Chez la drosophile, l’activation du récepteur Toll menant à une réponse antimicrobienne peut se faire par deux voies différentes. Ces deux voies sont activées soit par des récepteurs dédiés, les Pattern Recognition Receptors (PRRs) reconnaissant des motifs moléculaires microbiens, soit par la coupure d’une molécule circulante appelée Perséphone par des protéases microbiennes extrêmement diverses sécrétées pendant une infection. Cependant, le mécanisme par lequel Perséphone est activée demeurait ambigu. Nous avons identifié une région unique dans Perséphone fonctionnant comme un appât pour les protéases exogènes indépendamment de leur origine, type ou spécificité. Une coupure dans cette région constitue la première étape d’une activation séquentielle de Perséphone ; elle permet de recruter la cathepsine circulante 26-29-p, qui va générer la forme active de Perséphone.Ces travaux montrent comment un récepteur de l’immunité innée, Perséphone, peut être activé par un signal de danger, en l’occurrence des enzymes microbiennes, et non par la détection de motifs moléculaires qui peuvent être présents dans la flore microbienne hébergée par les animaux. / In Drosophila, the antimicrobial response against infections can be triggered by two different extracellular mechanisms that both lead to the activation of the Toll receptor. These two mechanisms are activated either by the recognition of specific microbial determinants by Pattern Recognition Receptors (PRRs), or by the cleavage of the circulating serine protease Persephone by a wide range of microbial proteases secreted during infections. However, the molecular mechanism underlying Persephone activation remained ambiguous. We identified a unique region in Persephone pro-domain that functions as a bait for exogenous proteases independently of their origin, type or specificity. Cleavage of Persephone in this bait region constitutes the first step of a sequential activation and licenses the subsequent maturation of Persephone to the endogenous circulating cysteine cathepsin 26-29-p. Our data establish Persephone itself as an immune receptor able to sense a broad spectrum of microbes through the recognition of danger signals rather than molecular patterns.

Les interférons (IFN) constituent une famille de cytokines aux propriétés antiprolifératives et antivirales. Ils activent, via la voie Jak/STAT, des gènes spécifiques dont les produits sont les médiateurs des effets biologiques des IFN. C’est le cas de PML (Promyelocytic leukemia), appelée aussi TRIM19, qui joue un rôle central dans la défense antivirale. PML appartenant à la famille des protéines Tripartite Motif (TRIM), caractérisée par la présence en N-terminal d’un motif RBCC, constitué d’un domaine RING, d’une ou de deux boites B et d’un domaine coiled-coil. PML a été identifiée dans la leucémie aiguë promyélocytaire, une pathologie causée par la translocation chromosomique t(15 ;17) qui fusionne les gènes PML et RARA, aboutissant à la synthèse d'une protéine chimère PML-RARA. Le trioxyde d'arsenic (As2O3) cible la portion PML de la protéine oncogénique, entraînant sa dégradation et la rémission complète des patients. Dans les cellules saines, les transcrits PML issus d’un gène unique génèrent par épissage alternatif 7 isoformes principales de PML, dont six sont nucléaires (PMLI à PMLVI) et une cytoplasmique (PMLVIIb). Toutes possèdent la même extrémité N-terminale mais diffèrent au niveau de leur extrémité C-terminale, conférant à chaque isoforme des fonctions spécifiques.PML est l’organisatrice d’une structure multi-protéique appelée corps nucléaires (CN), impliquée dans divers processus cellulaires tels que l’apoptose, la dégradation des protéines ou encore la défense antivirale.PML est modifiée par SUMO de façon covalente au niveau de trois sites lysines (K65, K160, K490) et de façon non covalente, via son domaine SIM (pour « SUMO Interacting Motif »). Ces modifications sont requises pour la formation de CN fonctionnels et le recrutement de protéines partenaires au sein de ceux-ci. Le but de ma thèse a été d’étudier le rôle différentiel des différentes isoformes de PML en réponse à l’As2O3 et suite à l’infection virale. Nous avons montré que le SIM de PML est nécessaire à sa dégradation en réponse à l'As2O3. Ce motif est présent dans toutes les isoformes de PML, hormis l’isoforme nucléaire PMLVI et l’isoforme cytoplasmique PMLVIIb. Le SIM de PML n’est pas requis pour sa SUMOylation et son interaction avec RNF4 (une E3 ubiquitine ligase responsable de la dégradation de PML via le protéasome). En revanche, ce motif est requis pour l’ubiquitination de PML, le recrutement des composants du protéasome et sa dégradation en réponse à l’As2O3. Concernant les propriétés antivirales de PML, l’étude que nous avons menée avec toutes les isoformes de PML a permis de montrer que seules PMLIII et PMLIV confèrent une résistance au Virus de la Stomatite Vésiculaire (VSV). L’effet antiviral de PMLIII n'est observé qu'à faible multiplicité d’infection (MOI) et est indépendant de la production d’IFN. Par contre, PMLIV exerce une puissante activité anti-VSV, y compris à forte MOI et s'exerce selon deux mécanismes distincts : (i) PMLIV inhibe la réplication du VSV par un mécanisme précoce indépendant de l’IFN, (ii) PMLIV augmente tardivement la production d’IFN-β via une plus forte activation d’IRF3 qui est due à la séquestration spécifique de Pin1 au sein des CN par PMLIV. Ces deux processus nécessitent la SUMOylation de PMLIV. Ces résultats montrent que PMLIV exerce une activité antivirale intrinsèque et est impliquée dans l’immunité innée en régulant positivement la voie de transduction conduisant à la synthèse d’IFN-β. / Interferons (IFNs) are a family of cytokines with antiproliferative and antiviral properties.They activate, via the Jak/Stat pathway, specific genes whose products are the mediators of the biological effects of IFNs. This is the case of PML (Promyelocytic leukemia), also known as TRIM19, which plays a central role in antiviral defense.PML belongs to the Tripartite Motif (TRIM) protein family, characterized by the presence of an N- terminal RBCC pattern, consisting of a RING domain, one or two B-boxes and a coiled-coil domain. PML was identified in acute promyelocytic leukemia, a disease caused by the chromosomal translocation t(15 ;17), which fuses the PML and RARA genes, leading to the synthesis of a chimeric protein PML-RARA . Arsenic trioxide (As2O3) targets the PML moiety of the oncogenic protein, resulting in its degradation and in the complete remission of patients.In healthy cells, PML transcripts derived from a single gene generate seven major isoforms of PML by alternative splicing, including six nuclear (PMLI to PMLVI) and one cytoplasmic (PMLVIIb). All share the same N-terminus but differ at their C-terminus, giving each isoform specific functions.PML is the organizer of a multi-protein structure called nuclear bodies (NBs) that are involved in various cellular processes such as apoptosis, protein degradation or antiviral defense.PML is covalently modified by SUMO at three lysine residues (K65, K160, K490) but also non-covalently via its SIM domain (for « SUMO Interacting Motif »). These modifications are required for the formation of functional NBs and the recruitment of partner proteins within them.The aim of my thesis was to study the differential role of the different PML isoforms in response to As2O3 and during viral infection.We have shown that the SIM PML SIM is necessary for its degradation in response to As2O3. This motif is present in all PML isoforms, except the nuclear PMLVI and the cytoplasmic PMLVIIb isoforms. The SIM of PML is not required for its SUMOylation and its interaction with RNF4 (the E3 ubiquitin ligase responsible for PML proteasome-dependent degradation). However, this motif is required for the ubiquitination of PML, the recruitment of proteasome components and the degradation of PML in response to As2O3.Concerning the antiviral properties of PML, the study that we conducted with all PML isoforms allowed us to show that only PMLIII and PMLIV confer resistance to Vesicular Stomatitis Virus (VSV). Whereas the antiviral activity of PMLIII is only observed at low multiplicity of infection (MOI) and is independent of IFN production, PMLIV has a potent anti-VSV activity, including at high MOI, which is mediated through two distinct mechanisms: (i) PMLIV inhibits the replication of VSV by an early and IFN-independent mechanism, (ii) PMLIV later increases the production of IFN-β via a stronger activation of IRF3, which is due to the specific sequestration of Pin1 by PMLIV within NBs. Both processes require the PMLIV SUMOylation. These results show that PMLIV has an intrinsic antiviral activity and is also involved in innate immunity by positively regulating the transduction pathway leading to IFN-β synthesis.

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (VFHCC) est un Nairovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae, responsable d’une maladie hémorragique sévère chez l’Homme, associée à des symptômes non spécifiques et à une forte mortalité. La transmission se fait par morsure de tique ou par contact direct avec des fluides corporels contaminés. N’ayant ni vaccin ni traitement spécifique, un apport de connaissances sur les interactions cellulaires VFHCC-hôte ainsi que sur les mécanismes développés en réponse à l’infection est nécessaire.Nous avons tout d’abord étudié le potentiel antiviral de molécules sur la réplication du VFHCC. La chloroquine et la chlorpromazine ont été identifiées et inhibent efficacement la réplication virale avec une protection induite chez la souris contre l’infection, en particulier en combinaison avec la ribavirine.De nombreux virus sont connus pour être ciblés par, ou pour détourner la voie de l’autophagie. Nous avons regardé si l’infection par le VFHCC était associée à une modulation de l’autophagie et si la réplication virale était impactée par l’activité autophagique. L’étude de cellules hépatocytaires et épithéliales a montré une mobilisation massive du LC3, principal marqueur des vésicules autophagiques, par le VHFCC. Celle-ci reflète une induction du flux autophagique d’un nouveau type, n’impliquant pas les voies classiques de recrutement du LC3. La réplication virale n’est pas directement modulée par cette autophagie atypique mais des effets indirects sont à étudier. La plupart de ces observations ont été montrées pour le Nairovirus Dugbe avec cependant une cinétique différente.Le dernier axe étudié porte sur l’analyse de l’impact des IFITMs, facteurs de restriction virale connu pour interférer avec les processus de fusion membranaire, sur la réplication du virus Dugbe. L’étude a révélé une inhibition de la réplication virale par certains IFITMs.Des études supplémentaires portant sur l’interaction virus-cellule hôte et les mécanismes moléculaires associés sont nécessaires pour mieux comprendre la physiopathologie induite par le VFHCC et mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV) belongs to Nairovirus genus and to Bunyaviridae family. It is responsible for a severe hemorrhagic disease in humans, associated with non-specific symptoms and high lethality. Transmission is made by tick’s bite or by direct contact with contaminated body fluids. Since no vaccines or treatments are available, there is a need to accumulate knowledge on all aspects of CCHFV-host cell interaction as well as on response mechanisms that are taking place during infection.We first investigated pharmacological ways to interfere with CCHFV replication. Chloroquine and chlorpromazine (known modulators of some viral infections) were efficiently inhibiting viral replication and induce a protection in mice against CCHFV infection, particularly in the presence of ribavirin. Since several viruses are targeted by, or take advantage of, the autophagy response of infected cells, we explored whether CCHFV infection was associated with modulation of autophagy and whether virus replication was impacted by the autophagic activity of infected cells. By using hepatocytes and epithelial cells, we found that CCHFV induced a massive mobilization of the major marker of autophagic vesicles LC3. This mobilization reflected an induced autophagy flux and was of a novel type since known pathways of LC3 recruitment were not involved. The replication of CCHFV was indeed not directly modulated by this atypical form of autophagy but indirect effects remain to be studied. Most of these observations were found to be valid for the related, Dugbe virus (DUGV) with however, a distinct kinetic.Finally, we analyzed whether DUGV was sensitive to the IFITMs, restriction factors that can interfere with membrane fusion processes. Studies revealed that DUGV replication could be inhibited by some IFITMs. Additional studies on virus host-cell interactions and their associated molecular mechanisms should help to better understand the physiopathology induced by CCHFV and to devise therapeutic strategies.

La maladie de Lyme est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue de l’hémisphère Nord. La peau est un organe clef dans cette maladie, car c’est à cet endroit qu’interagissent les cellules de l’hôte, le pathogène, le microbiote cutané et le vecteur. Nous avons développé un modèle murin d’infection disséminée de borréliose de Lyme, qui nous a permis de développer une méthode spécifique de détection de protéines de Borreliella dans le tissu cutané murin par SRM-MS, pouvant aboutir à une méthode de diagnostic chez l’homme. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux relations entre le microbiote cutané, les cellules résidentes de la peau, kératinocytes et fibroblastes, avec Borreliella. Les sécrétomes de trois bactéries commensales, S. epidermidis, P. acnes et C. striatum possèdent un effet synergique sur l’expression de gènes inflammatoires par les kératinocytes et les fibroblastes. Les sécrétomes de P. acnes et de C. striatum se sont également montrés capables d’inhiber une partie de la réponse inflammatoire des kératinocytes, pouvant aider le pathogène lors de la transmission/dissémination précoce. / Lyme disease is the most common vector-borne disease in the Northern Hemisphere. Skin is a key organ in the disease, since it is the key interface where host cells, pathogen, skin microbiota and vector interact early during pathogen transmission. We developed a late lyme borreliosis model on mice. This model allowed us to develop a specific detection method of Borreliella proteins in the mouse skin by SRM-MS that might be used to develop a human diagnosis of disseminated Lyme disease. In a second part, we analysed the relationship between skin microbiota, resident skin cells (keratinocytes and fibroblasts), in the presence or absence of Borreliella. The secretome of three commensals bacteria, S. epidermidis, P. acnes and C. striatum was shown to have a synergistic activity with Borreliella in pro-inflammatory gene expressions by keratinocytes and fibroblasts. P. acnes and C. striatum secretomes were also able to inhibit partially the inflammatory response of keratinocytes that might help the transmission/dissemination of the pathogen.

Au cours de cette thèse, nous avons étudié plus particulièrement deux calréticulines de parasite et leur interaction avec la protéine C1q humaine, dans un contexte de détournement du système immunitaire. En effet, une stratégie de mimétisme moléculaire avec des cellules apoptotiques a été proposée pour l'exposition de calréticuline à la surface de la forme infectieuse du parasite Trypanosoma cruzi, agent vecteur de la maladie de Chagas. Dans le cas du parasite Entamoeba histolytica, agent vecteur de l'amibiase, l'interaction de C1q avec la calréticuline exposée à la surface de l'amibe est utilisée pour mieux phagocyter les cellules de l'hôte.La calréticuline est une protéine principalement localisée dans le réticulum endoplasmique où elle joue le rôle de protéine chaperonne en favorisant le repliement des protéines monoglucosylées. Une des fonctions extracellulaires de la calréticuline humaine est de favoriser l'élimination des cellules apoptotiques par les macrophages. Pour cela, la calréticuline est exposée à la surface des deux types cellulaires, à la surface desquelles elle est reconnue par C1q.Nous avons résolu la structure de fragments des deux CRTs de parasite. Des interactions de type chaperonne et un aperçu de la flexibilité du domaine P ont été observés dans l'empilement cristallin et approfondis par analyse de diffusion des rayons X aux petits angles. Ces fragments générés pour l'analyse structurale nous ont permis en plus d'identifier une région clé dans l'interaction des calréticulines avec C1q. Du côté de C1q, deux mutations dans les régions globulaires de C1q (GRC1q), inhibent l'interaction avec la CRT et les IgM, suggérant un site partagé. Pour approfondir la caractérisation de l'interaction, des études du complexe par RMN ont débuté et nous avons développé une première forme recombinante monocaténaire de GRC1q, dont nous avons déterminé la structure. Nos recherches peuvent aider à développer des traitements contre ces parasites, aussi bien qu'à décrypter le rôle de la CRT des mammifères présente à la surface des macrophages et des cellules apoptotiques. / During this thesis, we were interested in two parasite calreticulin and their interaction with the human C1q protein in the context of the subversion of the immune system. Indeed, a molecular mimicry strategy with human apoptotic cells is suggested for the calreticulin exposure on the surface of the infectious form of the parasite Trypanosoma cruzi, which is responsible of Chagas' disease. In the case of the parasite Entamoeba histolytica, which is involved in amoebiasis, the interaction of C1q with the surface-exposed calreticulin is used to enhance phagocytosis of host cells.Calreticulin is mainly localised in the endoplasmic reticulum, where it acts as a chaperone protein to favour the folding of monoglycosylated proteins. Moreover one of the extracellular functions of human calreticulin is to enhance the clearance of apoptotic cells by macrophages. This function is mediated through C1q interaction with calreticulin exposed on the surface of both cells.We solved the structure of fragments of both parasite calreticulins. Chaperone-like interactions and an overview of the flexibility of the P domain were observed in the crystal packing and deepened using SAXS analyses. The fragments generated for X-ray crystallography studies allowed us to identify a key region of the interaction between C1q and the calreticulins. Two C1q mutations located in its globular regions (GRC1q) inhibit the interaction with calreticulin and IgM, suggesting a common binding area. To further characterise theses interactions, we started NMR experiments and we produced the first single-chain recombinant form of GRC1q, which allowed solving its structure at high-resolution. Our investigations could provide tools to develop therapies against these parasites, and to decipher the role of mammal CRT on the surface of macrophages and apoptotic cells.

La phagocytose est un processus cellulaire par lequel de larges particules sont internalisées dans une vésicule, le phagosome. Lorsque formé, le phagosome acquiert ses propriétés fonctionnelles à travers un processus complexe de maturation nommé la biogénèse du phagolysosome. Cette voie implique une série d’interactions rapides avec les organelles de l’appareil endocytaire permettant la transformation graduelle du phagosome nouvellement formé en phagolysosome à partir duquel la dégradation protéolytique s’effectue. Chez l’amibe Dictyostelium discoideum, la phagocytose est employée pour ingérer les bactéries de son environnement afin de se nourrir alors que les organismes multicellulaires utilisent la phagocytose dans un but immunitaire, où des cellules spécialisées nommées phagocytes internalisent, tuent et dégradent les pathogènes envahissant de l’organisme et constitue la base de l’immunité innée. Chez les vertébrés à mâchoire cependant, la transformation des mécanismes moléculaires du phagosome en une organelle perfectionnée pour l’apprêtement et la présentation de peptides antigéniques place cette organelle au centre de l’immunité innée et de l’immunité acquise. Malgré le rôle crucial auquel participe cette organelle dans la réponse immunitaire, il existe peu de détails sur la composition protéique et l’organisation fonctionnelles du phagosome. Afin d’approfondir notre compréhension des divers aspects qui relient l’immunité innée et l’immunité acquise, il devient essentiel d’élargir nos connaissances sur les fonctions moléculaire qui sont recrutées au phagosome. Le profilage par protéomique à haut débit de phagosomes isolés fut extrêmement utile dans la détermination de la composition moléculaire de cette organelle. Des études provenant de notre laboratoire ont révélé les premières listes protéiques identifiées à partir de phagosomes murins sans toutefois déterminer le ou les rôle(s) de ces protéines lors du processus de la phagocytose (Brunet et al, 2003; Garin et al, 2001). Au cours de la première étude de cette thèse (Stuart et al, 2007), nous avons entrepris la caractérisation fonctionnelle du protéome entier du phagosome de la drosophile en combinant diverses techniques d’analyses à haut débit (protéomique, réseaux d’intéractions protéique et ARN interférent). En utilisant cette stratégie, nous avons identifié 617 protéines phagosomales par spectrométrie de masse à partir desquelles nous avons accru cette liste en construisant des réseaux d’interactions protéine-protéine. La contribution de chaque protéine à l’internalisation de bactéries fut ensuite testée et validée par ARN interférent à haut débit et nous a amené à identifier un nouveau régulateur de la phagocytose, le complexe de l’exocyst. En appliquant ce modèle combinatoire de biologie systémique, nous démontrons la puissance et l’efficacité de cette approche dans l’étude de processus cellulaire complexe tout en créant un cadre à partir duquel il est possible d’approfondir nos connaissances sur les différents mécanismes de la phagocytose. Lors du 2e article de cette thèse (Boulais et al, 2010), nous avons entrepris la caractérisation moléculaire des étapes évolutives ayant contribué au remodelage des propriétés fonctionnelles de la phagocytose au cours de l’évolution. Pour ce faire, nous avons isolé des phagosomes à partir de trois organismes distants (l’amibe Dictyostelium discoideum, la mouche à fruit Drosophila melanogaster et la souris Mus musculus) qui utilisent la phagocytose à des fins différentes. En appliquant une approche protéomique à grande échelle pour identifier et comparer le protéome et phosphoprotéome des phagosomes de ces trois espèces, nous avons identifié un cœur protéique commun à partir duquel les fonctions immunitaires du phagosome se seraient développées. Au cours de ce développement fonctionnel, nos données indiquent que le protéome du phagosome fut largement remodelé lors de deux périodes de duplication de gènes coïncidant avec l’émergence de l’immunité innée et acquise. De plus, notre étude a aussi caractérisée en détail l’acquisition de nouvelles protéines ainsi que le remodelage significatif du phosphoprotéome du phagosome au niveau des constituants du cœur protéique ancien de cette organelle. Nous présentons donc la première étude approfondie des changements qui ont engendré la transformation d’un compartiment phagotrophe à une organelle entièrement apte pour la présentation antigénique. / Phagocytosis is a cellular process by which large particulate material are internalized in a newly formed vesicule, the phagosome. Once formed, the phagosome acquires its functional properties through a complex maturation process called phagolysosome biogenesis. This pathway involves a series of rapid interactions with organelles of the endocytic apparatus, enabling the gradual transformation of newly formed phagosomes into phagolysosomes in which proteolytic degradation occurs. The amoeba Dictyostelium discoideum uses phagocytosis as a predation mechanism for feeding, whereas multicellular organisms utilize this process as an immune mechanism where specialized cells named phagocytes internalize, kill and degrade phatogens found through the host, forming the basis of innate immunity. In jawed verterbrates however, the phagosome links innate and adaptive immunity by processing and presenting antigenic peptides. Despite its crucial role in immunity, little is known about the composition and the functional organization of the phagosome. It is therefore essential to characterize in details the functional properties that are recruited to the phagosome. High-throughput proteomics analysis of isolated phagosomes has been tremendously helpful for the molecular comprehension of this organelle. Studies of our lab notably have revealed the first proteomics identification of mouse phagosomes without determining the roles of these proteins through the complex process of phagocytosis (Brunet et al, 2003; Garin et al, 2001). In the first study of this thesis (Stuart et al, 2007), we characterized the functions of the entire drosophila phagosome proteome by combining high-throughput proteomics, interactive networks and RNAi. By applying this strategy, we’ve identified 617 phagosomal proteins by mass spectrometry from which we’ve expanded this list by building the phagosome interactome. The contribution of each protein to bacterial internalization was tested and validated by RNAi and led to the identification of a new regulator of phagocytosis, the exocyst complex. In generating this 'systems-based model', we show the power of applying this approach to the study of complex cellular processes and organelles and expect that this detailed model of the phagosome will provide a new framework for studying host-pathogen interactions and innate immunity. In the second study of this thesis (Boulais et al, 2010), we characterized some of the key steps that contributed to the remodeling of phagosomes functional properties during evolution. To do so, we isolated this organelle from three distant organisms: the amoeba Dictyostelium discoideum, the fruit fly Drosophila melanogaster, and mouse (Mus musculus) that use phagocytosis for different purposes. By performing and comparing proteomics and phosphoproteomics analyses of isolated phagosomes from the three species, we identified an ancient core of phagosomal proteins around which the immune function of this organelle have likely organized. Our data indicate that a larger proportion of the phagosome proteome, has been acquired through gene duplication at periods coinciding with the emergence of innate and adaptive immunity. Our study also characterizes in detail the acquisition of novel proteins and the significant remodeling of the phagosome phosphoproteome that contributed to modify the core constituents of this organelle in evolution. Our work thus provides the first thorough analysis of the changes that enabled the transformation of the phagosome from a phagotrophic compartment into an organelle fully competent for antigen presentation.

Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- " alarmine " de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l'inflammation cutanée induite par Borrelia.

Les voies respiratoires sont exposées à une panoplie de pathogènes. Lors d’une infection virale respiratoire les cellules qui recouvrent ces voies participent activement à la défense immunitaire contre ces derniers en limitant la propagation du virus et en engendrant une réponse proinflammatoire. Un évènement clef dans ces processus est l’activation des facteurs de transcription, notamment le « Nuclear Factor » (NF)-κB et l’« Interferon Regulatory Factor -3 » (IRF-3), qui régulent l’expression des cytokines antivirales et proinflammatoires. Des données récentes démontrent que les dérivés actifs de l’oxygène (ROS), produits suite à une infection virale, ont la capacité de réguler les voies de signalisation enclenchées par NF-κB et IRF-3. Une source importante de ROS est la famille de NADPH oxydases (NOX), qui contient les membres NOX1-5 et DUOX1 et 2. L’objectif de notre étude était d’identifier la NOX qui régule les mécanismes antiviraux et proinflammatoires suite à l’infection avec le virus respiratoire syncytial (RSV), qui cause des complications respiratoires majeures, et le virus Sendai (SeV), un modèle viral non-pathogène. Nos travaux ont permis d’identifier que NOX2 est une molécule clef dans la réponse proinflammatoire suite à l’infection virale. Plus spécifiquement, NOX2 est important pour l’activation de NF-κB et la sécrétion des cytokines régulées par ce dernier. De plus, nous avons observé une forte augmentation de la présence de DUOX2 dans les cellules de voies respiratoires humaines infectées par SeV. Une étude plus approfondie nous a permis de caractériser qu’une synergie entre deux cytokines secrétées lors de l’infection, soit l’interféron (IFN)β et le TNFα est responsable de l’induction de DUOX2. Nous avons aussi découvert que DUOX2 confère une activité antivirale et est nécessaire pour maintenir les taux des cytokines antivirales tardives IFNβ et IFNλ. Lors d’une infection avec RSV, l’induction de DUOX2 n’est pas détectable. Nous avons mis en évidence que RSV interfère avec l’expression de DUOX2 ce qui pourrait suggérer sa pathogénicité. En conclusion, nos travaux démontrent pour la première fois une implication spécifique des NADPH oxydase NOX2 et DUOX suite aux infections virales respiratoires. / The mucosal linings of the airways are constantly exposed to an array of microbial pathogens. During the course of respiratory viral infection, Airway epithelial cells (AEC) actively participate in the innate antiviral immune response by limiting the spread of respiratory viruses and by fostering a proinflammatory environment that attracts and activates players of the immune system. A key step in the establishment of the antiviral and proinflammatory state is the activation of Transcription Factors (TFs), such as Nuclear Factor (NF)-κB and Interferon Regulatory Factor 3 (IRF-3), which regulate the expression of antiviral and proinflammatory cytokines. For the efficient functioning of these events, the signaling pathways involved underlie strict regulatory mechanisms. Recent data suggest that Reactive Oxygen Species (ROS), which are produced upon viral infection, are able to regulate these intracellular signaling pathways. One important source of ROS is the NADPH oxidase (NOX) family of enzymes, which is composed of NOX1-5 and Dual Oxidase (DUOX) 1 and DUOX2. The aim of our study was to identify the NADPH oxidase(s) that regulate(s) antiviral and proinflammatory mechanisms following infection of AEC with Respiratory syncytial virus (RSV), which causes major human lower respiratory tract complications, and Sendai virus (SeV), a non pathogenic virus. During the course of our studies we identified that NOX2 is a key molecule in the early proinflammatory response to RSV and SeV infection. We demonstrate that NOX2 is necessary for the activation of NF-κB. Consequently, NOX2 impacts on the proinflammatory cytokine secretion upon AEC infection. Further, we observed that expression of the ROS-generating NADPH oxidase DUOX2 is strongly increased following infection of AEC with SeV. We identified that DUOX2 induction requires the synergistic stimulation by IFNβ and TNFα. Importantly, DUOX2 exhibited ROS-dependent antiviral action. We identified that DUOX2 was necessary for sustaining the levels of late antiviral cytokines IFNβ and IFNλ. When AEC were infected with RSV, DUOX2 expression was barely detectable. Our data reveal that RSV has developed an evasion mechanism to counteract DUOX2 induction likely contributing to RSV pathogenicity. In conclusion, our work demonstrates for the first time the specific implication of NOX2 and DUOX2 in the antiviral and proinflammatory response to respiratory virus infection.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est la maladie auto-immune la plus fréquente d’une prévalence de 1%. Les cellules résidentes de la cavité synoviale, les fibroblast-like synoviocytes (FLS), sont des acteurs majeurs de la PR. Leur activation par des récepteurs de l’immunité innée participe à l’acquisition d’un phénotype agressif menant à la destruction ostéo-articulaire. Dans cette étude, nous avons évalué le rôle régulateur de miARN sur les voies de signalisation des Toll-like receptors (TLR). L’activation de TLR2 et de TLR4 dans les FLS induit la diminution de l’expression de plusieurs miARN, dont miR-19a et b (miR-19), alors que TLR2 est surexprimé. Nous avons pu ainsi montrer que miR-19 régule Tlr2 et que la transfection de mir-19 dans les FLS activés induit une diminution de l’expression de TLR2 et de la synthèse d’IL-6 et de MMP-3. Mir-19 appartient au cluster miR-17~92, dont l’expression est abaissée dans les FLS. Il code pour 6 miARN dont miR-20a. miR-20a est également sous-régulé après activation de TLR2 et TLR4 dans les FLS et les THP-1. Nous avons montré que miR-20a régule directement l’expression d’Ask1, impliquée et surexprimée après activation de TLR4. La transfection de miR-20a in vitro nous a permis de montrer que miR-20a contrôle l’expression d’ASK1 et induit une inhibition de la synthèse de cytokines majeures de la PR dans les FLS et les THP-1. Des résultats équivalents ont été obtenus ex vivo chez la souris. Ces travaux ont permis d’identifier dans les FLS rhumatoïdes des miARN anti-inflammatoires dont la baisse d’expression permet une augmentation de l’expression de TLR2 et d’ASK1. Ces miARN pourraient donc constituer de nouvelles cibles thérapeutiques. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most frequently autoimmune disease with a prevalence of 1%. Resident cells of joints, the fibroblast-like synoviocytes (FLS), act as key players in RA. Their activation through Pattern-recognition receptors leads to an aggressive phenotype, leading in the osteo-articular destruction of the joints. In this study, we aimed to discuss the link between Toll-like receptors (TLR) and miRNA pathway. We established the down-regulation of a few miRNA when FLS were activated through TLR2 and TLR4, including miR-19a and miR-19b (miR-19). We showed that miR-19 regulates directly Tlr2 and that transfection of miR-19 mimics leads to a decrease of IL-6 and MMP-3 synthesis in FLS. miR-19 belongs to the cluster miR-17~92, which is also down-regulated in activated FLS. This primary transcript encodes for 6 miRNA, including miR-20a, which is also down regulated upon TLR2 and TLR4 activation in FLS and further in THP-1, a monocyte cell-line. Then, we validated the predicted regulation of miR-20a on Ask1, an important kinase involved in TLR4 pathway. The transfection of miR-20a mimics in vitro represses ASK1 expression and inhibits several major cytokines in RA both in FLS and THP-1. Further, we confirmed these results on ex vivo experiments on peritoneal macrophages. These works allowed us to identify new anti-inflammatory miRNA that are downregulated and allow overexpression of TLR2 and ASK1 in RA FLS. These results open new experiments on in vivo models. All together, these data give new insights for identify new therapeutics in RA.

Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- « alarmine » de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l’inflammation cutanée induite par Borrelia. / We studied the role of the skin innate immunity during the transmission of Borrelia (the infectious agent of Lyme borreliosis) by its vector, a hard tick belonging to the genus Ixodes. We showed that tick saliva and its protein Salp15 both inhibate Borrelia-induced inflammatory reaction of keratinocytes. The antialarmin effect of tick saliva ensure a favorable environment for Borrelia. We also showed that Borrelia induce a strong inflammatory response in dermal fibroblasts. We also demonstrate a dose-dependent lytic effect of tick salivary gland extracts on dermal fibroblasts and that this cytotoxic effect was of proteinaceous nature and not related to Salp15. These results indicate that dermal fibroblasts could be considered as central mediators in immune cell recruitment to the skin site of Borrelia invasion.