Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-09T20:12:20Z No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-17T19:54:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-17T19:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) Previous issue date: 2018-04-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O conhecimento a respeito de complexas redes de comunicação e interação celular alcançou muitos avanços graças a estudos de fluorescência aplicados à biologia das células. Embora muito progresso tecnológico empregado no imageamento celular tenha sido alcançado, os fluorocromos continuam desempenhando papel central para análises de condições fisiológicas e patológicas. O desenvolvimento de agentes fluorescentes é um processo laborioso que visa a criação de moléculas providas simultaneamente de diversas características favoráveis, tais como, amplos desvios de Stokes, altos coeficientes de extinção molar, permeabilidade a membranas celulares, ausência de citotoxicidade e alta especificidade. Moléculas derivadas do núcleo fluorescente benzotiadiazol (BTD), por apresentarem muitos desses aspectos, encontram várias aplicações no âmbito do imageamento celular. Neste contexto, o presente trabalho inicia uma série de aplicações em modelos biológicos de duas estruturas inéditas derivadas de BTD. O fluoróforo 2,1,3- benzotiadiazol triazol galactose, ou G2, e a molécula 2,1,3- benzotiadiazol triazol xilose, ou X2. Algumas linhagens tratadas com os compostos apresentaram considerável redução de viabilidade celular. Esse fato revelou ação citotóxica dos fluorocromos para determinados tipos de células, o que dificulta aplicações dessas moléculas em células vivas. Contudo os resultados de aplicações em diferentes modelos biológicos fixados foram excelentes para a sonda G2. Esta apresentou alta especificidade, sinal fluorescente intenso e ausência de marcação de fundo. Sabe-se que a recomendação de sondas fluorescentes apenas para material fixado é um aspecto comum a muitos marcadores de referência no mercado. Já o fluoróforo X2 não teve sua especificidade definida pois apresentou possíveis marcações em organelas como complexo de golgi, lisossomos, vesículas do sitema endossomal entre outras. Contudo, a partir de estudos de comarcação com Lysotracker (específico para organelas ácidas), de experimentos em C. elegans e de ensaios utilizando um sistema “baculovírus – células de inseto” foi observada certa preferência do composto por organelas ácidas ou organelas com alta quantidade de membranas, levando-nos também à hipótese de que o X2 possui afinidade por um tipo / um grupo de fosfolipídios. O composto G2 apresenta especificidade para corpúsculos lipídicos. Esta constatação ficou bem determinada através de estudos de comparação ou de colocalização em diferentes modelos, como células de insetos e C. elegans, com os corantes de referência para essas organelas: Oil Red O e BODIPY®. Também demonstramos que esta sonda é eficaz para avaliar dinâmica de lipídios, para isso utilizamos o sistema “baculovírus – células de inseto” em conjunto com o composto G2. Os resultados levaram a hipótese de que o G2 pode marcar um grupo mais seleto entre os lipídios, em comparação ao marcador BODIPY®. Por fim, este trabalho fundamenta a proteção intelectual e posterior divulgação da sonda G2 e ainda traz novos esclarecimentos para melhorias da molécula X2. / The knowledge about cellular communications and complexes networks interactions has been constantly developing thanks to fluorescence studies applied to cell biology. Although a good technological progress has been achieved in cell imaging, fluorochromes continue to play a central role in the analysis of physiological and pathological conditions. The development of fluorescent dyes is a difficult process, which aims create molecules provided simultaneously with several favorable characteristics. This physical or chemical features include wide Stokes shift, high molar extinction coefficients, permeability to cell membranes, absence of cytotoxicity and high specificity. The fluorescent molecule benzothiadiazole (BTD) have been used as a core in the synthesis of fluorophores that usually presents the chemical and physical mentioned characters and have a large of applications in the field of cellular imaging. In this context, the present work initiates a series of applications in biological models of two unpublished structures derived from BTD. The fluorophore 2,1,3-benzothiadiazole triazole galactose, or G2, and the molecule 2,1,3-benzothiadiazole triazole xylose, or X2. Some cell lines treated with the compounds presented considerable reduction of cell viability. This fact revealed cytotoxic action of the fluorochromes for certain cell types, which makes it difficult to apply these molecules to living cells. However, the results of applications in different fixed biological models were excellent for the G2 probe. This showed high specificity, intense fluorescent signal and absence of background. For this reason, the G2 is a fluorophore with potential for commercial application, even if it is only used in fixed materials. But the fluorophore X2 did not have its specificity determined because it showed possible labeling in vesicles of the endosomal system, lysosomes, Golgi complex and other organelles. However, studies of colocalization between X2 and Lysotracker (which one is specific for acidic organelles), experiments in C. elegans and assays using a system "baculovirus - insect cells" revealed a certain preference of the compound by acidic organelles or organelles with a high amount of membranes, leading us to hypothesize that X2 has affinity for a type or a group of phospholipids. The fluorophore G2 has specificity for intracellular lipid droplets. This finding was well determined through comparative studies or fluorescence colocalization in different models, such as insect cells and C. elegans, using the specific dyes for these organelles: Oil Red O and BODIPY®. We also demonstrated that this probe is effective for evaluation of lipid dynamics, for which we use the "baculovirus - insect cells" system together with the compound G2. The results led to the hypothesis that G2 are selecting a group within the lipids, in comparison to the BODIPY® dye. Finally, this work bases the intellectual protection and subsequent disclosure of the G2 probe and still brings new clarifications for improvements of the molecule X2.

aEPEC é capaz de causar lesão A/E, provocada por proteínas codificadas na região LEE. Foi realizada a análise estrutural e funcional da região LEE de amostras de aEPEC que expressam os padrões ALL, AA e AD, e amostra não aderente (NA). O padrão de adesão característico e capacidade de causar a lesão A/E foram investigados em células epiteliais. As amostras mantiveram o padrão de adesão independentemente da origem da linhagem celular. A lesão A/E foi detectada em algumas linhagens celulares após o contato com as amostras ALL e AD. A presença da região LEE foi detectada intacta e ensaios de PCR em tempo real, microarray e imunodetecção, mostrando a funcionalidade da mesma em todas as amostras. Um plasmídio que expressa a proteína EspFu foi introduzido em todas as 4 amostras, demonstrando não influenciar nos padrões de adesão e nem na capacidade de causar a lesão A/E nas amostras ALL, AA e AD. Mas, a amostra NA expressou o padrão ALL e foi capaz de causar a lesão A/E. Assim, EspFu desempenhou papel na adesão celular além do estabelecimento da lesão A/E in vitro. / aEPEC is capable to cause A/E lesion, triggered by proteins encoded by LEE region. We analyzed structurally and functionally the LEE region of aEPEC strains displaying LAL, AA, DA, and one nonadherent (NA) strain. The adherence characteristics and ability to cause A/E were investigated in epithelial cells. The displayed adherence patterns were independent of the cell line origin. A/E lesion was detected in some cellular lines after contact only with ALL- and AD-strains. LEE region presence was detected intact and real time PCR, microarray and immunodetection, in all samples tested. An EspFu-expressing plasmid was introduced in all strains, demonstrating no influence of this protein neither in the adherence patterns nor in the capacity to cause A/E of the LAL-, AA- and DA-strains. But, NA-strain expressed the LAL pattern and was able to cause A/E. Therefore, EspFu was shown to play a role in cell adhesion in addition to the establishment of the A/E lesion in vitro.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:32:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6456_1.pdf: 1328130 bytes, checksum: c35527d933f665ea518f8ad49ba91fcb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O ácido úsnico (AU) [2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3-(2H,9H)-dibenzofurano] é um composto derivado do metabolismo secundário de liquens e conhecido pela sua atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e micobactérias. A tuberculose pulmonar é caracterizada pelo envolvimento de macrófagos contendo no seu interior elevada quantidade de Mycobacterium tuberculosis. Os lipossomas têm sido usados como carreadores coloidais de fármacos direcionados às células. Há uma necessidade urgente de novos compostos para o tratamento de infecções causadas por micobactérias, uma vez que, nenhum novo antibiótico tem sido desenvolvido desde a década de 70. O objetivo desse estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do AU encapsulado em liposomas contra o M. tuberculosis e investigar sua interação com macrófagos. Os lipossomas foram preparados usando a técnica de hidratação do filme lipídico com subseqüente sonicação. A concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) contra o M. tuberculosis H37Rv foram determinadas segundo o ensaio de microdiluição utilizando Alamar blue. A citotoxicidade do AU foi avaliada para macrófagos J774 e a viabilidade celular foi detectada pelo ensaio padrão de MTT. O estudo de interação celular foi realizado com macrófagos J774 usando a espectroscopia de fluorescência. Os valores de CIM e CBM para o AU livre foram 6,5 e 32 &#956;g/ml, respectivamente. Por outro lado, AU lipossomal exibiu uma CIM de 5,85 &#956;g/ml e CBM de 16 &#956;g/ml. A concentração requerida para inibir 50% da proliferação celular (CI50) foram 22,5 e 12,5 &#956;g/ml para o AU livre e encapsulado, respectivamente. Um incremento do conteúdo intracelular de lipossomas contendo AU foi verificado pela maior emissão de fluorescência detectada (21,57 x 104 c.p.s) em comparação a do AU livre (9,54 x 104 c.p.s). Além disso, a formulação lipossomal proveu uma quantidade intracelular de AU praticamente invariável durante longo período de tempo (30 h, p < 0,05). Estes resultados indicaram uma forte interação entre lipossomas e macrófagos J774, facilitando a penetração do AU nessas células de defesa, como também, considerável aumento de sua atividade contra o M. tuberculosis

aEPEC é capaz de causar lesão A/E, provocada por proteínas codificadas na região LEE. Foi realizada a análise estrutural e funcional da região LEE de amostras de aEPEC que expressam os padrões ALL, AA e AD, e amostra não aderente (NA). O padrão de adesão característico e capacidade de causar a lesão A/E foram investigados em células epiteliais. As amostras mantiveram o padrão de adesão independentemente da origem da linhagem celular. A lesão A/E foi detectada em algumas linhagens celulares após o contato com as amostras ALL e AD. A presença da região LEE foi detectada intacta e ensaios de PCR em tempo real, microarray e imunodetecção, mostrando a funcionalidade da mesma em todas as amostras. Um plasmídio que expressa a proteína EspFu foi introduzido em todas as 4 amostras, demonstrando não influenciar nos padrões de adesão e nem na capacidade de causar a lesão A/E nas amostras ALL, AA e AD. Mas, a amostra NA expressou o padrão ALL e foi capaz de causar a lesão A/E. Assim, EspFu desempenhou papel na adesão celular além do estabelecimento da lesão A/E in vitro. / aEPEC is capable to cause A/E lesion, triggered by proteins encoded by LEE region. We analyzed structurally and functionally the LEE region of aEPEC strains displaying LAL, AA, DA, and one nonadherent (NA) strain. The adherence characteristics and ability to cause A/E were investigated in epithelial cells. The displayed adherence patterns were independent of the cell line origin. A/E lesion was detected in some cellular lines after contact only with ALL- and AD-strains. LEE region presence was detected intact and real time PCR, microarray and immunodetection, in all samples tested. An EspFu-expressing plasmid was introduced in all strains, demonstrating no influence of this protein neither in the adherence patterns nor in the capacity to cause A/E of the LAL-, AA- and DA-strains. But, NA-strain expressed the LAL pattern and was able to cause A/E. Therefore, EspFu was shown to play a role in cell adhesion in addition to the establishment of the A/E lesion in vitro.

A sinalização no sistema nervoso pode ocorrer pelo acoplamento direto entre células, via canais de junção comunicantes (JCs). Estes canais permitem a passagem de moléculas de até 1 kDa, e são formados por subunidades proteicas denominadas conexinas (Cxs). A comunicação celular via JCs desempenha um importante papel durante o desenvolvimento e a sinalização visual. Além disso, o acoplamento celular provido pelas JCs tem sido relacionado a processos de sobrevivência/morte celular. Do mesmo modo, ciclinas e cinases dependentes de ciclinas (CDKs), além de seu papel clássico na regulação do ciclo e diferenciação celular, estão envolvidas em processos neurodegenerativos. Estudos recentes têm observado a reentrada no ciclo celular de células neuronais pós-mitóticas em apoptose. Neste contexto, analisamos a expressão gênica e proteica das Cxs e ciclinas em resposta às lesões no sistema visual, especificamente na retina. Estas análises foram realizadas após a indução de trauma mecânico, modelo experimental que permite a visualização do foco, penumbra e áreas adjacentes à lesão. Utilizando técnicas combinadas, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real-Time), Western Blot e imuno-histoquímica, avaliamos a expressão espaço-temporal destes genes e as proteínas por eles codificadas, em diferentes tempos pós-lesão. Os resultados da PCR Real-Time revelaram uma ausência de modulação da expressão gênica de Cx36 para os diferentes tempos pós-lesão analisados. A Cx43 mostrou aumento dos transcritos, após três e sete dias pós-lesão. A ciclina D1 e B1 apresentaram modulação significativa após um, três e sete dias pós-lesão. As análises de imuno-histoquímica revelaram uma redistribuição da Cx36 em resposta à lesão em diferentes tempos pós-lesão. A Cx43, por sua vez, apresentou um aumento aparente de sua expressão no foco e zona de penumbra da lesão, nos período de um, três e sete dias pós-lesão. Em retinas, após um e três dias de lesão, a ciclina D1 encontrou-se presente em células próximas ao foco da lesão. Observamos a presença de ciclina B1 no foco da lesão após um dia de lesão. Por meio de análises de Western Blot não foi possível detectar alterações das diferentes proteínas estudadas nas retinas, em períodos variados de exposição à lesão. Os dados deste estudo sugerem que i) possivelmente, as células afetadas pela lesão se encontram acopladas; ii) expressam proteínas reguladoras do ciclo celular. Levando em consideração o conjunto de resultados, sugerimos que é possível induzir ou prevenir a reentrada do ciclo celular em células pós-mitóticas da retina, controlando o acoplamento mediado pelas proteínas formadoras das JC. / Communication in the nervous system can occur directly between the cells through structures known as gap junction (GJ) channels. These channels allow the passage of small molecules up to 1 kDa and are composed of protein subunits named connexins (Cxs). Cell communication through GJ plays an important role during the development and visual signaling. Furthermore, cell coupling provided by the GJs has been related to processes of survival/cell death. Similarly, in addition to the classic role of cyclins and cyclins dependent kinases (CDKs) in the cell cycle regulation and differentiation, they are also involved in neurodegenerative processes. Recent studies have demonstrated the reentry of apoptotic post mitotic neurons in the cell cycle. In this context, we analyzed the gene and protein expression of Cxs and cyclins after lesions in the visual system, specifically in the retina. For this purpose, a mechanic trauma was induced in the retina, which represents a model that allows us to visualize the lesion focus, penumbra and adjacent areas. Using combined techniques, such as the real time polymerase chain reaction (real-time PCR), Western blot and immunohistochemistry, we evaluated the spatio-temporal expression of these genes and their encoded proteins at different times post-lesion. The real-time PCR revealed no modulation of the Cx36 gene expression for all the times post-lesion analyzed. Our results showed increase in the Cx43 transcripts one, three and seven days post-lesion. The immunohistochemistry analysis indicated redistribution of Cx36 in response to the lesion in different times. On the other hand, Cx43 presented evident increased expression in the focus and penumbra areas of the lesion one, three and seven days post-lesion. In our experiments we could observe that cyclin D1 is expressed in cells located close to the lesion focus one and three days post-lesion, while cyclin B1 is expressed in these cells only one day post-lesion. The Western blot analysis did not show changes on the protein levels evaluated in this study in any of the post-lesion times analyzed. Data obtained from this study suggest i) the cells affected by the lesion are possibly coupled by GJ; ii) these cells express protein regulators of cell cycle. Altogether, the results indicate that it is possible to induce or prevent the reentry of post mitotic cells of the retina in the cell cycle, by controlling cell coupling provided by GJ.

O potencial oncogênico do papilomavírus humano (HPV) baseia-se na capacidade das oncoproteínas virais E6 e E7 alterarem o ciclo celular, levando à imortalização e malignidade das células. O importante papel das oncoproteínas na progressão tumoral e na interação com inúmeros alvos celulares tem relevância em estudos para o desenvolvimento de vacinas e terapias contra os cânceres associados ao HPV. Este estudo investigou a localização intracelular das oncoproteínas E6 e E7 de HPV16/18 e seus possíveis alvos celulares. Demonstrou a presença de E6 nuclear, citoplasmática e intramitocondrial, tanto em células naturalmente transformadas por HPV, como em células transfectadas com o oncogene E6 viral. E7 foi detectada no núcleo e citoplasma, porém nunca ocorreu E7 intramitocondrial. Confirmou a hipótese da presença intramitocondrial da oncoproteína viral E6 de HPV16/18 de alto risco. Dado inédito cuja relevância está relacionada com a aplicação clínica, no desenvolvimento de imunobiológicos e fármacos capazes de neutralizar a ação deste importante alvo terapêutico. / The oncogenic potential of HPV is based on the capacity of viral oncoproteins E6 and E7 to change cellular cycle leading to immortality and malignancy. The important role of oncoproteins in tumor progression and its interaction with numerous cellular targets have relevance in studies to the development of vaccines and therapies against HPV associated cancers. This study investigated intracellular localization of E6 and E7 HPV16/18 oncoproteins and its possible cellular targets. It showed the presence of E6 in the cellular nucleus, cytoplasm, and intramitochondrial in naturally HPV transformed cell, as well as in cells transfected with E6 viral oncogene. E7 was detected inside nucleus and cytoplasm, but E7 intramitochondrial did not occur. This study confirmed the hypothesis of the intramitochondrial presence of E6 viral oncoprotein from high risk HPV. This is an original data whose relevance is directly related to clinical application in the development of immunobiologicals and drugs, which are able to neutralize the action of this important therapeutic target.

A doença granulomatosa inflamatória envolve interações coordenadas entre linfócitos, monócitos/macrófagos, células epitelióides, eosinófilos, neutrófilos e fibroblastos. A comunicação intercelular mediada por junções gap, constituídas por conexinas, é responsável pela homeostase tecidual. A Cx43 está presente em células linfóides, células mielóides, fibroblastos e outras. Assim, para compreendermos o possível envolvimento das conexinas no granuloma, nós analisamos o efeito da deleção heterozigótica de uma Gja1 (gene Cx43) na formação e desenvolvimento dos granulomas hepáticos, induzidos por ovos de Schistosoma mansoni. Para tanto, camundongos heterozigotos (Cx43+/-) e selvagens (Cx43+/+) foram infectados com cercárias de Schistosoma mansoni e avaliados nos tempos: 6, 8 e 12 semanas após a infecção. As células dos granulomas apresentaram expressão de conexina 43, notadamente após 12 semanas de infecção. As lesões dos camundongos Cx43+/- apresentaram índice de proliferação reduzido e aumento na deposição de colágeno em fases tardias da doença. Apesar desses achados, não se encontrou redução no tamanho e celularidade das lesões em comparação aos camundongos selvagens. Também não obtivemos diferenças em relação ao hemograma ou população de linfócitos esplênicos CD4, CD8 e CD19. As células peritoneais dos animais de ambos genótipos apresentaram produção de NO e H<SUB2O<SUB2 similares. Contudo, os neutrófilos e monócitos sanguíneos dos animais Cx43+/-, estimulados por PMA, apresentaram aumento significante do burst oxidativo. Concluindo, nossos resultados indicam que a deleção de um alelo do gene da Cx43 modifica claramente a evolução da doença granulomatosa, mostrando um papel desta conexina no desenvolvimento do granuloma. / Inflammatory granulomatous disease involves coordinated interactions among lymphocytes, monocytes/macrophages, epithelioid cells, eosinophils, neutrophils and fibroblasts. Intercellular communication mediated by gap junctions constituted of connexins, is responsible for tissue homeostasis. Cx43 is present in lymphoid cells, myelogenous cells, fibroblasts and others. In order to understand the possible involvement of connexins in granuloma, we analyzed the effect of the heterologous deletion of a Gja1 (Cx43 gene) on the formation and development of hepatic granulomas induced by Schistosoma mansoni eggs. Heterozigous (Cx43+/-) and wild-type (Cx43+/+) mice were infected with S. mansoni cercarie and evaluated after 6, 8 and 12 weeks. Granuloma cells express Cx43, with considerable reduction in Cx43+/- mice. Moreover, granuloma cells from Cx43v+/- mice displayed reduced proliferation and increased collagen deposition at late phases of the disease. Despite these findings, no reduction of size or cellularity of the lesions was found in comparison to wild-type mice. We didn?t find differences in relation to blood count and splenic lymphocyte population CD4, CD8 and CD19. Peritoneal cells from animals of both genotypes presented similar production of NO and H2O2. However, blood neutrophils and monocytes from Cx43+/- mice, stimulated by PMA, displayed significantly increased oxidative burst. In conclusion, our results indicate that the deletion of one allele of the Cx43 gene clearly modifies the evolution of a granulomatous disease, supporting a role for this connexin on granuloma development.

Os gânglios da raiz dorsal (GRD) armazenam neurônios TrkA-positivos. A percepção e transmissão de estímulos por estes neurônios dependem de uma neuritogênese adequada. Miosina (MioVa) é expressa no tecido nervoso e está presente em neuritos, corpo celular e cone de crescimento. Caracterizamos o padrão de expressão de MioVa na neuritogênese de células TrkA-positivas do GRD de galinha in vivo e in vitro. In vivo, MioVa é expressa em células que não começaram a emitir neuritos em HH25, e sua expressão persiste por toda neuritogênese. In vitro, é recrutada para o processo de re-emissão de neuritos de neurônios TrkA positivos na presença de NGF, sendo expressa em neuritos em diferentes estádios de neo-neuritogênese. Nos ensaios funcionais, observamos que a superexpressão do domínio globular de MioVa em culturas de GRD com 10 ou 100ng/ml de NGF reduz a população de células com neuritos longos e aumenta a população de células com neuritos curtos ou sem neuritos. Em conjunto, estes dados sugerem que a MioVa é importante para o estabelecimento de neuritos nociceptores. / The dorsal root ganglia (DRG) harbor the TrkA-positive neurons. The stimuli perception and transmission by these neurons depend on a proper neuritogenesis. Myosin (MyoVa) is widely expressed in nervous tissue and is present in neurites, cell body and growth cone. Here, we characterized the MyoVa expression pattern in chicken DRG TrkA-positive cells neuritogenesis, in vivo and in vitro. In vivo, at stage HH25, MyoVa was present both in cells with and without neurites and its expression persists throughout neuritogenesis. In vitro, it is recruited for the regeneration process and TrkA-positive neurons neurites re-emission in the presence of NGF, being expressed in neurites at different stages of neo-neuritogenesis. In functional assays, we observed that MyoVa globular tail overexpression in GRD cultures maintained with 10 or 100ng/ml NGF reduces the number of neurons with long neurites and increased the number of neurons with short neurites or no neurites. Taken together, these results suggest that Myosin Va is important for the establishment of nociceptor neurites.

As junções comunicantes são canais protéicos formados entre células adjacentes que permitem a passagem de moléculas e íons menores do que 1kDa; conexinas são proteínas que formam estas junções. Vêm sendo demonstradas na literatura a diminuição da capacidade de comunicação celular e alterações na expressão e/ou localização das conexinas em neoplasias. Este estudo foi realizado com o intuito de se verificar a influência da deleção de um dos alelos da Cx43 na carcinogênese pulmonar. Para tanto, camundongos geneticamente manipulados heterozigotos (Cx43± ou selvagens (Cx43±) de ambos os sexos receberam 3g/kg de uretana aos 15 e 17 dias de idade, e foram sacrificados após 25 semanas. As quantificações macro e microscópicas das lesões revelaram que os camundongos Cx43± apresentaram maior multiplicidade de adenomas pulmonares. Estes apresentavam também maior taxa de proliferação celular, avaliada pela quantificação de núcleos positivos para o PCNA. As expressões das Cxs 26, 32, 43 e 46, presentes no epitélio pulmonar, foram avaliadas por PCR em tempo real (RT-PCR) e por imunoistoquímica. A expressão da Cx43 revelou-se cerca de 50% menor em camundongos Cx43± quando comparada à dos correspondentes Cx43+/+, como esperado. Estudos in vitro mostraram que os pneumócitos de tipo II (APTII) extraídos de camundongos Cx43±, apresentaram capacidade de comunicação menor do que os APTII de camundongos Cx43+/+. Quando submetidos ao tratamento com uretana, a expressão de Cx 43 aumentou em 100% no tecido pulmonar. As demais Cxs tiveram a expressão reduzida pelo tratamento e não foram evidenciadas no epitélio pulmonar livre de lesões após o tratamento com uretana. Não foi detectada a expressão da Cx43 e da Cx32 nos adenomas provenientes dos camundongos Cx43±. A expressão das Cxs 26 e 46 foi correlacionada com o fenótipo papilífero das lesões. Constatou-se que a Cx32 acumulava-se no citoplasma das células epiteliais pulmonares e teve sua expressão, juntamente com a da Cx43, associada ao sexo, provavelmente contribuindo para a menor susceptibilidade das fêmeas aos adenomas induzidos pela uretana. Em conclusão, a redução da expressão da Cx43 conferiu maior susceptibilidade ao desenvolvimento de adenomas pulmonares pela uretana. Este foi o primeiro estudo in vivo mostrando a influência da deleção de um único alelo da Cx43 na carcinogênese / Gap junctions are communicating protein channels formed between adjacent cells that allow the exchange of molecules and ions smaller than 1kDa; connexins are proteins that form these junctions. Studies in the literature have been showing the lower level of cell communication capacity and alterations in the expression and/or localization of connexins in neoplasia. This study was performed to verify the influence of the deletion of one allele of Cx43 on lung carcinogenesis. Genetically manipulated heterozygous (Cx43Gap junctions are communicating protein channels formed between adjacent cells that allow the exchange of molecules and ions smaller than 1kDa; connexins are proteins that form these junctions. Studies in the literature have been showing the lower level of cell communication capacity and alterations in the expression and/or localization of connexins in neoplasia. This study was performed to verify the influence of the deletion of one allele of Cx43 on lung carcinogenesis. Genetically manipulated heterozygous (Cx43± or wild type mice (Cx43+/+) were injected with 3g/kg of at the age of 15 and 17 days and were euthanized after 25-weeks. Macroscopic and microscopic quantification of pulmonary lesions revealed that Cx43± mice presented higher multiplicity of pulmonary adenomas. These presented also a higher cell proliferation index, as evaluated by counting PCNA positive nuclei. Cxs 26, 32, 43 and 46 expressions in the pulmonary epithelium were investigated by Real-Time PCR and by immunohistochemistry. Cx43 expression was about 50% lower in Cx43± mice, in comparison to Cx43+/+ mice, as expected. In vitro studies showed that the APTII cells extracted from Cx43± mice presented a reduced communication capacity. When treated with urethane, the expression of Cx43 was increased by 100%. Other Cxs were down-regulated after the treatment with urethane, and were not observed lung areas devoid of adenomas after the treatment with urethane. Cx43 and Cx32 were not detected in Cx43± mouse adenomas. However, Cx26 and Cx46 were correlated with papillary lesions. Cx32 was cumulated in the cytoplasm of the lung epithelial cells and its expression, together Cx43, were associated with the sex, maybe contributing to the lower susceptibility of the female mice to urethane. In conclusion, the reduced expression of Cx43 determines a higher susceptibility to the development of pulmonary adenomas by urethane. This study was the first in vivo showing the influence of the deletion of one allele of Cx43± or wild type mice (Cx43+/+) were injected with 3g/kg of at the age of 15 and 17 days and were euthanized after 25-weeks. Macroscopic and microscopic quantification of pulmonary lesions revealed that Cx43± mice presented higher multiplicity of pulmonary adenomas. These presented also a higher cell proliferation index, as evaluated by counting PCNA positive nuclei. Cxs 26, 32, 43 and 46 expressions in the pulmonary epithelium were investigated by Real-Time PCR and by immunohistochemistry. Cx43 expression was about 50% lower in Cx43± mice, in comparison to Cx43+/+ mice, as expected. In vitro studies showed that the APTII cells extracted from Cx43± mice presented a reduced communication capacity. When treated with urethane, the expression of Cx43 was increased by 100%. Other Cxs were down-regulated after the treatment with urethane, and were not observed lung areas devoid of adenomas after the treatment with urethane. Cx43 and Cx32 were not detected in Cx43± mouse adenomas. However, Cx26 and Cx46 were correlated with papillary lesions. Cx32 was cumulated in the cytoplasm of the lung epithelial cells and its expression, together Cx43, were associated with the sex, maybe contributing to the lower susceptibility of the female mice to urethane. In conclusion, the reduced expression of Cx43 determines a higher susceptibility to the development of pulmonary adenomas by urethane. This study was the first in vivo showing the influence of the deletion of one allele of Cx43 in carcinogenesis

O ciclo de vida de Dictyostelium discoideum é composto de duas fases independentes. Durante o crescimento vegetativo, as amebas crescem isoladas até que a fonte de nutrientes seja esgotada. A carência nutricional induz sua entrada num processo de desenvolvimento, que inclui a parada do crescimento, a agregação das células e a formação de um organismo multicelular onde as células se diferenciam em esporos que sobrevivem as condições desfavoráveis. A proteína quinase YakA é requerida para a transição entre o crescimento e o desenvolvimento. YakA regula os níveis da PKA. Mutantes yakA- apresentam o crescimento acelerado, são deficientes no processo de agregação e são hiper-sensíveis a estresse oxidativo e nitrosoativo. Uma mutação em um segundo sítio em keaA, suprime a morte induzida por SNP (um gerador de óxido nítrico) no mutante yakA-. O papel de keaA foi determinado em resposta a estresse oxidativo, nitrosoativo e carênica nutricional. O gene keaA é necessário para o crescimento e desenvolvimento. Uma mutação em keaA confere resistência a estresse nitrosoativoloxidativo confirmando que uma mutação em keaA confere resistência a estresse. Um segundo supressor da morte induzida por SNP no mutante yakA- foi isolado pela mesma técnica de REMI e identificado como pkaC um regulador da resposta a estresse. YakA e PKA integradam a resposta a vários estresse em Dictyostelium. Os resultados indicam que a yakA regula a parada do ciclo celular em resposta a estresses através da modulação de keaA. keaA regula, por sua vez, a expressão da pkaC, um regulador chave da produção de cAMP e do processo de desenvolvimento. A interação gênica entre estes elementos é complexa e deve ser ajustada para permitir que as células sobrevivam a mudanças ambientais encontradas durante o seu ciclo de vida. / Dictyostelium discoideum\'s life cycle is composed of two phases. During the vegetative phase, amoebae grow as single cells until the nutrients are depleted. Starvation induces a developmental program where isolated amoebae adopt a multicellular mode of living and differentiate into spores to survive the harsh conditions. The protein Kinase YakA is required for the growth to development transition. YakA regulates the leveis of PKA. yakA null cells have a faster cell cycle, are aggregation deficient and are hypersensitive to nitrosoative/oxidative stress. A second-site mutation in keaA, supresses the death induced by SNP, a generator of nitric oxide. The role for keaA has been determined in response to oxidative, nitrosoative and nutrient starvation stresses. keaA is required for proper growth and development. The keaA- cells are more resistant to nitrosoative and oxidative stress confirming that a mutation in keaA confers stress resistance. A second supressor of the death induced by SNP in the mutant yakA- was isolated with REMI and identified pkaC as a regulator of the nitrosoative stress response. YakA and PKA may integrate the responses to several stresses in Dictyostelium. The results indicate that yakA regulates the cell cycle arrest in response to stress through the modulation of keaA. KeaA regulates the expression of pkaC, a key regulator of cAMP prodution and development. Genetic interactions among these elements is complex and must be finely tuned in the many environmental changes cells endure during the life cycle.