Dermatófitos são um grupo de fungos intimamente relacionados, que tem a capacidade de invadir tecidos queratinizados como pele, cabelos e unhas de homens e outros animais causando dermatofitoses. Os agentes envolvidos nessas infecções pertencem aos gêneros Trichophyton, Microsporum ou Epidermophyton e, de acordo com seu habitat natural, são classificados em espécies geofílicas, zoofílicas ou antropofílicas. A maior incidência de dermatofitoses é causada pelo gênero Trichophyton, sendo T. rubrum a espécie mais prevalente em infecções de pele e unhas em humanos. Devido à severidade e longevidade destas infecções, e à resistência ao tratamento, o estudo de fatores envolvidos na interação patógeno-hospedeiro, na resistência dos dermatófitos a agentes antifúngicos e na manutenção do processo infeccioso são de grande relevância. Por análises morfológicas, fisiológicas e de expressão gênica, comparamos cinco dermatófitos cujos genomas foram sequenciados por iniciativa do Broad Institute, Microsporum canis, Trichophyton equinum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton rubrum e Trichophyton tonsurans. Cultivos em queratina, mimetizando o processo infeccioso, foram utilizados para analisar o envolvimento dos dermatófitos na interação patógeno-hospedeiro e manutenção do processo infeccioso. Também expusemos as espécies a concentrações subinibitórias de agentes terapêuticos, de modo a verificar a resposta destes fungos a diferentes drogas. Observamos que o acúmulo de transcritos dos genes relacionados à virulência em dermatófitos avaliados durante o crescimento em queratina sugere que a maquinaria metabólica com atividade de formação da parede celular do fungo, metabolização do substrato e adesão ao hospedeiro ativa nos períodos iniciais de infecção. Contudo, um padrão de expressão correlacionado à similaridade das sequências genômicas não foi observado nas condições testadas. Também não se observa correlação direta entre o nicho preferencial dos dermatófitos e os níveis transcricionais em resposta à queratina de origem animal. Analisamos três genes envolvidos na resistência a múltiplas drogas (MDR) durante crescimento na presença de drogas com atividade antifúngica. Nossos dados sugerem que os genes MDR atuam sinergicamente em dermatófitos, e podem atuar de forma compensatória quando em presença de drogas antifúngicas, o que pode ser uma importante causa de falhas no tratamento. Nossos resultados fornecem evidências de que a expressão dos genes analisados não se correlaciona com as relações filogenéticas entre estes dermatófitos, visto que apesar da íntima relação entre o conteúdo genético e organização do genoma, os níveis transcricionais destes genes são diferentes entre as espécies. Assim, diferenças na adaptação a nichos específicos e a progressão da doença entre os dermatófitos podem ser explicadas por diferentes perfis de transcrição do gene. / Dermatophytes are a group of closely related fungi, which have the ability to invade keratinized tissues, such as skin, hair, and nails of both human and animal hosts causing dermatophytosis. The agents involved in these infections belong to the genera Trichophyton, Microsporum or Epidermophyton and, according to their natural habitat, are classified as geophilic, zoophilic or anthropophilic species. The higher incidence of dermatophytosis is caused by the genera Trichophyton, being the specie T. rubrum the most prevalent causative of human skin and nail infections. Because of the severity and longevity of these infections and their resistance to treatment, the study of the factors involved in host-pathogen interaction, in resistance of dermatophytes to antifungal agents, and in maintenance of the infection is relevant. Through morphological, physiological and gene expression analysis we compared five dermatophytes, whose genomes were sequenced by initiative of the Broad Institute: Microsporum canis, Trichophyton equinum, Trichophyton interdigitale, T. rubrum and Trichophyton tonsurans. Growth in keratin, which mimetize the infectious process, was used to analyze the involvement of dermatophytes in host-pathogen interaction and maintenance of the infectious process. We also exposed the species to subinibitory concentrations of therapeutic agents to verify the response of these fungi to different drugs. We observed that the accumulation of transcripts of genes related to virulence in dermatophytes evaluated during growth in keratin, suggest that the metabolic machinery with activity on fungal cell wall formation, substrate metabolization, and host adhesion is activated in early stages of infection. However, an expression pattern correlating to genomic sequence similarity was not observed in the conditions tested. We also did not observe a direct correlation between the preferential niche of these dermatophytes and the transcriptional levels in response to the keratin from animal origin. We analyze three genes involved in multidrug resistance (MDR) during growth in the presence of drugs with antifungal activity. Our data suggest that MDR genes act synergistically in dermatophytes, and they may compensate for one another when challenged with antifungal drugs, which can be an important cause of therapeutic failure. We provide evidence that the expression of the analyzed genes does not correlate with the phylogeny of these dermatophytes since, in spite of the different species being highly related in gene content and genome organization, the transcription level of these genes is different among these species. Thus, differences in adaptation to a specific niche and disease progression among dermatophytes would be explained by different gene transcription profiles.

A caracterização da variabilidade genética intra-hospedeiro do vírus da dengue (DENV) é fundamental para a compreensão de sua evolução e dinâmica populacional no contexto atual como um importante patógeno viral humano. A diversidade viral acumulada em hospedeiros infectados influencia diretamente em outros aspectos como patogênese, transmissão e imunidade do hospedeiro. Contudo, apesar de existirem vários estudos sobre a diversidade genética intra-hospedeiro em dengue, nenhum tem sido relatado para DENV-4 até o presente momento. O ressurgimento e disseminação desse sorotipo foi associado com a sua co-circulação e o substituição dos sorotipos 1, 2 e 3 durante os recentes surtos no município do Guarujá-SP. Com base neste quadro epidemiológico, este estudo visou identificar a variação genética intra-hospedeiro do DENV-4 em amostras coletadas durante o surto de 2013, utilizando tecnologias de sequenciamento de nova geração. Portanto, nós caracterizamos a variabilidade genética de DENV-4 em diferentes níveis e as forcas evolutivas que afetam essa diversidade. Em adição, foram explorados os principais eventos na transmissão das variantes de DENV-4 identificadas. Nossos resultados revelaram uma baixa diversidade genética intra-hospedeiro para DENV-4. No entanto, mutação e pressões seletivas foram mecanismos importantes na variabilidade genética do vírus. A nível populacional, as variantes estão sujeitas á seleção natural negativa, não obstante identificamos seleção positiva atuando sob sítios específicos. Nenhuma evidência de recombinação foi detectada. Além disso, contra-intuitivamente, variantes de baixa frequência estão sendo transmitidas e contribuindo para diversidade genética do DENV-4 circulando em Guarujá. Nossos resultados fornecem novas evidências potencialmente úteis para futuros trabalhos focados em infecções mistas, escape imunológico, assim como o espalhamento e diversificação viral. / Characterizing intra-host genetic variability in dengue virus (DENV) virus is paramount for understanding its evolution and population dynamics in the context of its current status as a major human viral pathogen. The extent to which viral diversity accrues in infected host influences aspects such as pathogenesis, transmission, and host immunity. Although there are several studies about intra-host genetic diversity in dengue, so far nothing has been revealed about DENV-4. In the Guarujá municipality in the State of São Paulo, the reemergence and spread of this serotype was associated with its co-circulation and the displacement of serotypes 1, 2 and 3 during recent outbreaks. Based on this epidemiological framework, we seek to identify the intra-host genetic variation of DENV-4 strains from samples collected during the 2013 outbreak by using deep sequencing technologies. We characterized the genetic variability of DENV-4 at different levels, and the forces shaping this diversity. Likewise, we explored major transmission events among DENV-4 variants. Our results revealed a low intra-host genetic diversity for DENV-4. However, we found selective and mutational pressures contributing to genetic diversity, while recombination did not seem play an important role. We further identified purifying selection at population level but sites subject to potential diversifying selection. Additionally, we observed low frequency haplotypes being transmitted among hosts and contributing to the viral diversity of DENV-4 circulating in Guarujá. Our findings provide preliminary insights for future studies in mixed infections, drug resistance, virus variant spread and immune scape. This study is the first effort to investigate the intra-host diversity of DENV-4.

A relação evolutiva entre mamíferos e Plasmodium compreende infecções com reflexos adaptativos de ambos os lados. A evasão imune pelo parasita e a aquisição imune do hospedeiro contra antígenos importantes são extremos de um longo processo. Genes e antígenos variantes do parasita funcionam nesse processo desempenhando papel evasivo, de citoaderência e manutenção do processo infeccioso. Hospedeiros podem adquirir imunidade efetiva por vacinas contra antígenos variantes e antígenos de caráter reinvasivo. Testamos aqui três desenhos experimentais visando: 1- Definir se antigenos variantes BIR estão associados a citoadesão em infecção murina e se sua localização é em eritrócitos infectados. 2- O papel de um transgene controlado por um promotor de genes variantes no processo adaptativo infeccioso, frente a hospedeiros que diferem em apenas um único gene. 3- Criação de um modelo vacinal aplicável a qualquer antígeno relevante em infecções pelo gênero Plasmodium. Como resultados obtivemos que: 1- Antigenos BIR não parecem estar relacionados na cito adesão em modelo murino. Identificamos um outro grupo de antígenos com domínio LCCL que talvez desempenhe um papel de ligante. 2- promotores bir podem sofrer modulação em uma única infecção que difiere em somente um gene em hospedeiros. Os efeitos desencadeados foram maior parasitemia, anergia e tolerância imune sem afetar a morbidade da infecção de maneira nociva ao hospedeiro. Esse efeito parece ser mediado por subpopulações parasitarias usando exossomos entre parasita e hospedeiro. 3- Produzimos um sistema funcional de produção de proteínas recombinantes fusionadas a GPI que permite integração em lipossomos para usos vacinais. A prova de princípio foi o uso de antígenos PfRH5-GPI recombinantes em teste vacinal que conseguiram gerar anticorpos com alta atividade inibitória em cultivos de P. falciparum. Tomados em conjunto mostramos que o hospedeiro é capaz influenciar a expressão de transgenes controlados por promotores bir e que proteolipossomos contendo antígenos relevantes, como PfRH5, possuem potencial protetor quando vacinados contra malaria. / The relation between mammals and Plasmodium comprise infections with adaptive reflections for both sides. The immune evasion by parasites and immune acquisition by the host against important antigens are end points of a long process. Variant genes and proteins of the parasite can exert a role in this process by enbling immune evasion, cytoadherence resulting in the maintainence of the infective process. We tested three experimental approaches focusing on the following points:1-Show if variant BIR antigens are associated with cytoadherence during murine infections 2- The role of a transgene under the control of a variant gene promoter in adaptation to infection in hosts which express or not the transgene 3- Creation of a vaccine model applicable to any relevant antigen in infections with Plasmodium. As results we showed that: 1-BIR antigenes are likely not related to cito adhesion in the murine model. Cytoadherence in this model is probably related to exported parasite proteins with LCCL domains 2-bir promoters can be modulated during infection in hosts which which differ in one unique gene.The effects observed in this case was an increase in parasitemia, anergy and immune tolerance without affecting the morbidity of infection in the host. These effects are apparently mediated by parasite subpopulations producing exosomes that signal from the parasite to the host.3- We generated a system for recombinant protein production where antigens are fused to GPI and then integrated onto liposomes for vaccine usage. The proof of principle was the use of recombinant PfRH5-GPI as vaccine which elicited antibodies with strong blocking activity in P. falciparum cultures. Together we have shown that the host environment is capable of modulating the activity of variant bir gene promoters and that proteoliposomes loaded with relevant malarial antigens such as PfRH5, are potentially protective when used as malaria vaccine.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-10-24T11:23:13Z No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-10-26T15:45:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-26T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) Previous issue date: 2017-03-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Rhipicephalus microplus is a tick that infests preferably bovines and cause a great damage in the livestock. The main control method against ticks is the use of acaricides, which lead to the emergence of resistant populations, in addition to increasing costs and risk of contamination of meat, milk and environment. Thus, vaccine antigens have been identified and characterized as an alternative to acaricides. Salivary molecules of hematophagous parasites can inhibit responses associated to homeostasis and modulate the host immune system and, therefore, are options in the search for anti-tick vaccines. This work characterized a glycine rich-protein and the paramyosin of R. microplus. Glycine rich-proteins are secreted in tick saliva and are essential in the attachment and blood feeding. Paramyosin is able to evade the host immune system and proved to be an important allergen of mites and vaccine antigen against helminths. The cDNA and amino acid sequences of the R. microplus glycine rich-protein (RmGRP) were identified and analyzed, revealing two distinct portions of the protein (glycine residues presented dispersed in the N-terminal region and in repeated patterns along the C-terminal region). Cloning, expression and purification of RmGRP were performed and the recombinant protein was tested for recognition by sera from naturally and experimentally infested bovines, indicating their antigenicity, but also displaying a high heterogeneity in protein recognition between individuals and among infestations in the same individual. In addition, recombinant RmGRP was recognized by sera from rabbits immunized with saliva and salivary gland from partially and fully engorged females and eggs, but not from sera from rabbits immunized with gut. Expression of the gene encoding RmGRP (rmgrp) in different female tissues and tick development stages was evaluated by qRT-PCR. Gene transcription was found in eggs, larvae, adult males, salivary glands, fat bodies and ovaries of partially and fully engorged females, with the highest expression levels in 1-day-old larvae and salivary glands of fully engorged females. rmgrp was not expressed in 3- and 6-day-old eggs and in guts of partially and fully engorged females, corroborating to the aforementioned result. Effects of RNAm silencing corresponding to RmGRP and RmPRM were evaluated, which resulted in egg laying reduction in the group in which the RmPRM gene was silenced and in the reduction of larval hatching rate in the two groups. Therefore, it is suggested that both proteins are important during larval development, but only RmPRM is required in egg formation and/or laying. Cloning of the coding DNA regions and expression of N-terminal, internal and Cterminal fragments of R. microplus paramyosin (RmPRM) in Escherichia coli and of the complete RmPRM in Pichia pastoris were confirmed by SDS-PAGE and western-blot. From the data obtained, both RmGRP and RmPRM have characteristics that make them possible candidates to compose a cocktail vaccine against R. microplus. / O Rhipicephalus microplus ? um carrapato que infesta preferencialmente bovinos, causando um grande preju?zo ? pecu?ria. O principal m?todo de controle ? o uso de acaricidas, os quais selecionam popula??es resistentes, al?m de aumentar o custo e o risco de contamina??o da carne, do leite e do ambiente. Desta forma, ant?genos vacinais t?m sido identificados e caracterizados como alternativa aos acaricidas. Mol?culas salivares de parasitos hemat?fagos podem inibir respostas associadas ? homeostase e modular o sistema imune do hospedeiro e, portanto, s?o op??es na busca por vacinas anti-carrapato. Neste contexto, este trabalho caracterizou uma prote?na rica em glicinas e a paramiosina do R. microplus. Prote?nas ricas em glicinas s?o secretadas na saliva e s?o essenciais na fixa??o e na alimenta??o do parasito. J? a paramiosina ? capaz de evadir o sistema imune do hospedeiro e mostrou-se um importante alergeno em ?caros e ant?geno vacinal contra helmintos. As sequ?ncias de cDNA e amino?cidos da prote?na rica em glicinas de R. microplus (RmPRG) foram identificadas e analisadas, revelando duas por??es distintas da prote?na (com glicinas isoladas ao longo da regi?o N-terminal e padr?es repetidos contendo glicinas ao longo da regi?o C-terminal). A clonagem, express?o e purifica??o da RmGRP foram realizadas e a prote?na recombinante foi testada quanto ao reconhecimento por soros de bovinos naturalmente e experimentalmente infestados, indicando a sua antigenicidade, mas tamb?m uma alta heterogeneidade no reconhecimento da prote?na entre indiv?duos e entre infesta??es no mesmo indiv?duo. Al?m disso, a RmGRP recombinante foi reconhecida pelos soros de coelhos imunizados com saliva e gl?ndula salivar de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas e ovos, mas n?o por soros de coelhos imunizados com intestino. A express?o do gene codificante para a RmGRP (rmgrp) em diferentes tecidos de f?meas e fases do desenvolvimento do carrapato foi avaliada por qRT-PCR. A transcri??o do gene foi encontrada em ovos, larvas, machos adultos, al?m de gl?ndulas salivares, corpos gordurosos e ov?rios de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, apresentando os maiores n?veis de express?o nas larvas de 1 dia e nas gl?ndulas salivares de f?meas totalmente ingurgitadas. rmgrp n?o foi expresso nos ovos de 3 e 6 dias e no intestino de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, corroborando o resultado anterior. Ainda foram avaliados os efeitos do silenciamento do RNAm correspondente ? RmGRP e ? RmPRM, o que resultou na redu??o da taxa de postura de ovos no grupo em que o gene da RmPRM foi silenciado e da eclos?o de larvas em f?meas tratadas nos dois grupos. Portanto, sugere-se que as duas prote?nas s?o importantes durante o desenvolvimento larval, mas s? a RmPRM seja necess?ria na forma??o e/ou postura dos ovos. Tamb?m foi realizada a 8 clonagem da regi?o codificante e express?o dos fragmentos N-terminal, interno e C-terminal da paramiosina de R. microplus (RmPRM) em E. coli e da RmPRM completa em P. pastoris, sendo confirmadas por SDS-PAGE e western-blot. A partir dos dados obtidos, ambas RmGRP e RmPRM apresentam caracter?sticas que fazem delas poss?veis candidatas a comporem uma vacina coquetel contra o R. microplus.

Esta tese objetivou realizar pesquisas essenciais como a utilização de hospedeiro alternativo e o comportamento de dispersão de Telenomus remus, para nortear a utilização desta espécie em programas de controle biológico aplicado, nas culturas de milho e soja. Os experimentos iniciais envolveram metodologias que determinaram que para a condução dos experimentos é necessário utilizar ovos inviabilizados, 24 h de exposição ao parasitismo e 20 fêmeas para 100 ovos do hospedeiro. Os estudos sobre a biologia e parasitismo de T. remus em ovos Corcyra cephalonica, por diferentes gerações, apresentaram índices de parasitismo crescentes até a geração F7, a partir desta, o número de ovos parasitados foi semelhante (±62 ovos) e o potencial de parasitismo ao longo da vida foi semelhante àquele verificado para o hospedeiro de criação na geração F19. A influência da umidade relativa foi avaliada e permitiu determinar que deve ser igual ou superior a 80% para que T. remus apresente bom desenvolvimentos em ovos de C. cephalonica. A qualidade dos parasitoides criados em ovos do hospedeiro alternativo foi avaliada mediante análise morfométrica e atividade de vôo e os resultados obtidos demonstraram que, embora T. remus criado em ovos de C. cephalonica apresente tamanho inferior àqueles observados nos parasitoides criados em ovos de S. frugiperda, este fator não influenciou a sua atividade de vôo. Em experimentos de campo foi possível avaliar a capacidade e o padrão de dispersão de T. remus nas culturas de milho e soja onde foi determinado que 40 pontos/ha é o número necessário para controle efetivo de ovos de S. frugiperda, mas a direção eólica atua diretamente no padrão de dispersão e deve ser considerada nas liberações. Assim, com estes resultados é possível concluir que T. remus age efetivamente em campo, no controle de S. frugiperda, e que C. cephalonica pode ser utilizada como hospedeiro alternativo em criação massais. / This thesis aimed to conduct essential research and the use of alternative host and dispersion behavior of Telenomus remus, to guide the use of this species in biological control programs, in corn and soybean. Initial experiments, involving methodologies that for conducting experiments determined is necessary to use unfeasible eggs, 24 h exposure to parasitism and 20 females for 100 host eggs. Studies on the biology and parasitism of T. remus to Corcyra cephalonica eggs by different generations, showed rates of parasitism augmentative to the F7 generation, from this, the number of parasitized eggs was similar (± 62 eggs) and the potential of parasitism throughout life was analogous to that observed for the host creation in F19 generation. The influence of relative humidity was reviewed and has determined that this must be equal to or greater than 80% for T. remus present good developments in eggs of C. cephalonica. The quality of the parasitoids reared on eggs of the factitious host was assessed by morphometric analysis and flight activity and the results showed that although T. remus reared in eggs of C. cephalonica present smaller size to those observed in parasitoids reared on eggs of S. frugiperda, this factor did not affect their flight activity. In field experiments it was possible to assess the ability and the pattern of spread of T. remus in corn and soybean where it was determined that 40 points/ha is required for effective control of eggs of S. frugiperda, but wind direction acts directly on the dispersion pattern and should be considered in releases. So with these results we conclude that T. remus acts effectively on the field, control of S. frugiperda and C. cephalonica may be used as factitious host for mass rearing.

Schistosoma mansoni é um dos agentes causadores da esquistossomose, doença infecciosa negligenciada que afeta milhões de pessoas no mundo. É um platelminto parasitário dióico, com um complexo ciclo de vida, composto de seis estágios. Nos últimos cinco anos, projetos de seqüenciamento em larga escala de etiquetas de genes expressos (ESTs) de Schistosoma geraram uma quantidade razoável de dados que ainda pode ser mais bem explorada. O objetivo central deste trabalho é analisar computacionalmente a expressão gênica de S. mansoni, sob três focos distintos: (i) micro-arranjos de DNA, para os quais descrevemos o desenho e análise de dados de uma plataforma de cDNA (4,600 elementos) e outra de oligonucleotídeos (44,000 elementos). Estão também descritas diversas ferramentas de análise que implementamos e são amplamente usadas em nosso grupo. Os micro-arranjos têm servido de base para vários projetos, como o estudo da resposta do parasita a hormônios e drogas e expressão gênica durante o ciclo de vida. (ii) Identificação in silico de pares de transcritos senso- antisenso com possível ação em trans, potencialmente importantes na regulação gênica. (iii) Análises da coleção de ESTs existentes sob uma perspectiva evolutiva. Através dessa abordagem encontramos genes importantes como um possível inibidor de angiogênese e um regulador da via do mevalonato, conhecido como essencial para a produção de ovos; estes constituem a principal causa de morbidez da esquistossomose. Os resultados aqui apresentados contribuem para o entendimento da complexa biologia inerente ao ciclo de vida de S. mansoni e para acelerar a busca de futuras possibilidades de tratamento. / Schistosoma mansoni is one of the causative agents of schistosomiasis, a neglected infectious disease which affects millions of people worldwide. It is a dioecious parasitic platyhelminth, with a complex life cycle composed of six stages. In the past five years, large scale sequencing projects have generated a reasonable amount of expressed sequence tag (EST) data that can still be better explored. The goal of this thesis is to computationally analyze the S. mansoni gene expression, under three different focuses: (i) DNA microarrays, for which we describe the design and data analyses of a cDNA (4,600 elements) and an oligonucleotide (44,000 elements) platform. We also describe the implementation of several analysis tools which are widely used in our group. Our microarrays are being used in several projects, such as the study of parasite response to drugs and hormones, as well as its gene expression pattern during the life cycle. (ii) In silico identification of possible trans acting natural sense-antisense pairs, potentially important in gene regulation. (iii) Analyses of the available EST dataset under an evolutionary perspective. We have found interesting genes such as a possible angiogenesis inhibitor and a regulator of the mevalonate pathway, known to be essential for egg production; eggs are the main cause of morbidity of schistosomiasis. The results reported here contribute to the understanding of the complex biology underlying the S. mansoni life cycle and to accelerate the search for future possibilities of treatment.

A caracterização da variabilidade genética intra-hospedeiro do vírus da dengue (DENV) é fundamental para a compreensão de sua evolução e dinâmica populacional no contexto atual como um importante patógeno viral humano. A diversidade viral acumulada em hospedeiros infectados influencia diretamente em outros aspectos como patogênese, transmissão e imunidade do hospedeiro. Contudo, apesar de existirem vários estudos sobre a diversidade genética intra-hospedeiro em dengue, nenhum tem sido relatado para DENV-4 até o presente momento. O ressurgimento e disseminação desse sorotipo foi associado com a sua co-circulação e o substituição dos sorotipos 1, 2 e 3 durante os recentes surtos no município do Guarujá-SP. Com base neste quadro epidemiológico, este estudo visou identificar a variação genética intra-hospedeiro do DENV-4 em amostras coletadas durante o surto de 2013, utilizando tecnologias de sequenciamento de nova geração. Portanto, nós caracterizamos a variabilidade genética de DENV-4 em diferentes níveis e as forcas evolutivas que afetam essa diversidade. Em adição, foram explorados os principais eventos na transmissão das variantes de DENV-4 identificadas. Nossos resultados revelaram uma baixa diversidade genética intra-hospedeiro para DENV-4. No entanto, mutação e pressões seletivas foram mecanismos importantes na variabilidade genética do vírus. A nível populacional, as variantes estão sujeitas á seleção natural negativa, não obstante identificamos seleção positiva atuando sob sítios específicos. Nenhuma evidência de recombinação foi detectada. Além disso, contra-intuitivamente, variantes de baixa frequência estão sendo transmitidas e contribuindo para diversidade genética do DENV-4 circulando em Guarujá. Nossos resultados fornecem novas evidências potencialmente úteis para futuros trabalhos focados em infecções mistas, escape imunológico, assim como o espalhamento e diversificação viral. / Characterizing intra-host genetic variability in dengue virus (DENV) virus is paramount for understanding its evolution and population dynamics in the context of its current status as a major human viral pathogen. The extent to which viral diversity accrues in infected host influences aspects such as pathogenesis, transmission, and host immunity. Although there are several studies about intra-host genetic diversity in dengue, so far nothing has been revealed about DENV-4. In the Guarujá municipality in the State of São Paulo, the reemergence and spread of this serotype was associated with its co-circulation and the displacement of serotypes 1, 2 and 3 during recent outbreaks. Based on this epidemiological framework, we seek to identify the intra-host genetic variation of DENV-4 strains from samples collected during the 2013 outbreak by using deep sequencing technologies. We characterized the genetic variability of DENV-4 at different levels, and the forces shaping this diversity. Likewise, we explored major transmission events among DENV-4 variants. Our results revealed a low intra-host genetic diversity for DENV-4. However, we found selective and mutational pressures contributing to genetic diversity, while recombination did not seem play an important role. We further identified purifying selection at population level but sites subject to potential diversifying selection. Additionally, we observed low frequency haplotypes being transmitted among hosts and contributing to the viral diversity of DENV-4 circulating in Guarujá. Our findings provide preliminary insights for future studies in mixed infections, drug resistance, virus variant spread and immune scape. This study is the first effort to investigate the intra-host diversity of DENV-4.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-11-07T17:53:28Z No. of bitstreams: 1 StellaMarisdeFreitasLimaTese2018.pdf: 12066835 bytes, checksum: 9ad384b4f040333154c3598b59852583 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-11-07T17:53:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 StellaMarisdeFreitasLimaTese2018.pdf: 12066835 bytes, checksum: 9ad384b4f040333154c3598b59852583 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-07T17:53:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 StellaMarisdeFreitasLimaTese2018.pdf: 12066835 bytes, checksum: 9ad384b4f040333154c3598b59852583 (MD5) Previous issue date: 2018-08-21 / Failure of endodontic therapy is mainly based on the persistence of the microorganism inside the root canal system, perpetuating periradicular pathologies. The need for endodontic reintervention reduces the success rate and turns the development of new therapies into a necessity. Host defense peptides (HDPs) have a therapeutic potential because of its characteristics as broad spectrum antimicrobial activity, immunomodulatory capacity and repair induction. The present study aimed to demonstrate HDPs HHC-10, LL-37 and synoeca-MP activities compared to the commonly used chemical agents Ca(OH)2, NaOCl and chlorhexidine (CHX) in in vitro and in vivo environments. In vitro analysis involved (1) antimicrobial assays for MIC/MBC/MFC determination, antibiofilm and synergistic activities (against Candida albicans, Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus), (2) hemolytic assay and determination of therapeutic index, (3) immunomodulation assays (from RAW 264.7 monocytes) and (4) osteoclastogenesis assays (from mouse bone marrow cells). In vivo assays were based on periradicular lesions induced and treated in rats with subsequent analysis by radiographic, tomographic and histological examinations. Results demonstrated effective antimicrobial activity of HHC-10 (except antibiofilm activity) and synoeca-MP besides NaOCl and CHX. Higher therapeutic index was observed for peptides (HHC-10 and synoeca-MP) with low or no hemolytic activity. Synergism analysis demonstrated better interaction between synoeca-MP and CHX. Immune assays from monocyte cultures demonstrated a pro-inflammatory activity of LL-37 and synoeca-MP and a pro- and anti-inflammatory effect of HHC-10 and Ca(OH)2. However, none of the agents tested reduced osteoclastogenesis in vitro. In in vivo endodontic treatment conditions, HHC-10, synoeca-MP and Ca(OH)2 significantly reduced periapical lesions, although only peptides were able to reduce inflammation in histological analysis. Therefore, HHC-10 and synoeca-MP demonstrated in vitro and in vivo potential for application in endodontic therapy. However, further researches are needed regarding the mechanism of action of HDPs and the possible therapeutic formulations for future analysis in animal models. / O insucesso da terapia endodôntica está baseado na persistência de microrganismos principalmente no interior do sistema de canais radiculares, perpetuando as patologias perirradiculares associadas à tal infecção. A necessidade de reintervenção endodôntica reduz o percentual de sucesso e, portanto, o surgimento de novas terapias é necessário. Dessa forma, peptídeos de defesa do hospedeiro (PDHs) possuem potencial terapêutico associado às suas características de atividade antimicrobiana de amplo espectro, capacidade imunomodulatória e indução de reparo. O presente estudo objetivou demonstrar a atividade dos PDHs HHC-10, LL-37 e synoeca-MP comparado aos agentes químicos comumente utilizados Ca(OH)2, NaOCl e clorexidina (CHX) em ambientes in vitro e in vivo. Para tanto, foram realizadas análises in vitro envolvendo: (1) ensaios antimicrobianos com determinação de MIC/MBC/MFC, atividade antibiofilme e atividade sinérgica (contra Candida albicans, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus), (2) ensaio hemolítico e determinação do índice terapêutico, (3) ensaios de imunomodulação (a partir de monócitos RAW 264.7) e (4) ensaios osteoclastogênese (a partir de células da medula óssea de camundongos). Os ensaios in vivo foram conduzidos a partir das lesões perirradiculares induzidas e tratadas em ratos com subsequente análise por exames radiográficos, tomográficos e histológicos. Assim, os resultados demonstraram efetiva atividade antimicrobiana dos peptídeos HHC-10 (exceto atividade antibiofilme) e synoeca-MP além do NaOCl e CHX. Observou-se maiores índices terapêuticos para os peptídeos (HHC-10 e synoeca-MP) com baixa ou nenhuma atividade hemolítica. As análises de interação demonstraram combinação sinérgica necessitando de menor concentração a partir da interação entre synoeca-MP e CHX. A partir da cultura de monócitos, observou-se uma atividade pró-inflamatória a partir dos peptídeos LL-37 e synoeca-MP e um efeito pró- e anti-inflamatório do peptídeo HHC-10 e do Ca(OH)2. No entanto, nenhum dos agentes testados reduziram a osteoclastogênese in vitro. Já em condições de tratamento endodôntico in vivo, os PDHs HHC-10, synoeca-MP e o Ca(OH)2 reduziram significativamente lesões periapicais, apesar de somente os peptídeos serem capazes de reduzir inflamação em análises histológicas. Portanto, os peptídeos HHC-10 e synoeca-MP demonstraram potencial in vitro e in vivo para aplicação na terapia endodôntica. No entanto, faz-se necessário maiores investigações sobre o mecanismo de ação dos mesmos e possíveis formulações terapêuticas para futuros testes em modelos animais.

Orientador: Gervásio Henrique Bechara / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Osvaldo Augusto Brasil Esteves Sant'Anna / Resumo: No hospedeiro bovino o nível de resistência ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus varia de acordo com a raça sendo os fenótipos contrastantes herdáveis. O presente trabalho explora esses fenótipos a fim de estabelecer os perfis das respostas imunes, humoral e inflamatória, correlacionados com resistência em raça zebuína (Nelore) e susceptibilidade em raça taurina (HPB). Os animais foram expostos a infestação natural pelo R.(B.) microplus e amostras de soros foram coletadas em pontos estratégicos da cinética das infestações. Os níveis de imunoglobulinas totais (IgG1 e IgG2), bem como os de anticorpos IgG1, IgG2 e IgE anti-extrato de ovo, anti-extrato de larva não alimentada e anti-saliva foram determinados. Elementos da resposta inflamatória, como as principais proteínas de fase aguda e óxido nítrico, também foram dosados. Os resultados obtidos mostram que as infestações muito intensas, em hospedeiros suscetíveis, são capazes de modular os níveis séricos de IgG1 e IgG2 total, diminuindo-os significativamente em relação aos níveis observados durantes infestações menores. Também modulam negativamente a produção de todos os anticorpos específicos IgG1 e IgG2 avaliados a nível sistêmico. Bovinos susceptíveis ao carrapato produzem níveis mais altos de anticorpos IgE para todos os antígenos. O fenótipo susceptivel de infestação se diferencia pela maior freqüência do alótipo de IgG?2a, herdado por herança Mendeliana co-dominante. Animais suscetíveis, quando infestados, produzem níveis mais altos da proteína de fase aguda a1- glicoproteína ácida, de padrão anti-inflamatório, enquanto que animais resistentes produziram relativamente mais proteínas de fase aguda pró-inflamatórias, haptoglobina e amilóide sérica A. Em ambas as raças não houve diferença nos níveis de transferrina e óxido nítrico sistêmico, porém a produção de ambos é influenciada pelos níveis de infestação. / Abstract: In bovine hosts resistance to the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, varies according to the breed, being the phenotypes of infestations inherited. The present work exploits these contrasting phenotypes in order to determine the profile of the humoral, inflammatory and acute phase responses that are correlated with resistance seen in a zebuine breed (Nelore) and susceptibility seen in a taurine breed (Holstein). Bovines were exposed to natural infestations with R.(B.) microplus and they presented, as expected, different levels of infestation that also varied in intensity according to the season of the year. Samples of sera were collected at strategic points during the kinetics of different cycles of infestations. The levels of total serum IgG1 and IgG2 immunoglobulins, as well as those of IgG1, IgG2 and IgE anti-egg extracts, anti-unfed larvae extracts and anti-saliva antibodies were measured. Components of the inflammatory response, nitric oxide, as well as acute phase proteins, were also measured. The results show that very intense infestations in ticksusceptible bovines modulate the serum levels of IgG1 and IgG2, which are significantly diminished relative to those observed during less intense infestations. Intense infestations also modulate the production of all specific IgG1 and IgG2 antibodies. Susceptible animals produced more specific IgE, suggesting that this isotype does not participate in resistance against ticks. The susceptible cattle also have a higher frequency of IgG?2a , which are encoded by Mendelian co-dominant alleles. When infested susceptible animals produced higher levels of the anti-inflammatory acute phase protein, a1-acid glycoprotein, whereas resistant animals produced relatively higher levels of the pro-inflammatory proteins, haptoglobin and serum amyloide A. / Mestre

Plantas de mostarda-do-campo (Brassica rapa) exibindo intenso superbrotamento de ramos finos, com folhas e flores de tamanho reduzido, foram observadas em campos cultivados com couve-flor. Como os sintomas se mostravam similares àqueles induzidos por fitoplasmas, suspeitou-se que esta espécie daninha estava infectada por este tipo patógeno. Visando confirmar a diagnose, plantas foram amostradas e seu DNA extraído para ser usado em ensaios de duplo PCR, conduzidos com os iniciadores R16mF2/mR1, SN910601/SN011119, 16F2n/R2 e R16(III)F2/16(III)R. As amplificações de fragmentos genômicos correspondentes ao 16S rRNA revelaram uma constante associação entre um fitoplasma do grupo 16SrIII com as plantas sintomáticas. A doença foi denominada de superbrotamento. Cigarrinhas da espécie Agalia albidula foram coletadas nas áreas marginais e no interior dos campos de couve-flor, onde cresciam plantas de mostarda-do-campo. O DNA total foi extraído e usado em duplo PCR desenvolvido com os mesmos iniciadores citados anteriormente. Os resultados mostraram que os insetos analisados eram portadores de um fitoplasma do grupo 16SrIII. Para alguns isolados do fitoplasma encontrado em plantas de mostarda-do-campo, os produtos amplicados em duplo PCR com os iniciadores R16(III)F2/16(III)R foram sequenciados e confirmaram que as sequências pertenciam a um representante do grupo 16SrIII. Mapas de sítios putativos de restrição foram elaborados com o emprego de diversas endonucleases, porém não se logrou sucesso em definir a identidade deste fitoplasma ao nível de classificação de subgrupo. Com base nos resultados obtidos no presente estudo, plantas de mostarda-do-campo servem como hospedeiro alternativo de um fitoplasma do grupo 16SrIII, o qual foi anteriormente associado à doença conhecida como enfezamento, ocorrente em outras espécies de brássica, como repolho, brócolis e couve-flor. Assim, é sugerido que esta espécie daninha possa abrigar o agente de doença, garantindo sua sobrevivência e atuando como fonte de inóculo para as culturas comerciais. Além disto, cigarrinhas da espécie A. albidula podem ser apontadas como potenciais vetores do fitoplasma relacionado ao superbrotamento da mostarda-do-campo, bem como ao agente causal do enfezamento em brássicas. A presente pesquisa contribuiu para melhor compreensão dos aspectos relacionados aos enfezamentos das brássicas, envolvendo diversidade de fitoplasmas, gama de hospedeiros alternativos destes agentes de doença e ocorrência de vetores deste tipo de patógeno. / Mustard-field plants (Brassica rapa) showing intense shoots proliferation, small sized leaves and flowers, were observed in cauliflower production fields. Since the symptoms were similar to those induced by phytoplasmas, it was suspected that this weed was infected by this type of pathogen. To confirm the diagnosis, plants were sampled for DNA extraction to be used in nested PCR tests conducted with primers R16mF2/mR1, SN910601/SN011119, F6F2n/R2 and R16(III)F2/16(III)R. The amplification of genomic fragments corresponding to the 16S rRNA showed a constant association between a phytoplasma group 16SrIII with symptomatic plants. The disease was called witche\"s broom. Species of leafhopper, Agalia albidula, were collected in marginal areas and at cauliflower fields, where mustard-field plants grew. The total DNA was extracted and used in nested PCR carried out with the same primers mentioned above. The results showed that the insects analyzed were carriers of a phytoplasma group 16SrIII. For some isolates of phytoplasma found in mustard-field plants, the products obtained in nested PCR with primers R16(III)F2/16 (III)R were sequenced and confirmed that belonged to a representative 16SrIII group. Putative restriction sites maps, were prepared using a many restriction endonucleases, but no success has been achieved in defining the identity of the phytoplasma subgroup classification level. Based on the results in the present study, mustard-field plants could be an alternative host of a phytoplasma group 16SrIII, which was previously associated with the disease known as stunting, occurring in other species of rapeseed such as cabbage, broccoli and cauliflower. Thus, it is suggested this weed could harbor the disease agent, ensuring their survival and acting as a source of inoculum for commercial crops. Moreover, the species of leafhoppers, A. albidula, could be identified as a potential vector of the phytoplasma associated with witche\"s broom mustard-field as well as the causal agent of stunting in brassicas. This research contributed to understanding the issues related to stunting in brassicas, involving a diversity of phytoplasmas, range of alternative hosts of these disease agents and occurrence of vectors of this pathogen type.