Durante o processo de infecção, o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae desenvolve uma estrutura especializada denominada apressório. Essa estrutura é responsável por realizar pressão de turgor sobre a cutícula do hospedeiro para auxiliar na transposição desta barreira e instalar a infecção. Neste trabalho, a diferenciação de apressório foi induzida através de cultivo de conídios sobre lamínulas de vidro na presença de extrato de levedura como fonte de nitrogênio. As melhores condições de cultivos determinadas foram de um meio contendo 0,0040% de extrato de levedura, concentrações de conídios por lamínula entre 2,5.105 e 5.105 e tempo de cultivo de 16 horas a 28C. A sequência genômica de emp1 foi isolada e apresentou uma ORF de 803 nucleotídeos codificando uma proteína predita de 226 aminoácidos. A proteína predita contém uma região N-terminal contendo um peptídeo sinal para secreção, um sítio potencial de N-glicosilação, 16 aminoácidos na porção C-terminal característicos de sítios de adição de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A massa molecular da proteína predita foi de 22KDa com um pI de 5,5. A sequência de emp1 apresentou homologia com os genes das proteínas de matriz extracelular de Fusarium oxysporum (gene fem1) e de Magnaporthe grisea (gene emp1). Com base na sequência de emp1 de M. anisopliae um vetor de disrupção foi construído e a seleção inicial dos transformantes foi conduzida. / The entomopathogenic fungi Metharhizium anisopliae develops specialized infection structures known as appressorium wich trigger turgor pressure that is crucial for host penetration. In this work, the appressorium differentiation was induced in glass coverslips and the best nutritional condition (0.004% of yeast extract), time of growth (16 hours) and conidia concentration between 2.5.105 and 5.105 were optimized. Genomic DNA sequence of M. anisopliae emp1 showing sequence homology to an extracellular matrix protein gene fem1 of Fusarium oxysporum and emp1 of Magnaporthe grisea was isolated. This sequence presents an open reading frame of 803 nucleotides encoding a predicted protein of 226 amino acids. The estimated molecular weight of the predicted protein product was 22 KDa with a pI of 5.5. It contains amino acid N-terminal secretion signal sequence, as well a potential N-glycosylation site. At its C-terminus, the protein contains a 16 amino acid sequence showing characteristics of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor addition signal. Based on this sequence a disruption vector was constructed with the bar cassette, allowing initial selections of mutants.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-11T17:59:48Z No. of bitstreams: 1 2017_SamyraMaraCoelhoCaxito.pdf: 1139297 bytes, checksum: 24f3a0eef6fd020d0c115c27afb54541 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-16T16:04:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_SamyraMaraCoelhoCaxito.pdf: 1139297 bytes, checksum: 24f3a0eef6fd020d0c115c27afb54541 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-16T16:04:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_SamyraMaraCoelhoCaxito.pdf: 1139297 bytes, checksum: 24f3a0eef6fd020d0c115c27afb54541 (MD5) / A incidência de infecções fúngicas sistêmicas vem se elevando com o aumento de situações em que se observa supressão do sistema imune do paciente, tornando-se este, um problema de saúde mundial. Cryptococcus neoformans é um fungo cosmopolita e mundialmente distribuído, que se apresenta como uma levedura encapsulada, presente no ambiente, acometendo, especialmente, pacientes imunodeprimidos e apresentando índice de mortalidade acima de 60%. Embora existam extensivos estudos sobre a estrutura capsular das leveduras do fungo C. neoformans, pouco se sabe sobre a interação deste patógeno com o hospedeiro, particularmente no que diz respeito aos componentes de sua parede celular. Estudos em algumas espécies de fungos vem apontando os componentes presentes na parede destes micro-organismos, como forte imunomodulador durante a interação patógeno-hospedeiro, podendo estes componentes serem empregados em estudos na elaboração de vacinas. Nesse trabalho, foi avaliada a capacidade da fração 1 (F1) extraída da parede celular de diferentes linhagens de C. neoformans em modular a resposta imune do hospedeiro. Inicialmente, foram realizados ensaios in vitro, para avaliar a viabilidade celular de macrófagos de camundongo, empregando diferentes concentrações das frações, extraídas a partir das linhagens de C. neoformans H99, B3501 e da linhagem mutante cap67Δ. Em seguida, foi avaliada a capacidade das fracões em induzir a produção de citocinas nas células do hospedeiro. Os dados mostram que, após 18 horas de interação, as frações das linhagens B3501 e cap67Δ induziram elevados níveis de TNF-α, demonstrando que há uma prévia ativação desses fagócitos sem alterar a viabilidade celular. Além disso, foi avaliado a atividade microbicida e de fagocitose de macrófagos previamente estimulados com essas frações, seguindo com interação com leveduras de C. neoformans. Os dados demonstram que, no intervalo de 24 horas após interação, houve uma diminuição significativa no número de leveduras recuperadas a partir dos macrófagos. Além disso, houve também um aumento significativo no número de leveduras fagocitadas. Nos testes in vivo, usando camundongos fêmeas da linhagem C57Bl/6, as frações foram previamente aplicadas nos animais, e em seguida os animais foram infectados com leveduras de C. neoformans H99. Os resultados mostram um aumento significativo na sobrevida dos animais que receberam o tratamento com as frações 14 em relação aos não tratados. Em conjunto, esses resultados claramente sugerem que os estímulos realizados com a fração F1 da parede de C. neoformans, são capazes de imunomodulador a resposta do hospedeiro, resultando em uma ação protetora contra a infecção a fúngica. Esses resultados abrem margem para possíveis alvos terapêuticos, além de contribuir com os estudos na elaboração de vacinas contra a infecção causada por C. neoformans. / The incidence of systemic fungal infections has been aggravated by the increase in diseases that induce a suppression of the immune system, making it a global health problem. Cryptococcus neoformans is a globally distributed, cosmopolitan fungus that presents as an encapsulated yeast present in the environment, especially affecting immunosuppressed patients and showed a mortality rate above 60%. Although there are extensive studies on the capsular structure, composed especially of polysaccharides involving the yeasts of C. neformans, little is known about the interaction of this pathogen with the host, particularly with respect to the components of its cell wall. Studies in some species of fungi have pointed out the components present in the wall of these microorganisms, as a strong immunomodulator during pathogen-host interaction, and these components can be used in studies in the elaboration of vaccines. In this study the captivity of the different fractions extracted from the cell wall of C. neoformans was evaluated in modulating the immune response of the host. Initially, in vitro assays were performed to assess the cell viability of mouse macrophages cultured with different concentrations of b-glucan fraction from H99, B3501 and a mutant strain cap67Δ strains of C. neoformans. Following, it was investigated the ability of these fractions to induce cytokine production in host cells. The data show that after 18 hours interaction, the fractions of strains B3501 and cap67Δ increased the TNF-α levels, showing that these fractions are able to activate the macrophage response without affecting the cell viability. Moreover, we evaluate the microbicidal and phagocytosis capacity of macrophages, previously stimulated with these fractions, during interaction with C.neoformans yeast. The data showed that after 24 hour of interaction, the number of yeasts recovered from macrophages was significantly decreased. Furthermore, there was a significant increase in the number of yeast phagocytosed. Mice treated with b-glucan fraction previously of C. neoformans infection showed a increased survival compared to the mouse not treatment. Taken together, these results clearly suggest that cell wall components is able to stimulate host immune response, resulting in an increased host immunity. These results open to the new therapeutic possibilities, beyond gives support on adjuvant therapeutic research during C. neoformans infections.

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A incidência de infecções microbianas relacionadas ao uso de cateteres vem aumentando. Uma característica importante dos microrganismos envolvidos é a capacidade de aderência à superfícies com conseguinte formação de colônia, produção de substâncias extracelulares, e subsequente formação de uma matriz compacta, amorfa, de múltiplas camadas, o biofilme. A atividade de bacteriocinas produzidas por Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sobre microrganismos isolados de dispositivos intravasculares foi avaliada. As bacteriocinas Pep5 e Epidermina inibiram um maior número de isolados clínicos quando avaliadas in vitro por antagonismo direto, apresentando halos de inibição de 20 a 36 mm. A adição de Pep5 e Epidermina durante o crescimento de S. epidermidis e Corynebacterium sp resultou na redução do número de células viáveis. O efeito das bacteriocinas sobre a adesão bacteriana à cateteres de silicone foi avaliado através de três protocolos onde variou-se o momento de adição da bacteriocina: (A) simultaneamente, (B) previamente, e (C) posteriormente ao inóculo microbiano. As bacteriocinas Pep5 e Epidermina reduziram significativamente o número de células de S. epidermidis e Corynebacterium sp. aderidas aos cateteres após 6 h e 12 h de incubação. Não foram observadas diferenças importantes entre os três protocolos A, B, ou C. O efeito de Pep5 sobre Corynebacterium sp. foi verificado por microscopia eletrônica de varredura, podendo ser observadas áreas com resíduos celulares na superfície do cateter. / The in cidence of catheter-related microbial infections has been increasing. One important characteristic of related microorganisms is the adhesion to surfaces with colony formation, production of extracellular substances, and subsequent development of a compact, amorphous, multiple layer matrix, the biofilm. The activity of bacteriocins produced by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis against microorganisms isolated from intravascular catheters was studied. The bacteriocins Pep5 and Epidermin inhibited a higher number of clinical isolates when evaluated by direct antagonism, showing inhibition zones of 20 to 36 mm. The addition of Pep5 and Epidermin during growth of S. epidermidis and Corynebacterium sp. resulted in a decrease of viable cell counts. The effect of bacteriocins on bacterial adhesion to silicon catheter was evaluated through three protocols differing in the time of bacteriocin addition: (A) simultaneously, (B) before, and (C) after the microbial inoculum. The bacteriocins Pep5 and Epidermin caused a significant reduction of the number of adhered cells of S. epidermidis and Corynebacterium sp. after 6 h and 12 h. No important differences among the protocols A, B or C were observed. The effe tions ct of Pep5 on Corynebacterium sp. was studied by scanning electron microscopy. Sec with cellular residues were observed on the catheter surface.

Tese(doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de ciências da saúde, Programa de pós-graduação em ciências da saúde, 2012. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-07-24T12:32:25Z No. of bitstreams: 1 2012_DanielladeSousaMendesMoreiraAlves.pdf: 1244791 bytes, checksum: dc7a7f8820b1c2ea4b7f7ff74913ebe4 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-27T11:04:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DanielladeSousaMendesMoreiraAlves.pdf: 1244791 bytes, checksum: dc7a7f8820b1c2ea4b7f7ff74913ebe4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-27T11:04:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DanielladeSousaMendesMoreiraAlves.pdf: 1244791 bytes, checksum: dc7a7f8820b1c2ea4b7f7ff74913ebe4 (MD5) / Várias espécies do gênero Acanthamoeba podem causar ceratite e encefalite amebiana granulomatosa. A avaliação dos critérios de patogenicidade é de grande importância para analisar o risco de infecção. Nossos objetivos foram determinar o potencial patogênico de isolados ambientais de Acanthamoeba de Brasília, DF e avaliar uma técnica de purificação de cultivos de Acanthamoeba. A análise da sequência do 18S rDNA revelou que: entre os 19 isolados estudados, oitoapresentaram similaridade com o genótipo T5, seis com o genótipo T4 e um com o genótipo T2/T6. Os genótipos dos outros quatro isolados não foram determinados. A cepa de referência Acanthamoeba polyphaga (ATCC 30461) serviu de controle. Além disso, 11 isolados (58%) cresceram a 37°C e oito (42%) cresceram em presença de manitol 1,5 M, parâmetros fisiológicos associados com isolados patogênicos de Acanthamoeba, enquanto quatro isolados de água de piscina e um de ceratite apresentaram elevado potencial patogênico. Nos testes de patogenicidade in vivo, realizados com três isolados e a cepa de referência ATCC30461, o isolado de córnea foi considerado patogênico e dois isolados ambientais,invasivos. Foi possível reduzir a porcentagem de fungos e bactérias em uma placa de cultura da cepa de referência ATCC 30461 e de bactérias em uma placa de cultura de um isolado de solo com a inoculação na cavidade peritoneal de camundongos. Nossos resultados indicam ampla distribuição de isolados de Acanthamoeba spp. similares aos genótipos T4, T5 e T2/T6, classificados como invasivos, em diversos habitats de Brasília, DF, revelando o risco potencial de infecção humana e a necessidade de medidas preventivas. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Several Acanthamoeba species may cause keratitis and granulomatous amebic encephalitis. The evaluation of the criteria of pathogen city is very important to assess the risk of infection. We aimed to determine the pathogenic potential of environ mental isolates of Acanthamoeba from Brasília, DF, Brazil, and assess technique to purify Acanthamoeba cultures. Sequence analysis of 18S rDNArevealed that: among the 19 isolates tested, eight were similar to genotype T5, six to genotype T4, and one to genotype T2/T6. The genotypes of the remaining four isolates were not determined. The reference Acanthamoeba polyphaga strain (ATCC30461) was the control. Moreover, 11 strains (58%) presented growth at 37°C and eight (42%) developed in medium containing 1.5 M mannitol, the physiological parameters associated with pathogenic isolates of Acanthamoeba, whereas fours trains isolated from swimming pool water and one from a patient with keratitisshowed high pathogenic potential. In vivo pathogen city tests, performed with three isolates and the reference strain ATCC 30461, showed that the isolate from a patient with keratitis was considered pathogenic and two environmental isolates, invasive. It was possible to reduce the percentage of fungi and bacteria in a culture plate of the reference strain ATCC 30461 and bacteria in a culture plate of one soil isolate byinoculating them into the peritoneal cavity of mice. Our results indicate a wide distribution of Acanthamoeba spp. isolates similar to genotypes T4, T5, and T2/T6, classified as invasive, isolated from several habitats of Brasília, DF, revealing the potential risk of human infection and the need for preventive measures.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-13T13:38:11Z No. of bitstreams: 1 2013_PedroHenriqueVianaSaavedra.pdf: 1314251 bytes, checksum: ee5b0094f71f46179c6f13bef2a69329 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-15T11:34:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PedroHenriqueVianaSaavedra.pdf: 1314251 bytes, checksum: ee5b0094f71f46179c6f13bef2a69329 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-15T11:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PedroHenriqueVianaSaavedra.pdf: 1314251 bytes, checksum: ee5b0094f71f46179c6f13bef2a69329 (MD5) / Cryptococcus neoformans é um fungo encapsulado patogênico humano que afeta principalmente indivíduos imunossuprimidos. Sua cápsula é um dos mais importantes fatores de virulência, e está envolvida com os processos de evasão da resposta imune e disseminação no hospedeiro. Neste trabalho foi investigado a ativação do inflamassoma por C. neoformans e o papel de sua cápsula nesse processo. Observou-se que o mutante acapsular de C. neoformans induziu elevados níveis da secreção de IL-1β e ativação da protease caspase-1. A secreção de IL-1β foi analisada em macrófagos derivados de medula deficientes para as proteínas ASC, caspase-1, NLRP3 e NLRC4, demonstrando que essa secreção depende do inflamassoma NLRP3, mas não de NLRC4. Além disso, os componentes do inflamassoma se mostraram dispensáveis para fagocitose e atividade antifúngica frente a infecção. Os mecanismos envolvidos no processamento de IL-1β foram dependentes de catepsina B frente ao dano lisossomal e sinalização via quinase Syk. Foi demonstrado também que a sinalização por IL-1β não aumenta a atividade antifúngica de macrófagos. No entanto, ela participa na restrição da taxa de infecção por mecanismos desconhecidos. Estes resultados mostram pela primeira vez que C. neoformans ativa o inflamassoma NLRP3 de forma dependente de caspase-1 através da liberação de catepsina B e sinalização via Syk, levando a produção de IL-1β e restrição da taxa de infecção. Adicionalmente, esses dados demonstram que os isolados encapsulados conseguem diminuir a ativação do inflamassoma. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cryptococcus neoformans is an encapsulated human pathogenic fungus that affects primarly immunocompromised individuals. It has a prominent capsule that is an important virulence factor, which is involved in immune response evasion and fungal dissemination. In the present study we investigated whether C. neoformans was able of triggering inflammasome activation and the role of its capsule in this event. The results showed that the acapsular mutant induced high levels of IL-1β secretion and caspase-1 activation. IL-1β -/- -/-secretion induced by C. neoformans was assessed in WT, Asc , Casp1 , -/- -/- Nlrp3 and Nlrc4 bone marrow-derived macrophages, showing IL-1β secretion to be dependent on NLRP3, but independent on NLRC4 inflammasome. In addition, inflammasome components were dispensable for C. neoformans uptake or killing. The mechanisms underlying IL-1β processing and release were dependent on cathepsin B release following lysosomal destabilization and Syk tirosine kinase signaling. We also demonstrate that IL- 1β signaling is not required to restrict intracellular yeast, but limited the rate of infection by an unknown mechanism. Together, our data show for the first time that acapsular C. neoformans activates the NLRP3 inflammasome and IL-1β secretion in a caspase-1 dependent manner and that the mechanisms involved in this event rely on cathepsin B released during lysosomal damage and Syk signaling, leading to restriction of infection rate. Furthermore, our results show that encapsulated C. neoformans is able to dimish inflammasome activation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-12T16:32:11Z No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo patogênico e dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul. O fungo ocorre na natureza na forma de micélio, na temperatura de 26ºC, e na forma de levedura, na temperatura de 37ºC in vitro, sendo esta a forma encontrada nos tecidos de hospedeiros. A transição dimórfica da forma miceliana para a de levedura parece ser essencial para a patogênese, como também observado para outros fungos patogênicos e dimórficos. O projeto "Genoma Funcional e Diferencial do Fungo P. brasiliensis", realizado sob coordenação de nosso laboratório, foi empreendido a partir do seqüenciamento de bibliotecas de cDNA das formas de micélio e levedura cultivadas in vitro. No contexto desse trabalho, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir do RNA total de P. brasiliensis obtido após seis horas de co-cultivo com células de macrófagos peritoneais murinos, sem qualquer cultivo adicional do fungo in vitro. A análise do perfil transcricional desse fungo a partir dessa biblioteca de cDNA, denominada PbY-MF, visa melhor compreender o padrão de expressão de genes potencialmente importantes para a adaptação e sobrevivência de P. brasiliensis no modelo de infecção. Nesse sentido, esse trabalho iniciou a caracterização do transcriptoma de P. brasiliensis recuperado de macrófagos, pelo seqüenciamento de cDNAs da biblioteca PbY-MF. A partir da submissão das seqüências ao pipeline de análise, um total de 474 ESTs de qualidade (PHRED ³ 20 e tamanho ³ 100 nt), foram geradas e analisadas. Após agrupamento pelo CAP3, essas ESTs foram agrupadas em 16 contigs e 99 singlets. Análises de similaridades empregando os bancos de dados do projeto transcriptoma de P. brasiliensis, GeneBank nr e dbEST, utilizando as ferramentas Blastn e Blastx, foram realizadas. Os resultados dessa análise revelam que 355 ESTs, agrupadas em 4 contigs e 16 singlets, apresentaram similaridades com seqüências já descritas para o fungo P. brasiliensis, sendo a maioria relacionada com genes da maquinaria traducional mitocondrial. Cinco contigs e sete singlets, ainda não descritos em P. brasiliensis, apresentaram similaridades com seqüências de outros organismos, sendo que a maioria também mostrava similaridade com genes mitocondriais que codificam proteínas da cadeia de transporte de elétrons. Das 474 ESTs analisadas no contexto desse trabalho, seis contigs e 63 singlets não apresentaram similaridades com nenhuma seqüência descrita nos bancos de dados empregados nessa análise, correspondendo a genes novos potencialmente específicos de P. brasiliensis. Em adição, nesse trabalho também foi realizada a análise de quatro contigs que apresentam similaridades com o gene de isocitrato liase (icl), o qual codifica uma proteína chave do ciclo do glioxilato, que mostra-se ativado em diferentes modelos de células de mamíferos infectadas por patógenos intracelulares facultativos. Essas contigs foram identificadas no transcriptoma de P. brasiliensis cultivado in vitro. Nesse sentido, foram realizados o seqüenciamento adicional de clones de cDNAs relacionados a essas contigs, análises de similaridade dessas seqüências e experimentos de Southern blot. Os resultados sugerem que três contigs, apresentando similaridade com uma mesma seqüência de isocitrato liase do fungo Coccidioides immitis, representam provavelmente um mesmo transcrito de P. brasiliensis, enquanto a quarta contig apresenta maior similaridade com o gene metilisocitrato liase do fungo Emericella nidulans. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracocidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Dimorphic transition is triggered by a temperature shift from the environmental 26 ºC, in which the fungus is found as a free-living mycelium, to the 37 ºC of the human host, when it changes to the pathogenic yeast form. The dimorphic transition is believed to play an essential role in pathogenesis, as described for other dimorphic pathogenic fungi. The project "Functional and Differential Genomics of the P. brasiliensis fungus", coordinated by our laboratory, has performed the sequencing of cDNA libraries from in vitro grown yeast and mycelium cells, resulting in 19,718 expressed sequence tags (ESTs) from in vitro cultivated yeast (9,941 ESTs) and mycelium (9,777 ESTs). The CAP3 clusterization software has assembled these raw sequence data into 2,655 contigs and 3,367 singlets. In order to better understand the expression of genes potentially involved in P. brasiliensis adaptation and survival in an infection model, in this work we describe the construction of a cDNA library using as template mRNA extracted from a six-hour co-culture of P. brasiliensis yeast cells and murine peritoneal macrophages, named PbY-MΦ. The sequencing of the PbY-MΦ library generated 474 ESTs that suited inclusion criteria of PHRED ≥ 20 and size greater than 100 nucleotides, which were clustered into 16 contigs and 99 singlets. BLAST-analysis against the P. brasiliensis transcritpome project, nr and dbEST databases, grouped 355 ESTs into four contigs and 16 singlets similar to previously described P. brasiliensis sequences, most of them corresponding to components of the mitochondrial translation apparatus. Five contigs and seven singlets, which were not described in P. brasiliensis, were found to be similar to sequences described in other organisms, with most of them implicated in the mitochondrial electron transport chain. Six contigs and 63 singlets were unique in that they had no homology to known sequences. In addition, we have performed a better characterization of four contigs described in the in vitro transcriptome, which were similar to the isocitrate lyase gene (icl), an enzyme of the glyoxylate cycle. Sequencing, similarity analysis and southern blotting experiments of these contigs suggest that three of them correspond to the isocitrate lyase from Coccidioides immitis, while the fourth is related to a methyl-isocitrate lyase gene from Emericella nidulans.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-01-02T10:23:34Z No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / O basidiomiceto Cryptococcus neoformans, é um fungo oportunista, que comumente infecta pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e imunocomprometidos em geral. É o agente etiológico da criptococose, doença potencialmente fatal e cosmopolita cuja incidência mundial vem se aproximando da de doenças como a tuberculose. O gene VOSA pertence à família velvet, exclusiva de fungos e primeiramente descrita em Aspergillus, e está envolvido na viabilidade dos esporos e na regulação das fases assexuada e sexuada. Proteínas dessa família são fatores transcricionais altamente conservados entre ascomicetos e basidiomicetos que regulam diferentes processos em resposta a estímulos ambientais. A análise in silico do gene VOSA de C. neoformans mostrou sua conservação entre os fungos. Construiu-se um cassete de deleção do gene VOSA contendo o gene de resistência à higromicina B por PCR double joint. O cassete foi transformado por biobalística nas linhagens selvagens KN99a/α (soroA) que permitiu a obtenção de mutantes vosAaΔ e vosAαΔ. Da mesma forma, o fragmento contendo o locus VOSA foi transformado para obtenção do reconstituído tipo a (vosAaΔ::VOSA). Confirmou-se a deleção e a reconstituição de VOSA por PCR comum. Os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos aos testes de fenótipo: crescimento a 30°C e 37°C, formação de cápsula, produção de urease e fosfolipase, alterações de parede celular e produção de melanina, no entanto não foram observadas quaisquer alterações no fenótipo quando comparados com a linhagem selvagem. Quanto à capacidade de realizar acasalamento, os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos a acasalamento com linhagem selvagem de tipo sexual oposto e apresentaram diminuição na formação de hifas e alteração morfológica significativa de sua estrutura. Mutantes de tipo sexual opostos (vosAaΔ vs. vosAαΔ) também foram submetidos a acasalamento e não apresentaram qualquer formação de hifas. Acredita-se que VOSA seja um regulador positivo da reprodução sexuada, e que controle a formação de estruturas sexuais. A expressão de genes velvet foi analisada no mutante vosAaΔ em comparação à cepa selvagem sem indicação de qualquer alteração transcricional. Os resultados até agora obtidos em C. neoformans colaboram para um melhor entendimento do papel de VOSA na patobiologia deste patógeno. Pretende-se identificar em detalhe o papel deste gene no ciclo de vida de C. neoformans, em especial na produção de esporos, que são as formas infectivas e de disseminação deste patógeno. Os dados moleculares gerados neste trabalho servem como ponto de partida para elucidar a complexa regulação do ciclo sexual de C. neoformans e pela primeira vez descreve o envolvimento de um gene velvet na biologia de um basidiomiceto. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The basidiomycete fungus Cryptococcus neoformans is an opportunistic organism which commonly infects HIV and immunocompromised patients. It is the etiological agent of cryptococcosis, a potentially fatal and cosmopolitan disease, whose world’s incidence is approaching from diseases such as tuberculosis. VOSA gene belongs to the velvet family, fungal exclusive and primarily described in Aspergillus, involved in the regulation of sexual and asexual development as well as in the viability of the spores. Proteins of this family are transcriptional factors highly conserved among ascomycetes and basidiomycetes regulating different process in response to environmental stimuli. In silico analysis of VOSA gene showed its conservation among the fungi. A VOSA disruption cassette containing the hygromycin reistance gene was assembled by Double Joint PCR. The cassette was transformed by biolistic in KN99a/α (soroA) wild type strains that allowed obtaining the vosAaΔ and vosAαΔ mutants. Likewise, the fragment containing the VOSA locus was transformed to obtain a mating type a reconstituted strain (vosAaΔ::VOSAa). Both disruption and reconstitution were confirmed by traditional PCR. The mutants vosAαΔ and vosAaΔ were tested for various phenotypes: growth at 30 and 37°C, capsule formation, urease and phospholipase production, changes in cell wall and melanin production, however no phenotypic changes were observed compared to the wild type strains. Regarding the ability to mate, vosAaΔ and vosAαΔ mutants were crossed with wild type strain of opposite mating type and the crosses showed decreased hyphae formation and significant morphological alteration of its structure. Mutants of opposite mating type (vosAaΔ vs. vosAαΔ) were subjected to mating and showed no formation of hyphae. VOSA is believed to be a positive regulator of sexual reproduction, and that controlling the formation of sexual structures. Expression of velvet genes was analyzed in vosAaΔ mutant in comparison with wild type strain and any significant transcriptional changes were noticed. The results obtained so far in C. neoformans collaborate for a better understanding of its role in the pathobiology of this pathogen. It is intended to identify in detail the role of VOSA in C. neoformans lyfe cycle, in particular spore production, the infective and dissemination form of the pathogen. The molecular data generated in this study are starting point for a research to elucidate the molecular mechanism of the sexual cycle regulation on C. neoformans and for the first time describ a velvet gene involved in the biology of a basidiomycete.

Durante o processo de infecção, o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae desenvolve uma estrutura especializada denominada apressório. Essa estrutura é responsável por realizar pressão de turgor sobre a cutícula do hospedeiro para auxiliar na transposição desta barreira e instalar a infecção. Neste trabalho, a diferenciação de apressório foi induzida através de cultivo de conídios sobre lamínulas de vidro na presença de extrato de levedura como fonte de nitrogênio. As melhores condições de cultivos determinadas foram de um meio contendo 0,0040% de extrato de levedura, concentrações de conídios por lamínula entre 2,5.105 e 5.105 e tempo de cultivo de 16 horas a 28C. A sequência genômica de emp1 foi isolada e apresentou uma ORF de 803 nucleotídeos codificando uma proteína predita de 226 aminoácidos. A proteína predita contém uma região N-terminal contendo um peptídeo sinal para secreção, um sítio potencial de N-glicosilação, 16 aminoácidos na porção C-terminal característicos de sítios de adição de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A massa molecular da proteína predita foi de 22KDa com um pI de 5,5. A sequência de emp1 apresentou homologia com os genes das proteínas de matriz extracelular de Fusarium oxysporum (gene fem1) e de Magnaporthe grisea (gene emp1). Com base na sequência de emp1 de M. anisopliae um vetor de disrupção foi construído e a seleção inicial dos transformantes foi conduzida. / The entomopathogenic fungi Metharhizium anisopliae develops specialized infection structures known as appressorium wich trigger turgor pressure that is crucial for host penetration. In this work, the appressorium differentiation was induced in glass coverslips and the best nutritional condition (0.004% of yeast extract), time of growth (16 hours) and conidia concentration between 2.5.105 and 5.105 were optimized. Genomic DNA sequence of M. anisopliae emp1 showing sequence homology to an extracellular matrix protein gene fem1 of Fusarium oxysporum and emp1 of Magnaporthe grisea was isolated. This sequence presents an open reading frame of 803 nucleotides encoding a predicted protein of 226 amino acids. The estimated molecular weight of the predicted protein product was 22 KDa with a pI of 5.5. It contains amino acid N-terminal secretion signal sequence, as well a potential N-glycosylation site. At its C-terminus, the protein contains a 16 amino acid sequence showing characteristics of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor addition signal. Based on this sequence a disruption vector was constructed with the bar cassette, allowing initial selections of mutants.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-18T18:08:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) biblioteca central.pdf: 4054998 bytes, checksum: 00c4a7ffb902283c81b233cc5cfcc56b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T18:08:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) biblioteca central.pdf: 4054998 bytes, checksum: 00c4a7ffb902283c81b233cc5cfcc56b (MD5) Previous issue date: 2014-02-12 / OBJETIVO. Analisar a participação de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento em endoftalmite infecciosa aguda pós-facectomia. MÉTODOS. Amostras de humor vítreo de 18 pacientes com endoftalmite foram coletadas e armazenadas a -80oC. IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, FGF básico, Eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-BB, RANTES, TNF-α e VEGF foram dosadas pela técnica de Bioplex e comparadas com 39 pacientes submetidos a vitrectomia por doença não-infecciosa (controle). RESULTADOS. As concentrações de IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, IL-17, eotaxina, FGF Básico, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-bb, RANTES e TNF-α foram significantemente maiores (p<0.05) em olhos com endoftalmite. Não houve diferença significante entre os grupos em relação à concentração de IL-5, IL-12 (p70), IL-13 e VEGF. A concentração de IL-7 foi superior no grupo controle (p=0.0229). Considerando-se os diferentes diagnósticos do grupo controle, apenas IL-5 não apresentou diferença significante entre os grupos (p=0.1764). Foi observada correlação positiva entre TNF-α e eotaxina, IL-8, MIP-1a, MIP1b e RANTES. Observou-se correlação positiva moderada entre TNF-α e acuidade visual inicial (r=0.59, p=0.0096). Não se encontrou correlação entre acuidade visual inicial ou final entre os demais fatores dosados. CONCLUSÕES. A endoftalmite infecciosa pós-facectomia estimula a produção de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Os níves de TNF-α podem estar relacionados com a gravidade do processo inflamatório inicial. Não foi encontrado fator inflamatório preditivo para a acuidade visual final. / Purpose. To analyze the involvement of cytokines, chemokines and growth factors in acute infectious endophthalmitis following cataract extraction surgery. Methods. Vitreous humor samples were collected from 18 patients with infectious endophthalmitis. The Bio-Plex technique was used to measure IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, basic FGF, eotaxin, GCSF, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-BB, RANTES, TNF-α and VEGF for comparison with levels in 39 patients undergoing vitrectomy for a noninfectious disease (control). Results. IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, IL-17, eotaxin, bFGF, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-BB, RANTES and TNF-α levels were significantly higher (p <0.05) in eyes with endophthalmitis. There were no significant differences between groups for IL-5, IL-12 (p70), IL-13 and VEGF levels. IL-7 levels were higher in the control group (p = 0.0229). Considering the different diagnosis in the control group, only IL-5 was not significantly different between groups (p = 0.1764). There were positive correlations between TNF-α and eotaxin, IL-8, MIP-1a, MIP1b and RANTES, and a moderate positive correlation between TNF-α and the initial visual acuity (r = 0.59, p = 0.0096). There was no correlation with the initial or final visual acuity for the other factors measured. Conclusions. Infectious endophthalmitis following cataract extraction stimulates the production of cytokines, chemokines and growth factors. Levels of TNF-α may be related to the severity of the initial inflammatory processes. No inflammatory factor that could predict the final visual acuity was evident.