A descoberta de novos alvos terapêuticos capazes de reverter o efeito tumoral imunossupressor sobre as células dendríticas (DCs) é de grande relevância clínica. Identificamos que monócitos de pacientes com leucemia linfóide crônica (LLC) têm alterações na sinalização de STAT6 induzida por IL-4 que previne a maturação fenotípico-funcional das DCs. Embora os monócitos dos pacientes apresentem alta expressão de IL-4R, a atividade de STAT6 está inibida devido aos elevados níveis de SOCS5. IL-10 reproduz esta desregulação de STAT6/SOCS5 nos monócitos de doadores saudáveis, causando diferenciação defeituosa das DCs. Isso indica que SOCS5 está envolvida nas alterações das DCs de pacientes. Ainda, encontramos que a inibição de STAT3 com pirimetamina, um composto em ensaio clínico para LLC, não afeta a maturação das DCs, diferentemente da inibição de STAT5 por JQ1. Isso mostra que STAT5 é importante para a maturação das DCs, e sugere que a JQ1, mas não a pirimetamina, pode causar imunossupressão. Já SOCS5 pode ser um novo potencial alvo para terapia do câncer. / Discovery of new targets to reverse tumor immunosuppression on dendritic cells (DCs) hold great therapeutic promise. Here, we identify that monocytes from chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients have alteration in IL-4-induced STAT6 signaling that prevents DCs phenotypic and functional maturation. Although patients monocytes display high IL-4R expression, STAT6 activity is inhibited because of elevated SOCS5 levels. IL-10-treatment of healthy donors monocytes reproduces this altered mechanism (STAT6/SOCS5) and leads to a defective DC differentiation. These findings indicate that a high SOCS5 level is involved on CLL-DCs impaired function. Moreover, we find that pharmacologic inhibition of STAT3 by pyrimethamine, a clinical trial compound for CLL, does not affect LPS-induced DCs maturation while STAT5 inhibition by JQ1 prevents it. Our findings show that STAT5 is important for DCs maturation, and suggest that JQ1, but not pyrimetamine, can cause immunosuppression. Additionally, SOCS5 emerges as a new potential target for cancer treatment.

Hepatite é uma condição inflamatória do fígado que pode ser autolimitada ou pode progredir para um quadro de fibrose, cirrose ou câncer. Uma das consequências mais graves associada ao dano hepático é a insuficiência hepática aguda (também conhecida como insuficiência hepática fulminante), cujas etiologias mais comuns são as infecções virais, a autoimunidade e o uso de medicamentos. Conhecendo as atividades biológicas das moléculas presentes na saliva dos insetos hematófagos, e com base em resultados anteriores do nosso grupo de pesquisa, acreditamos que os componentes salivares do mosquito Aedes aegypti possam ser empregados na prevenção e/ou tratamento de doenças inflamatórias. Assim, para avaliar o potencial terapêutico da saliva de A. aegypti em quadros de insuficiência hepática aguda, empregamos um modelo experimental amplamente utilizado para o estudo da hepatite autoimune, a hepatite experimental aguda induzida por concanavalina A (Con A) e um modelo de hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno (APAP), comumente empregado para o estudo da lesão hepática induzida por fármaco. Nossos resultados demonstram que a exposição de animais às picadas de mosquitos A. aegypti reduz os níveis das enzimas alanino aminotransferase (ALT) em ambos os modelos e de aspartato aminotransferase (AST) no modelo de hepatite induzida por Con A. Além disso, o tratamento com a saliva foi capaz de reduzir os níveis de citocinas séricas IFN-&gamma, IL-6 e IL-2, bem como a expressão de IFN-&gamma no fígado no modelo de hepatite experimental aguda induzida por Con A e as citocinas séricas TNF-, IL-6, IL1 e IL-10 no modelo de hepatite tóxica induzida por APAP. Os animais injetados com Con A apresentaram um aumento das frequências de populações de células NK e macrófagos e a exposição às picadas reduziu essas alterações para níveis próximos aos do grupo controle. Da mesma maneira, a exposição aos mosquitos também reduziu as populações de células dendríticas, macrófagos e células NKT, que se apresentaram aumentadas no grupo de animais injetados com APAP. Tais dados demonstram que a saliva de A. aegypti é capaz de proteger os animais dos efeitos deletérios das hepatites avaliadas, devido à sua capacidade de modular a resposta inflamatória nos animais experimentais. Estudos futuros poderão caracterizar as moléculas responsáveis por essa atividade biológica, destacando seu potencial uso como opção para prevenção e/ou tratamento destas condições. / Hepatitis is an inflammatory condition of the liver that can be self-limiting or progress to fibrosis, cirrhosis or cancer. One of the most severe consequences associated with the hepatic damage is the acute liver failure (also known as fulminant hepatic failure). being viral infections, autoimmunity and use of medications the most common etiologies. Knowing the biological activities of the compounds present in the saliva of hematophagous insects, and based on previous results from our group, we believe that the salivary components of Aedes aegypti mosquitoes can be employed in the prevention and/or treatment of inflammatory diseases. Thus, to evaluate the therapeutic potential of A. aegypti mosquito saliva in acute liver failure, we employed a well-established model for the study of autoimmune hepatitis, acute experimental hepatitis induced by concanavalin A (Con A), and a model of hepatotoxicity induced by acetaminophen (APAP) commonly employed to study drug-induced liver injury. Our results demonstrate that the exposure of animals to A. aegypti mosquito bites reduces alanine aminotransferase (ALT) enzyme levels in both models and aspartate aminotransferase (AST) in the acute experimental hepatitis induced by Con A. In addition, the treatment with saliva was able to reduce the levels of the serum cytokines IFN-&gamma, IL-6 and IL-2, as well as the expression of hepatic IFN-&gamma in the in the model of acute experimental hepatitis induced by ConA as well as the serum cytokines TNF-, IL-6, IL-1, and IL-10 in the APAP-induced toxic hepatitis model. Animals injected with Con A presented an increase in the frequencies of NK cells and macrophages populations, and the exposure to the bites reduced this changes to levels close to that found in the control group. Likewise, mosquito exposure also reduced the populations of dendritic cells, macrophages and NKT cells that were increased in the group of animals injected with APAP. These data demonstrate that A. aegypti saliva is able to protect animals from the deleterious effects of the evaluated hepatitis, due to its ability to modulate the inflammatory response of the experimental animals. Future studies might characterize the molecules responsible for this biological activity, highlighting their potential use as an option for prevention and/or treatment of these conditions.

O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), doença endêmica na América Latina. A partir do reconhecimento de componentes fúngicos, macrófagos são ativados e adquirem propriedades que favorecem a eliminação do patógeno. Essas células produzem citocinas responsáveis pelo direcionamento da resposta adaptativa, sendo que o perfil Th1 é associado a proteção. Lectinas são proteínas que se ligam seletiva e reversivelmente a açúcares. Sua interação com glicanas da superfície de células da imunidade pode resultar em ativação e produção de citocinas, o que pode culminar em imunomodulação de efeito anti-infectivo. Nosso grupo trabalha com uma lectina de P. brasiliensis, denominada de Paracoccina (PCN) que se liga a N-acetilglicosamina. Assim, no presente trabalho objetivamos a produção de paracoccina recombinante (rPCN) expressa em Pichia pastoris e análise do papel ativador da rPCN em macrófagos. Demonstramos que esse organismo transformado secreta rPCN para o meio de cultura, com baixa contaminação de proteínas endógenas, o que possibilita o isolamento da proteína recombinante através de etapa cromatográfica única. Verificamos que a preparação obtida reproduz características da proteína nativa obtida de leveduras de P. brasiliensis e tem massa molecular aparente de 27 kDa. Demonstramos que rPCN estimula macrófagos murinos a produzirem citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-) e óxido nítrico (NO). Macrófagos estimulados com rPCN polarizam-se em direção ao perfil M1, como indicado pela maior expressão relativa de mRNA para iNOS2, SOCS3 e STAT1. Verificamos que TLR2 e TLR4 medeiam a ativação de macrófagos por rPCN, uma vez que a ausência de cada um desses receptores, com destaque para TLR4, afeta a produção de mediadores inflamatórios estimulada pelo componente fúngico. TLR4 é também responsável pela polarização de macrófagos em direção ao perfil M1, pois na ausência desse receptor não se detecta mensagem para iNOS2. Concluímos que o método de produção de rPCN via P. pastoris é eficiente e que a preparação obtida ativa macrófagos, levando-os a produzirem mediadores pró-inflamatórios e se polarizarem em direção ao perfil M1. Esses processos são essencialmente mediados por TLR4. Postula-se que paracoccina seja um agonista de TLR4 capaz de desencadear respostas que, sabidamente, conferem proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / The dimorphic fungus Paracoccidioiddes brasiliensis (P. brasiliensis) is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. From the recognition of fungal components, macrophages are activated and acquire properties that favor the elimination of the pathogen. These cells produce cytokines that are responsible for directing the adaptive response, wherein Th1 immunity is protective. Lectins are proteins that bind selectively and reversibly to sugars. Their interaction with glycans in the surface of immune cell can result in activation and cytokine production, which may result in immunomodulatory anti-infective effect. Our group has been working with a lectin from P. brasiliensis called paracoccin (PCN) which binds to N-acetylglucosamine. In the present work we aimed to produce recombinant paracoccin (rPCN) expressed in Pichia pastoris and analysis of the role of rPCN in macrophages activation. We have demonstrated that this transformed organism secret rPCN to the culture medium and presents low contamination with endogenous proteins, which allows the isolation of recombinant protein by a single chromatography step. We found that the obtained preparation reproduces characteristics of the native protein from P. brasiliensis yeast and has apparent molecular mass of 27 kDa. We demonstrated that rPCN stimulates murine macrophages to produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12 p40, and TNF-) and nitric oxide (NO). Macrophages stimulated with rPCN polarize toward the M1 profile, as indicated by increased relative expression of iNOS2, SOCS3, and STAT1. We found that TLR2 and TLR4 mediate macrophage activation by rPCN, since the absence of each of these receptors, especially TLR4, affects the production of inflammatory mediators stimulated by the fungal component. TLR4 is also responsible for macrophage polarization toward the M1 profile, because in the absence of this receptor, the message to iNOS2 is not detected. We conclude that the method used to rPCN production, by P. pastoris, is efficient and that the obtained preparation is able to active macrophage, inducing them to produce pro-inflammatory mediators and polarize into the M1 profile. These processes are primarily mediated by TLR4. It is postulated that Paracoccin corresponds to a TLR4 agonist, able to trigger responses that are known to provide protection against infection with P. brasiliensis.

O resveratrol, um polifenol de origem natural, é descrito como uma substância antiinflamatória, antioxidante, cardioprotetora e anticancerígena. Diversos estudos comprovam a atividade imunomodulatória do resveratrol in vitro e in vivo, estimulando ou diminuindo a secreção de citocinas envolvidas na resposta Th1/Th2. Além do uso em vacinas como adjuvantes, a descoberta de novas substâncias imunomodulatórias pode ser aplicada na profilaxia e tratamento de doenças imunodegenerativas com perda da tolerância sistêmica ou periférica. O objetivo desse estudo é relacionar o efeito modulador do resveratrol em ensaios de endocitose em macrófagos e de secreção de citocinas IL-6(produção de IgA) e IL-10(resposta Th2 e tolerância em mucosas) com a produção de anticorpos anti-ova IgG e IgA após imunização via-oral. Os resultados obtidos demonstraram que in vitro, houve aumento da endocitose em macrófagos e diminuição na secreção de IL-6 pelas células isoladas de placas de peyer em concentrações abaixo de 50 µM de resveratrol. Após a administração oral de resveratrol de 5 mg e 10 mg/kg observou-se o aumento significativo da secreção de IL-10 em esplenócitos isolados de camundongos Balb/C. Nos grupos imunizados com 1 mg de ovalbumina/animal e resveratrol (5 mg e 10 mg/kg) via oral 2 vezes, com 14 dias de intervalos, houve aumento significativo da produção de IgG sérico em relação ao grupo imunizado somente com ovalbumina. Porém a produção de IgA sérico e em lavado intestinal diminuiu, indicando um possível aumento da tolerância oral. Esses resultados demonstram o efeito imunomodulador do resveratrol in vitro/in vivo e a necessidade de maiores estudos sobre o uso desta substãncia como adjuvante de vacinas ou uma droga imunossupressora de mucosa. / Resveratrol, a polyphenol of natural origin, is described as a substance-inflammatory, antioxidant, cardioprotective and anticancer. Several studies have demonstrated the immunomodulatory activity of resveratrol in vitro and in vivo, stimulating or decreasing the secretion of cytokines involved in Th1/Th2 response. Besides the use as adjuvants in vaccines, the discovery of new immunomodulatory substances can be applied for prophylaxis and treatment of diseases imunodegenerativas with loss of peripheral tolerance or systemic. The aim of this study is to relate the modulating effect of resveratrol on tests of endocytosis in macrophages and secretion of IL-6 (IgA production) and IL-10 (Th2 response and mucosal tolerance) with the production of anti-ova IgG and IgA after oral immunization route. The results of in vitro tests showed an increase of endocytosis in macrophages and decrease in IL-6 secretion by cells isolated from Peyer\'s patches at concentrations below 50 mM of resveratrol. After oral administration of resveratrol 10 mg / kg was observed to significantly increase the secretion of IL-10 in splenocytes isolated from Balb / C. In groups immunized with 1 mg ovalbumin / animal and resveratrol (5 mg and 10 mg / kg) orally two times with 14 days intervals, significant increase of IgG level in relation to the group immunized with ovalbumin only. But the production of IgA in serum and intestinal lavage decreased, indicating a possible increase in oral tolerance. These results demonstrate the immunomodulatory effect of resveratrol in vitro / in vivo and the need for more studies on substance use as a vaccine adjuvant or immunosuppressive drugs mucosa.

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma alteração neuromuscular hereditária e progressiva que afeta humanos do sexo masculino. O modelo canino Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) é considerado modelo experimental para estudos de novas propostas terapêuticas e melhor entendimento da fisiopatogênica da DMD. O processo progressivo da distrofia está relacionado com alterações nas populações celulares que compõe o sistema imune dos pacientes, pois devido a ausência da proteína distrofina na membrana sarcoplasmática, o músculo fica mais susceptível à lesões, ocorrendo liberação de citocinas, que recrutam e estimulam células do sistema imune, principalmente macrófagos e linfócitos T. A longo prazo, essa resposta inflamatória contínua e persistente, leva a uma série de reações que culminam com danos cada vez maiores, a ponto de ocorrer um esgotamento de células satélites e fibrose do tecido muscular. Uma das propriedades mais estudadas das células tronco mesenquimais (MSCs) é sua capacidade imunomoduladora, fazendo com que essas células se tornem promissoras na utilização da terapia celular. Neste contexto, esta ferramenta imunomoduladora pode atuar como uma estratégia interessante na manipulação do sistema imune. O estudo proposto foi elaborado com a finalidade de trazer subsídios para viabilização de experimentos de terapia celular na distrofia muscular, por meio do conhecimento sobre a imunomodulação durante o tratamento in vitro, contribuindo para uma possível aplicação terapêutica em humanos. Para tanto, foram estudados dois grupos de cães, um grupo controle (GR; n=5) e um grupo de cães afetados (GRMD; n=9), compostos por machos e fêmeas. O estudo consistiu na avalição da proliferação de linfócitos na presença de MSC em diferentes concentrações, bem como da proliferaçao de linfócitos específicos como o Tauxiliar (CD4+FoxP3-) e Tregulatórios (CD4+FoxP3+) com as MSCs. Adicionalmente, realizamos a dosagem de nitrito com o intuito de quantificar a produção de óxido nítrico (NO) através do cocultivo de macrófagos com as MSCs. Neste estudo foi possível observar que as MSCs estimularam a proliferação significativa de linfócitos T regulatórios. Adicionalmente, essa porcentagem de divisão aumentou em cocultivos que utilizaram maiores concentrações de MSC. Maior concentração de nitrito também foi encontrada no cocultivos de MSC e macrófagos estimulado com LPS. Estas informações geram incrementos no entendimento de como as MSCs podem agir no organismo distrófico e como poderemos explorar essa fonte para promover um retardamento no processo inflamatório e consequentemente melhorar a qualidade de vida do paciente. / The Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive hereditary neuromuscular disorder that affects human males. The canine model Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) is considered experimental model for studies of new therapies and better understanding of the DMD. The process of progressive dystrophy is related to changes in cell populations that comprise the immune system of patients, because due to the absence of the protein dystrophin in the sarcoplasmic membrane, the muscle is more susceptible to injury, occurring release of cytokines that recruit and stimulate cell immune, mainly macrophages and T lymphocytes in the long term, this continuous and persistent inflammatory response, the system takes a series of reactions that culminate with increasing damage to the point of exhaustion of satellite cells of muscle tissue and fibrosis occur. One of the most studied properties of mesenchymal stem cells (MSCs) is their immunomodulatory capacity, making these cells become promising in the use of cell therapy. In this context, this immunomodulatory can act as an interesting strategy in manipulating the immune system. The proposed study was designed in order to provide support for the feasibility of cell therapy trials in muscular dystrophy, through the knowledge of immunomodulation during treatment in vitro, contributing to a possible therapeutic application in humans. In this purpose, two groups were studied, a group of affected dog (GRMD, n=9) and a control group (GR, n=5 GR). The study consisted of rating of lymphocyte proliferation in the presence of MSCs in different concentrations as well as the proliferation of specific lymphocytes as Thelper (CD4+FoxP3-) and Tregulatory (CD4+FoxP3+) to MSCs. In addition, the dosage of nitrite performed in order to quantify the production of nitric oxide (NO) by coculture with macrophages MSCs. In this study we observed that MSCs stimulated significant proliferation of regulatory T lymphocytes. Additionally, this percentage split increased cocultivos that used higher concentrations of MSC. Highest concentration of nitrite was also found in cocultivos of MSC and macrophages stimulated with LPS. This information generates increments in understanding how MSCs may act in the body dystrophic and how we exploit this source to promote a delay in the inflammatory process and consequently improve the quality of life of patients

Neospora caninum (Nc) é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório, causador da neosporose, uma doença clínica indicada como uma das principais causas de aborto, morte neonatal e infertilidade em bovinos, representando um importante problema de saúde veterinária com grande impacto econômico no mundo todo. Galectina-1 (gal-1), uma proteína ligante de ?-galactosídeos, exibe diversas atividades biológicas em muitas doenças inflamatórias, mas nada foi descrito até o momento sobre a gal-1 na infecção por Nc. Este trabalho foi desenvolvido para avaliar o efeito da gal-1 (tanto endógena quanto exógena) na infecção experimental murina por N. caninum e o efeito da gal-1 exógena sobre a invasão celular de N. caninum em ensaios in vitro. Primeiramente, foram realizados ensaios para investigar a capacidade de ligação da gal-1 com taquizoítas de Nc e seu papel na invasão in vitro por Nc em diferentes modelos celulares. Nesses ensaios, gal-1 mostrou ligar-se aos taquizoítas de Nc via CRD (domínio de reconhecimento de carboidrato) de maneira dose-dependente. Tanto células VERO, quanto macrófagos e esplenócitos mostraram ser modelos eficazes para o estudo in vitro do processo de invasão e proliferação de Nc, porém, gal-1 não interfere no processo de invasão. Para os ensaios in vivo, camundongos C57BL/6 machos selvagens (WTgal-1+/+) e geneticamente deficientes de gal-1 (KOgal-1-/-) foram infectados com taquizoítas de Nc1-lacZ, por via intraperitoneal, e tratados com gal-1 exógena por 7 dias. Aos 5, 8 e 15 dias pós-infecção, foram avaliados diversos parâmetros imunológicos, como carga parasitária peritoneal e produção de óxido nítrico por células da cavidade peritoneal, perfil celular do peritônio e baço, produção de citocinas por células T, quantificação de anticorpos específicos anti-Nc e quantificação de citocinas nos sobrenadantes de cultura de células esplênicas. A ausência de galectina-1 endógena levou ao aumento da produção de óxido nítrico (NO), da população de macrófagos F4/80+ peritoneais e da secreção de IL-6. Porém, essa deficiência de gal-1 levou à redução da população de linfócitos T (CD4+ e CD8+) produtores de IFN- ?, diminuição da ativação de linfócitos B e da secreção de IFN-? e IL-10. Com relação aos camundongos WTgal-1+/+, foi destacada a contribuição da gal-1 exógena para estimular a produção de NO, promover o aumento do número de células F4/80+, induzir a secreção de IFN- ?, IL-10, IL-4 e IL-6, além de aumentar a produção de IgG e IgM. Em animais KOgal-1-/-, em contrapartida, foi observado um efeito imunorregulatório dessa galectina exógena sobre a resposta à infecção, caracterizado pelo aumento da carga parasitária peritoneal e diminuição da população de macrófagos (F4/80+) produção de NO na cavidade peritoneal. Além disso, e em conformidade com o perfil regulatório da resposta, foi possível observar a diminuição da população de linfócitos TCD8+ produtores de IFN-? e aumento das células T (CD4+ e CD8+) produtoras de IL-10 nos animais infectados e tratados, que corroborou com a secreção destas citocinas por células esplênicas. Com base nestes resultados, sugerimos que a gal-1 endógena medeia perfis imunológicos da resposta do hospedeiro, inibindo mecanismos efetores da resposta inata e estimulando a resposta adaptativa contra o parasita N. caninum e que a suplementação com gal-1 exógena gera uma imunorregulação na reposta do hospedeiro contra o parasita N. caninum. Nosso trabalho é pioneiro no estudo da interação da gal-1 na infecção com Nc e, embora seja um investigação inicial dos mecanismos imunológicos envolvidos nesse processo, sugere uma ação da gal-1 na modulação da resposta imunológica contra N. caninum. / Neospora caninum (Nc) is an apicomplexa protozoan, an obligate intracellular parasite that causes neosporosis, a clinical disease indicated as one of the main causes of abortion, neonatal death and infertility in cattle, representing an important veterinary health problem with great economic impact worldwide. Galectin-1 (gal-1), a ?-galactosidase binding protein, exhibits several biological activities in many inflammatory diseases. This work was aimed to evaluating the effect of gal-1 (both endogenous and exogenous) on N. caninum infection and the effect of exogenous gal-1 on the in vitro cellular invasion of N. caninum. Firstly, assays were developed to investigate the binding capacity of gal-1 with Nc tachyzoites and the role of this lectin in in vitro invasion process by Nc. Different cell models were used and VERO cells, macrophages and splenocytes proved to be effective models for the study of the Nc invasion and proliferation process. However, although galectin-1 has the ability to bind to Nc via CRD in a dose-dependent manner, this lectin does not interfere with the invasion process. For the in vivo assays, wild-type (WTgal-1+/+) and genetically deficient gal-1 mice (KOgal-1-/-) were intraperitoneally infected with Nc1-lacZ tachyzoites and treated with gal-1 for 7 days. At 5, 8 and 15 days post infection, various immunological parameters were evaluated, such as peritoneal parasite load and nitric oxide production by peritoneal cells, peritoneal and spleen cell profile, cytokine production by T cells, quantification of specific anti-Nc and quantification of cytokines in splenic cell culture supernatants. The absence of endogenous galectin-1 led to increased nitric oxide, peritoneal F4/80+ macrophage population and IL-6 secretion. However, gal-1 deficiency decreased the population of T cells (CD4+ and CD8+) producing IFN-?, the B lymphocyte activation and the secretion of IFN-? and IL-10. With respect to WTgal-1+/+ mice, we can highlight a contribution of exogenous gal-1 to stimulating NO production, promoting the increase of F4/80+ cells, inducing the secretion of IFN-?, IL-10, IL-4 and IL-6, in addition to increasing the production of IgG and IgM. In contrast, an immunoregulatory effect of this galectin in response to infection was observed in the KOgal-1-/- animals. It was observed an increased peritoneal parasite burden, decreased macrophage (F4/80+) population and NO production by these cells in the peritoneal cavity. In addition, in agreement with the regulatory profile of the response, it was observed a decrease of the CD8+ T cells population producing IFN-? and increased T cells (CD4+ and CD8+) producing IL-10, which corroborated with the secretion of these cytokines by the splenic cells. Based on these results, we suggest that endogenous gal-1 mediates immunological profiles of host response by inhibiting innate effector mechanisms and stimulating an adaptive response against N. caninum. Furthermore, exogenous gal-1 immunoregulate the host immune response against the parasite. Our work is a pioneer in studying the interaction of gal-1 in Nc infection and, although it is an initial investigation of the immunological mechanisms, our data suggests role of gal-1 in the modulation of the immune response against N. caninum

A endometriose é uma doença inflamatória crônica, estrógeno-dependente e de etiologia multifatorial, caracterizada pela implantação e crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina e associada à dor pélvica e infertilidade. A doença é classificada de acordo com os estádios e sítios de acometimento nos órgãos pélvicos. Variantes genéticas, endócrinas e ambientais podem contribuir para a geração de uma deficiência na resposta imune local permitindo a implantação das células ectópicas na cavidade pélvica. Alterações constatadas no padrão de citocinas presentes no microambiente pélvico poderiam promover um ambiente imunossupressor, justificando a diminuição da resposta imune efetora verificada na endometriose. Dentre os possíveis fatores imunomoduladores, está o antígeno leucocitário humano-G (HLA-G), cuja expressão se dá intensamente nas células trofoblásticas, sendo reconhecido por induzir a tolerância materno-fetal. A proteína HLA-G pode ser expressa na membrana celular ou ser secretada na forma solúvel. HLA-G encontra receptores inibitórios nas células do sistema imune inato e adaptativo e tem sua expressão induzida sob condições não fisiológicas, como em transplantes alogênicos, doenças inflamatórias ou neoplasias malignas. Assim, a hipótese deste estudo é a de que a proteína HLA-G seria produzida em níveis superiores nas mulheres com endometriose, o que poderia contribuir para a imunossupressão no microambiente da doença. Para testar esta hipótese, a proteína solúvel foi mensurada no soro e no fluido peritoneal de mulheres com e sem endometriose, por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Além disto, a expressão gênica de HLA-G foi avaliada nos tecidos de endométrio, por qRT-PCR, bem como a expressão da proteína, avaliada por imunohistoquímica, nos tecidos de endométrio e de lesão de endometriose, em mulheres com e sem a doença. Como resultados, verificaram-se maiores níveis da proteína solúvel no soro de mulheres que apresentavam endometriose em estádios avançados, especialmente naquelas com endometriose ovariana. Entretanto, na comparação entre os fluidos peritoneais, não houve diferença significativa entre os grupos com e sem endometriose. A expressão do transcrito gênico (mRNA) se mostrou maior no endométrio de mulheres sem a doença, mas a presença da proteína foi semelhante entre os endométrios de mulheres com e sem endometriose. Por outro lado, a expressão da proteína HLA-G nos tecidos de lesão de endometriose avançada se mostrou superior à do endométrio de mulheres sem a doença, indicando que a expressão de HLA-G seria induzida ectopicamente, no microambiente pélvico da doença. Portanto, os resultados apontam para um aumento da expressão de HLA-G em endometriose avançada / Endometriosis is a chronic inflammatory, estrogen-dependent disease of multifactorial etiology characterized by implantation and growth of endometrial tissue outside the uterine cavity, and associated with pelvic pain and infertility. Endometriosis is classified according to the stages and sites of the disease. Genetic, endocrine and environmental factors may contribute to the deficit on local immune response, allowing ectopic implantation of endometrial cells into the pelvic cavity. Changes in cytokines pattern in the pelvic microenvironment might promote an immune suppressor environment and explain the decreased immune effector cells response verified in endometriosis. Among possible immunomodulatory factors is the human leucocytary antigen-G (HLA-G) which is intensively expressed in trophoblasts and recognized by inducing maternal-fetal tolerance. HLA-G protein is expressed in both membrane-bound and soluble forms. HLA-G binds inhibitory receptors on innate and adaptive immune cells surface and its expression is induced in non-physiological conditions, such as allogeneic transplants, inflammatory diseases or neoplastic malignancies. Thus, this study hypothesizes that the HLA-G protein would be overexpressed in women with endometriosis, and could contribute to the immunosuppression in the disease microenvironment. To test this hypothesis soluble HLA-G protein was measured in serum and peritoneal fluid of women with and without endometriosis. Moreover, HLA-G gene expression were evaluated on endometrial tissue using RT-qPCR, and HLA-G protein expression were evaluated in matched ectopic and eutopic endometrium of women with and without endometriosis. As results, higher levels of soluble HLA-G were found in serum of women with advanced endometriosis, especially in those with ovarian endometriosis. However, soluble HLA-G levels in peritoneal fluid did not show significant differences between women with and without endometriosis. HLA-G mRNA expression were higher in eutopic endometrium of women without endometriosis, but the HLA-G protein expression were similar in eutopic endometrium of women with and without endometriosis. On the other hand, HLA-G protein expression in ectopic endometrium of women with advanced endometriosis was higher than in eutopic endometrium of women without endometriosis, suggesting that HLA-G expression was induced ectopically, in the pelvic microenvironment of the disease. In conclusion, the results point to an upregulation of HLA-G expression in advanced endometriosis

Orientador: Alexandrina Sartori / Resumo: A rapamicina, também conhecida como sirolimus, é um imunossupressor isolado da bactéria Streptomyces hygroscopicus. Este fármaco tem sido empregado clínicamente para o controle de rejeição de transplantes de órgãos sólidos, diabetes, esclerose tuberosa, doenças neurode-generativas e inclusive, no controle da esclerose múltipla (EM). O entendimento do mecanis-mo de ação da rapamicina requer o conhecimento da via de sinalização intracelular envolvendo os complexos mTOR (mammalian target of rapamycin). Evidências indicam que o mTOR está envolvido na ativação pró-inflamatória de leucócitos. Nesse contexto, o objetivo geral desta dissertação foi investigar o efeito in vitro da rapamicina em células envolvidas na imu-nopatogênese da encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo murino de EM. Células do sisterma nervoso central (SNC) e do baço de camundongos com EAE foram trata-das com rapamicina e simultaneamente estimuladas com glicoproteína da mielina de oligo-dendrócitos. A rapamicina reduziu a produção de IL-17 em culturas de células do SNC e do baço. Adicionalmente, diminuiu a produção de IFN-γ, TNF-α e IL-10 e a expressão gênica de RORc em culturas de células do SNC. A microglia, que é uma célula fagocítica residente no SNC e envolvida na neuroinflamação, também foi testada. Em células da microglia (linhagem BV-2) estimuladas com LPS, a rapamicina diminuiu a produção de TNF-α e IL-6 e também reduziu a mediana da intensidade da fluorescência referente às moléculas MH... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rapamycin, also known as sirolimus, is an immunosuppressant produced by the bacterium Streptomyces hygroscopicus. Rapamycin has been clinically used for the control of rejection of solid organ transplants, diabetes, tuberous sclerosis, neurodegenerative diseases, including multiple sclerosis (MS). To better understand the mechanism of action of rapamycin, is necessary the knowledge of intracellular signaling of the mTOR (mammalian target of rapamycin) complex. Evidence indicates that mTOR is involved in the proinflammatory activation of leukocytes. In this scenario, the main objective of this investigation was to evaluate the in vitro effect of rapamycin in cells derived from mice with experimental autoimmune encephalomielits (EAE) and in a microglia cell line. CNS and spleen cells from EAE mice were treated with rapamycin and simultaneosly stimulated with a myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide. Rapamycin reduced IL-17 production in both, CNS and spleen cell cultures. Additionally, rapamycin decreased IFN-γ, TNF-α and IL-10 production and RORc mRNA expression in CNS cell cultures. Microglia, that is a phagocytic immune cell in the CNS involved in neuroinflammation, was also tested. Microglia (BV-2 lineage) treated simultaneously with rapamycin and LPS showed a decreased production of TNF-α and IL-6 and also reduced expression of MHC II, CD40 and CD86. This downmodulatory effect was associated to upregulated TREM2 mRNA and downregulated iNOS mRNA expression. These resul... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) reste à l’heure actuelle la seule thérapie curative de nombreuses hémopathies malignes. Les lymphocytes T (LT) du donneur constituent une immunothérapie contre les cellules de la leucémie (ou lymphome) appelé effet « GVL » pour « Graft versus Leukemia ». Malheureusement cet effet est intimement lié à la maladie du greffon contre l’hôte appelée « GVH » pour « Graft versus Host » (destruction des cellules saines du receveur par les LT du donneur). L’allogreffe de CSH est de plus en plus souvent réalisées avec des greffons mobilisés par du G-CSF. Quelques publications identifient des cellules immunosuppressives avec un phénotype peu précis CD11b+ Gr1+ induites par le G-CSF pouvant regrouper plusieurs sous-types cellulaires et sans trouver de contre-partie humaine ou avec un mécanisme d’action peu clair. Nous avons démontré que le G-CSF mobilise chez l’homme, dans la fraction CD34+ du greffon, une population monocytaire. Lorsqu’elle représente plus de 12% des CD34+, les receveurs ont une incidence moindre de la GVH aiguë. Cette même population est phénotypiquement et fonctionnellement conservée chez la souris. En réponse à l’IFN-γ relargué par les LT allogéniques, elle produit de l’Oxyde Nitrique capable d’induire l’apoptose de ces LT in vitro. In vivo, nous avons pu décortiquer (chez la souris uniquement) les mécanismes de régulation de la GVH aiguë. Les LT apoptotiques phagocytés par les macrophages capables alors de devenir tolérogènes en produisant du TGF-β et ainsi d’induire des LT régulateurs. Dans le modèle murin d’allogreffe de CSH, le transfert adoptif de cette population purifiée protège le receveur de la GVH aiguë. Nous pensons que si cette population peut être cultivée et expandue ex vivo, elle pourrait être une thérapie cellulaire préventive contre la GVH. / Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Allo-HSCT) is the most effective immunotherapy for acute leukemia, due to the development of graft-versus-leukemia (GVL) effect mediated by alloreactive donor T cells. However, donor T cells specific for recipient alloantigens are also responsible for graft-versus-host disease (GVHD), a life-threatening complication that frequently occurs after allo-HSCT. The administration of Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is routinely performed to collect Peripheral Blood Stem Cells (PBSC) from healthy donors for allo-HSCT. Few studies identified that G-CSF can induce myeloid suppressive cells in mice (CD11b+ Gr1+) with no human counterpart. We demonstrated in our study that G-CSF can induce a new population named CD34+Monocyte. The cumulative incidence of acute grade II to IV GVHD following allo-HSCT was lower in patients receiving grafts containing CD34+ monocyte frequencies above 12% of the CD34+ population. In mice, we demonstrated that G-CSF mobilized a highly conserved CD34+ monocyte population. CD34+Monocytes require T cell-mediated IFN-γ to produce Nitric Oxide that inhibits T cell activation and proliferation. In vivo, we report that CD34+ monocyte-derived NO regulates the alloreactive response by inducing T cell apoptosis and subsequently, the induction of regulatory T cells. In fact, uptake of apoptotic T cells by macrophages triggers them to produce high levels of TGF-β that drives the expansion of Tregs and induces immune tolerance. Such tolerogenic monocytes could represent a good candidate for the development of novel immunoregulatory and therapeutic cellular therapies.

A membrana amniótica é uma das membranas fetais presentes no período gestacional e que é considerada uma ferramenta potencial no tratamento de diversas patologias, como na cicatrização de feridas de pele e córnea, hérnias, cirurgias reconstrutivas e prevenção de aderências. As células-tronco (CT) obtidas de membrana amniótica apresentam alta taxa de proliferação e plasticidade, além de propriedades imunomoduladoras que participam no processo de tolerância materno-fetal. Devido à dificuldade e a escassez de estudos envolvendo a membrana amniótica humana em diferentes estágios gestacionais, optamos pela escolha do modelo canino, pois pode ser considerado um modelo ideal devido às semelhanças genéticas e fisiológicas com humanos. Baseado no potencial das CT de membrana amniótica, os objetivos deste trabalho foram caracterizar as CT de membrana amniótica canina (MAC) em diferentes estágios gestacionais e avaliar a expressão de genes relacionados à imunomodulação. Para tanto, foram utilizados 20 fetos caninos, sem raça definida com três idades gestacionais, terço inicial (20-30 dias) (n=7), terço médio (31-45 dias) (n=7) e terço-final (46-63 dias) (n=6), oriundos de programas de castrações. As células das MAC foram caracterizadas por meio de testes de viabilidade celular, curva de crescimento, unidade formadora de colônia (UFC-F), diferenciação in vitro, imunofenotipagem celular e potencial pluripotente. Para avaliação dos aspectos imunomoduladores, as células foram submetidas a RT-qPCR, com intuito de determinar a expressão gênica de IDO, HGF, EGF, PGE2, IL-6 e IL10. Como resultados, as células de MAC apresentaram morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico com viabilidade celular de 83,3% em terço inicial, 80,1% em terço médio e 75,22% em terço final. Na análise da curva de crescimento, as células apresentaram pico de crescimento em segunda passagem, com posterior queda e uma tendência estacionária. Na UFC-F, obtivemos uma média de 145 colônias em terço inicial, 142,3 colônias em terço médio e 127,3 colônias em terço final. Na diferenciação in vitro, as células se diferenciaram em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas após 21 dias de cultivo celular. Na imunofenotipagem celular, as células de terço inicial obtiveram marcação de CD90 (31,7%), CD105 (5,6%), CD34 (0,3%) e CD45 (0,4%), terço médio de CD90 (36,7%), CD105 (6,3%), CD34 (0,2%0 e CD45 (0,4%), terço final CD90 (67,1%), CD105 (96,4%), CD34 (4,4%) e CD45 (2,0). Na avaliação imunomoduladora, observamos a expressão qualitativa dos genes IDO, HGF, EGF, PGE2 e a não expressão dos genes IL-6 e IL-10. Na expressão quantitativa, houve somente a expressão do gene IDO, com maior expressão em terço médio e final. Neste contexto, concluímos que as células de MAC de diferentes estágios gestacionais apresentam características compatíveis com CT mesenquimais e que a idade gestacional de terço final apresentou melhores resultados. / The amniotic membrane is one of the fetal membranes present during gestation and it is considered a potential tool to treat many pathologies. Stem cells (SC) from the amniotic membrane present a high proliferation and plasticity ratio, in addition to immunomodulatory properties that participate in the mother-fetus tolerance process. Due to high difficulty and lack of research involving human amniotic membrane at different gestational stages we chose to use a canine model, as it can be considered an ideal model due to genetic and physiological similarities to humans. Based on the potential properties of the amniotic membrane SC, the purpose of this research was to characterize the SC from the canine amniotic membrane (CAM) in different gestational stages and determine its immunomodulatory potential in vitro. To do so, we studied 20 canine fetuses with no established race in the first third of gestational stage (20-30 days) (n-7), second third (31-45 days) (n=7) and final third (46-63 days) (n=6), from local castration programs. CAM cells were characterized through cellular viability tests, growth curve, colony-forming unit (CFU), in vitro differentiation and cellular immunophenotyping. To assess the immunomodulatory aspects the cells were submitted to RT-qPCR to determine genic expressions from IDO, HGF, EGF, PGE2, IL-6 and IL-10. As a result, CAM cells presented fibroblastoid morphology, adherence to plastic and cell viability of 83,3% in the first third, 80,1% in the second third and 75,22% in the final third of the gestational stage. In the growth curve analysis, the cells presented a higher growth in the second passage, with subsequent drop and stationary tendency. In the CFU we obtained an average of 145 colonies in the first third, 142,3 in the second third and 127,3 colonies in the final third of the gestational stage. In in vitro differentiation the cells differentiated in adipogenic, osteogenic and chondrogenic strains after 21 days of cellular culture. In cellular immunophenotyping, the cells from the first gestational stage expressed the following markers: CD90 (31,7%), CD105 (5,6%), CD45 (0,4%) and CD34 (0,3%); cells from the second gestational stage expressed CD90 (36,7%), CD 105 (6,3%) CD45 (0,4%) and CD34 (0,2%) and lastly cells from the final gestational stage expressed CD105 (96,4%), CD90 (67,1%), CD34 (4,4%) and CD45 (2,0%). In the immunomodulator evaluation we observed qualitative expression of genes IDO, HGF, EGF, PGE2 and no expression of genes IL-6 and IL-10. In the quantitative expression, we only found IDO gene expressed, with higher expression in the second and final thirds. In this context we can conclude that MAC cells from different gestational stages present characteristics consistent with mesenchymal SC and that the final gestational stage presented better results. We also concluded that gestational age is a key factor that can influence the functional and immunomodulatory properties of cells in cell therapy.