dans les cellules de la SVZ, j'ai montré que l'action des HTs permet l'activation de la protéine DRP1, médiatrice de la fission mitochondriale, et ce principalement dans les cellules du lignage neuronal. Les HTs favorisent donc la détermination des CSNs de la SVZ vers un destin neuronal grâce à l'activation de la respiration et de la fission mitochondriales. / The adult mammalian brain maintains its capacity to generate new cells from neural stem cells (NSCs), mainly localized in two specific brain regions, the hippocampus and the sub-ventricular zone (SVZ). This process, named neurogenesis, results in the production of new neurons and new glial cells (astrocytes and oligodendrocytes). Several signals control NSCs proliferation and differentiation. Among those, thyroid hormones (THs) are involved in NSCs proliferation in the SVZ and in neuronal differentiation. NSC metabolism relies mainly on glycolysis associated with a low mitochondrial activity, whereas mature cells, like neurons and glia, preferentially use oxidative phosphorylation. Changes in NSC metabolism can impact cell fate. As THs play an important part in activating mitochondrial metabolism, I hypothesized that the influence of TH signaling on mitochondrial activity triggers NSC fate choice in the adult SVZ. First, I showed in vivo and in vitro that THs allow NSC determination in neuronal precursors, whereas a short hypothyroidism favors glial determination. Transthyretine, a TH binding protein, is specifically present in the SVZ cells having a neuronal fate, while type 3 deiodinase, a TH inhibitor, is expressed by oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These results indicate that THs signaling isdifferentially activated in neuronal and glial cell lineages. I observed that cells adopting a neuronal fate display a greater mitochondrial activity when compared to OPCs, and that TH signaling favors mitochondrial respiration and ROS production in the SVZ cells. Inhibiting the mitochondrial respiratory chain prevents TH-mediated promotion of neuronal determination, proving the need of mitochondrial activation for NSC commitment toward a neuronal phenotype. Besides, it is also known that modifications of mitochondrial morphology (or mitochondrial dynamics) are required for the respiration to increase. Among mitochondrial dynamics, fission is crucial for a good intracellular repartition of energy production, and for cell migration. In the SVZ cells, I showed that, DRP1, the main inducer of mitochondrial fission, is activated by THs mainly in cells adopting a neuronal fate. Thus, THs favor NSC fate choice toward a neuronal phenotype through the activation of mitochondrial metabolism and mitochondrial fission in the adult mouse SVZ.

Dans le thyrocyte normal, la TSH active une voie dépendante de l’adénylyl cyclase/AMPc, qui représente l’une des trois voies mitogéniques de la thyroïde. La cascade de signalisation de la TSH diffère des deux autres voies dans sa capacité à induire à la fois la prolifération et la différenciation, comprenant la synthèse et la sécrétion des hormones thyroïdiennes. Identifier les acteurs de cette cascade de signalisation, ainsi que les interactions entre effecteurs, est donc très important pour la compréhension de la fonction de la cellule thyroïdienne. C’est dans ce cadre que s’insère notre travail au cours duquel nous nous sommes intéressés au récepteur de la TSH ainsi qu’à une protéine récemment identifiée dans le laboratoire et dont l’expression est modulée en réponse à la TSH dans la thyroïde :C3VS. <p>C3VS est une protéine qui présente six motifs ankyrine et une tirette à leucine et dont la fonction était inconnue à l'époque. Dans un premier temps, nous avons contribué à l’obtention de la séquence codante complète du C3VS de chien, puis, l'identification des partenaires d'une protéine pouvant aider à caractériser sa fonction, nous nous sommes proposé de rechercher les partenaires potentiels de la région N-terminale de C3VS par la méthode double-hybride. Nous avons étudié la distribution tissulaire et la régulation par la TSH de différents partenaires isolés. Parmi eux, SUG1, une ATPase du protéasome 26S, a été étudiée plus avant mais l’interaction n’a pas pu être confirmée par "GST-pulldown assay". Simultanément, une remise en question de la position de la méthionine initiale de C3VS, couplée à une impossibilité d’exprimer la protéine en cellules COS par transfection mettait en péril le travail. En l’absence de plus d’arguments fonctionnels permettant d’orienter l’étude des positifs, cette partie du travail a été suspendue au profit de notre étude sur le récepteur de la TSH. L'activation de cascades différentes dans le thyrocyte humain et canin pouvant être due à l'action de protéines intracellulaires, nous avons tenté de rechercher par double-hybride des partenaires protéiques autres que les protéines G pour le récepteur de la TSH. Nous avons ainsi identifié PRA1 mais nous n’avons pas pu confirmer l'interaction entre les deux protéines par "GST-pulldown assay". Pour tenter de comprendre le rôle de cette interaction, nous avons réalisé des essais fonctionnels en transfectant des cellules pour évaluer l'implication de PRA1 sur la synthèse d’AMPc. Ces expériences ne nous ont pas permis de montrer un rôle pour PRA1 au niveau de la cascade, mais en revanche, nous avons mis en évidence le fait que la co-transfection de deux ADNc codant pour des protéines membranaires sature la machinerie de traduction et diminue l'expression du RTSH. <p>Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons étudié la 5-phosphatase SHIP2, dont l’implication dans la cascade de réponse à l’insuline était suggérée, entre autres, par le travail d’Isabelle Vandenbroere qui avait montré l’interaction de cette protéine avec CAP et c-Cbl. Nous avons développé au laboratoire la culture de la lignée pré-adipocytaire 3T3-L1 et étudié la localisation de SHIP2 au niveau des rafts de ces cellules. Nous avons montré que SHIP2 n’y est pas recrutée. CAP et c-Cbl ne semblent pas non plus y être recrutées, tandis que nous y avons détecté le récepteur de l'insuline. La localisation de différentes protéines impliquées dans la cascade de l'insuline dans les rafts est une question controversée à l’heure actuelle et notre étude montre que l’implication fonctionnelle de SHIP2 dans la cascade de l'insuline n'est probablement pas dépendante des rafts.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La métamorphose est une étape cruciale du cycle de vie de beaucoup de métazoaires. Elle est définie comme la transition d’une larve en un juvénile, souvent accompagnée de changements drastiques de morphologie, physiologie et de niche écologique. Le rôle des hormones thyroïdiennes a été mis en évidence dans la métamorphose des amphibiens, mais aussi de nombreux autres chordés comme certains poissons téléostéens ou l'amphioxus, suggérant que ce système était déjà présent et impliqué dans la métamorphose chez l'ancêtre commun de tous les chordés.Nous avons étudié le lien entre hormones thyroïdiennes et métamorphose selon deux axes. Premièrement, nous avons étudié la coordination entre la métamorphose et le recrutement larvaire, chez le chirurgien bagnard Acanthurus triostegus. Ce travail nous a permis de mieux comprendre le rôle de l’hormone thyroïdienne comme signal déclencheur d'une transition écologique importante. Dans le second axe de travail nous avons examiné l’origine de la signalisation thyroïdienne. Chez l’annélide Platynereis dumerili, nous avons identifié un récepteur fonctionnel des hormones et un rôle de l’hormone thyroïdienne dans son développement. Cela qui nous permet de démontrer que la signalisation thyroïdienne était présente à l’origine des bilateriens. Nous avons également mis en évidence un rôle des hormones thyroïdiennes dans le développement de cette espèce. Enfin dans le troisième axe nous nous sommes penchés sur l’origine de la synthèse de l’hormone thyroïdienne en retraçant l’évolution de la thyroglobuline, la protéine nécessaire à la production d’hormone chez les vertébrés. Son absence dans les autres taxons, alors que les dérivés de l’hormone y ont un rôle biologique, pose la question des mécanismes ancestraux de synthèse de ces hormones.Ces travaux explorent l’évolution de la signalisation thyroïdienne et proposent d’aborder la question du lien avec la métamorphose d’un point de vue évolutif et non-seulement développemental, afin de mieux comprendre la diversité des métamorphoses observées dans le monde animal. / Metamorphosis is a critical life step of many metazoans. It is defined as the transition between a larva and a juvenile. It comes with major changes of morphology, physiology and ecology. The role of thyroid hormone has been proven in the metamorphosis of amphibians but also in many other chordates such as teleost fishes or the amphioxus. This suggests that this system was functional and involved in the metamorphosis of the common ancestor of all chordates.We studied the link between thyroid hormones and metamorphosis according to two axes. First, we studied the coordination between metamorphosis and the larval colonization, using the convicted surgeon fish Acanthurus triostegus as a model. This work allowed us to better understand the role of thyroid hormones as a trigger signal of a major ecological transition. On the second axis, we investigated the origin of thyroid hormone signalization. In the annelid Platynereis dumerilii, we identified a functional thyroid hormone receptor and a role of TH in its development. This proves that thyroid hormone signaling was present at the basis of bilaterians. We also assessed the question of the origin of thyroid hormone synthesis by tracing back the evolution of the thyroglobulin, the protein mandatory for thyroid hormone synthesis in vertebrates. It absence in the other taxa, whereas thyroid hormone derivatives have a biological role, asks the question of the ancestral mechanisms of thyroid hormone synthesis.These works investigate the evolution of the thyroid hormone signalization and suggest to tackle the question of the link with metamorphosis from an evolutionary perspective, and not only from a developmental one, in order to better understand the diversity of metamorphosis overserved in the animal kingdom.

Le maintien et le renouvellement des populations de poissons coralliens dépendent en grande partie du recrutement larvaire, c’est-à-dire de l’installation des larves pélagiques dans les habitats récifaux adultes, et de leur survie après s’être métamorphosées en juvéniles. De plus en plus d’études révèlent que les changements de composition de l’eau, causés par le changement climatique et la pollution, peuvent altérer les capacités sensorielles des poissons coralliens, diminuant leurs aptitudes à localiser des habitats propices (maximisant leur croissance et diminuant leur mortalité) lors de l’installation. Cependant, les mécanismes internes à l’origine de ces phénomènes sont méconnus. Lors de cette thèse, j’ai examiné le recrutement larvaire du poisson chirurgien bagnard Acanthurus triostegus et mis en évidence que les changements écologiques, morphologiques, physiologiques et comportementaux qui s’y déroulent correspondent à une métamorphose contrôlée par les hormones thyroïdiennes (HT). J’ai ensuite analysé comment des stress d’origine anthropique, tels que l’élévation des températures de surface et la pollution par un pesticide d’origine agricole, peuvent perturber sa métamorphose. Lors de cette étape clé de leur cycle de vie, ces perturbations diminuent les taux d’HT, altérant la maturation de leurs organes sensoriels, leurs capacités sensorielles, et augmentant leur mortalité. Cette thèse est donc une analyse holistique de l’impact des perturbations anthropiques sur les processus moléculaires, et les changements histologiques, anatomiques et comportementaux du recrutement larvaire des poissons coralliens. Elle souligne l’importance du système thyroïdien, et invite à une meilleure compréhension des processus endocriniens du recrutement larvaire, dans l’optique d’une amélioration de la conservation des récifs coralliens. / The persistence and sustainability of coral-reef fish populations depends on the continued larval recruitment, i.e. successful settlement by pelagic larvae into adult reef habitats and post-settlement survival through metamorphosis to a juvenile stage. There is growing evidence that changes to water conditions due to global change and waterborne pollution can impair coral-reef fish sensory abilities to locate settlement habitats that maximize growth while minimizing mortality risk. However, the inner mechanisms of such impairments remain unknown. In this thesis, I have examined the recruitment phase of the convict surgeonfish Acanthurus triostegus, and determined that the ecological, morphological, physiological and behavioral changes occurring at recruitment correspond to a metamorphosis mediated by thyroid hormones (TH). Then, I investigated whether this metamorphosis is prone to endocrine disruption under anthropogenic disturbances such as elevated sea water temperature and agricultural pesticide pollution. I demonstrated that such pressures can reduce TH levels at a critical developmental stage in coral-reef fishes, impairing their metamorphic processes such as intestine remodeling, sensory organ maturation, and sensory abilities acquisition, further increasing their mortality rates. Overall, this thesis is a holistic analysis that addresses molecular, histological, anatomical, and behavioral assays of multiple stressors affecting coral-reef fish recruitment. It indicates the importance of a proper endocrine function during coral-reef fish recruitment, highlighting the need for a better understanding of these processes for coral-reef conservation.

La thyroïde capte et concentre l’iodure afin de produire les hormones thyroïdiennes T3 et T4. L’iodure est capté au pôle basolatéral du thyrocyte par le symporteur Na+/I- (NIS) et transporté jusqu'au pôle apical de la cellule où il est oxydé par la thyroperoxydase (TPO). La forme oxydée de l’iodure se lie à des résidus tyrosyls de la thyroglobuline (Tg), contenue dans la thyroïde, qui couplés donneront naissance à la T3 et la T4. L’iodation et le couplage sont possibles grâce à la thyroperoxydase et à la présence d’un système générateur d’H2O2. Celui-ci est composé des protéines à sept hélices transmembranaires Duox1 et Duox2 présentant 83% de similitude de séquence entre elles et possédant deux motifs EF-hand ainsi qu’un site de liaison au FAD et quatre sites de liaison au NADPH. Dans la thyroïde humaine, l’ARN messager de Duox2 est plus exprimé que celui de Duox1. Jusqu'il y a peu de temps, nous n'avions à notre disposition aucun anticorps spécifique de l’une ou l’autre des Duox. Il n'était donc pas possible de déterminer si cette différence d’expression se retrouve au niveau protéique. Les PCCl3 sont une lignée de thyrocytes de rat possédant un système générateur d’H2O2 fonctionnel. Contrairement aux cultures primaires de thyrocytes humains, ces cellules peuvent être transfectées facilement. L’introduction de siRNAs spécifiques de Duox1 ou Duox2 de rat, via des vecteurs plasmidiques, a permis de démontrer que le peroxyde d’hydrogène produit par les PCCl3 est principalement généré par Duox1. En effet, l’inhibition de l’expression de Duox1 est directement corrélée à la diminution de production d’H2O2. Cette inhibition n’interfère pas avec d’autres fonctions de la cellule thyroïdienne puisque les cellules invalidées pour Duox1 sont toujours capables de capter l’iodure. De plus, la réintroduction de l’expression de Duox1 par transduction lentivirale permet de restaurer la production de peroxyde d’hydrogène.<p>Faute d’une maturation correcte des protéines Duox à la membrane plasmique, il a longtemps été impossible de reconstituer un système générateur d’H2O2 actif par transfection de Duox1 et/ou Duox2 en système hétérologue. En 2006, les protéines activatrices des protéines Duox1 et Duox2, respectivement appelées DuoxA1 et DuoxA2, ont été identifiées. Leur co-expression avec les enzymes Duox permet à ces dernières de migrer à la membrane et d’être actives. La distribution tissulaire des protéines DuoxA est parallèle à celle des Duox. La découverte des protéines activatrices a permis d’étudier spécifiquement la régulation de l’activité de Duox1 et de Duox2. La production d’H2O2 de Duox1 est positivement régulée par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la protéine kinase A (PKA). La génération d’H2O2 de Duox2 est sous le contrôle de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ conduisant à l’activation de la protéine kinase C (PKC). L’activation de Duox2 est également corrélée à une modification de l’état de phosphorylation de la protéine. Dans les thyrocytes humains, le récepteur de la TSH est couplé aux protéines Gs et Gq/11. La TSH liée à son récepteur est donc capable d’activer la voie de l’AMPc et la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Dans les thyrocytes humains en culture primaire, l’activation de la PKA et de la PKC mène également à une augmentation de la phosphorylation des protéines Duox. <p>En conclusion :1) Duox1 est majoritairement responsable de la production d’H2O2 dans la lignée de thyrocytes de rat PCCl3 ;2) l’activité de Duox1 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est régulée positivement par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la PKA ;3) l’activité de Duox2 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est stimulée par la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ via des phosphorylations par la PKC ;4) les thyrocytes humains expriment les deux protéines Duox. La production d’H2O2 est augmentée suite à l’activation de la voie de l’AMPc et de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Les protéines Duox sont phosphorylées au niveau basal et cette phosphorylation est augmentée suite à l’activation de la PKA ou de la PKC.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les jeunes oiseaux exposés au froid assurent leur homéothermie en stimulant les oxydations mitochondriales dans les muscles squelettiques. L’exposition prolongée au froid accroit les capacités de thermogenèse musculaire grâce à une plasticité bioénergétique mitochondriale dont le contrôle reste hypothétique. Chez les mammifères, des protéines de fusion (les mitofusines (Mfns) et OPA1(OPtic Atrophy 1)) participent au remaniement des réseaux dynamiques mitochondriaux dans de multiples types cellulaires. Le but de ce travail de thèse était de caractériser l’expression d’homologues aviaires des protéines de fusion mammaliennes et d’étudier leurs variations d’expression lors de la mise en place des processus bioénergétiques chez l’oiseau en croissance, lors d’une exposition aiguë ou prolongée au froid ou lors de challenges nutritionnels ou endocrines.Sur le plan méthodologique, une approche intégrative a été utilisée de l’animal entier (calorimétrie indirecte) à l’expression protéique (western blot) ou transcriptionnelle (RT-PCR) en passant par des mesures de la fonctionnalité bioénergétique sur des fibres musculaires perméabilisées et mitochondries isolées. Deux modèles animaux ont été utilisés, une espèce naturellement adaptée aux conditions extrêmes de l’Antarctique, le manchot Adélie (Pygoscelisadeliae), et un modèle de laboratoire, le canard de Barbarie (Cairina moschata). Nos résultats ont permis de caractériser chez l’oiseau l’expression de protéines de fusion (Mfn2, OPA1) immunoréactives homologues à celles des mammifères. Le séquençage d’une partie de la séquence codante des gènes codant les Mfns a montré une bonne similitude entre les espècesd’oiseaux et les mammifères. Chez le manchot, l’abondance relative de ces protéines dans lesmitochondries musculaires variait avec la croissance et l’exposition thermique en corrélation positiveavec les capacités bioénergétiques musculaires. Chez le canard, l’activité respiratoire et l’abondance relative de ces protéines étaient également corrélées suite à un jeûne de 60h ou, bien que dans une moindre mesure, après altération pharmacologique du statut thyroïdien.Ces résultats montrent pour la première fois chez l’oiseau l’expression de protéines homologues aux protéines de fusion des mammifères. L’association entre les variations d’expression de ces protéines et les modifications bioénergétiques du muscle squelettique indiquent qu’elles pourraient contribuer à la plasticité bioénergétique observée chez l’oiseau en croissance. Ces résultats suggèrent que des modifications potentielles de l’organisation des réseaux mitochondriaux musculaires pourraient contribuer aux réponses adaptatives des organismes face aux contraintes environnementales. / Cold-exposed young birds maintain their homeothermy by stimulating mitochondrial oxidations in skeletal muscle. Prolonged cold exposure enhances muscle thermogenic capacities through mitochondrial bioenergetics plasticity which control still remains hypothetical. In mammals, fusion proteins (mitofusins (Mfns) and OPA1 (Optic Atrophy 1)) contribute to the permanent and dynamic changes in mitochondrial networks in multiple cell types. The aim of our work was to characterize the expression of avian homologues of mammalian fusion proteins and to study the variations of their expression during the establishment of bioenergetics processes in growing birds, during an acute or a prolonged cold exposure and finally during nutritional or endocrine challenges. Methodologically, an integrative approach has been used from whole animal (indirect calorimetry) to protein (western-blot) or gene (RT-PCR) expression through measurements of the bioenergetics functionality of permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria. Two animal models were used, a species naturally adapted to Antarctica harsh conditions, the Adélie penguin (Pygoscelis adeliae), and a laboratory model, the Muscovy duck (Cairina moschata).Our results allowed us to characterize, in birds, the expression of immunoreactive fusion proteins (Mfn2, OPA1) which were homologous to those of mammals. The sequencing of a part of the coding sequence of Mfns genes showed a great similitude between avian and mammalian species. In penguins, the relative abundance of these proteins in muscle mitochondria was modified by growth in the cold and was positively correlated with muscle bioenergetics capacities. In ducks, the respiratory activity and the relative abundance of these proteins were also correlated after a 60h fasting period or,though a lesser extent, after a pharmacological alteration of thyroid status. Our results show, for the first time in birds, the expression of proteins homologous to mammalian fusion proteins. The association between the changes in expression of these proteins and the bioenergetics modifications in skeletal muscle indicates that these proteins could contribute to thebioenergetics plasticity observed in growing chicks. These results suggest that potential modifications of the muscle mitochondrial network organization could play a role in the adaptive responses of organisms to the environmental constraints.

Les biphényles polychlorés (BPC) sont des contaminants de l’environnement, omniprésents dans la chaîne alimentaire, qui ont une propension à la bioaccumulation dans le corps humain. Ils traversent la barrière placentaire et sont suspectés d’induire des altérations du développement mental ou moteur chez des enfants exposés aux BPC pendant la vie intrautérine. Ces effets s’expliqueraient notamment par la capacité des BPC à perturber l’homéostasie de la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Malgré le nombre considérable d’études épidémiologiques réalisées, la relation entre l’exposition prénatale aux BPC et les altérations du développement mental et moteur ou de la fonction thyroïdienne n’a pas encore été clairement établie ; d’une part, différents bioindicateurs de l’exposition ont été employés (différents congénères de BPC mesurés et différentes matrices biologiques ou unités de mesure) limitant la comparaison directe entre les études et, d’autre part, le lien de causalité entre les BPC et les effets ciblés n’a pas été vérifié avec des critères épidémiologiques reconnus. Cette étude a été réalisée afin d’analyser la relation « concentration biologique de BPC – effet » entre l'exposition aux BPC de la mère pendant la grossesse et le développement mental et moteur de l’enfant ainsi que les paramètres de la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte et le nouveau-né à partir d’une analyse systématique des études épidémiologiques disponibles en standardisant les données biologiques entre les études. Sur la base de considérations toxicocinétiques et en appliquant des facteurs de conversion établis à partir de la littérature épidémiologique publiée, les concentrations des BPC rapportées dans les différentes études revues ont été standardisées en termes d’équivalent de BPC totaux par kilogramme de lipides dans le plasma maternel (µg PCBMPEQ/kg de lipides). Afin d’analyser la possibilité d’une association causale entre l’exposition aux BPC et les effets d’intérêt, les critères de Hill ont été appliqués systématiquement à l’ensemble des associations « concentrations biologiques standardisées – effet ciblés ». En appliquant cette approche aux données publiées de 20 études épidémiologiques sur la relation entre les BPC et le poids à la naissance, l’exposition prénatale aux BPC, aux niveaux décrits (moyenne < 1920 µg PCBMPEQ/kg de lipides), n’apparaît pas associée de manière significative à un poids à la naissance inférieur à 2500 g dans les populations étudiées. Par ailleurs, en considérant des études menées sur le suivi de neuf cohortes d’enfants, la probabilité qu’une altération cognitive ou motrice cliniquement significative, qui persiste entre la naissance et l’âge scolaire, soit observée à des concentrations de BPC totaux inférieures à 1000 µg PCBMPEQ/kg de lipides semble faible. Aussi, à partir de l’analyse systématique des données de 17 études épidémiologiques, l’exposition aux BPC aux niveaux standardisés décrits (moyenne < 1000 µg PCBMPEQ/kg de lipides) ne semble pas induire de variation des hormones thyroïdiennes ou de TSH en dehors des intervalles physiologiques reconnus chez la femme enceinte et le nouveau-né. Ainsi, la valeur biologique de référence établie à 1000 µg PCBMPEQ/kg de lipides pour prévenir les effets sur le développement devrait aussi prévenir les effets sur le poids à la naissance et la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Les résultats présentés dans cette thèse fournissent aux autorités de santé publique responsables de l’établissement de directives et des normes de l’information utile à la révision des critères sanitaires visant à protéger des effets des BPC sur le développement de l’enfant et la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte et le nouveau-né. / Polychlorinated biphenyls (PCBs) are persistent organic pollutants (POPs) ubiquitously present in the food chain, and with a propensity to bioaccumulate in the human body. They can cross the placental barrier and are suspected of inducing mental and motor development alterations in children prenatally exposed to PCBs. These contaminants could injure brain development by disrupting thyroid homeostasis in pregnant women or newborns. Despite the large number of epidemiological publications on PCBs, “biological concentration – response” relationships between PCB exposure and mental and motor development or thyroid function in pregnant women and newborns are not well established; a direct comparison of biological levels between published studies is limited by the heterogeneous biological PCB measurements (different PCB congeners or groups of congeners measured, variations in biological matrices sampled or units chosen to express biological results), and causal relationship between PCBs and a studied effect has not been verified with recognized epidemiological criteria. This research was performed to analyze “biological PCB concentration – effect” relationship between prenatal PCB exposure and children mental and motor development as well as parameters of thyroid function in pregnant women and newborns by conducting a systematic analysis of available epidemiological studies and by standardizing biological data between studies. Reported PCB concentrations in the different reviewed studies were standardized in terms of total PCB equivalent per kilogram of lipids in maternal plasma (µg PCBMPEQ/kg of lipids), by taking into account PCB toxicokinetics and using conversion factors based on published epidemiological data. To analyze a possible causal association between PCB exposure and studied effects, Hill criteria were consistently applied to all “standardized biological concentrations – response” associations. The systematic analysis of “standardized biological concentration – birth weight” relationship across 20 reviewed studies did not show any association between prenatal exposure to PCBs at the described levels (mean < 1920 µg PCBMPEQ/kg de lipids) and abnormal birth weight (< 2500 g). Furthermore, combining data from nine children cohorts to assess the “standardized biological concentration – development” relationship during follow-up of each cohort showed that risk of mental or motor development should be negligible for prenatal PCB concentrations below ≈ 1000 µg/kg of lipids in maternal plasma. Also, the systematic analysis of data from 17 epidemiological studies indicated that the weight of evidence of a significant impact of PCB exposure on TSH and thyroid hormone levels was low at reported levels in pregnant women and newborns (mean < 1000 µg PCBMPEQ/kg de lipids). The PCBMPEQ biological reference value of 1000 µg/kg lipids that should prevent neurodevelopmental effects should also prevent effects on birth weight and on thyroid function in pregnant women or newborns. Results presented in this thesis should provide useful information to public health authorities for the revision of guidelines and standards ensuring protection from PCB effects on child development and thyroid function in pregnant women and newborns.

La métabolomique par résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’étudier laréponse métabolique globale d’un système biologique à un stimulus ou un événementphysiopathologique (maladie, manipulation génétique, etc.). Cette discipline connaît un essorimportant dans la recherche clinique et biologique, et constitue ainsi un outil à fort potentielpour la découverte de biomarqueurs de maladies, et l’étude de la fonction des gènes.Cette thèse est dédiée à l’application de la métabolomique par RMN à hauts champspour l’étude des pathologies associées à la signalisation thyroïdienne chez la souris. L’objectifglobal est d’identifier des biomarqueurs spécifiques liés aux différentes maladies hormonales :l’hypothyroïdie et la maladie génétique émergente résistance à l’hormone thyroïdienne due àune mutation au niveau du récepteur TRα1 (RTHα). Cette dernière est particulièrementdifficile à diagnostiquer à cause du manque de marqueurs biochimiques et de symptômesspécifiques à cette maladie. De plus, elle présente des similitudes avec l’hypothyroïdie auniveau symptomatique. Des modèles murins de RTHα et de l’hypothyroïdie ont été analysés,et l’investigation a été menée sur l’urine et le plasma sanguin dans le but de différenciermétaboliquement ces maladies et d’identifier des biomarqueurs spécifiques à RTHα. Dessignatures métaboliques liées à chaque maladie ont été identifiées dans l’urine et le plasmasanguin. Cinq métabolites qui varient de façon significative ont été identifiés dans l’urinecomme étant liés à la maladie RTHα : trimethylamine, dimethylamine, isovalerylglycine, Nacetylglucosamineet la choline. Dans le sang, ce sont les lipides insaturés qui varient de façonsignificative chez les souris mimant la maladie RTHα. / Metabolomics by nuclear magnetic resonance (NMR) allows studying the metabolicresponse of a global biological system to a stimuli or a physiopathological even (diseases,genetic modifications, etc.). This discipline is growing especially in the clinical and biologicalfields, and represents a strong potential tool to identify biomarkers related to diseases, andstudy the function of genes.This thesis is dedicated to the application of metabolomics by high field NMR to studythyroid signalisation pathologies in mice. The main goal is to identify biomarkers related tothe emerging genetic disease called resistance to thyroid hormone due to a mutation in thyroidhormone receptor TRα1 (RTHα). This disease is particularly difficult to diagnose because ofthe lack of biochemical markers and specific symptoms. In addition, it presents commonfeatures with hypothyroidism in term of symptoms. Mice models of RTHα andhypothyroidism were analysed, and the investigation were driven on urine and blood plasmain order to differentiate metabolically theses diseases and identify biomarkers related toRTHα. Metabolic fingerprints related to each disease were identified in both urine and bloodplasma. Five metabolites vary significantly in the urine of RTHα mice: trimethylamine,dimethylamine, isovalerylglycine, N-acetylglucosamine and choline. Unsaturated lipids varysignificantly in the blood plasma of RTHα mice.The impact of thyroid hormones (TH) and the thyroid hormone receptor TRβ on theliver metabolism were also studied in the present manuscript through NMR-basedmetabolomics. A mouse model, with a specific knock-out of TRβ gene in hepatocytes (LTRβ-KO), were used to study this question. To understand the function of TH mediated by TRβ,the liver metabolic response to TH, obtained from liver aqueous extracts and intact livertissues, TRβKO and wild-type mice were compared. The results suggest the presence ofdirect and indirect effects of thyroid hormones on the liver metabolism.