Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-04-02T13:47:38Z No. of bitstreams: 1 Rosane Borges Dias - Estudo do perfil... 2014.pdf: 2418992 bytes, checksum: 9a4f389957bc3f98114112321eee18b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-02T13:47:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosane Borges Dias - Estudo do perfil... 2014.pdf: 2418992 bytes, checksum: 9a4f389957bc3f98114112321eee18b4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Universidade Federal da Bahia. SAlvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A displasia epitelial oral (DEO) é um aspecto histológico descrito em lesões potencialmente malignas, cujos mecanismos relacionados a patogênese e potencial de transformação são pouco conhecidos. Sabendo-se que a via de sinalização Sonic Hedgehog(SHH)tem participação no desenvolvimento do carcinoma escamocelular de boca(CEB) e que as proteínas relacionadas a esta via de sinalização estão envolvidas nos mecanismos biológicos relacionados a iniciação e progressão de tumores humanos. O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão das proteínas da via de sinalização SHH em DEO, a fim de contribuir para o conhecimento do perfil biológico desta lesão. Material e Métodos: As amostras de DEO foram revisadas e classificadas de acordo com o risco de malignidade descrito por Kujan et al.(2006) e OMS(2005). Vinte e cinco casos de DEO foram submetidos a reação imuno-histoquímica para as proteínas SHH, PTCH1, SUFU, HHIP, GLI1 e Ciclina D1(CCND1)utilizando o sistema polimérico AdvanceTM(Dako). Para fins comparativos, cinco casos de hiperqueratose, oito de hiperplasia fibrosa inflamatória(HFI) e quatro de mucosas não-neoplásica(MNN)também foram avaliados.Todos os casos foram analisados de acordo com os parâmetros semiquantitativos descritos por Gurgel et al.(2008)e os dados foram analisados usando Graph Pad Prism5.01. Resultados: Vinte e um(84%)DEO foram classificados como lesões de baixo risco e 4(16%)como alto risco. A proteína SHH foi predominante no citoplasma(n =14, sendo 56%) e a positividade de PTCH1 foi observada em membrana e citoplasma (n=23, 92%). As proteínas HHIP e SUFU foram observadas principalmente no citoplasma das células epiteliais e foram positivas em 17 (68%) e 11 (44%) das DEO, respectivamente. GLI1 foi positivo em 21 (84%), principalmente localizada nos núcleos das células epiteliais (n=12; 70,6%). A proteína CCND1 foi exclusivamente no núcleo 19(76%).Em DEO, os escores predominantes para SHH, PTCH1, HHIP, SUFU, GLI1 e CCND1 foram: 2+ (57,14%), 3+ (73,91%), 3+ (58,82%), 2+ e 3+ (36,36%), 3+ (90,48 %), 1+(47,37 %), respectivamente. Os casos de DEO exibiram maior expressão de HHIP(p=0,02) e GLI1(p=0,00), em comparação com hiperqueratose. Além disso, níveis elevados de PTCH1 (p=0,05), HHIP (p= 0,01) e CCND1 (p=0,00) foram observados em DEO em comparação com HFI. Ainda, uma maior expressão de PTCH(p=0,01) foi observada nos casos de DEO quando comparados com MNN. Conclusões: Os nossos resultados sugerem que a via SHH pode participar da patogênese da DEO e reforçam a relação desta cascata sinalizadora na carcinogênese oral. / Oral epithelial dysplasia (OED) is a histological aspect described in premalignant lesions and the mechanisms related to the pathogenesis and malignant progression are poorly understood. It is known that Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway participates in the development of oral squamous cell carcinoma, and proteins related to this cascade are involved in biological mechanisms related to the initiation and progression of human tumors. The aim of this study was to investigate SHH signaling molecules in OED, in order to contribute to the knowledge of the biological profile of this lesion. Methods: Samples of OED were reviewed and classified according to the risk of malignancy described by Kujan et al. (2006) and WHO (2005). Twenty five cases of DEO were to submitted to immunohistochemical reactions for SHH, PTCH1, SUFU, HHIP, GLI1 and Cyclin D1 (CCND1) proteins using AdvanceTM polymer system (Dako). For comparative purposes, five cases of hyperkeratosis, eight inflammatory fibrous hyperplasia (IFH) and four non- neoplastic (NNM) mucosa were also evaluated. All OED were analyzed according to the semi-quantitative parameters described by Gurgel et al. (2008) and the data was analyzed using Graph Pad Prism 5.01. Results: Twenty- one (84%) OED were classified as low risk lesions and 4 (16%) as high risk. SHH protein was predominant in cytoplasm (n=14; 56%) and PTCH1 positivity was described in both membrane and cytoplasm (n=23; 92%). HHIP and SUFU proteins were observed in cytoplasm of epithelial cells and were positive in 17 (68%) and 11 (44%) OED, respectively. GLI1 protein was positive in 21 (84%), mainly located in the cells nuclei (n=12; 70.6%). CCND1 protein was exclusively in the nucleus 19 (76%). The predominant scores for SHH, PTCH1, HHIP, SUFU, GLI1 and CCND1 were: +2 (57.14%), +3 (73.91%), +3 (58.82%), +2 and +3 (36.36%), +3 (90.48%), +1 (47.37%), respectively. OED sample had higher levels of HHIP (p=0.02) and GLI1 (p=0.00) as compared to hyperkeratosis. Furthermore, high levels of PTCH (p=0.05), HHIP (p=0.01) and CCND1 (p=0.00) were observed in OED as compared to IFH OED. Also, a high level of PTCH (p= 0.01) was observed in OED as compared to NNM. Conclusions: Our results suggest that the SHH pathway may participate in the pathogenesis of DEO and corroborates to the relationship of this signaling cascade in oral carcinogenesis.

Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com a aprovação da Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA e com apoio financeiro parcial do Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA (FIPE). O experimento 1, chamado de projeto piloto, teve como objetivo implementar a técnica de IHQ para identificar a Listeria monocytogenes (L.m.), utilizando anticorpo policlonal antilisteria monocytogenes (Biodesig ). Vários testes foram realizados para acertar a diluição (1:1000) que foi diferente da preconizada pelo fabricante. Os blocos de parafina, de dez placentas provenientes de parto prematuro ou aborto foram utilizados para os cortes histológicos e a preparação das lâminas para a coloração Hematoxilina e Eosina (HE) e imunoistoquímica (IHQ). As lâminas foram identificadas por números para resguardar a identidade das pacientes. O resultado do HE mostrou alterações inflamatórias em oito placentas e L. m. foi identificada pelo IHQ em cinco dessas placentas. O objetivo do 2º experimento foi identificar a L. m. em tecido nervoso cerebral de ruminantes, utilizando a técnica implementada no projeto piloto. O material utilizado neste trabalho foi cedido pelo Setor de Patologia Veterinária do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria. Os casos estudados (2 ovinos, 1 caprino e 2 bovinos) tinham suspeitas clínicas diversas e as necropsias dos animais evidenciaram aspectos sugestivos da doença. Os cinco casos foram confirmados pelo IHQ, comprovando a importância da utilização desta técnica para o diagnóstico da listeriose no SNC de ruminantes. O 3º experimento objetivou identificar a L. m. em placentas encaminhadas ao Serviço de Patologia do HCPA no ano 2000. Da mesma forma que no experimento 1, as lâminas foram identificadas por números. Após o levantamento realizado nos registros dos exames anatomopatológicos (AP) deste setor, observou-se que 714 AP eram de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo examinados naquele período. Foram sorteados 254 AP para análise através de HE, revelando que 148 desses AP apresentavam alterações inflamatórias (corioamnionite, vilite e deciduite). Os blocos destas placentas foram utilizados para fazer as lâminas e realizar IHQ. A consulta aos prontuários dos casos com alterações inflamatórias permitiu observar que um deles tinha a confirmação bacteriológica de L. m. na placenta, tornando-se este o controle positivo. O controle negativo foi selecionado entre aqueles sorteados que não apresentavam alterações inflamatórias. A presença de L. m. foi identificada em 33,78% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que mostraram diferença estatística significativa nas placentas positivas. L. m. estava presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestres gestacionais. A idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro não mostraram diferença estatística significativa com a presença ou ausência de L. m. nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem L. m. no tecido placentário. Conclusão: a técnica de imunohistoquímica pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em placentas e tecido nervoso central de ruminantes. / This project was developed at the Pathology Experimental Laboratory of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), after approval by the local Research Ethics Committee, and received partial financial support from the Research Incentive Fund (FIPE) of HCPA. The first experiment (or pilot scheme) aimed at implementing the immunohistochemistry (IHC) technique for the identification of Listeria monocytogenes (L.m.), by way of anti-listeria polyclonal antibody (Biodesign ). Several tests were performed in order to find the correct dilution (1:1000), which was different from that which had been recommended by the manufacturer. Paraffin-embedded blocks of placentas obtained from premature birth or abortion were used for the histological sections, and the slides were prepared for hematoxylin-eosin (HE) staining and immunohistochemistry. The slides were labeled with numbers in order to preserve patient anonymity. The result of HE staining revealed inflammatory disorders in eight placentas and L.m. was identified by IHC in five of them. The aim of the second experiment was to identify L.m. in the brain tissue of ruminants by employing the technique implemented in the pilot scheme. The material used in this study was provided by the Division of Veterinary Pathology of the Department of Pathology of Universidade Federal de Santa Maria. The animals studied (2 sheep, 1 goat and 2 cows) exhibited several clinical suspicions and the necropsy results were suggestive of the disease. The five cases were confirmed by IHC, highlighting the importance of this technique to the diagnosis of listeriosis in the CNS of ruminants. The aim of the third experiment was to identify L.m. in placentas and abortion specimens that had been referred to the Division of Pathology of HCPA in year 2000. As with the first experiment, the slides were numbered. After surveying the registries of pathoanatomical exams (PAs), we noted that 714 PAs corresponded to placentas, obtained from abortion, premature delivery and full-term birth, examined during that period. Two hundred fifty- four PAs were randomly selected (drawn out) for HE staining, and 148 of these PAs showed evidence of inflammatory disorders (chorioamnionitis, villitis and deciduitis). The blocks of these placentas were used for preparing the slides and carrying out IHC. The analysis of medical records in the cases with inflammatory disorders allowed us to observe that one of the records contained bacteriological confirmation of L.m. in the placenta (positive control). The negative control was chosen among the drawn-out PAs that did not present inflammatory disorders. L. m. was detected in 33.78% of the placentas analyzed by IHC. Chorioamnionitis and villitis showed significant statistical difference in the positive placentas. L. m. occurred in the 1st, 2nd and 3rd trimesters of pregnancy. The age of pregnant women, the cases of abortion and/or premature births were not statistically different as to the presence or absence of L. m. in the placentas. Habitual abortions occurred in patients with or without L. m in the placental tissue. Conclusion: Immunohistochemistry may be used to confirm the histopathological diagnosis of listeriosis in placentas and brain tissue of ruminants.

La cécité d’origine cornéenne est Ia deuxième cause de cécité dans le monde. Son traitement de choix est la kératoplastie. ll est aujourd’hui nécessaire de réfléchir à de nouvelles solutions pour remplacer la kératoplastie dans sa forme actuelle qui bien que satisfaisante, n’est pas totalement parfaite. En effet, les techniques actuelles de kératoplastie utilisent une allogreffe. Le greffon va subir chez le donneur une diminution de la densité des cellules endothéliales (CE) du greffon au fil du temps. Ce travail présente successivement les solutions abordées par le BiiGC pour produire des CE en masse ainsi que les différents supports en vue d’une kératoplastie lamellaire postérieure. Les solutions envisagées par le laboratoire BiiGC doivent permettre un transfert à l’être humain dans des conditions de sécurité et d’acceptabilité maximales. Les différents contrôles de l’identité des cellules obtenues et les contrôles de sécurité nécessitent une connaissance robuste de la biologie, du morphotype et du phénotype des CE cornéennes. Cette thèse présente les différentes exigences réglementaires et de qualité nécessaires à l’obtention de greffons cornéens bioengineerés. Le choix du BiiGC devant se conformer d’emblée à ces exigences en vue d’un transfert à l’être humain. Dans une première partie, nous présentons une revue de la littérature sur le bioengineering de greffons cornéens. La production de CE et de stroma seront ensuite exposés avec les différentes approches abordées par le BiiGC. Enfin, les différentes techniques de validation morphologiques et fonctionnelles de greffons obtenus seront présentées. / Corneal diseases are the first leading cause of blindness worldwide. Its treatment relies on keratoplasty which in its actual form is a satisfying but not a perfect solution. We have to think about new solutions for corneal graft. Today, corneal graft is often an allograft. With this technique, there is a loss of endothelial cell (EC) density through time. This work presents the solutions which BiiGC laboratory is working on for mass production of EC and different carriers for these cells for posterior keratoplasty. These solutions must be possible on human being with safety conditions. Controls of identity, of obtained cells and security controls need a strong knowledge of biology, morphology and phenotype of EC. This work presents the legal conditions of quality needed to obtain bioengineered corneal grafts. The choice of BiiGC laboratory must involve these conditions for a transfer to human being. In a first part, we present a review of the literature about corneal bioengineering. Production of EC and of corneal stroma are discussed with different approaches by BiiGC laboratory. In the end, the different techniques of morphological controls of corneal grafts are discussed.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:24Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00205.pdf: 1087268 bytes, checksum: 8ae7e5f6bdd855e97595278010953ec4 (MD5) / Objetivo: Analisar as expressoes imunohistoquimicas das proteinas p53, bcl-2 e Ki-67 no adenocarcinoma colorretal, correlacionando-as com os fatores prognosticos clinico-patologicos. Metodo: Foram confeccionados blocos de parafina de TMA com tecido de adenocarcinoma colorretal ressecados cirurgicamente em 82 pacientes no Hospital Sao Paulo da UNIFESP/EPM, de 2002 a 2005, nao submetidos a radio ou quimioterapia. Cortes de 4 ƒÊm foram submetidos a reacao imunohistoquimica e obtidos escores de intensidade das imunoexpressoes, que foram correlacionados com o grau de diferenciacao celular, estadiamento, tempo livre de doenca, recidiva, sobrevida e mortalidade especifica entre si e com os dados de sobrevida dos pacientes. As variaveis do estudo foram analisadas pelos testes do qui-quadrado e de Kaplan-Meier para verificar as associacoes com os marcadores. A significancia das diferencas entre as curvas do tempo livre de doenca e da sobrevida foi analisada pelos testes de Logrank e Wilcoxon. Resultados: A expressao imunohistoquimica da p53 foi positiva em 70 tumores (85,4%) e negativa em 12 (14,6%). A bcl-2 foi positiva em 26 tumores (31,7%) e negativa em 56 (68,3%). A expressao imunohistoquimica da Ki-67 foi positiva em 62 tumores (75,6%), sendo em 20 (24,4%) negativa. Nao houve correlacao estatisticamente significante entre as expressoes imunohistoquimicas dos marcadores analisadas separadamente ou em conjunto, envolvendo o grau de diferenciacao celular, estadiamento, tempo livre de doenca, sobrevida e mortalidade especifica. Com relacao a recidiva, observou-se uma correlacao estatisticamente significante com a expressao imunohistoquimica positiva da Ki-67 (p= 0,035). Conclusao: A expressao imunohistoquimica positiva da Ki-67 no cancer colorretal esta relacionada com a incidencia de recidiva da doenca. / Purpose: To analyse the immunohistochemical expressions of the proteins p53, bcl-2 e Ki-67 in colorectal adenocarcinoma and correlate it with the clinical pathological prognostic factors. Methods: A TMA paraffin block was constructed with colorectal carcinoma tissue of 82 patients who had undergone surgery in the Hospital Sao Paulo-UNIFESP, from 2002 to 2005, submitted neither to chemo or radiotherapy. Four ìm sections from the was submitted to immunohistochemistry and immunoexpression staining scores were obtained, than was correlated with the degree of cellular differential, stage, relapse-free survival, relapse, survival and specific mortality. The variables of the study were analyzed by tests of the qui-square and Kaplan-Meyer to verify the markers association. The significance of the differences between the curves of relapse-free survival and of the overall survival was analyzed by tests of lgrank and Wilcoxon. Results: The immunohistochemical expression of the p53 was found to be positive in 70 tumours (85,4%) and negative in 12 (14,6%). The bcl-2 was found to be positive in 26 (31,7%) and negative in 56 (68,3%). The immunohistochemical expression of the ki-67 was found to be positive in 62 (75,6%) and negative in 20 (24,4 %). There was no correlation statistically significant between the markers expressions separately and in conjunction, involving the degree of cellular differentiation, stage, relapse-free survival, survival and specific mortality. With respect the relapse, there was a correlation statistically significant with the positive expression of the ki-67 (p53=0,035). Conclusion: The immunohistochemical expression of the Ki-67 in colorectal cancer is related to the incidence of the relapse of the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-01-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Em casos de carcinoma gástrico, para contribuir ao conhecimento do processo de carcinogênese: Objetivo: Estudar a expressão das proteínas da família Bcl-2 (BcI-2, Bcl-xl, Bak, Bad, Bax). Correlacionar a expressão destas proteínas com 0 índice apoptótico mediante a expressão da proteína Caspase 3 clivada, com 0 índice mit6tico mediante a expressão da proteína Ki-67 e com a expressão da proteína p53. Método: Técnica de arranjo em matriz de amostras teciduais (TMA): em 87 amostras de adenocarcinomas gástricos (grupo teste) e de mucosa gástrica não tumoral (grupo controle) foi avaliada a imuno-expressão das proteínas da família BcI-2 (BeI-2, Bcl-xl, Bak, Bad, Bax), da proteína p53, da proteína caspase 3 e da proteína Ki-67. Resultados: Todas as proteínas examinadas foram observadas nos adenocarcinomas e mucosa não tumoral, porem com diferenças de expressão em relação à porcentagem de positividade e intensidade. Observamos: i) Houve associação entre 0 tamanho do tumor e a proteína p53. ii) Houve associação da proteína Bad no adenocarcinoma com a idade dos pacientes. iii) Associação das proteínas Bax, Bad e Ki-67 com 0 adenocarcinoma de tipo intestinal. iv) As proteínas Bcl-xl, Bak, Bad, p53 e Ki-67 apresentaram diferenças estatisticamente significantes entre a imuno-expressão no tumor e na mucosa não tumoral. v) Associação das proteínas Bax, Bak e Bad na mucosa não tumoral. vi) Não houve correlação da imunoexpressão das proteínas com a sobrevida dos pacientes. Conclusão: A expressão aumentada da proteína Bcl-xl nos adenocarcinomas, com evidente diferença de expressão entre 0 grupo teste e 0 grupo controle, esta relacionada com 0 efeito anti-apoptótico da proteína. A expressão reduzida das proteínas Bak e Bad e a expressão aumentada das proteínas p53 e Ki-67 nos adenocarcinomas demonstram 0 desequilíbrio entre morte e proliferação celular, permitindo 0 crescimento descontrolado das células neoplásicas. / Purpose: To study the immunoexpression of Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bak, Bad) and to evaluate the correlation between the immunoexpression of these proteins with the cleaved caspases 3, Ki-67 and p53 immuno-expression. Methods: A TMA paraffin block was constructed with gastric carcinoma tissue (test group) and normal gastric adjoining mucosa (control group) of 87 patients. The TMA block was submitted to immunohistochemistry for Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bak, Bad, p53 and-cleaved Caspase 3. Results: All studied proteins were present in tumor and normal gastric adjoining mucosa, but with different intensity and amount of positive cells. i) There was an association between tumor size and p53 expression. ii) association between Bad expression in the tumor and patient’s age. iii) Intestinal type adenocarcinoma was positively correlated with the expression of Bax, Bad and Ki-67. iv) The protein Bcl-xl, Bak, Bad, p53 and Ki-67 showed statistically significant differences between the immuno-expression in tumor and normal gastric adjoining mucosa. v) There was an association between the proteins Bax, Bak and Bad expression in the normal gastric adjoining mucosa. vi) No correlation between patient’s survival rates and the expression of the proteins was observed. Conclusions: The higher expression of Bcl-xl protein in adenocarcinoma, the difference of Bcl-xl expression between test group and control group, might be related with the anti-apoptotic effect of this protein. The lower expression of Bak and Bad and the increased expression of p53 protein and Ki-67 protein in adenocarcinomas demonstrate the imbalance between death and cellular proliferation, which allows the uncontrolled tumor cell proliferation. / FAPESP: 04/09932-4 / FAPESP: 06/54187-0 / TEDE

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-12-05T17:32:40Z No. of bitstreams: 1 Manoel Leoncio da Penha Filho Anticorpos monoclonais... 2003.pdf: 40157874 bytes, checksum: a8a843890d6d1f967434db64a38014bb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T17:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manoel Leoncio da Penha Filho Anticorpos monoclonais... 2003.pdf: 40157874 bytes, checksum: a8a843890d6d1f967434db64a38014bb (MD5) Previous issue date: 2003 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O diagnóstico de certeza da leishmaniose visceral (LV) só é conseguido através da demonstração do parasito diretamente ou em cultura o que implica em procedimentos demoradc» envolvendo certo risco e/ou dor. Este estudo tem como objetivos a produção de AcMc diVí^ã-Leishmania chagasi, padronização de um ensaio de imunohistoquímica para visualização de amastigotas de Leíshmania utilizando AcMc e verificação do potencial de um ELISA de inibição utilizando AcMc em quantificar amastigotas de Leishmania. [MATERIAIS E MÉTODOS] Camundongos BALB/c foram imunizados com antígeno de amastigotas de L chagasi ou com a proteína recombinante Lc-13 cujo gene foi clonado de uma biblioteca de cDNA de L chagasi. Os esplenócitos destes animais foram fundidos com células SP 2-0 através de polietilenoglicol. Estes, juntamente com um AcMc já disponível, o 5A9H8, foram usados em um ensaio de imunohistoquímica utilizando fígado de hamster infectado com L chagasi parafinado fixado em formalina, testando-se diferentes protocolos de exposição de epitopos. Também com os mesmos AcMc foi realizado um ELISA de inibição a fim de quantificar amastigotas de /.e/s/?/nan/a.[RESULTADOS] Foram encontrados dois clones reativos em cada fusão; o 10B4/6 e o 10D8 na primeira e o 2C10D5 e o 11E8H7 na segunda. Os AcMc 10B4/6 e o 10D8 são ambos lgG1, reconhecem antígenos com peso molecular entre 47 e 57 kDa e são possivelmente idênticos. Foi encontrada marcação de amastigotas, em tecidos infectados, com os seguintes AcMc: 5A9H8, em seções pré-tratadas com calor, e o 10B4/6 e o 10D8, em seções pré-tratadas com pronase. No ELISA de inibição o AcMc 5A9H8 mostrou-se capaz de detectar no mínimo 10® parasitos por poço de placa de microtitulação. / The certainty of diagnosis in visceral leishmaniasis is only achieved through the direct demonstration of parasites in culture, implying in long procedures and in risks and/or pain for the patients. The objectives of this study is the production of anti-Leishmania chagasi monoclonal antibodies (mAb), standardization of an immunohistochemical assay for allowing the visualization of Leishmania amastigotes using the mAb, and finding out the potential of a mAb-based inhibition ELISA for quantifying Leishmania amastigotes. [MATERIAL & METHODS] BALB/c mice were immunized with L chagasi amastigote antigens or with a recombinant protein denominated Lc13, the gene of which was cloned from a L chagasi amastigote cDNA library. Splenocytes from these animals were obtained and fused with SP 2-0 myeloma cells by using polyethylene glycol. The mAb produced by the hybrid cells, together with an available mAb (5A9H8), were used in an immunohistochemical assay, using paraffin sections of infected hamster liver. Different protocols for the exposition of epitopes were evaluated. One of the mAb was also used in an inhibition ELISA to quantify Leishmania amastigotes. [RESULTS] Two anti-amastigote mAb-producing clones were obtained in each fusion, the 10B4/6 and the 10D8 mAb in the first and the 2C10D5 and the 11E8H7 mAb in the second. The 10B4/6 and the 10D8 mAb, obtained from the fusion of myeloma with splenocytes of an animal immunized with lysed amastigotes, were both lgG1, recognized the same antigens, with molecular weights ranging from 47 to 57 kDa, and were possibly identical, o 10B4/6 e o 10D8 na primeira e o 2C10D5 e o 11E8H7 na segunda. The following mAb stained amastigotes in infected tissues in an im mu noperoxidase reaction: the 5A9H8, using heat-treated sections, and the 10B4/6 and the 10D8, in pronase-treated sections. The 5A9H8 mAb detected a minimum of 10® parasites per well In the inhibition ELISA.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-27T17:37:40Z No. of bitstreams: 1 Ludmila de Faro Valverde Via hedgehog....pdf: 1435521 bytes, checksum: 2442c32fdacd9e814b9e8a6035eb3bdc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-27T17:37:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Ludmila de Faro Valverde Via hedgehog....pdf: 1435521 bytes, checksum: 2442c32fdacd9e814b9e8a6035eb3bdc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-27T17:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ludmila de Faro Valverde Via hedgehog....pdf: 1435521 bytes, checksum: 2442c32fdacd9e814b9e8a6035eb3bdc (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / INTRODUÇÃO/OBJETIVO: O Carcinoma Escamocelular de Boca (CEB) corresponde a mais de 95% dos casos de câncer diagnosticados na cavidade bucal e consiste numa neoplasia invasiva e agressiva. Sabendo-se que a via Hedgehog (HH) está envolvida na patogênese de diversos tumores, o presente trabalho propôs-se a avaliar a expressão de componentes desta via em CEB, associando a expressão destas moléculas com aspectos clínicos, angiogênese, graus de diferenciação tumoral, potencial proliferativo e macrófagos CD163+. MATERIAL E MÉTODOS: Vinte e oito casos de CEB, 9 casos de margens tumorais (MAT) e 4 casos de mucosa bucal não neoplásica (MNN) foram submetidos à reação imuno-histoquímica para as proteínas MCM3, SHH, IHH, GLI1, CD163 e CD105 utilizando o sistema polimérico AdvanceTM. A co-localização das proteínas IHH/CD163 e GLI1/CD105 foi avaliada através de dupla marcação imuno-histoquímica. As análises das proteínas MCM3, SHH, IHH e GLI1 foram realizadas em 5 áreas coincidentes de cada caso, de acordo com os parâmetros semi-quantitativos descritos por Gurgel et al. (2008). A densidade de macrófagos (DM) e microdensidade vascular (MDV) foram mensuradas considerando-se a população destas células e vasos neoformados em 5 áreas e os resultados expressos em cel/mm² e vasos/mm². A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism versão 6.03. RESULTADOS: Todos os casos de CEB foram positivos para a proteína MCM3, em citoplasma e núcleo de células do parênquima tumoral, sendo o escore 4+ predominante (n=19; 67,85%). Em parênquima tumoral, a proteína SHH estava presente no citoplasma de células neoplásicas e foi positiva em 25 casos (89,28%) de CEB, sendo o escore 4+ predominante (n=17; 68%). Vinte e dois casos (78,57%) apresentaram marcação citoplasmática da proteína IHH no parênquima tumoral, predominando os escores 4+ (n=7; 31,82%) e 3+ (n=7; 31,82%). A proteína GLI1 apresentou marcação citoplasmática e nuclear em 24 (85,72%) casos de CEB, predominando, no parênquima do tumor, o escore 4+ (n=15; 62,5%). Vinte e três casos de CEB (82,14%) apresentaram imunoexpressão de CD163, enquanto 24 (85,72%) exibiram positividade para a proteína CD105. Foi observada uma tendência de maior imunoexpressão de SHH e IHH nos grupos com alto perfil proliferativo. Foi observada uma tendência de maior expressão das proteínas MCM3 (p=0.11), SHH (p=0.21) e IHH (p=0.07) em tumores menos diferenciados. Uma forte correlação positiva foi observada entre a DM e a MDV em CEBs e correlação positiva perfeita em MATs. Quando comparado à MAT e MNN, os casos de CEB apresentaram maior imunoexpressão de MCM3 (p=0.0003), SHH (p=0.01), IHH (p=0.39), GLI1 (p=0.03), DM (p=0.0002) e MDV (p=0.0002). CONCLUSÕES: Nossos resultados sugerem a participação da via HH em CEBs, através de uma sinalização autócrina e parácrina e com participação de ambos ligantes, SHH e IHH, os quais parecem contribuir para a proliferação e diferenciação do CEB. Demonstramos que células endoteliais também exibem positividade para componentes da via HH e que essas moléculas podem contribuir na angiogênese tumoral, ao mesmo tempo que macrófagos CD163+ expressam IHH, ligante da via, e estão associados com a neo-vascularização tumoral. Em adição, nossos achados sugerem que a proteína MCM3 pode despontar como um bom marcador de proliferação celular em CEB. / INTRODUCTION/OBJETIVE: The Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) accounts for over 95% of all cancers diagnosed in the oral cavity and it consists on an invasive and aggressive type of tumor. The Hedgehog pathway (HH) has been involved in the pathogenesis of different tumors. The aim of this study was to evaluate the components of the HH pathway in OSCC, correlating the results with clinical aspects, angiogenesis, tumor differentiation, proliferative potential and macrophages CD163+. MATERIAL AND METHODS: Twenty-eight cases of OSCC, 9 cases of tumor margins (TM) and 4 cases of non-neoplastic oral mucosa (NNM) were submitted to immunohistochemical reaction for MCM3, SHH, IHH, GLI1, CD163 and CD105 proteins using the AdvanceTM polymer system. Co-localization for IHH/GLI1 and CD163/CD105 proteins was evaluated using double staining method. The analysis of MCM3, SHH, IHH and GLI1 proteins were conducted in 5-matching areas and data described using the semi-quantitative parameters described by Gurgel et al. (2008). The density of macrophages (MD) and microvessel density (MVD) were measured considering the population of these cells and newly formed vessels in 5-matching areas and the results expressed in cells/mm² and vessels/mm², respectively. Statistical analysis were performed using GraphPad Prism v. 6.03. RESULTS: All cases of OSCC were positive for MCM3 protein on the cytoplasm and nucleus of tumor cells, and 4+ was the main score (n= 19; 67.85%). In tumor cells, the SHH protein was observed in the cytoplasm and it was positive in 25 OSCC cases (89.28%), with a 4+ score predominant (n= 17; 68%). Twenty-two cases (78.57%) presented with cytoplasmic IHH protein in tumor cells and scores 4+ (n=7; 31.82%) and 3+ (n=7; 31.82%) were more common. The GLI1 protein was positive in 24 OSCC cases (85.72%) and detected in tumor cells on cytoplasmic and nuclear patterns, with score 4+ (n=15; 62.5%). Positive staining for CD163 and CD105 were described in 23 (82.14%) and 24 OSCC, respectively. In groups with high proliferative profile, we observed a larger amount of SHH and IHH proteins. In addition, on OSCC with a lower differentiation, we observed a tendency to increased levels of MCM3 (p=0.11), SHH (p=0.21) and IHH (p=0.07) proteins. A strong and a perfect positive correlation was observed between MD and the MVD in OSCC and TMs, respectively. A higher expression of MCM3 (p=0.0003), SHH (p=0.01), IHH (p=0.39), GLI1 (p=0.03), MD (p=0.0002) and MVD (p=0.0002) were founded in OSCC by comparing to TM and NNM. CONCLUSIONS: Our results suggest that the HH pathway may participate in OSCC through an autocrine and paracrine mechanisms, with parcipation of both ligands, SHH and IHH. These ligands seem to contribute to the proliferation and differentiation of the OSCC. We demonstrate that endothelial cells also display positivity for HH pathway components, which may contribute to the tumor angiogenesis. Moreover, CD163+ macrophages are positives for IHH ligand and highly associated with tumor-vessels. Additionally, our findings suggest that MCM3 protein could emerge as a good marker for cell proliferation in OSCC.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-11-20T12:57:21Z No. of bitstreams: 1 Maira Garcia Saldanha. Avaliação da resposta...pdf: 27666774 bytes, checksum: 6259788e94ba7cdd8989c58b6e2433cf (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-11-20T12:57:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Maira Garcia Saldanha. Avaliação da resposta...pdf: 27666774 bytes, checksum: 6259788e94ba7cdd8989c58b6e2433cf (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T12:57:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maira Garcia Saldanha. Avaliação da resposta...pdf: 27666774 bytes, checksum: 6259788e94ba7cdd8989c58b6e2433cf (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução: A leishmaniose cutânea (LC) é a forma clínica mais frequente da leishmaniose humana, considerada um importante problema de saúde no Brasil. A infecção por Leishmania braziliensis induz um amplo espectro de lesões que pode se manifestar como uma única lesão cutânea localizada, geralmente em partes descobertas do corpo. Tem início com uma pápula, caracterizando a leishmaniose cutânea recente (LCR) e, na maioria dos casos, tende a desenvolver uma úlcera, representando a leishmaniose cutânea clássica (LCC). Pacientes com LCR apresentam um elevado número de parasitas na lesão e, frequentemente, não respondem positivamente à terapia padrão, desenvolvendo a lesão mesmo após o tratamento. Objetivo: Descrever de modo comparativo os aspectos histopatológicos na Leishmaniose Cutânea Recente e Leishmaniose Cutânea Clássica. Métodos: Secções histológicas obtidas de biópsias de pele de 15 pacientes com LCR e 28 com LCC, foram coradas em HE e mensuradas as áreas de inflamação e necrose nas diferentes fases da doença. Realizamos imunohistoquímica para marcação de células CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD68+ e CD138+. Além disso, utilizamos a microscopia eletrônica de transmissão para identificar morfologicamente as células, localizar amastigotas nos meios intra e extracelulares e reconhecer possíveis interações celulares. Resultados: Alterações na epiderme foram aparentes em ambas as fases e na derme, foram mais frequentes as células gigantes e os neutrófilos na LCC. O número de amastigotas foi maior na LCR, apresentando o parasita uma morfologia ultraestrutural íntegra, sugerindo viabilidade. A inflamação conduzida por um variado espectro celular apresentou uma predominância dos linfócitos T CD3+, com os subtipos CD4+ e CD8+, que aumentaram de acordo com o progresso da doença. O número de macrófagos CD68+ foi correlacionado positivamente ao número de amastigotas, nas fases tardias da doença. Além disso, houve uma correlação positiva entre as células CD68+ e o tamanho da lesão nas fases iniciais e, entre os macrófagos e a área de necrose, durante todo o curso da doença. Conclusão: A presença do parasita e a extensiva infiltração celular, com participação efetiva dos macrófagos, provocam alterações na epiderme e derme, contribuindo para o desenvolvimento da lesão cutânea e interferindo na resposta terapêutica. / Introduction: Cutaneous leishmaniasis (CL) is the most common clinical form of human leishmaniasis induced by L. braziliensis. It is considered a major health problem in Brazil. Leishmania braziliensis infection induces a large spectrum of lesions that can manifest as one localized skin lesion, usually undressed body parts. It starts with a papule in early cutaneous leishmaniasis (ECL) clinical manifestation and, in most cases, tends to develop an ulcer, in the late cutaneous leishmaniasis (LCL). ECL patients have a high number of parasites in the lesion, and often do not respond to standard therapy, developing the lesion even after treatment. Aim: To describe comparative the histopathological aspects of early cutaneous leishmaniasis compared to late ulcerated cutaneous leishmaniasis. Methods: Histological sections of skin biopsies from 15 ECL patients and 28 LCL, were stained with HE and measured areas of inflammation and necrosis in the different stages of the disease. We performed immunohistochemical for CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD68+ and CD138+. In addition, we used transmission electron microscopy to identify the cells morphologically, to locate amastigotes in intra and extracellular and to recognize possible cellular interactions. Results: Changes in the epidermis are apparent in both phases. In the dermis chronic inflammation with giant cells and neutrophils in the LCL. The number of amastigotes is higher in the ECL. Amastigotes are morphologically intact at ultrastructural analysis, suggesting their viability. Inflammation with a varied spectrum of cells, commonly with CD3+, CD4+ and CD8+ cells, increasing as the lesion progress. The number of CD68+ macrophages are predominat cells in the infiltrate and was positively correlated with number of amastigotes in the late stages of the disease. Furthermore, there was positive correlation between CD68+ cells and the lesion size in the early stages and between macrophages and necrotic areas during the disease progress. Conclusion: The presence of the parasite and the extensive cellular infiltration with the effective participation of macrophages, cause changes in the epidermis and dermis, contributing to the development of skin lesion and affecting the therapeutic response.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T16:51:02Z No. of bitstreams: 1 Daiana Santos de Oliveira Leptospira 2015.pdf: 4808507 bytes, checksum: 3179db44fe75f386418d9e3244499ccf (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T16:51:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Daiana Santos de Oliveira Leptospira 2015.pdf: 4808507 bytes, checksum: 3179db44fe75f386418d9e3244499ccf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-04T16:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daiana Santos de Oliveira Leptospira 2015.pdf: 4808507 bytes, checksum: 3179db44fe75f386418d9e3244499ccf (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / A leptospirose é uma zoonose distribuída globalmente causada por bactérias do gênero Leptospira. Rattus norvegicus é o principal reservatório de Leptospira em comunidades urbanas do Brasil e em outros países. As vias de infecção por Leptospira nas populações de roedores são desconhecidas. O objetivo deste trabalho foi identificar a presença de Leptospira em mama e leite como indicadores da transmissão vertical em R. norvegicus. As capturas de roedores foram realizadas em 2013 e 2014 em uma comunidade urbana de Salvador, Brasil. Nós pesquisamos a presença de Leptospira na mama, leite e rins de fêmeas em lactação utilizando testes de Imunofluorescência (IFA), Imunohistoquímica (IHQ), qPCR e exame no microscópio eletrônico de varredura (MEV). Nós examinamos 24 ratas em lactação. Todas as fêmeas foram positivas no rim em pelo menos uma das técnicas utilizadas. 18/24 (75%) foram positivas no leite por IFA e 04/28 (17%) foram confirmadas por qPCR. Na mama 16/24 (67%) ratas foram positivas por IFA ou IHQ. Observamos a presença de Leptospira em 1/4 ratas no exame com MEV. Na mama foram encontradas Leptospira em áreas sem ou com alterações patológicas. A presença de Leptospira na mama (67%) e no leite (75%) sugere que ocorra transmissão vertical pela amamentação nas populações urbanas de R. norvegicus. Estes achados precisam ser confirmados por estudos experimentais. A caracterização das vias de transmissão e manutenção de Leptospira é fundamental para entender a dinâmica do patógeno nos reservatórios, permitindo o desenvolvimento de novos modelos preditivos de risco para leptospirose em roedores e em seres humanos / Leptospirosis is a zoonosis distributed globally caused by bacteria of the genus Leptospira. Rattus norvegicus is the main reservoir of Leptospira in urban communities in Brazil and other countries. The routes of Leptospira infection in the rodent populations are unknown. The objective of this study was to identify the presence of Leptospira in breast milk and as an indicator of vertical transmission in R. norvegicus. The rodents were trapped in 2013 and 2014 in an urban community of Salvador, Brazil. We research the presence of Leptospira in the breast, milk and kidney of lactating females using immunofluorescence test (IFA), Immunohistochemistry (IHC), qPCR and examination in Scanning Electron Microscope (SEM). 24 rats were examined lactating. All were positive in at least one kidney of techniques. 18/24 (75%) tested positive in milk by IFA and 4/28 (17%) were confirmed by qPCR. In breast tissue 16/24 (67%) rats were positive by IFA or IHC. In a breast tissue sample from a rat was examined under SEM four Leptospira presence observed. In the presence of breast Leptospira was observed in areas with or without pathological changes. The presence of Leptospira breast (67) and milk (75%) suggests that vertical transmission occurs by feeding in urban populations of R. norvegicus. These findings need to be confirmed by experimental studies. The characterization of Leptospira transmission routes and maintenance is fundamental to understanding the dynamics of the pathogen in the reservoir allowing the development of new predictive models risk for leptospirosis in rodents and in humans.

Introdução: Proteínas da Superfamília do fator transformador de crescimento β (TGF-β) estão implicadas na regulação de diversas funções biológicas. Embora alguns estudos revelaram a sua presença no endométrio ectópico de portadoras de adenomiose, a sua função na etiopatogenia da doença permanece pouco conhecida. Objetivo: o estudo visa comparar a expressão imuno-histoquímica de TGF-β1 no endométrio ectópico de portadoras de adenomiose com o endométrio tópico de pacientes sem essa condição. Método: Estudo de caso-controle utilizando imuno-histoquímica em amostras uterinas (blocos de parafina) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A amostra contém 28 casos de adenomiose e 21 controles. Resultados: Não encontramos associação entre tabagismo e adenomiose (P = 0,75), abortos e adenomiose (P = 0,29), gestações e adenomiose (P = 0,85), curetagens e adenomiose (P = 0,81), dor pélvica e adenomiose (P = 0,72) e presença de mioma e adenomiose (P = 0,15). Além disso encontramos relação entre sangramento uterino anormal (SUA) e adenomiose (P = 0,02) e cesarianas prévias e adenomiose (P = 0,02) . A expressão imuno-histoquímica de TGF-β1 no endométrio ectópico de portadoras de adenomiose não teve diferença significativa quando comparado com a expressão dessa proteína no endométrio tópico de pacientes sem adenomiose (P = 0,86). Conclusão: Nosso estudo foi um dos primeiros a comparar a expressão de TGF-β1 no endométrio de pacientes com e sem adenomiose. Em nossa análise não obtivemos diferença significativa entre os grupos, resultado diferente do encontrado em outros dois estudos. Mais estudos são necessários para investigar o papel da superfamília TGF no desenvolvimento e manutenção da adenomiose. / Background: Proteins of transforming growth factor β superfamily (TGF-β) are implicated in the regulation of various biological functions. Although some studies have revealed their presence in ectopic endometrium of women with adenomyosis, their role in the pathogenesis of the disease remains largely unknown. Objective: The study aims to compare the immunohistochemical expression of TGF- β1 in ectopic endometrium of women with adenomyosis with the topic endometrium of patients without this condition. Methods: Casecontrol study using immunohistochemistry in uterine samples (paraffin blocks) obteined from Hospital de Clínicas de Porto Alegre. The sample contained 28 adenomyosis cases and 21 controls. Results: We found no significant difference between smoking and adenomyosis (P = 0.75), abortions and adenomyosis (P = 0.29), pregnancies and adenomyosis (P = 0.85), curettage and adenomyosis (P = 0.81), pelvic pain and adenomyosis (P = 0.72) and presence of myoma and adenomyosis (P = 0.15). We did find a relationship between adenomyosis and abnormal uterine bleeding (AUB) (P = 0.02) and previous cesarean section and adenomyosis (P = 0.02). Immunohistochemical expression of TGF-β1 in ectopic endometrium of women with adenomyosis did not have significant difference when compared with the expression of this protein in the topic endometrium of patients without adenomyosis (P = 0.86). Conclusion: Our study was one of the first to compare the TGF-β1 expression in the endometrium of patients with and without adenomyosis. In our analysis we have not had significant difference between the groups, unlike observed in two other studies. More studies are needed to investigate the role of TGF superfamily in the development and maintenance of adenomyosis.