A sinalização da resposta Imune Inata exerce um papel fundamental na eliminação de patógenos bem como no recrutamento de progenitoras para recuperação de tecidos nervosos lesionados. Nossos estudos iniciais que buscavam a compreensão desta participação da atividade inflamatória na neurorregeneração e degenerção do OE constataram que a administração tópica de lipopolissacarídeo (LPS) gera perda de seus neurônios olfatórios (OSNs), enquanto que camundongos deficientes do gene Myd88 apresentam uma taxa de reposição neuronal pós-lesão mais elevada que a de selvagens e o uso consecutivo de DEX retarda a neurorregeneração olfatória em curto prazo. Prosseguimos agora no esclarecimento destes resultados em três vertentes: A primeira busca descrever as respostas do OE de animais selvagens e trangênicos Tlr4-/-, Myd88-/-, Ticam1-/-, Il1r1-/-, Casp1-/-/Casp4-/- e Casp1-/-/Casp4-/-/Casp4tg a estímulos inflamatórios provenientes de infusões intranasais de ligantes e citocinas recombinantes envolvidas na sinalização dos TLRs. Isto através de análises histológicas por marcação nuclear e análise da espessura e alterações anatômicas do OE, e da expressão de IL1b e Nf&#954bia por hibridização in situ (ISH), ou ainda pela contagem de suas células TUNEL-positivas pós-tratamento. Neste estudo propomos ainda um modelo de lesão para estudos de neurorregenereração através da análise por imunofluorescência (IF) de OSNs em função do tempo após uma infusão intranasal (IN) de LPS. A segunda analisa por microarranjos de oligonucleotídeos (microarray) as alterações de expressão gênicas associadas à ausência do gene Myd88 no OE pós-lesão seguida de análises histológicas de sua regeneração em camundongos com deleções em genes selecionados. Por fim o terceiro estudo investiga a degeneração e a neurorregeneração do OE sob o efeito do uso tópico consecutivo de DEX. O corticoide é co-aplicado topicamente com um insulto inflamatório para avaliar o seu efeito preventivo e consecutivamente por três dias em dois modelos de lesão para avaliar sua interferência na neurorregeneração 14 dias após o tratamento. Foram realizadas IF para quantificação dos volumes neuronais, espessura do OE, proliferação celular, síntese proteica e morte celular por TUNEL. O uso tópico de LPS promove a degeneração do OE via TLR4 a partir de regiões com expressão de Il1b e Nf&#954bia e número de células TUNEL elevada. Este efeito é via MyD88-dependente sem a participação da TRIF-dependente. O gene Myd88 é tão crucial nesta degeneração do epitélio quanto na gerada por rmIL-1β e rmTNFα. Sua ausência não promove citoproteção contra o gás NO. Possivelmente, CASP1 e IL-1R estejam também envolvidos. O modelo de lesão imunológica para estudos de neurorregeneração é rápido e eficaz. A ausência do gene Myd88 acompanha uma redução na expressão da enzima degradadora de insulina (IDE) no OE pós-lesão. Camundongos que não a expressam apresentam uma reposição celular do epitélio mais rápida. A co-IN de DEX com LPS impede a degeneração do OE. 10µl deste corticoide a 40ng/µl administrada por IN não é tóxica a este epitélio, porém seu uso consecutivo em curto prazo promove aberrações anatômicas nos modelos de lesão imunológica, além de interferir na sua dinâmica de reposição neural, elevação da taxa de síntese proteica e proliferação celular, sem alterar a diferenciação, após lesão induzida por metimazol. / The innate immune response signaling plays a key role in the elimination of pathogens and in the recruitment of new cells to recover the injured nervous tissues. Our preliminary studies on the roles of the inflammatory activity in OE degeneration and neuroregeneration process showed that the topical administration of lipopolysaccharide (LPS) generates the loss of olfactory sensorial neurons (OSNs), Myd88 gene-deficient mice exhibit a higher neuronal replacement rate after injury than wild-type mice, and that the consecutive use of DEX provokes retarding olfactory neuroregeneration over the short term. We seek now to clarify these results in three ways: The first describes the OE response in wild-type animals Tlr4-/-, Myd88-/-, Ticam1-/-, Il1r1-/-, Casp1-/-/Casp4-/- and Casp1-/-/Casp4-/-/Casp4tg animals to inflammation through the intranasal infusion (IN) of ligands and cytokines associated with Toll-Like Receptors (TLR) signaling. This was acomplished through histological analysis of the thickness and anatomical changes in DAPI stained OE, Il1b and Nfκbia expression analysis by in situ hybridization (ISH), and TUNEL-positive cells counting after treatment. In this study we propose an inflammatory lesion for neuroregeneration studies using immunofluorescence (IF) analysis of the OE in function of time after the intranasal infusion of LPS. The second part analyzes the Myd88 gene loss in the OE gene expression of after a lesion using microarray. This is followed by the histological analysis of regeneration using IF in transgenic mice with the deletion of specific genes (microarray versus literature review). Finally, the third study evaluates the OE degeneration and neuroregeneration under the influence of consecutive topical use of the DEX. The corticosteroid is co-administered with the inflammatory stimulus in order to evaluate its protective effect and consecutively for three days in two models of lesion to assess their influence on neuroregeneration 14 days after treatment. The IF analysis was performed in order to quantify the neuronal volumes, the thickness of the OE, cell proliferation, protein synthesis (by incorporation the identification of puromycin) and cell death by TUNEL. The topical use of LPS promotes the degeneration of OE by TLR4 from sites that feature an overexpression of Il1b and Nfκbia and a high number of TUNEL-positive cells. This effect is MyD88-dependent. The Myd88 gene is as crucial in this degeneration of the epithelium as in those generated by rmIL-1β and rmTNFα. Their absence does not promote cytoprotection against the cytotoxic gas nitric oxide (NO). It is possiby that CASP1 and IL-1R are also involved. The immunologic lesion model for neuroregeneration studies is fast and effective. The absence of Myd88 gene reduces the expression of insulin-degrading enzyme (IDE) in the post-lesion OE. Mice without this enzyme show a rapid cellular restoration in the epithelium. The Co-IN of DEX with LPS prevents the degeneration EO. The doses adopted by us are nontoxic; however its short-term consecutive use promotes anatomical aberrations in the immunological lesion model, and interferes with the dynamics of neural replacement by impairing both the rate of protein synthesis and proliferation of the epithelium without halting their differentiation.

O tratamento radioterápico continua aperfeiçoando-se, porém ainda pode estar associado com toxicidade pulmonar. Objetivo: Estudar os efeitos locais e sistêmicos provocados pela radioterapia conformacional torácica adjuvante em mulheres portadoras de câncer de mama, sem fatores de riscos prévios para desenvolvimento de alterações pulmonares. Por meio da tomografia computadorizada de alta resolução; identificar as possíveis alterações radiológicas no parênquima pulmonar. Se presentes, correlacioná-las com parâmetros obtidos da exploração funcional dos pulmões, com os efeitos sistêmicos, pela dosagem de mediadores inflamatórios, IL-1, IL-6 e TNF- , e suas repercussões sobre a qualidade de vida. Material e Métodos: Em 25 pacientes saudáveis foram coletadas amostras de sangue para serem utilizadas apenas como referência de normalidade da IL-1, IL-6 e TNF- . Em decorrência dos rígidos critérios de inclusão e exclusão estabelecidos, das 157 pacientes entrevistadas apenas 24 foram selecionadas para o estudo. A avaliação funcional pulmonar foi abrangente e constou de: medida dos volumes e capacidade dos pulmões, sendo o volume residual obtido pelo método de diluição do hélio em circuito fechado; estudo dos fluxos expiratórios máximos (curva fluxo x volume e curva volume x tempo) e medida da capacidade de difusão pulmonar pela técnica de respiração única do CO. A tomografia computadorizada de alta resolução (16 detectores) foi realizada no pré-planejamento da radioterapia conformacional do tórax, esta com dose total de 45-50 Gy em 25 frações. Para as dosagens de citocinas plasmáticas foram empregadas as técnicas de imunoabsorção enzimáticas (ELISA). Na avaliação da qualidade de vida foi aplicado o questionário Saint George´s Respiratory Questionnary traduzido e adaptado culturalmente ao Brasil. Todos estes procedimentos foram obtidos na fase pré e repedidos 3 meses após a radioterapia. Os resultados das duas fases foram comparados utilizando-se a versão exata do teste Wilcoxon e o teste de Correlação de Spearman, nível de significância p 0,05. Resultados: Entre parâmetros funcionais houve queda significativa apenas na difusão e no fluxo expiratório a 50% da capacidade vital forçada. Mesmo comportamento observou-se para citocina IL-6, já que os mesmos encontravam-se aumentados pré-RT. Não ocorreram mudanças significativas em nenhum dos domínios do questionário de qualidade de vida. As alterações tomográficas ocorreram 60,87% das pacientes na fase pós-radioterapia, em sua maioria de graus leves a moderados e não correlacionaram-se com as alterações observadas em outros parâmetros estudados. Conclusão: O aumento observado na IL-6 durante a fase pré-RT, parece ser um bom índice preditivo de alteração pulmonar. A capacidade de difusão foi a alteração mais evidente e parece ser o índice que melhor reflete as alterações pulmonares que afetam essas pacientes. Diante das discretas alterações tomográficas e funcionais observadas após a RT, é provável que para a redução observada na DLCO concorra uma combinação de fatores ao nível da membrana alvéolo-capilar. No conjunto, as alterações induzidas pela radioterapia conformacional nas pacientes estudadas foram de pequena monta, insuficientes para influenciar aspectos funcionais do pulmão e a qualidade de vida. / Radiotherapy continues to improve itself, but it may still be associated with pulmonary toxicity. Objective: To study the effects caused by local and systemic adjuvant thoracic conformal radiotherapy in women with breast cancer, without risk factors prior to the development of pulmonary alterations. Through high-resolution computed tomography, to identify the possible radiological alterations in the lung parenchyma. If positive identification occurs, correlates it with pulmonary functional parameters, its systemic effects, the dosage of inflammatory mediators IL-1, IL-6 and TNF-, and their impact on quality of life. Material and Methods: Blood samples were collected from 25 healthy patients to be used as a normal reference for IL-1, IL-6 and TNF- mediators. Due to the established strict inclusion and exclusion criteria, only 24 from the initial 157 interviewed patients were selected for this study. The evaluation of pulmonary function was comprehensive and included: Lung volume and capacity measurement through closed loop helium residual volume dilution method;Peak expiratory flow study (flow curve x volume and volume vs. time curve) and CO diffusing capacity measurement through single breath technique. High-resolution computerized tomography (16 detectors) was performed in the pre-planning phase of thoracic conformal radiotherapy where 45-50 Gy total dose was applied in 25 fractions. For cytokines plasma measurement, the enzymatic immunosorbent techniques (ELISA) were used. For quality of life assessment, the Brazil´s validated Saint George\'s Respiratory Questionnary was used. All these procedures were applied in the pre-phase and repeated three months later after radiotherapy sessions. The results of the two phases were compared using the exact version of the Wilcoxon test and Spearman correlation test with p 0.05 significance level. Results: Among the functional parameters, there were a significant decrease in dissemination and expiratory flow at 50% of forced vital capacity. The same behavior was observed for cytokine IL-6, since they were already high at pre-RT. There were no significant changes in any of the aspects of quality of life questionnaire. The tomographic alterations occurred in 60,87% of patients in the post radiotherapy phase, mostly having low to moderate degree and not correlated with the observed changes in other parameters. Conclusion: The IL-6 increase in the pre-RT phase appears to be a reasonable predictive index of pulmonary alterations. The diffusing capacity alterations were the most evident and seem to be the index that best reflects the pulmonary alterations that affect these patients. Given the discrete tomographic and functional abnormalities observed after RT, it is likely that for the observed reduction in DLCO compete a combination of factors occurring at alveolar-capillary membrane level. Overall, the conformal radiotherapy induced changes in the studied patients were not expressive, insufficient to influence the pulmonary functional aspects and the quality of life of the patients.

La Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA) est la première cause de cécité légale dans les pays industrialisés chez les personnes âgées. L’atrophie géographique – l’une des formes tardives de la DMLA - est caractérisée par la perte de l’épithélium pigmentaire et la dégénérescence des photorécepteurs. Nous groupe a montré précédemment que dans l’atrophie géographique, les phagocytes mononucléés (PMs) s’accumulent dans l’espace sous-rétinien, et induisent la dégénérescence rétinienne via la production d’IL-1β. Dans un premier temps, nous montrons que la présence de PMs sous-rétiniens est associée à la perte des bâtonnets et la dégénérescence des segments de cônes dans la zone de transition de patients atrophiques. Nous montrons ensuite dans différents modèles in vivo et ex vivo que les macrophages récapitulent ces effets, et qu’IL-1β est nécessaire à la perte des segments externes des cônes induite par les PMs. Dans un deuxième temps, nos résultats montrent qu’IL-1β induit indirectement la mort des bâtonnets, en perturbant l’homéostasie rétinienne du glutamate. L’inhibition des récepteurs glutamatergiques pour prévenir l’excitotoxicité du glutamate, ou la supplémentation en cystine favorisant la restauration de la machinerie neuronale antioxydante, permettent de protéger les bâtonnets de la toxicité induite par IL-1β. L’ensemble de nos résultats démontre le rôle joué par IL-1β dans la dégénérescence des segments de cônes et la perte des bâtonnets dans l’inflammation sous-rétinienne. Cette étude permettra la mise au point de thérapies innovantes, afin de lutter contre la forme atrophique de la DMLA, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement. / In geographic atrophy (GA), one of the late forms of Age-related Macular Degeneration (AMD), an extending atrophic zone forms, characterized by the loss of retinal pigment epithelium and photoreceptor degeneration. Subretinal mononuclear phagocytes (MPs) accumulate in GA, and are associated with IL-1β-dependent retinal degeneration. First, we confirmed that subretinal accumulation of MPs is associated with rod degeneration and cone segment loss in the transitional zone in GA human samples. Using ex vivo and in vivo models, we then demonstrated that MPs-derived IL-1β leads to severe cone segment degeneration. Therefore, inhibiting subretinal MP accumulation or IL-1β might protect the cone segment, and help preserve high acuity daytime vision in conditions characterized by subretinal inflammation. Second, we showed that IL-1β effect on rod degeneration is indirect, and mediated by glutamate. Our results indicate that IL-1β impairs Müller glial cells glutamate recycling, and subsequently leads to the extracellular increase in glutamate content. Inhibiting glutamate receptors to prevent excitotoxicity, or exogenous cystine supplementation to supply antioxidant metabolism, are sufficient to protect rods from IL-1β-induced neurotoxicity. Our results provide new perspectives to treat pathologies associated with subretinal inflammation such as late AMD. Our results collectively demonstrated that MP-derived IL-1β induces cone segment loss, and glutamate homeostasis disruption associated with rod degeneration. This study will help with the development of new therapeutic strategies in dealing with inflammatory retinal pathologies as geographic atrophy.

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Im Jahr 2008 gab es weltweit 347 Millionen Diabetiker bei weiter zunehmender Inzidenz. Die beiden größten Unterformen sind mit 90 % Typ 2- und 10 % Typ 1-Diabetes (Danaei et al. 2011). Beiden Diabetesformen sind eine Dysfunktion und ein Zelltod der Betazellen durch Apoptose gemeinsam, die Betazellschädigung wird dabei über ähnliche Signaltransduktionwege vermittelt. Ein wichtiger Gegenspieler der Betazellapoptose ist der Transkriptionsfaktor CREB, der an der Regulation der Insulingentranskription beteiligt und wichtig für das Betazellüberleben ist (Oetjen et al. 1994, Jhala et al. 2003). Durch die MAP3-Kinase DLK kann die transkriptionelle Aktivität von CREB in Betazellen gehemmt werden (Oetjen et al. 2006). Als übergeordnete MAP3K kann DLK die Apoptose-regulierende MAP-Kinase JNK aktivieren und von ihr wieder aktiviert werden (Handley et al. 2007). Die bei Diabetes mellitus Typ 1 und Typ 2 vermehrt produzierten proinflammatorischen Zytokine TNF-Alpha und IL-1 Beta können ebenfalls JNK aktivieren (Mandrup-Poulsen 2003). In dieser Arbeit wurde die Wirkung von TNF-Alpha und IL-1 Beta auf die CREB-abhängige Gentranskription im Luciferase-Reporter-Assay und auf das Absterben und die Apoptose von Betazellen im MTT-Test und Immunfluoreszenz-Assay in der Betazelllinie HIT-T15 untersucht. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Zytokinwirkung DLK-abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass TNF-Alpha und IL-1 Beta die stimulierte CRE-/CREB-abhängige Gentranskription hemmen, Überexpression von DLK verstärkt diese Wirkung, bei TNF-Alpha mehr als bei IL-1Beta. Verminderung der endogenen DLK durch siRNA reduziert die TNF-Alpha- und IL-1 Beta-induzierte CREB Hemmung. Beide Zytokine konnten eine Betazellapoptose auslösen, die ebenfalls durch die DLK verstärkt wird. Bei Überexpression einer Kinase-toten DLK-Mutante konnte durch TNF-Alpha keine Apoptose induziert werden, aber durch IL-1 Beta, dies spricht dafür, dass die Wirkung von TNF-Alpha zu einem größeren Teil abhängig von der DLK ist als die Wirkung von IL-1 Beta, die zum Teil DLK-unabhängig vermittelt wird. Zusammengefasst könnte TNF-Alpha über Aktivierung von DLK und JNK und anschließend gegenseitiger Signalamplifikation beider Kinasen zu einer DLK-vermittelten Hemmung der CREB-abhängigen Gentranskription führen, eine Betazelldysfunktion und Apoptose vermitteln und zur Entstehung von Diabetes beitragen. Dagegen könnte IL-1 Beta über Aktivierung von JNK indirekt die DLK aktivieren und zu einer CREB-Hemmung führen. Die DLK scheint eine zentrale Rolle in der Zytokin-induzierten Betazellschädigung einzunehmen. Eine gewebespezifische Hemmung der DLK, wie z.B. über den Proteinkinaseinhibitor Tozasertib im Glaukommodell gezeigt (Welsbie et al. 2013), könnte daher auch einen neuen Ansatz in der Therapie des Diabetes mellitus darstellen.

A doença infecciosa que causa o maior número de mortes no mundo é a tuberculose, causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis. Um dos fatores de risco que aumenta três vezes o desenvolvimento de tuberculose é a diabetes, sendo a obesidade associada com predisposição à diabetes. A obesidade gera inflamação de baixo grau que agrava a progressão de doenças crônicas. Estudos que avaliaram a associação da obesidade com tuberculose são controversos, e o tema merece maior investigação. No presente estudo, usamos um modelo experimental para determinar a interface da obesidade e da tuberculose. Camundongos C57BL/6 foram alimentados com dieta hiperlipídica (HFD - High Fat Diet) durante 60 dias, quando foram infectados com M. tuberculosis (HFD/Mtb) por via intra-traqueal. Como controles experimentais, animais foram alimentados com dieta padrão (LFD - Low Fat Diet) e infectados (LFD/Mtb). Paralelamente, um grupo recebeu HFD e outro LFD, e seguiram sem infecção. Após 30 dias de infecção, totalizando 90 dias de dieta, os diferentes grupos foram avaliados. Os animais obesos e infectados (HFD/Mtb) apresentaram aumento do peso corporal e do peso dos tecidos adiposos, aumento da expressão gênica de IL-1? no tecido adiposo, intolerância à glicose, deficiência na produção de insulina e aumento dos níveis séricos de IFN-? comparados aos animais LFD/Mtb. Além disso, o grupo HFD/Mtb foi mais suscetível e apresentou maior inflamação pulmonar comparado ao grupo LFD/Mtb. A inflamação foi caracterizada por aumento na expressão gênica para IL-17, IFN-?, TNF, IL-1?, IL-1?, NLRP3, caspase-1, IL-18, IL-6, aumento de células CD4+ produtoras de IFN-? e/ou IL-17 nos pulmões, e foi também acompanhada por aumento de células CD8+ e células CD4+Foxp3+ quando comparado ao grupo LFD/Mtb. Como NLRP3 é uma molécula chave na metainflamação induzida pela obesidade, mas seu papel ainda não está bem definido na tuberculose, animais deficientes de NLRP3 receberam HFD e foram infectados (NLRP3-/- HFD/Mtb). Esse grupo NLRP3-/- HFD/Mtb foi mais resistente e exibiu redução da inflamação pulmonar comparado ao grupo WT (Wild Type) HFD/Mtb. Sabendo que a obesidade está associada à disbiose e que produtos bacterianos derivados da dieta alimentar ou da microbiota podem estimular a liberação de IL-1? pela ativação de NLRP3, avaliamos o papel da microbiota na comorbidade obesidade e tuberculose. Encontramos disbiose intestinal, caracterizada por aumento do Filo Firmicutes e redução dos Filos Bacteroidetes e Proteobacteria, além do aumento de butirato e redução de acetato e propionato nos intestinos do grupo HFD/Mtb comparado ao grupo LFD/Mtb. O aumento na expressão de claudina-2 sugere alteração na permeabilidade intestinal e possível translocação bacteriana, caracterizada pela disbiose nos pulmões, nos quais foi detectado aumento de Firmicutes, Bacteroidetes e Actinobacteria, e redução de Proteobacteria no grupo HFD/Mtb. Em conclusão, a obesidade aumenta a magnitude da inflamação pulmonar e a suscetibilidade à infecção por M. tuberculosis por um mecanismo dependente de NLRP3. Ambos, aumento da suscetibilidade à infecção e da inflamação pulmonar estão associadas com disbiose intestinal e pulmonar, e aumento da permeabilidade intestinal. / The infectious disease that causes the largest number of deaths in the word is tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis bacilli. One of the risk factors that increases the devolpment of tuberculosis three times is diabetes. Obesity generates lowgrade inflammation that magnify the progression of chronic disease. Studies that have evaluated the association between obesity and tuberculosis are controversial, and the issue requires further investigation. In this study, we used an experimental model to determine the interface between obesity and tuberculosis. C57BL/6 mice were fed a highfat diet (HFD) for 60 days and infected by M. tuberculosis (HFD/Mtb) via intratracheal. As experimental control, animals were fed a light-fat diet (LFD) and were infected (LFD/Mtb). In parallel, one group was fed with HFD and another LFD, and they remained without infection. After 30 days of diet completing 90 days of feeding, the different groups were evaluated. Obese and infected animals (HFD/Mtb) showed increased body mass and adipose tissue weight, increased of IL-1? gene expression in adipose tissue, glucose intolerant, impaired insulin production and increased of serum levels of IFN-? compared to LFD/Mtb animals. In addition to, HFD/Mtb animals were more susceptible and exhibited higher lung inflammation compared to LFD/Mtb animals. The inflammation was characterized by increased of IL-17, IFN-?, TNF, IL-1?, IL-1?, NLRP3, caspase-1, IL-18, IL-6 gene expression and increase of IFN-? and/ or IL-17- producing CD4+ cells in the lungs, and was also accompanied by increased CD8+ and CD4+Foxp3+ cells compared to the LFD/Mtb group. As NLRP3 is a key molecule in obesity-induced meta-inflammation, but its role is still not well defined in tuberculosis, NLRP3 deficient animals fed with HFD and were infected (NLRP3-/- HFD/Mtb). This NLRP3-/- HFD/Mtb group was more resistant and exhibited reduction of lung inflammation compared to the WT (Wild Type) HFD/ Mtb group. Considerate that obesity-associated dysbiosis and that bacterial products derived from diet or microbiota can stimulate the release of IL-1? by the activation of NLRP3, we evaluated the microbiota role in obesity and tuberculosis comorbidity. We found intestinal dysbiosis characterized by increased Firmicutes phylum and reduction of Bacteroidetes and Proteobacteria phylum, as well as increased butyrate and diminished acetate and propionate in the intestine of the HFD/Mtb group compared to the LFD/Mtb group. An increase of claudin-2 expression suggests an alteration in intestinal permeability and a possible bacterial translocation characterized by dysbiosis in the lungs, with increased of Firmicutes, Bacteroidetes and Actinobacteria and diminished of Proteobacteria in the HFD/Mtb group. In conclusion, obesity increases the magnitude of pulmonary inflammation and susceptibility to M. tuberculosis infection by an NLRP3-depedent mechanism. Both increased susceptibility to infection and pulmonary inflammation are associated with intestinal and pulmonary dysbiosis, and increased intestinal permeability.

O tratamento radioterápico continua aperfeiçoando-se, porém ainda pode estar associado com toxicidade pulmonar. Objetivo: Estudar os efeitos locais e sistêmicos provocados pela radioterapia conformacional torácica adjuvante em mulheres portadoras de câncer de mama, sem fatores de riscos prévios para desenvolvimento de alterações pulmonares. Por meio da tomografia computadorizada de alta resolução; identificar as possíveis alterações radiológicas no parênquima pulmonar. Se presentes, correlacioná-las com parâmetros obtidos da exploração funcional dos pulmões, com os efeitos sistêmicos, pela dosagem de mediadores inflamatórios, IL-1, IL-6 e TNF- , e suas repercussões sobre a qualidade de vida. Material e Métodos: Em 25 pacientes saudáveis foram coletadas amostras de sangue para serem utilizadas apenas como referência de normalidade da IL-1, IL-6 e TNF- . Em decorrência dos rígidos critérios de inclusão e exclusão estabelecidos, das 157 pacientes entrevistadas apenas 24 foram selecionadas para o estudo. A avaliação funcional pulmonar foi abrangente e constou de: medida dos volumes e capacidade dos pulmões, sendo o volume residual obtido pelo método de diluição do hélio em circuito fechado; estudo dos fluxos expiratórios máximos (curva fluxo x volume e curva volume x tempo) e medida da capacidade de difusão pulmonar pela técnica de respiração única do CO. A tomografia computadorizada de alta resolução (16 detectores) foi realizada no pré-planejamento da radioterapia conformacional do tórax, esta com dose total de 45-50 Gy em 25 frações. Para as dosagens de citocinas plasmáticas foram empregadas as técnicas de imunoabsorção enzimáticas (ELISA). Na avaliação da qualidade de vida foi aplicado o questionário Saint George´s Respiratory Questionnary traduzido e adaptado culturalmente ao Brasil. Todos estes procedimentos foram obtidos na fase pré e repedidos 3 meses após a radioterapia. Os resultados das duas fases foram comparados utilizando-se a versão exata do teste Wilcoxon e o teste de Correlação de Spearman, nível de significância p 0,05. Resultados: Entre parâmetros funcionais houve queda significativa apenas na difusão e no fluxo expiratório a 50% da capacidade vital forçada. Mesmo comportamento observou-se para citocina IL-6, já que os mesmos encontravam-se aumentados pré-RT. Não ocorreram mudanças significativas em nenhum dos domínios do questionário de qualidade de vida. As alterações tomográficas ocorreram 60,87% das pacientes na fase pós-radioterapia, em sua maioria de graus leves a moderados e não correlacionaram-se com as alterações observadas em outros parâmetros estudados. Conclusão: O aumento observado na IL-6 durante a fase pré-RT, parece ser um bom índice preditivo de alteração pulmonar. A capacidade de difusão foi a alteração mais evidente e parece ser o índice que melhor reflete as alterações pulmonares que afetam essas pacientes. Diante das discretas alterações tomográficas e funcionais observadas após a RT, é provável que para a redução observada na DLCO concorra uma combinação de fatores ao nível da membrana alvéolo-capilar. No conjunto, as alterações induzidas pela radioterapia conformacional nas pacientes estudadas foram de pequena monta, insuficientes para influenciar aspectos funcionais do pulmão e a qualidade de vida. / Radiotherapy continues to improve itself, but it may still be associated with pulmonary toxicity. Objective: To study the effects caused by local and systemic adjuvant thoracic conformal radiotherapy in women with breast cancer, without risk factors prior to the development of pulmonary alterations. Through high-resolution computed tomography, to identify the possible radiological alterations in the lung parenchyma. If positive identification occurs, correlates it with pulmonary functional parameters, its systemic effects, the dosage of inflammatory mediators IL-1, IL-6 and TNF-, and their impact on quality of life. Material and Methods: Blood samples were collected from 25 healthy patients to be used as a normal reference for IL-1, IL-6 and TNF- mediators. Due to the established strict inclusion and exclusion criteria, only 24 from the initial 157 interviewed patients were selected for this study. The evaluation of pulmonary function was comprehensive and included: Lung volume and capacity measurement through closed loop helium residual volume dilution method;Peak expiratory flow study (flow curve x volume and volume vs. time curve) and CO diffusing capacity measurement through single breath technique. High-resolution computerized tomography (16 detectors) was performed in the pre-planning phase of thoracic conformal radiotherapy where 45-50 Gy total dose was applied in 25 fractions. For cytokines plasma measurement, the enzymatic immunosorbent techniques (ELISA) were used. For quality of life assessment, the Brazil´s validated Saint George\'s Respiratory Questionnary was used. All these procedures were applied in the pre-phase and repeated three months later after radiotherapy sessions. The results of the two phases were compared using the exact version of the Wilcoxon test and Spearman correlation test with p 0.05 significance level. Results: Among the functional parameters, there were a significant decrease in dissemination and expiratory flow at 50% of forced vital capacity. The same behavior was observed for cytokine IL-6, since they were already high at pre-RT. There were no significant changes in any of the aspects of quality of life questionnaire. The tomographic alterations occurred in 60,87% of patients in the post radiotherapy phase, mostly having low to moderate degree and not correlated with the observed changes in other parameters. Conclusion: The IL-6 increase in the pre-RT phase appears to be a reasonable predictive index of pulmonary alterations. The diffusing capacity alterations were the most evident and seem to be the index that best reflects the pulmonary alterations that affect these patients. Given the discrete tomographic and functional abnormalities observed after RT, it is likely that for the observed reduction in DLCO compete a combination of factors occurring at alveolar-capillary membrane level. Overall, the conformal radiotherapy induced changes in the studied patients were not expressive, insufficient to influence the pulmonary functional aspects and the quality of life of the patients.

Diese Arbeit verdeutlicht die Wirkung von Chondroitinsulfat auf die Synthese von Prostaglandin E2 in humanen mesenchymalen Stromazellen in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades. MSC zeichnen sich durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften aus und haben damit einen modulierenden Effekt auf Wundheilungsprozesse. Als Vorläuferzellen von Osteoblasten sind sie direkt an der Knochenneubildung beteiligt. Eine persistierende Entzündung hat eine kontinuierliche Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1 zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass IL-1 in hMSC zu einer Freisetzung von PGE2 führt. Unter kurzzeitiger Wirkung stimuliert PGE2 die Knochenneubildung. Eine langanhaltende Präsenz leitet dagegen die Bildung des Faktors RANKL, einen die Osteoklastogenese stimulierenden Faktor, ein. Seit langem ist der positive Effekt von Chondroitinsulfat in chronischen Entzündungsprozessen, wie Rheumatoider Arthritis, bekannt. Zudem werden sie in aktuellen Studien als Beschichtungsbestandteile von Knochenimplantaten verwendet. Sie führten hier zu einer besseren Bioinduktivität und Biokonduktivität. Bisher ist dennoch der molekulare Wirkmechanismus nicht genau beschrieben. Die Schwierigkeit besteht darin, dass die molekularen Signalkaskaden für die einzelnen Kulturmoldelle Unterschiede aufweisen und kein ubiquitärer Mechanismus dargestellt wird. In hMSC führte die Stimulation mit IL-1 unter vorheriger Zugabe von Chondroitinsulfat zu einer Reduktion der PGE2 Freisetzung. Der Effekt des hochsulfatierten sCS3 war gegenüber dem nativen C4S verstärkt. Die reduzierende Wirkung von C4S setzte verzögert ein. Es ist bereits bekannt, dass die negative Ladung der CS zu einer Bindung von Zytokinen führt. Dadurch wird eventuell die Konzentration der Zytokine, wie IL-1 im Bereich der Zellrezeptoren erniedrigt und führt zu einer verringerten Stimulation der Zelle. Denkbar ist auch die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionskaskade durch die Bindung der CS an einen speziellen, bisher unbekannten, Membranrezeptor. Die entscheidenden Enzyme der PGE2 Synthese sind die Cyclooxygenase-2 (Cox-2) und die mikrosomale Prostaglandin E Synthase 1 (mPGES1). Die mRNA beider Enzyme war unabhängig vom Sulfatierungsgrad der CS reduziert. Dieser Effekt konnte auf Protein-ebene nicht belegt werden. Die produzierte Proteinmenge an mPGES1 wird durch IL-1 induziert, bleibt aber auch durch Zugabe von CS unverändert. Somit kann von einer erhöhten Translationseffizient und mRNA Stabilität der mPGES1 RNA ausgegangen werden. MAPK Kinasen sind entscheidende Schnittstellen bei der Regulation der mRNA Stabilität als auch der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. In dieser Studie konnte die MAPK p38 als entscheidendes Enzym bei der Wirkung von CS auf die PGE2 Synthese ermittelt werden. Dabei führten sowohl das natürliche C4S als auch das hochsulfatierte sCS3 zu einer verringerten Aktivierung. Der Transkriptionsfaktor NfkB ist einer von mehreren, die an den Promotorbereichen der beiden induzierbaren PGE2 Enzyme, Cox-2 und mPGES1, binden. Es ist anzunehmen, dass die hier aufgezeigte verringerte Aktivität von NfkB als auch die verhinderte Translokation in den Zellkern eine reduzierte Transkription der jeweiligen mRNA bedingten. Abhängig vom untersuchten Modell und den verwendeten Kulturbedingungen können diese Prozesse moduliert sein. Die Erkenntnisse dieser experimentellen Arbeit liefern einen weiteren wichtigen Baustein zum Verständnis der molekularbiologischen Abläufe während entzündlicher Prozesse. Die Verwendung von Chondroitinsulfat, insbesondere hochsulfatiertes CS, in Kombination mit hMSC kann gezielt zu einer Verringerung der Entzündungsreaktion während der Implantateinheilung führen. Die durch PGE2 hervorgerufenen Symptome, wie erhöhte Gefäßpermeabilität, Schwellung und verstärktes Schmerzempfinden begründen diese positiven Effekte.

La paralysie cérébrale (PC) affecte 3/1000 nouveau-nés. Les conditions pathologiques menant à la PC sont de natures infectieuse-inflammatoire et/ou hypoxique-ischémique (HI). Ce projet a eu comme objectif de caractériser un modèle animal de lésions cérébrales à un temps où la maturité cérébrale du raton est comparable à celle du nouveau-né humain à terme. L'hypothèse est que les cytokines pro-inflammatoires IL-1[bêta] et TNF-[alpha] jouent un rôle dans l'induction des lésions cérébrales. Matériel et Méthodes : Ce modèle animal est composé de cinq conditions expérimentales : CTL, sham , LPS, HI, et LPS+HI. Brièvement, une injection i.p de LPS à une dose de 200[micro]g/kg a été réalisée 4h avant une ligature permanente de la carotide commune droite suivie d'une hypoxie (8% O[indice inférieur 2]) pendant 2h30-3h30. Les ratons ont été sacrifiés à différents temps post-HI afin d'analyser l'expression d'IL-1[bêta], d'IL-1Ra et de TNF-[alpha] cérébrales. L'expression in situ des cellules CD68+, Iba-1+ et GFAP+ a été analysée par IF. L'IRM et l'histologie ont été utilisés afin de caractériser les dommages cérébraux. Des injections de bloquants de cytokines pro-inflammatoires ont été effectuées. Résultats : Des dommages cérébraux ont été induits dans les conditions HI«LPS, sélectivement dans l'hémisphère cérébral droit, et étaient maximaux lors de la combinaison des agression [sic]. Une surexpression des cytokines IL-1[bêta], IL-1Ra, et TNF-[alpha] a été induite dans l'hémisphère droit exposé à l'HI«LPS. Une gliose a été détectée au sein des lésions cérébrales. Certains déficits cognitifs et moteurs ont été observés dans la condition LPS+HI. L'administration systémique des bloquants de cytokines n'a pas réduit les dommages cérébraux aux doses utilisées. Conclusions : Dans ce modèle animal, l'HI«LPS a induit des dommages cérébraux similaires à ceux observés chez le nouveau-né humain à terme. Les déficits cognitifs et comportementaux induits sont caractéristiques de la PC. Bien qu'il y ait une forte induction intracérébrale d'IL-1[bêta] et de TNF-[alpha], les essais de neuroprotection ont suggérés que ces cytokines ne sont pas impliquées dans la genèse des lésions cérébrales à ce stade de développement.

GATA-4 est un facteur de transcription essentiel dans la formation du tube cardiaque primitif. Dans l'intestin, GATA-4 joue un rôle dans le développement et dans le maintien de l'identité jujéno-iléale. L'analyse par micropuce à ADN effectuée sur des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 suggère un rôle de GATA-4 dans la réponse inflammatoire et des études antérieures réalisées au laboratoire ont permis de confirmer l'implication de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire C/EBPdépendante. L'objectif de mon projet était de déterminer si GATA-4 module la réponse inflammatoire par d'autres mécanismes que ceux déjà découverts au laboratoire et de générer des mutants de GATA-4 pour caractériser l'implication de certains domaines et sites spécifiques de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire intestinale. Des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 ou des mutants de GATA-4 de façon stable, induites ou non à l'IL-1[béta] ont été utilisées comme modèle. L'activation des voies MAPK et Akt a été vérifiée par immunobuvardage de type Western. La liaison à l'ADN des facteurs de transcription AP-1, C/EBPs et NF-[kappa]B a été vérifiée par gel de rétention. L'expression de certains gènes de réponse inflammatoire a été vérifiée par RT-PCR. Finalement, des lignées cellulaires exprimant des mutants de GATA-4 ont été partiellement caractérisées. Mes résultats montrent qu'une surexpression de GATA-4 dans les IEC-6 traitées à l'IL-1[béta] réduit la phosphorylation de p42/p44 et d'Akt. Les facteurs de transcription AP-1, C/EBP et NF-[kappa]B sont davantage recrutés à l'ADN. La nature de leurs complexes semble être également affectée. Cette induction de liaison coïncide avec une baisse d'expression des gènes pro-inflammatoires CCL5 et iNOS. La caractérisation des mutants de GATA-4 suggère que le premier doigt de zinc (216-240) pourrait moduler la morphologie cellulaire et que la région basique (294-336) pourrait contribuer à la vitesse de prolifération augmentée des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4. En somme, mes résultats suggèrent que GATA-4 pourrait participer à l'instauration d'une tolérance immunitaire prenant place lors de la différenciation entérocytaire.