Human mesenchymal stem cells (MSC) have attracted a great deal of interest for their potential use in regenerative medicine and suppression of the inflammation. Nevertheless, all known therapy protocols require large amounts of MSCs, which can be obtained only by in vitro expansion. One of the most important methodological problems is associated with the use of animal-derived components in the cell culture medium. The main aim of the current research was to elucidate the influence of different serum substitutes on the proliferation, differentiation, expression of cell surface markers, and total protein expression of mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue. In addition we were aiming to determine the features of mesenchymal stem cell populations from an exfoliated deciduous tooth (SHED) and their response to the multifunctional proinflammatory protein alpha1-antitrypsin. Our results indicate that adipose tissue derived MSCs cultivated in the presence of fetal calf serum and allogeneic human serum display similar properties, while synthetic serum substitute induces increase in growth and differentiation potential of MSCs. Moreover, our results indicate, that synthetic serum substitute also activates transcription of genes related to adipogenic and osteogenic differentiation and diminishes expression of cell surface marker CD146. In the present study, we used a proteomic approach that allowed us to compare protein expression signatures between primary cell... [to full text] / Žmogaus suaugusio organizmo mezenchiminės kamieninės ląstelės (MKL) pradėtos sėkmingai naudoti pažeistų audinių regeneracijai ir uždegiminio proceso slopinimui. Šiuolaikiniams terapijos protokolams yra reikalingi dideli ląstelių kiekiai, todėl prieš naudojimą yra būtina jas padauginti in vitro. Tačiau naudojant skirtingus MKL išskyrimo, in vitro kultivavimo ir padauginimo protokolus, yra sunku lyginti mokslinių tyrimų duomenis ir klinikinių tyrimų rezultatus. Nevienodos kultivavimo sąlygos gali įtakoti MKL funkcines savybes (augimo greitį, gebėjimą diferencijuotis, migracinį aktyvumą ir kt.). Šiame disertaciniame darbe tyrėme auginimo terpių, praturtintų skirtingais serumais (gyvulinės kilmės serumai, žmogaus alogeninis serumas, sintetinis serumas), poveikį žmogaus riebalinio audinio MKL. Taip pat charakterizavome MKL išskirtas iš žmogaus pieninių dantų pulpos ir palyginome šių ląstelių kultūros bei jų dukterinių klonų savybės. Kompleksiškai tyrėme uždegimo antiproteinazės alfa1-antitripsino (AAT) poveikį šioms ląstelėms. Nustatėme, kad, lyginant su kitais tyrime naudotais serumais, sintetinis serumo pakaitalas geriausiai skatino MKL augimą bei gebėjimą diferencijuotis adipogenine ir osteogenine kryptimis. Taip pat, skirtingai nuo kitų naudotų gyvulinės kilmės ir žmogaus serumų, sintetinis serumo pakaitalas veikė kaip adipogeninės ir osteogeninės diferenciacijos indukcijai svarbių genų PPARγ ir Msx2 transkripcijos aktyvatorius. Be to, sintetinis serumo pakaitalas slopino... [toliau žr. visą tekstą]

L’ingénierie tissulaire osseuse a pour objectif de repousser les limitesexistantes de la régénération osseuse. Les stratégies proposées consistent àassocier à une matrice tridimensionnelle (3D) des cellules autologues, capables derégénérer en 3D un tissu fonctionnel. Le but de ce travail a été d’étudier l’importancede la communication cellulaire entre les cellules du compartiment stromal et lescellules endothéliales au sein d’une matrice tridimensionnelle poreuse constituée depolysaccharides naturels biodégradables. Nos résultats montrent que l’architecture etla nature de cette matrice permettent de guider la différenciation ostéoblastique descellules humaines mésenchymateuses issues de la moelle osseuse. L’organisationcellulaire en agrégats observée stimule les interactions cellulaires, et plusparticulièrement la formation de jonctions communicantes de type GAP et l’activitédes Connexines 43. Nous avons en également étudié la fonction des Pannexines 1et 3 dans la culture 3D. En conclusion, l’ensemble de nos travaux démontre que lesinteractions cellule-cellule constituent des événements majeurs dans cesmécanismes de régénération tissulaire. Les données cellulaires et expérimentalestémoignent de l’intérêt d’utiliser la totalité de la suspension de moelle osseuse pourfavoriser à la fois l’ostéoformation et la vascularisation du tissu. / Bone tissue engineering aims to resolve the existing limitations of boneregeneration methods. One of the proposed strategies consists on the association,within a three-dimensional (3D) matrix, with autologous cells able to regenerate afunctional 3D tissue. The purpose of this study was therefore to investigate theimpact of cellular communication, between cells of the stromal compartment andendothelial cells, within the three-dimensional porous matrix made of biodegradablenatural polysaccharides, focusing on bone repair. Our results show that thearchitecture and the nature of the 3D macroporous matrix promotes the guidance ofmesenchymal stems cells, derived from human bone marrow, towards theosteoblastic lineage. Also, that the organization in aggregates, promoted by the 3Dmatrices, stimulated cell communication, evidenced by the formation of GAPjunctions and activity of Connexins 43. We also focused on the function ofPannexines 1 and 3 for the 3D culture in these matrices of polysaccharides. Inconclusion, this work shows that cell-cell interactions play a major role in order toimprove bone tissue regeneration. Also, cellular and experimental data demonstratesthe advantage of using a total fraction of bone marrow cells to promote both boneformation and vascularization.

The local release of complexed siRNA from biomaterials opens precisely targeted therapeutic options. In this study, complexed siRNA was loaded to gelatin microparticles cross-linked (cGM) with an anhydride-containing oligomer (oPNMA). We aggregated these siRNA-loaded cGM with human mesenchymal stem cells (hMSC) to microtissues and stimulated them with osteogenic supplements. An efficient knockdown of chordin, a BMP-2 antagonist, caused a remarkably increased alkaline phosphatase (ALP) activity in the microtissues. cGM, as a component of microtissues, mineralized in a differentiation medium within 8–9 days, both in the presence and in the absence of cells. In order to investigate the effects of our pre-differentiated and chordin-silenced microtissues on bone homeostasis, we simulated in vivo conditions in an unstimulated co-culture system of hMSC and human peripheral blood mononuclear cells (hPBMC). We found enhanced ALP activity and osteoprotegerin (OPG) secretion in the model system compared to control microtissues. Our results suggest osteoanabolic effects of pre-differentiated and chordin-silenced microtissues.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής, ήταν η διερεύνηση της διεπιφάνειας ανθρώπινων μεσεγχυματικών κυττάρων (Human Mesenchymal Stem Cells, hMSCs) -Νανοσωλήνων Άνθρακα Πολλαπλού Τοιχώματος (Multi Walled Carbon Nanotubes, MWCNTs) υπό στατικές και δυναμικές συνθήκες. Οι MWCNTs έχει αποδειχθεί ότι, έχουν μοναδικές ηλεκτρικές και φυσικές ιδιότητες, μηχανική αντοχή και χαμηλή πυκνότητα, χαρακτηριστικά που τους καθιστούν εξαιρετικά ελκυστικούς για το σχεδιασμό βιοϋλικών για ορθοπαιδικές εφαρμογές. Αρχικά, μελετήθηκε η βιοσυμβατότητα των hMSCs σε επιφάνειες MWCNTs, ως προς την κυτταροτοξικότητα, τη μορφολογία, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του κυτταροσκελετού. Το υπόστρωμα των MWCNTs ευνόησε την εξάπλωση των κυττάρων, προήγαγε τον πολλαπλασιασμό και προώθησε τη διαφοροποίηση των hMSCs σε οστεοβλάστες, όπως έδειξε η έκφραση αλκαλικής φωσφατάσης, οστεοποντίνης και οστεοκαλσίνης. Μελετήθηκε η γονιδιακή έκφραση των ιντεγκρινικών υποδοχέων, υπεύθυνων για την προσκόλληση των κυττάρων στους MWCNTs. Με την τεχνική του περιστρεφόμενου δίσκου, εκτιμήθηκε η δύναμη προσκόλλησης των hMSCs στους MWCNTs και η επίδραση της κάθε ιντεγκρίνης στη μεταβολή της δύναμης προσκόλλησης. Για τη διερεύνηση της απόκρισης των οστεοβλαστών στη μηχανική φόρτιση, τα προσκολλημένα κύτταρα στους MWCNTs καταπονήθηκαν για 3 και 24 ώρες, με σύστημα μηχανικής φόρτισης βασισμένο στην Αρχή Κάμψης Τεσσάρων Σημείων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, η φόρτιση επηρεάζει θετικά την έκφραση γονιδίων προσκόλλησης και δεικτών διαφοροποίησης. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η συμπεριφορά των hMSCs ως προς την κυτταροτοξικότητα, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την οργάνωση του κυτταροσκελετού και την έκφραση γονιδίων προσκόλλησης, σε τροποποιημένες επιφάνειες MWCNTs με υδροξυλομάδες, καρβοξυλομάδες και αμινομάδες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, η αμινοτροποποιημένη επιφάνεια ευνόησε σημαντικά την κυτταρική συμπεριφορά σε σύγκριση με τις άλλες δύο επιφάνειες. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της τοπογραφίας με χρήση κάθετα ευθυγραμμισμένων MWCNTs, σε σύγκριση με τυχαία προσανατολισμένους MWCNTs. Η απόκριση των hMSCs στους κάθετα ευθυγραμμισμένους MWCNTs ήταν καλύτερη σε σύγκριση με τους τυχαία προσανατολισμένους, τόσο ως προς τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση, όσο και ως προς την οργάνωση του κυτταροσκελετού. Τα αποτελέσματα της διατριβής είναι υποσχόμενα για το μελλοντικό σχεδιασμό βιοϋλικών με MWCNTs, με τελικό σκοπό την εφαρμογή σε θεραπείες στις οποίες απαιτείται ανακατασκευή του οστού. / The aim of the present study was the investigation of the interface of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) – Multiwalled Carbon Nanotubes (MWCNTs), under static and dynamic conditions. MWCNTs have been proven to obtain unique electric and physical properties, mechanical strength and low density, which render them highly attractive for the design of biomaterials for orthopaedic applications. Firstly, the biocompatibility of MWCNTs was studied, in terms of hMSCs cytotoxicity, morphology, proliferation, differentiation, cytoskeleton organization and toxicity. The substrate of MWCNTs favored cell spreading, increased proliferation and promoted cell differentiation, as measured by the expression of alkaline phosphatase, osteopontin and osteocalcin. The gene expression of integrin receptors responsible for cell attachment on MWCNTs was studied. Using the Spinning Disc Technique, the attachment strength of hMSCs on MWCNTs was evaluated, as well as the impact of each integrin to the alteration of attachment strength. In order to investigate the cell response to mechanical loading, the attached cells on MWCNTs were stressed for 3 and 24 hours, using a system for mechanical loading based on the 4-point bending principle. Results showed that loading positively induces the expression of genes associated with attachment and differentiation markers. Additionally, the cell behavior concerning proliferation, differentiation, cytoskeleton organization, apoptosis and gene expression associated with attachment, was studied on MWCNTs after surface modification with hydroxyl-, carboxyl-, and amino- groups. The findings indicated that the amino- modified surface significantly favored the cell behavior, compared to the other two surfaces. Lastly, the topography effect was studied using vertically aligned MWCNTs. Cell response was found better on the vertically compared to the randomly oriented, in terms of proliferation, differentiation and cytoskeleton organization. The findings of the study are promising for the future design of biomaterials of MWCNTs, aiming for application in therapies where bone reconstruction is demanded.

Flocktechnologie ist eine im Bereich der Textiltechnik angewandte Methode, bei der kurze Fasern nahezu senkrecht auf ein vorher mit Klebstoff beschichtetes Substrat aufgebracht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die elektrostatische Beflockung als Methode zur Herstellung von porösen, dreidimensionalen Scaffolds für das Tissue Engineering von Knorpel und Knochen etabliert. Dieser neuartige Scaffoldtyp wurde eingehend charakterisiert und in Zellversuchen im Hinblick auf seine Biokompatibilität untersucht. Dabei zeigte sich, dass verschiedene Zellen im Scaffold proliferieren und differenzieren können. Die in der Arbeit beschriebenen Flockscaffolds stellen somit eine vielversprechende Matrix für die Therapie von Gelenkknorpeldefekten dar.

Nonviral gene delivery, though limited by inefficiency, has extensive utility in cell therapy, tissue engineering, and diagnostics. Substrate-mediated gene delivery (SMD) increases efficiency and allows transfection at a cell-biomaterial interface, by immobilizing and concentrating nucleic acid complexes on a surface. Efficient SMD generally requires substrates to be coated with serum or other protein coatings to mediate nucleic acid complex immobilization, as well as cell adhesion and growth; however, this strategy limits reproducibility and may be difficult to translate for clinical applications. As an alternative, we screened a chemically defined combinatorial library of 20 different extracellular matrix mimetic substrates containing combinations of (1) different sulfated polysaccharides that are essential extracellular matrix glycosaminoglycans (GAGs), with (2) mimetic peptides derived from adhesion proteins, growth factors, and cell-penetrating domains, for use as SMD coatings. We identified optimal substrates for DNA lipoplex and polyplex SMD transfection of fibroblasts and human mesenchymal stem cells. Optimal extracellular matrix mimetic substrates varied between cell type, donor source, and transfection reagent, but typically contained Heparin GAG and an adhesion peptide. Multiple substrates significantly increased transgene expression (i.e. 2- to 20-fold) over standard protein coatings. Considering previous research of similar ligands, we hypothesize extracellular matrix mimetic substrates modulate cell adhesion, proliferation, and survival, as well as plasmid internalization and trafficking. Our results demonstrate the utility of screening combinatorial extracellular matrix mimetic substrates for optimal SMD transfection towards application- and patient-specific technologies.

Eine bevorzugte Zellquelle für den Einsatz im Tissue Engineering sind mesenchymale Stammzellen (MSZ). Diese besitzen, neben einer hohen Proliferationsrate, die Fähigkeit, sich in verschiedene Zellen des mesodermen Ursprungs und in die entsprechenden Gewebetypen zu entwickeln. Um ein funktionales Gewebe zu erhalten ist es Ziel, sich bereits in vitro den in vivo Bedingungen anzunähern. Hierbei spielen neben der dreidimensionalen Struktur der Scaffolds auch die biochemische Mikroumgebung der Zellen in Form der unlöslichen extrazellulären Matrix (EZM) und den löslichen Mediatorproteinen wie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, sowie die physikalische Stimulation der Zellen eine wichtige Rolle. Während sich gegenwärtige Untersuchungen im TE vorwiegend mit den alleinigen Einflussfaktoren beschäftigen, verfolgt die vorliegende Arbeit das Ziel, die Auswirkungen kombinierter Stimuli durch Verwendung einer artifiziellen EZM, bestehend aus definierten Komponenten der nativen EZM, und physikalischer Stimuli durch elektrische Felder zu untersuchen. Letzteres erfolgte mit einem innerhalb der Arbeitsgruppe neu entwickelten System, dass die Stimulation von Zellen mit ausschließlich elektrischen Feldern, ohne störende Nebeneinflüsse, erlaubt.

The issue of prosthetic infection leading to implant failure due to the formation of bacterial biofilms on biomaterial surfaces has been widely recognized as a major issue, often leading to revision surgery. The growing number of patients requiring synthetic biomaterials as implants is on the rise and so is the risk of infection arising from pre/peri-/post-operative surgical procedures. Traditional antibiotic treatment has led to the emergence of bacterial drug resistance. Therefore, the development of novel bactericidal methods to combat drug resistant microbial pathogens is the need of the hour. The first part of the thesis is an attempt to address prosthetic infection by the development of novel ultrasmall gold nanoparticles (AuNPs) which are cytocompatible and present a therapeutic dosage window for eliciting antimicrobial property. Towards this end, ultrasmall AuNPs with 0.8 nm and 1.4 nm gold core sizes, stabilized by monosulphonated triphenylphosphine ligand shells were synthesized. Such intricately designed AuNPs with ultrasmall gold cores and phosphine-based ligand chemistry were demonstrated to be highly potent bactericidal agents against staphylococci, the most common human pathogen causing biomaterial associated infection. The antibacterial efficacy of these AuNPs was significant even in mature staphylococcal biofilms. In another study, the application of high strength pulse magnetic fields (1-4 Tesla) was examined for bacterial growth inactivation in vitro. A magnetic field strength dependent decrease in bacterial viability with a concomitant increase in the production of reactive oxygen species (ROS) and longer doubling times were recorded. The mechanism of action was explained through an analytical model which involves ion-transport interference of essential ions like Ca2+ and Mg2+ and disruption of FeS clusters leading to inactivation of bacterial redox enzymes. On the contrary, such high magnetic fields did not pose any detrimental effects to eukaryotic cells under similar exposure. Additionally, the potency of low intensity direct current electric field (DC EF: 1V/cm) against biofilm formation by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was explored on antimicrobial surfaces of hydroxyapatite and Zinc oxide (HA-xZnO; x = 0, 5, 7.5 and 10 wt%). An EF exposure time dependent decline in the viability and stability of MRSA biofilms were noted. Further, EF treatment resulted in bacterial membrane depolarization and reduced biofilm formation on HA-ZnO composites, independent of the substrate composition. In summary, the above three studies were cases of the developmental methods to address prothetic infection. The second part of the thesis is focused on the development of magneto-responsive biomaterials as implants for orthopaedic applications. Under this category, the sintering/ hot pressing of hydroxyapatite-magnetite (HA-xFe3O4; x = 0, 5, 10, 20 and 40 wt%) powders in oxidizing and inert atmospheres was carried out and the resulting phases and microstructure were characterized. A detailed analysis of the phase assemblage by Rietveld refinement of the X-ray diffraction (XRD) data and Mössbauer spectroscopy revealed the major retention of Fe3O4 along with wustite (FeO) formation under reducing conditions while hematite (α-Fe2O3) was the oxidized product of conventional sintering in ambient atmosphere. A good correlation between the unit cell volume increases in HA observed from Rietveld refinements and Fe incorporation into the apatite lattice from Mössbauer spectral parameters was evident. Further, the Mössbauer data analysis indicated a preferential occupancy of Fe at the Ca(1) site under oxidizing conditions and Ca(2) site in inert atmosphere. The above phase analyses were further confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), Infrared spectroscopy (FT-IR) and CHN analysis. The microstructure of the hot-pressed samples observed under transmission electron microscope (TEM) divulged similar phases as deduced from XRD as well as the formation of translational Moire fringe patterns due to inference of overlapping crystal planes of HA and Fe3O4 in the HA-40 wt% composite. Such translational Moire fringes suggest a preferred arrangement and orientation of the crystallites resulting from hot-pressing, which correlated well with the room temperature magnetic measurements made with the help of a vibrating sample magnetometer (VSM). The compositional similarity of Fe doping in HA to that of the tooth enamel and bone presents these HA-Fe3O4 composites as potent dental/ orthopaedic implant materials. In the conclusive study, the hot-pressed HA-xFe3O4 composites were tested for their efficacy in supporting the osteogenesis of human mesenchymal stem cells (hMSCs) assisted by intermittent static magnetic field exposure. The magneto-responsive substrates were applied as platforms for the culture of hMSCs and the effect of static magnetic field (SMF) exposure on the viability, proliferation and differentiation of hMSCs were elucidated. With a mild compromise in viability, SMF triggered the osteogenic differentiation of hMSCs mediated by proliferative arrest in the G0/G1 phase and elevated intracellular calcium levels. The early bone marker genes - Runx2, Col IA and ALP were significantly up regulated upon SMF exposure on pure HA and HA-Fe3O4 composites. Further, the late osteogenic markers – OCN and OPN were detected exclusively in the HA-xFe3O4 (x = 10 and 40 wt%) composites. Matrix mineralization was enhanced and CaP nodules were detected on similar SMF treated HA-Fe3O4 composites. A substrate magnetization and time dependent modulation of gene expression was recorded which corroborated well with the temporal trending of osteogenic genes during bone development. In conclusion, substrate magnetization can be applied as a tool to modulate the behavior of stem cells and direct them towards osteogenic lineage. Such a pertinent combination of substrate magnetization and external magnetic field stimulation can be applied synergistically for stem cell based bone tissue engineering applications.

Eine bevorzugte Zellquelle für den Einsatz im Tissue Engineering sind mesenchymale Stammzellen (MSZ). Diese besitzen, neben einer hohen Proliferationsrate, die Fähigkeit, sich in verschiedene Zellen des mesodermen Ursprungs und in die entsprechenden Gewebetypen zu entwickeln. Um ein funktionales Gewebe zu erhalten ist es Ziel, sich bereits in vitro den in vivo Bedingungen anzunähern. Hierbei spielen neben der dreidimensionalen Struktur der Scaffolds auch die biochemische Mikroumgebung der Zellen in Form der unlöslichen extrazellulären Matrix (EZM) und den löslichen Mediatorproteinen wie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, sowie die physikalische Stimulation der Zellen eine wichtige Rolle. Während sich gegenwärtige Untersuchungen im TE vorwiegend mit den alleinigen Einflussfaktoren beschäftigen, verfolgt die vorliegende Arbeit das Ziel, die Auswirkungen kombinierter Stimuli durch Verwendung einer artifiziellen EZM, bestehend aus definierten Komponenten der nativen EZM, und physikalischer Stimuli durch elektrische Felder zu untersuchen. Letzteres erfolgte mit einem innerhalb der Arbeitsgruppe neu entwickelten System, dass die Stimulation von Zellen mit ausschließlich elektrischen Feldern, ohne störende Nebeneinflüsse, erlaubt.:1 Einleitung und Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Der Knochen 2.1.1 Allgemeine Biologie und Physiologie des Knochengewebes 2.1.2 Knochenersatzmaterialien 2.2 Tissue Engineering von Knochengewebe 2.2.1 Trägermaterialien für das TE von Knochen 2.2.2 Zellen für das TE von Knochen 2.2.3 Artifizielle extrazelluläre Matrizes für das TE von Knochen 2.3 Einfluss elektrischer Felder auf Knochenumbauprozesse 2.3.1 Methoden zur Applikation von elektrischen Feldern 2.3.2 In vitro Untersuchungen zum Einfluss elektrischer Felder 2.3.3 Methode der Transformator-ähnlichen Einkopplung (TC) 3 Materialien 3.1 Technische Hilfsmittel und Geräte 3.2 Verbrauchsmaterialien 3.3 Chemikalien, Reagenzien und Kits 3.4 Antikörper 3.5 Oligonukleotide 3.6 Puffer-, Medien- und Lösungszusammensetzungen 3.7 Zellen 4 Methoden 4.1 Polycaprolacton-Co-Lactid (PCL)-Scaffolds 4.1.1 Präparation und Hydrophilisierung der PCL-Scaffolds 4.1.2 Beschichtung der PCL-Scaffolds 4.1.3 Charakterisierung der Beschichtung auf den PCL-Scaffolds 4.2 Zellkulturtechniken 4.2.1 Auftauen und Subkultivierung 4.2.2 Einfrieren 4.2.3 Induktion der osteogenen Differenzierung 4.2.4 Induktion der adipogenen Differenzierung 4.2.5 Induktion der chondrogenen Differenzierung 4.2.6 Besiedlung und Kultivierung der Zell-Matrix-Konstrukte 4.2.7 Elektrische Stimulation der Zell-Matrix-Konstrukte 4.2.8 Blockierung definierter Signaltransduktionswege 4.3 Mikroskopische Analytik der Zellen 4.3.1 Darstellung der Zellverteilung mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) 4.3.2 Qualitative Bestimmung von Fetttröpfchen mittels Oil-Red-O Färbung 4.3.3 Qualitative Bestimmung der Mineralisierung mittels vonKossa- Färbung 4.4 Durchflusszytometrie 4.5 Biochemische Analytik der Zellen 4.5.1 Bestimmung der Zellzahl mittels Lactatdehydrogenase (LDH)- Aktivität 4.5.2 Bestimmung der alkalische Phosphatase (ALP)-Aktivität 4.5.3 Quantitative Bestimmung des Kalziumgehaltes 4.6 Molekularbiologische Analytik / Genexpressionsanalyse 4.6.1 RNA Extraktion 4.6.2 cDNA-Synthese / Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) 4.6.3 Amplifikation von cDNA mittels quantitativer Real-Time PCR (qPCR) 4.7 Statistische Auswertung 5 Weiterentwicklung der Kammer zur TC-Einkopplung 5.1 Grundlegende theoretische Betrachtungen zur TC-Einkopplung 5.1.1 Ersatzschaltbild der TC-Einkopplung 5.1.2 Abschätzung des Eisenkernquerschnitts 5.1.3 Einfluss der Primärwindungszahl 5.2 Neudimensionierung und Aufbau der Stimulationseinrichtung 5.3 Verlauf der elektrischen Größen 5.3.1 Simulation 5.3.2 Messung 5.3.3 Abschätzung des magnetischen Feldes in der Kammer 5.4 Zusammenfassung 6 Zellexperimentelle Ergebnisse 6.1 Charakterisierung der humanen MSZ nach in vitro Kultivierung 6.1.1 Morphologie 6.1.2 Phänotypische Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie 6.1.3 Multipotentes Differenzierungspotential 6.2 Zellverhalten auf den unbeschichteten PCL-Scaffolds 6.2.1 Ermittlung eines geeigneten Besiedlungsregimes 6.2.2 Zellverteilung und Proliferation der MSZ 6.2.3 Osteogene Differenzierung der MSZ 6.3 Einfluss der aEZM auf das Zellverhalten von MSZ 6.3.1 Quantitative Bestimmung der aEZM-Komponenten 6.3.2 Einfluss der aEZM auf die Adhärenz und Proliferation von MSZ 6.3.3 Einfluss der aEZM auf die osteogene Differenzierung von MSZ 6.4 Einfluss elektrischer Felder auf das Zellverhalten von MSZ 6.4.1 Einfluss der elektrischen Felder auf die Proliferation und osteogene Differenzierung von MSZ 6.4.2 Einfluss elektrischer Felder in Kombination mit Koll/sHya enthaltenden aEZM auf die Proliferation und osteogene Differenzierung von MSZ 6.4.3 Untersuchungen zu möglichen Signaltransduktionswegen 7 Diskussion der Ergebnisse 7.1 Charakterisierung der humanen MSZ nach in vitro Kultivierung 7.2 Zellverhalten auf den unbeschichteten PCL-Scaffolds 7.3 Einfluss der aEZM auf das Zellverhalten von MSZ 7.4 Einfluss elektrischer Felder auf das Zellverhalten von MSZ 8 Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis Danksagung Eigene Publikationen und Mitautorschaften A Zusatzinformationen für die quantitative RT-PCR A.1 Versuchsdesign der Genexpressionsanalysen A.2 Qualitätskontrolle der isolierten RNA