Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética / A large number of patients with growth disorders do not have the cause of their clinical phenotype established, including about 50% of patients with Silver-Russell syndrome (SRS), and 10-20% of patients with Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS). The aim of this study was to investigate the (epi)genetic causes of growth disorders of unknown etiology, in a contribution to the understanding of growth regulation. The study included: (1) the investigation of submicroscopic chromosomal imbalances, by aCGH, (2) the analysis of the allele-specific expression profile of imprinted genes (IG), by pyrosequencing (PSQ) or Sanger sequencing, in patients with growth restriction; (3) the investigation of global methylation pattern in patients with growth restriction, using methylation microarray. The cohort consisted of 41 unrelated patients with growth disorders: (1) 25, with the diagnostic hypothesis of SRS; (2) six, with intrauterine growth restriction and birth weight below the 10th centile, associated with other clinical signs; (3) seven, with the diagnostic hypothesis of BWS; and (4) three, with prenatal or postnatal macrosomia, associated with other clinical signs. Chromosomal microdeletions and microduplications were investigated in 40 patients. Fifty-eight rare variants were detected in 30/40 patients (75%): 40 were considered likely benign (18 patients, 45%), 12, of unknown pathogenic significance (11 patients, 27.5%), two, likely pathogenic (one patient, 2.5%), and four, pathogenic (three patients, 7.5%). These frequencies are similar to those described in studies investigating CNVs in groups of patients with growth disorders and other congenital abnormalities, including SRS, and show the importance of investigating chromosomal microimbalances in these patients. The diversity of CNVs identified can be attributed to the clinical heterogeneity of these cohorts. In this study, many of the patients, with the diagnostic hypothesis of SRS or BWS, had atypical clinical signs, thus explaining the absence of specific SRS/BWS (epi)genetic mutations. The identification of CNVs, known to be causative of other syndromes, reflected the overlapping of some of their clinical features with those of SRS and BWS. The analysis of IG allele-specific expression profile was performed in a subgroup of 18 patients with growth restriction. Thirty IGs were initially selected, based on their association with cell proliferation, fetal growth or neurodevelopment. Transcribed SNPs with high frequency in the general population were selected for the genotyping of patients, parents and control subjects, determination of IG expression in peripheral blood, and of the monoallelic or biallelic expression pattern. The allele-specific expression of 13 IGs expressed in blood was then investigated in patients (seven of them by PSQ and six by Sanger sequencing). Expression alterations of two normally paternally expressed genes were detected in 4/18 patients (22%). This study is the first to use pyrosequencing and Sanger sequencing in the evaluation of IG allele-specific expression profile, in patients with growth restriction. Despite the limitations, both techniques have proved to be robust, and revealed interesting alterations in allelic expression; however, the causal relationship of these alterations with the clinical phenotypes remained unclear. The investigation of the global DNA methylation was performed in a subgroup of 21 patients with growth restriction, and in 24 control subjects. Two types of analysis were performed: (1) group differential analysis, and (2) individual differential analysis. In the first analysis, the methylation pattern obtained for the group of patients with the diagnostic hypothesis of SRS (n=16) was compared to that of the control group (n=24); no bias towards DNA hypo or hypermethylation was detected in the SRS group. In the second analysis, the methylation patterns of each of the 21 patients with growth restriction, and each of the 24 control subjects were compared to the methylation pattern of the control group. The average numbers of hypermethylated CpGs and of differentially methylated segments (DMSs) were significantly higher in the patients. In total, 82 hypermethylated DMSs - 57 associated with gene(s) (69.5%), in 16 patients, and 51 hypomethylated DMSs - 41 associated with gene(s) (80.4%), in 10 patients, were identified. Gene ontology analysis of the 61 DMS-associated genes highlighted genes involved in development and morphogenesis of the skeletal system and fetal organs, and also in the regulation of gene transcription and metabolic processes. Methylation changes in genes involved with cellular proliferation and differentiation, and growth were identified in 9/20 patients (45%), suggesting clinical implications; an epigenetic mutation common to SRS patients was not detected, likely due to the clinical heterogeneity of the cohort. The data generated by this global methylation analysis, using microarray, might contribute to the understanding of molecular mechanisms in growth restriction. In an apparently balanced translocation -t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detected in a patient with the diagnostic hypothesis of SRS, a gene found to be disrupted by the chromosome 6 breakpoint might explain the phenotype; alternatively, the translocation might have impacted the regulation of developmental genes in the vicinity of breakpoints. Expression analysis showed a significant decrease in the disrupted gene cDNA levels in the patient\'s blood cells, as expected. In addition to the SRS typical signs, the patient presented clinical features suggestive of cleidocranial dysplasia. Thus, the translocation t(5;6) might have altered the interaction of developmental genes and regulatory elements, leading to misregulation of spatiotemporal gene expression, thus resulting in an atypical phenotype, with overlapping features of more than one genetic syndrome

O objetivo do experimento I foi avaliar a interação entre dois ganhos médios diários [GMD - fator nutricional (ganho elevado GA = 0,700 e ganho baixo GB = 0,300 Kg/dia)] e a diferença esperada da progênie (DEP para idade ao primeiro parto - fator genético) na puberdade de novilhas Nelore. Foram utilizadas 58 novilhas desmamadas com 8 meses de idade, filhas de 4 touros [2 precoces (P) e 2 tardios (T)], formando um esquema fatorial 2 x 2, no qual o fator 1 foi o GMD e o fator 2 foi a DEP do touro, constituindo assim quatro tratamentos: Touro precoce com GMD elevado (PGA), touro precoce com GMD baixo (PGB), touro tardio com GMD elevado (TGA), touro tardio com GMD baixo (TGB). Houve efeito dos tratamentos na porcentagem de novilhas púberes durante o experimento (PGA e PGB = 100%; TGA = 83% até 27 meses de idade; TGB = 38% até 3 anos de idade). As novilhas do PGA apresentaram a menor (P = 0,0001) idade na puberdade (18 ± 1 meses). Contudo, a nutrição atrasou a puberdade em cerca de 10 meses nas novilhas filhas de touros precoces e tardios (PGA = 18 ± 1 vs. PGB = 29 ± 1 meses; TGA = 24 ± 1 vs. TGB = 34 ± 1 meses). Assim podemos concluir que a DEP para IPP foi o fator necessário para o adiantamento da idade a puberdade. No entanto, o GMD foi um fator limitante para o aparecimento da puberdade. O objetivo do experimento II foi avaliar o efeito do imprinting metabólico dos 3 aos 7 meses de idade na puberdade em novilhas cruzadas (Angus x Nelore). Os tratamentos foram arranjados em esquema fatorial 2 x 2, no qual o fator 1 foi GMD elevado e médio dos 3 aos 7 meses de idade (fase 1) e o fator 2 foi GMD elevado e médio dos 7 meses de idade até a puberdade (fase 2). Formando os seguintes tratamentos: CAA Novilhas cruzadas submetidas ao GMD elevado nas fases 1 e 2; CAM - GMD elevado na fase 1 e GMD médio na fase 2; CMA- GMD médio na fase1 e GMD elevado na fase 2; CMM GMD médio nas fases 1 e 2. O GMD médio foi atingido pela restrição do consumo de matéria seca (CMS) no GMD médio. As novilhas dos tratamentos CAA, CAM e CMA apresentaram puberdade na mesma idade (cerca de 12 meses). As novilhas cruzadas submetidas ao GMD elevado na fase 2 foram mais pesadas (P = 0,0379) na puberdade do que novilhas submetidas ao baixo GMD. O GMD elevado dos 3 aos 7 meses de idade não impactou na puberdade das novilhas cruzadas. O objetivo e a metodologia do experimento III foram semelhantes ao experimento II, no entanto foram utilizadas novilhas Nelore (N) ao invés de cruzadas e o experimento terminou aos 19 meses de idade. O tratamento NAA (84%) induziu maior (P = 0,0145) proporção de novilhas púberes do que o NMM (23%), mas não houve diferença na taxa de puberdade entre os tratamentos NAM (60%) e NMA (50%). Além disso, o comportamento das curvas de puberdade dos tratamentos NAM e NMA foram semelhantes, sendo assim não houve efeito de imprinting metabólico nas novilhas Nelore. O GMD elevado dos 3 aos 19 meses idade aumentou a porcentagem de novilhas Nelore púberes aos 19 meses de idade / The objective of experiment I was to evaluate the interaction between two average daily gain (ADG nutritional factor (high gain HG = 0,700 and low gain LG = 0,300 kg/day)] and expected progeny differences (EPD to age at first calving; genetic factor) on puberty attainment of Nellore heifers. Fifth eight heifers weaned at 8 months of age and daughters of 4 sires [2 precocious (P) and 2 later (L)]. A factorial design 2 x 2 was used, where the factor 1 was the ADG and the factor 2 was the EPD of sire, resulting in four treatments: Precocious sire with HG (PHG), precocious sire with LG (PLG), later sire with HG (LHG) and later sire with LG (LLG). There was effect of treatment in the percentage of pubertal heifers (PHG and PLG = 100%; LHG = 83% until 27 month of age; LLG = 38% until 3 years old). Heifers from the PHG treatment were the youngest (P = 0,0001) (18 months of age). However, the nutritional factor delayed puberty achievement by approximately 10 months the age at puberty in precocious and later heifers (PHG = 18 ± 1 vs. PLG = 29 ± 1 months; LHG = 24 ± 1 vs. LLG = 34 ± 1 months of age). The EPD to age at first calving was the main factor affecting the age at puberty. However, the ADG was limiting to puberty onset. The objective of experiment II was to evaluate the effect of metabolic imprinting from 3 to 7 months of age on puberty attainment of crossbreed heifers (Angus x Nellore). The treatments were arranged in 2 x 2 factorial design, where the factor 1 was high (H) and medium (M) ADG from 3 to 7 months of age (phase 1) and the factor 2 was high and medium ADG from 7 months of age to puberty onset (phase 2), resulting in the following treatments: CHH crossbreed heifers submitted to high ADG in both phases of experiment; CHM high ADG in phase 1 and medium ADG in phase 2; CMH medium ADG in phase 1 and high ADG in phase 2; CMM Medium ADG in both phases. The medium ADG were targeted by restricting of dry mater intake (DMI) in medium ADG. Crossbreed heifers of treatments CHH, CHM, CMH showed the same age at puberty, about 12 months. Heifers submitted to high ADG on phase 2 were heavier (P = 0,0379) at puberty than heifers submitted to low ADG. The high ADG from 3 to 7 months did not affect puberty onset in crossbreed heifers. The objective and methodology used in experiment III was the same of used in experiment II. However, Nellore heifers (N) were used instead of crossbreed heifers and the experimental period ended at 19 months of age. The NHH treatment (84%) induced higher (P = 0,0145) percentage of pubertal heifers than NMM (23%), but there was not difference in puberty rate between NHM (60%) and NMH (50%) treatments. Furthermore, the comportment of curves of puberty of treatments NHM and NMH were similar, thus there was not effect of metabolic imprinting in Nellore heifers. The high ADG from 3 to 19 months of age increased the percentage of pubertal Nellore heifers at 19 months of age

A epigenética aborda o controle da expressão gênica através de diversos fatores que agem sob a cromatina, os melhor estudados são a metilação do DNA e a acetilação em histonas, relacionadas à repressão e ativação gênica, respectivamente. Em mamíferos, existem dois fenômenos epigenéticos interessantes: a inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas, que garante o equilíbrio transcricional gênico entre os sexos, e o imprinting genômico, caracterizado pela expressão monoalélica dependente da origem parental. No presente estudo, propusemos verificar a manutenção do controle epigenético em células humanas normais e transformadas em condições semelhantes de hipometilação do DNA e hiperacetilação em histonas (após uso das drogas 5-aza-2-\'deoxicitidina (5-aza-dC) e ácido valproico, respectivamente), através do monitoramento da expressão alelo-específica pelo uso de polimorfismos de única base presentes em regiões codificadoras. Em células normais houve manutenção da ICX e do imprinting genômico, enquanto que em células transformadas hipometiladas foram observadas indução de XIST, e perda de imprinting dos genes IGF2, H19 e PEG10. Observamos que ambas as drogas podem diminuir a expressão de DNMT1, e 5-aza-dC altera o equilíbrio entre acetilação e desacetilação da histona H4. Ainda, a ordem de adição dos reagentes ocasionou diferenças no nível de acetilação da histona H4 e na expressão gênica de XIST e PEG10. Nossos dados sugerem que: células humanas normais apresentam maior estabilidade do controle epigenético comparadas às células humanas transformadas, genes submetidos à ICX e \"imprintados\" não apresentam diferenças na rigidez do controle de expressão, e a cascata de reação seguida após perturbação de marcas epigenéticas pode ser alterada dependendo da modificação inicial. / Epigenetics refers to mechanisms related to gene activity through conformational modifications in DNA without changes in the nucleotide sequence. Key players in the epigenetic control are DNA methylation and histone acetylation, which are related to gene activation and repression, respectively. Two striking epigenetic phenomena in mammalians are X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting. XCI triggers the transcriptional silencing of all but one X chromosome in each female cell, while genomic imprinting is a process that leads to mono-allelic gene expression based on parental origin. In the present study, we intended to verify the maintenance of epigenetic control in normal and transformed human cells under the same conditions of epigenetic disturbance. For this purpose, 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-aza-dC) and valproic acid (VPA) were used to cause DNA hypomethylation and histone hyperacetylation, respectively. By monitoring allelic-specific expression using single nucleotide polymorphisms present in coding regions, we were able to check the effects of the modifications in the expression pattern of imprinted or subjected to XCI genes. While in female normal cells XCI and genomic imprinting were not affected by VPA or 5-aza-dC treatments, transformed male cells showed XIST activation and loss of imprinting of PEG10, IGF2 and H19 genes in the hypomethylation scenario. In addition, both drugs can decrease the expression of DNMT1, and 5-aza-dC alters the balance between acetylation and deacethylation of histone H4. Furthermore, we could see different degrees of histone H4 acetylation levels and of XIST and PEG10 expression, depending on which of the drugs was added first. Our data suggest that the epigenetic control in normal human cells is more stable when compared to transformed human cells. In addition, both XCI and genomic imprinting are epigenetic features equally hard to disturb. Finally, depending on the initial epigenetic modification (global demethylation or acethylation), it will induce different epigenetic control networks, with consequence to the final status of gene expression.

Eventos epigenéticos como o imprinting genômico e a inativação do cromossomo X (ICX), já foram amplamente estudados em camundongos. Nesses animais muitos dos processos epigenéticos que levam à ICX já estão profundamente esclarecidos. Em humanos entretanto, o conhecimento sobre a ICX é mais limitado, em particular os eventos iniciais do processo durante o desenvolvimento embrionário. O desenvolvimento e aprimoramento de ensaios que envolvem o sequenciamento em larga escala do transcriptoma (RNA-Seq) de células únicas iniciam uma nova era nos estudos sobre a ICX. São crescentes os dados de RNA-Seq depositados em bancos de dados públicos e em 2013 os trabalhos de Xue e colaboradores e de Yan e colaboradores tornaram disponíveis os resultados de RNA-Seq de células individuais isoladas de embriões humanos a partir do estágio de duas células até a fase de blastocisto. Através de técnicas de bioinformática avaliamos o nível de expressão do gene XIST, intimamente envolvido no processo de ICX, nos diferentes estágios do desenvolvimento. Alinhamos também as leituras geradas por RNA-Seq contra o genoma humano de referência no intuito de se identificar variantes em regiões transcritas e assim verificar a origem do alelo expresso. Com isso, pudemos observar que o gene XIST tem sua expressão iniciada em embriões humanos no estágio de oito células, e que o silenciamento transcricional dos genes do cromossomo X já se iniciou no estágio de blastocisto de forma aleatória mas ainda não se disseminou, i.e. a ICX não está completa. Devido ao fenômeno de ICX, a caracterização de genes \"imprintados\" neste cromossomo é desafiadora. Ainda assim em camundongos foram relatados alguns genes do X que são assim regulados. Mulheres portadoras da síndrome de Turner (45,X) apresentam diferenças fenotípicas dependentes da origem parental do cromossomo X herdado, sugerindo a existência de genes \"imprintados\" no X humano. Em particular os genes MAOA, MAOB e USP9X foram indicados como candidatos a serem regulados por imprinting. Através do sequenciamento de regiões transcritas contendo SNPs em heterozigose foram avaliados o padrão de expressão alelo-específico dos três genes indicados. Nenhum sinal de regulação por imprinting pôde ser detectado nem em placenta nem em cérebro humano, pois a procedência dos alelos expressos era independente da origem parental. Isso não significa que a variabilidade fenotípica em mulheres com Turner não possa ser explicada por imprinting em genes do X. Experimentos de RNA-Seq em diversos tecidos humanos ou a partir de células únicas são uma abordagem conveniente para se elucidar este fenômeno / Epigenetic phenomena as genomic imprinting and X chromosome inactivation (XCI) have been widely studied in mice. While most of the processes and steps involved in XCI in mice are well studied, in humans our knowledge is still very limited, specially during early embryo development. Advances in single-cell whole transcriptome high troughput sequencing techniques (RNA-Seq) bring a new era to the XCI field. Single-cell RNA-Seq results of from 2-cell to the blastocyst stage of human embryos were published by Xue et cols and Yan et cols in 2013. Using bioinformatics techniques we searched for the XIST gene expression level (a gene closely involved in XCI) throughout the human pre-implantation embryo development. We aligned reads generated by RNA-Seq assays to the human reference genome looking for variants in gene transcriptional regions and to identify the origin of the expressed allele. Our results show that XIST expression starts from the 8-cell stage and is stabilized and upregulated at the female blastocyst stage. We also show that the transcriptional silence of X-linked genes started at the blastocyst stage and is independent of parental origin but this does not apply for all genes. We concluded that the completion of the transcriptional silence step is probably established during post-implantation stage. The search for X-linked imprinted genes is challenging due to the XCI phenomenon. Nevertheless, X-imprinted genes were reported in mice. In humans, no X-imprinted genes were found so far, but phenotypic differences reported in Turner\'s syndrome (45,X) women was related to the parental origin of the X chromosome inherited. This suggests the existence of X-linked imprinted genes, in particular MAOA, MAOB and USP9X seemed good candidates. By sequencing transcript regions containing heterozygous SNPs in these genes we could access their expression pattern. Our results show no sign of imprinting regulation of MAOA, MAOB and USP9X, neither in human brain nor in human term placenta. This does not rule out the possibility that the phenotypic differences observed in Turner\'s syndrome women could be the consequence of other unknown X-linked imprinted genes. RNA-Seq of different human female tissues is a powerful approach to finally find the genes involved in such phenotypes

Genomic imprinting is an epigenetic phenomenon by which a subset of genes is expressed in a parent of origin specific manner. Most of the imprinted genes are located in clusters. Genetic evidences suggest that genes in imprinted clusters are regulated by Imprinting Control Regions (ICRs). To elucidate the mechanisms by which the imprinting is maintained in clusters, we have chosen a well characterized cluster at the distal end of mouse chromosome 7. This cluster contains 15 imprinted genes and they have been shown to be regulated by H19 and Kcnq1 ICRs. The mouse H19 ICR, which is shown to have a chromatin insulator function, is implicated in the regulation of H19 and Igf2 genes by interacting with the CTCF protein. It has been documented that CTCF is also involved in the maintenance of differential methylation at the ICR. In this investigation we demonstrated that CTCF maintained differential methylation is lost when we subjected the ICR containing episomal plasmids to de novo methylation machinery of the human choriocarcinoma cell line, JEG3, suggesting that the H19 ICR looses its methylation privilege property under neoplastic conditions. The Kcnq1 ICR has been implicated in the regulation of 11 imprinted genes. The Kcnq1 ICR is methylated on the active maternal allele but unmethylated on the inactive paternal allele and overlaps an oppositely oriented and paternally expressed gene known as Kcnq1ot1. In this investigation, we documented that the Kcnq1 ICR controls the imprinting of neighboring genes by behaving as a bidirectional silencer and that this function is regulated by antisense RNA Kcnq1ot1. Furthermore, we have documented that duration of antisense transcription plays a critical role in the antisense RNA- mediated silencing. In conclusion, this thesis provides more insights into the complex mechanistic aspects by which ICRs, control imprinting of genes in clusters during development and neoplasia.

Nanotechnology has a steadily increasing impact on worldwide research and business activities. This work explores advanced micro/nano patterning approaches for molecular manipulation. The objectives are to (1) build a proper bridge from a few microns to the 100-10 nm range and below as well as to (2) combine “top-down” precise design with the “bottom-up” size scale to create designed surfaces, areas and volumes that can interact with molecules in a designed way. Three studies were designed and studied accordingly. The first investigation demonstrates that “top-down” Inclined Nanoimprinting Lithography (INIL) is able to produce three-dimensional (3-D) nanopatterns of varying heights in a single step. INIL reduces pattern's feature size from microns to nanometers. The degree of resulting nanopattern's asymmetry can be controlled by the magnitude of the inclination angle. Various 3-D nanostructures are successfully demonstrated including nanolines, nanocircles and nanosquares. The underlying INIL mechanism is investigated, which is primarily due to the induced shear force when the inclination angle is not zero. This leads to the anisotropic dewetting of polymer fluid and consequently asymmetric 3D nanopatterns of varying heights. INIL removes the need of preparation of expensive 3D nanotemplates or multiple template-to-substrate alignments. In addition, such 3-D structures are successfully transferred to silicon, silicone rubber and metal gold. INIL enables 3D nano-scale devices including angle-resolved photonic and plasmonic crystals. The second investigation demonstrates the success of “bottom-up” molecular imprinting of X-ray contrast agent iodixanol in polymer matrix. The synthetic tailor-made molecularly imprinted polymers (MIPs) are poly(4-vinylpyridine-co-ethylene glycol dimethacrylate) which possess specific binding sites induced by the template molecules of X-ray contrast agent iodixanol. It leads the feature size reduction from macromolecules to molecular scale. The properly imprinted binding sites also leads MIPs to have improved absorption capacity and efficiency for X-ray contrast agent iodixanol relative to non-imprinted polymers. The best binding capacity achieved from the optimized MIPs was 284 mg/g in aqueous solution, 8.8 times higher than that of the non-imprinted polymers. The best binding capacity obtained in sheep plasma was 232 mg/g, 4.5 times higher than the non-imprinted polymers. The factors that may affect the binding performance of MIPs in aqueous media are studied. The optimized MIPs are encouraging for biomedical implementations including dialysis and nanosensors. The third investigation of nanolithography-based molecular manipulation (NMM) explores a hybrid approach by combining “top-down” electron-beam lithography (EBL) with “bottom-up” surface initiated polymerization (SIP). It reduces the nanopattern's feature size to sub-10 nm and simultaneously tunes its surface chemistry through functional polymer brushes. The process has reduced process complexity and cost. The demonstrated prototype molecular manipulation templates have 3D surface nanostructures with sub-10 nm feature size and anisotropic surface functionalities. They mimic biocatalyst enzymes to “bottom-up” assemble nanoparticle targets at specific locations producing 3D nanostructures in a designated way. Various 3D synthetic nanostructures have been demonstrated including polystyrene “nanomushrooms” “nanospikes”, “nanofibers” and polystyrene-iron oxide “nanoflowers”. Potential applications of these synthetic 3D nanostructures can be improved therapeutic agents. This hybrid strategy realizes the integration of “top-down” design with “bottom-up” molecular scale to create designed nanopatterned surfaces that can interact with molecules in a designated way.

A epigenética aborda o controle da expressão gênica através de diversos fatores que agem sob a cromatina, os melhor estudados são a metilação do DNA e a acetilação em histonas, relacionadas à repressão e ativação gênica, respectivamente. Em mamíferos, existem dois fenômenos epigenéticos interessantes: a inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas, que garante o equilíbrio transcricional gênico entre os sexos, e o imprinting genômico, caracterizado pela expressão monoalélica dependente da origem parental. No presente estudo, propusemos verificar a manutenção do controle epigenético em células humanas normais e transformadas em condições semelhantes de hipometilação do DNA e hiperacetilação em histonas (após uso das drogas 5-aza-2-\'deoxicitidina (5-aza-dC) e ácido valproico, respectivamente), através do monitoramento da expressão alelo-específica pelo uso de polimorfismos de única base presentes em regiões codificadoras. Em células normais houve manutenção da ICX e do imprinting genômico, enquanto que em células transformadas hipometiladas foram observadas indução de XIST, e perda de imprinting dos genes IGF2, H19 e PEG10. Observamos que ambas as drogas podem diminuir a expressão de DNMT1, e 5-aza-dC altera o equilíbrio entre acetilação e desacetilação da histona H4. Ainda, a ordem de adição dos reagentes ocasionou diferenças no nível de acetilação da histona H4 e na expressão gênica de XIST e PEG10. Nossos dados sugerem que: células humanas normais apresentam maior estabilidade do controle epigenético comparadas às células humanas transformadas, genes submetidos à ICX e \"imprintados\" não apresentam diferenças na rigidez do controle de expressão, e a cascata de reação seguida após perturbação de marcas epigenéticas pode ser alterada dependendo da modificação inicial. / Epigenetics refers to mechanisms related to gene activity through conformational modifications in DNA without changes in the nucleotide sequence. Key players in the epigenetic control are DNA methylation and histone acetylation, which are related to gene activation and repression, respectively. Two striking epigenetic phenomena in mammalians are X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting. XCI triggers the transcriptional silencing of all but one X chromosome in each female cell, while genomic imprinting is a process that leads to mono-allelic gene expression based on parental origin. In the present study, we intended to verify the maintenance of epigenetic control in normal and transformed human cells under the same conditions of epigenetic disturbance. For this purpose, 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-aza-dC) and valproic acid (VPA) were used to cause DNA hypomethylation and histone hyperacetylation, respectively. By monitoring allelic-specific expression using single nucleotide polymorphisms present in coding regions, we were able to check the effects of the modifications in the expression pattern of imprinted or subjected to XCI genes. While in female normal cells XCI and genomic imprinting were not affected by VPA or 5-aza-dC treatments, transformed male cells showed XIST activation and loss of imprinting of PEG10, IGF2 and H19 genes in the hypomethylation scenario. In addition, both drugs can decrease the expression of DNMT1, and 5-aza-dC alters the balance between acetylation and deacethylation of histone H4. Furthermore, we could see different degrees of histone H4 acetylation levels and of XIST and PEG10 expression, depending on which of the drugs was added first. Our data suggest that the epigenetic control in normal human cells is more stable when compared to transformed human cells. In addition, both XCI and genomic imprinting are epigenetic features equally hard to disturb. Finally, depending on the initial epigenetic modification (global demethylation or acethylation), it will induce different epigenetic control networks, with consequence to the final status of gene expression.

A síndrome de Silver-Russell (SRS) é caracterizada principalmente por grave retardo de crescimento intrauterino e pós-natal e face típica, pequena e triangular, entre outras características variáveis. A SRS é geneticamente heterogênea, ocorrendo em geral de forma esporádica. Mutações genéticas e epigenéticas em regiões sujeitas a imprinting genômico nos cromossomos 7 e 11 são detectadas em cerca de 50% dos pacientes. Mais frequentemente, a SRS é causada pela alteração da expressão gênica na região 11p15 devido à hipometilação do centro de imprinting telomérico (ICR1) que ocorre em pelo menos 40% dos afetados. Duplicações cromossômicas de origem materna incluindo o centro de imprinting centromérico (ICR2) estão presentes em 1-2% dos casos. A dissomia uniparental materna do cromossomo 7 (matUPD7) é responsável por 5-10% dos casos. Mais recentemente microdeleções e microduplicações cromossômicas foram detectadas em um grupo pequeno de pacientes, algumas delas se mostrando com possível efeito patogênico. Com a identificação da hipometilação de ICR1 em 11p15, matUPD(7) e desequilíbrios (sub)microscópicos, a confirmação molecular para o diagnóstico clínico da SRS tornou-se possível em ~50% dos pacientes, o que deixa metade dos casos sem causa genética determinada. A amostra foi constituída por 64 pacientes brasileiros não aparentados, com suspeita clínica da síndrome de Silver-Russell. O número de cópias de DNA e o padrão de metilação do cromossomo 11p15 foram investigados em 49 pacientes utilizando MS-MLPA, e 21 (43%) deles apresentaram hipometilação de ICR1. Em um desses pacientes (2%), ambos os centros, ICR1 e ICR2, estavam hipometilados, alteração complexa que já foi relatada em ~4% dos pacientes com SRS que apresentavam hipometilação de ICR1. Em outro paciente (2%), foi detectada uma microduplicação de origem materna que incluía o domínio ICR2, mas não ICR1. Essa microduplicação segrega em três gerações de uma família e a manifestação da síndrome depende da transmissão via materna: houve quatro casos de transmissões paternas da microduplicação de um único homem uniformemente resultando em prole normal, e cinco transmissões maternas, de duas irmãs clinicamente normais, com todas as crianças apresentando SRS. Outra microduplicação de origem materna restrita ao domínio ICR2 e associada com SRS em um menino foi descrita anteriormente. Entre os genes duplicados nos dois casos, CDKN1C aparece como candidato para o fenótipo da SRS, uma vez que codifica para um inibidor de quinase dependente de ciclina que regula negativamente o crescimento celular e tem papel crucial no desenvolvimento fetal humano. Esse novo caso familial vem confirmar que a duplicação restrita ao domínio ICR2, de herança materna, está causalmente associada com a SRS; mostra também que nenhuma alteração fenotípica aparente está presente, quando a duplicação é herdada via paterna. Entre os 64 pacientes da amostra, três (4,7%) foram identificados apresentando matUPD(7), pela genotipagem de microssatélites do cromossomo 7. As frequências de hipometilação de ICR1 (43%) e matUPD(7) (4,7%) entre os nossos pacientes, concordantes com o de outros estudos semelhantes, apontam para a seleção adequada dos pacientes com SRS, do ponto de vista clínico. A investigação de microrrearranjos cromossômicos por a-CGH foi realizada em 19 pacientes, que previamente tiveram afastadas alterações (epi)genéticas em 11p15 e a matUPD(7). A maioria dos pacientes não apresentou alterações (n=7) ou possuía apenas CNV frequentes em indivíduos normais da população e consideradas polimorfismos (n=8). Quatro microdeleções potencialmente patogênicas foram detectadas, em 2p23.3 (~320 Kb), 13q24 (~94,3 Kb), 15q11.2 (~320 Kb) e 16p13.11 (~95,8 Kb). Em nenhum dos casos foi possível estabelecer relação direta com o fenótipo da SRS, porque não foi possível investigar ambos os genitores ou a alteração estava presente em um genitor clinicamente normal ou já tinha sido relatada em indivíduo normal da população, não havendo, entretanto, indicação de ser polimórfica. A penetrância incompleta ou a manifestação de alelo recessivo patogênico no cromossomo homólogo são duas possíveis explicações para o efeito patogênico das microdeleções herdadas de genitor clinicamente normal. Três estudos recentes que utilizaram microarrays na busca de genes ou regiões cromossômicas associadas com a SRS, em que a causa genética era desconhecida, detectaram microduplicações e microdeleções, algumas potencialmente patogênicas: uma microdeleção em 15q26.3, incluindo o gene IGF1R, foi identificada em dois pacientes; outras microdeleções incluíam os genes IGF2BP3 em 7p15, GPC5 em 13q31.3, o MAPK1 em 22q11.2 e o HMGA2 em 12q14, considerados candidatos, possivelmente influenciando o crescimento. Esse conjunto de resultados indica que a investigação de microrrearranjos deve estender-se a um número maior de pacientes com SRS, na busca regiões cromossômicas e genes que possam estar causalmente associados com a síndrome. Em 30 pacientes com SRS, buscamos mutações no gene CDKAL1, por sequenciamento direto das regiões codificadoras. Esse gene foi considerado candidato para a síndrome, após ter sido interrompido em um dos nossos pacientes com SRS, portador de uma translocação t(5;6). Nenhuma alteração patogênica foi detectada, indicando que mutações de ponto na região codificadora do gene CDKAL1 não é causa comum da SRS. Em 18 dos 30 pacientes, investigamos a presença de microdeleções e microduplicações por a-CGH e não encontramos alteração que incluísse esse gene. Considerando o pequeno tamanho amostral, não podemos excluir definitivamente a possibilidade de que alterações no gene CDKAL1 possam contribuir para a etiologia da SRS. / Silver Russell syndrome (SRS) is characterized by severe intrauterine and postnatal growth retardation in association with a typical small triangular face and other variable features. Most cases are sporadic. Genetic and epigenetic disturbances on imprinted regions at chromosomes 7 and 11 are detected in about 50% of the patients. Most frequently, SRS is caused by altered gene expression on chromosome 11p15 due to hypomethylation of the telomeric imprinting center (ICR1) that is present in at least 40% of the patients. Maternally inherited duplications encompassing the centromic imprinting center (ICR2) domains at 11p15 are present in about 1-2% of cases. Maternal uniparental disomy of chromosome 7 (mUPD7) is identified in 5-10% of patients. More recently, chromosomal microdeletions and microduplications were detected in a small group of SRS patients, some of them with possible pathogenic effect. This leaves approximately half of the SRS cases without a genetic cause determined. Our cohort consisted of 64 unrelated Brazilian patients with clinical diagnosis of SRS. DNA copy number changes and the methylation pattern on chromosome 11p15 were investigated in 49 patients by MS-MLPA, and 21 (43%) presented with hypomethylation of ICR1. In one patient (2%), both centers (ICR1 and ICR2) were hypomethylated, a complex alteration that has been reported in ~4% of SRS patients that shows hypomethylation of ICR1. In a further patient (2%), we detected a ~1.6 Mb microduplication encompassing the whole ICR2 domain, but not the ICR1. This microduplication was shown to segregate in a three-generation family, and was associated with SRS whenever maternally transmitted: there were four instances of paternal transmissions of the microduplication from a single male uniformly resulting in normal offspring, and five maternal transmissions, via two clinically normal sisters, with all the children exhibiting SRS. A maternally inherited microduplication also restricted to the ICR2 domain and associated with SRS in a boy was described previously. Among the duplicated genes in both cases, CDKN1C is a likely candidate for the SRS phenotype, because it encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor that negatively regulates cell proliferation and growth, and plays a crucial role in human fetal development. This new case brings confirmatory evidence that microduplications restricted to the ICR2 domain result in SRS when maternally transmitted. It also shows that no apparent phenotypic change is present when ICR2 duplication is paternally inherited. By genotyping chromosome 7 microsatellites, we identified three patients (4.7%) with mUPD(7), in the cohort of 64 patients. The frequencies of hypomethylation of ICR1 (43%) and mUPD(7) (4.7%) among our patients are in accordance with the literature, and point to a proper selection of patients with SRS, from the clinical point of view. The investigation of submicroscopic chromosomal imbalances by a-CGH was performed in 19 patients in whom (epi)genetic mutations at 11p15 and mUPD(7) had been excluded. Most patients showed no changes (n = 7) or had only CNV considered to be polymorphic (n = 8). Four potentially pathogenic microdeletions were detected, on chomosomes 2p23.3 (~320 Kb), 13q24 (~94.3 Kb), 15q11.2 (~320 Kb) and 16p13.11 (~95.8 Kb). In neither case we could establish a direct relationship between the imbalance and the phenotype, because it was not possible to investigate both parents or the change was present in a clinically normal parent or it had been reported in normal individuals, without, however, indication of being polymorphic. Incomplete penetrance or unmasking of a pathogenic recessive allele on the homologous chromosome are two possible explanations to the pathogenic effect of a microdeletion inherited from a clinically normal parent. Three recent studies that used microarrays to identify genes or chromosomal regions associated with SRS, wherein the genetic cause was unknown, detected microdeletions and microduplications, some of them potentially pathogenic: a microdeletion at 15q26.3, including the IGF1R gene, was identified in two patients; other microdeletions included the IGF2BP3 gene at 7p15, GPC5 gene at 13q31.3, MAPK1 gene at 22q11.2 and HMGA2 gene at 12q14, which were considered candidates, possibly influencing growth. This set of results, including ours, indicates that the investigation of submicroscopic chromosomal imbalances should be extended to a larger cohort of SRS patients, in the search for chromosomal regions and genes that may be causally associated with the syndrome. In 30 SRS patients, we searched for point mutations in the CDKAL1 gene by direct sequencing of coding regions. This gene was considered a candidate for SRS, after being disrupted in one of our SRS patients with a t(5;6). No pathogenic mutation was detected and, therefore, point mutations in the coding region of CDKAL1 do not appear to be a common cause of SRS. In 18 of the 30 patients, we investigated the presence of microdeletions and microduplications by a-CGH and found no changes encompassing CDKAL1 gene. Considering the small cohort size, we cannot definitely exclude the possibility that changes in CDKAL1 gene may contribute to the etiology of SRS.

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:07:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_ElusaCristinade_M.pdf: 10251411 bytes, checksum: b1a5d2634c9831ce84cdf0a70561fdc8 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Em ratos machos, a completa função reprodutiva é criticamente dependente da adequada ação do estrógeno nos diferentes níveis do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas. A administração de altas doses de estrógeno durante o período de diferenciação sexual resulta em diversas alterações no sistema reprodutor masculino. De forma geral, os estrógenos têm efeito anti-androgênico atuando no eixo hipotálamo-hipófise-testículos e, assim, reduzindo a produção de testosterona pelos testículos. A administração de estrógeno nos períodos. críticos do desenvolvimento promove um mecanismo conhecido como imprinting estrogênico. Este fenômeno é extremamente importante, pois pode ser acionado pela exposição do recém-nascido a várias substâncias com caráter estrogênico, e não somente ao estrógeno. Um dos efeitos do imprinting estrogênico causado por altas doses de estrógeno é a regulação negativa da expressão de receptores de andrógenos (ARs). na próstata e reduzida resposta a aplicações de andrógenos, o que parece alterar padrões de comportamento em machos. Diante disso, este trabalho investigou os aspectos relacionados aos mecanismos gerais envolvidos no imprinting estrogênico, com o propósito de analisar a participação do estrógeno e a sua influência sobre os ARs no hipotálamo de ratos Wistar. Para tanto, ratos machos foram tratados no período neonatal inicial com três doses de 15 mg/kg de 17p-estradiol (E2) e comparados com ratos controle (tratados apenas com óleo de milho) e com fêmeas que não receberam nenhum tratamento farmacológico, e os efeitos foram observados na idade adulta. Foram verificados os padrões de distribuição do AR por imunoistoquímica, o conteúdo total de AR por Western blotting e do correspondente RNAm por RT-PCR no hipotálamo dos animais submetidos à estrogenização neonatal. A estrogenização promoveu diminuição no conteúdo total de AR e na expressão do RNAm correspondente, e modificações no padrão de distribuição do AR nos núcleos ventromedial, pré-óptico medial anterior, paraventricular e área pré-óptica, aproximando-se do padrão apresentado por fêmeas. Portanto, esses dados indicam que o estrógeno é capaz de promover imprinting neonatal no hipotálamo e alterar a expressão do AR, o que possivelmente pode afetar o comportamento sexual desses animais / Abstract: In male rats, complete reproductive function is critically dependent on adequate estrogen action at different levels of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The administration of high doses during the period of sexual differentiation results in irreversible alterati ns in the male reproductive system. In brief, the estrogens have anti-androgenic effects t. ey act in the hypothalamus-pituitary-testes axis, reducing the testosterone production by the testes. The administration of estrogen in critical periods of development promotes a mechanism known as estrogen imprinting. This phenomenon is extremely important, because it can be started by the exposure of the neonate to several estrogen-like substances with estrogen characteristics, and not only to estrogen. One of the estrogenic imprinting effects caused by high doses of estrogen is the negative regulation of the expression of androgen receptors (ARs) in the prostate and reduced responses to androgen exposure that seems to alter the male behavior. This study investigated the participation of estrogen and it influence on the ARs in the hypothalamus of Wistar rats afier estrogen imprinting. For this, male rats were treated in the early neonatal period with 17pestradiol (E2) three doses of 15mg/kg and compared with control rats (only treated with com oil) and with not treated females, and the effects were analyzed in the adulthood. The AR distribution pattem was analyzed by immunohistochemistry, the total content of the AR by Westem blotting and it's mRNA by RT-PCR in the hypothalamus oftreated animaIs. The neonatal estrogenization promoted decrease of expression oftne AR and its mRNA. Also revealed that the AR distribution, pattem at the ventromedial, anterior medial preoptic and paraventricular nuclei and preoptic area were altered and with a pattem close to not treated females. Therefore, our data indicate that estrogen is able to induce estrogen imprint in the hypothalamus and to alter the AR expression and possibly affecting the sexual behavior / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Duas espécies de aranhas da família Oxyopidae, Peucetia rubrolineata e P. flava, foram observadas em campo e laboratório. Durante essas observações foram coletadas informações sobre habitat (associação com plantas que possuem tricomas glandulares), inimigos naturais (ootecas parasitadas por vespas da família Ichneumonidae e neurópteros da família Mantispidae) e dieta (registro de 22 eventos de alimentação). Os dados apresentados são comparados com informações da literatura. Embora conhecidas como predadores generalistas, muitas espécies de aranhas podem manifestar preferência por determinados tipos de presa. Estudos indicam que a preferência alimentar das aranhas da família Oxyopidae pode estar relacionada a processos de estampagem, que ocorrem no início do desenvolvimento dos animais. Durante as incursões em campo, 19 fêmeas adultas da espécie P. rubrolineata foram coletadas e levadas ao laboratório para realização de experimentos de preferência alimentar. Jovens de P. rubrolineata foram submetidos a testes de escolha de presas, nos quais foram oferecidos grilos recémnascidos (Gryllus sp) e moscas de fruta (Drosophila sp). Foram realizados 3 experimentos, que combinavam 4 variáveis: tipo de presa, idade do animal (5 ou 15 dias), período de exposição às presas (5 ou 10 dias) e quantidade de presas oferecidas. Os parâmetros que se mostraram mais eficientes no estabelecimento da preferência alimentar foram início da alimentação 15 após a saída da ooteca e período de 10 dias de exposição às presas. Quando bem alimentadas, as aranhas jovens preferem como presa moscas adultas ao invés de grilos recémnascidos, mas quando em escassez de alimento, a preferência é pelo primeiro tipo de presa experimentado, configurando o efeito de primazia importante fator na determinação da estampagem. Discutemse quais os possíveis fatores responsáveis pelo estabelecimento dessas preferências, bem como as características deste aprendizado. O estabelecimento da preferência alimentar dos jovens se dá concomitante ou muito próximo do período de cuidado parental, que, nas aranhas da superfamília Lycosoidea, consiste no cuidado ativo da ooteca e dos filhotes pela fêmea até a dispersão. O cuidado parental destas aranhas tem sido usado como fonte de caracteres em estudos de reconstrução filogenética e, devido à complexidade deste tipo de caráter, sua delimitação deve ser cuidadosa. Baseandose nas informações obtidas na literatura e também em observações do cuidado materno deste grupo, são propostos 4 caracteres: comportamento de cuidado com a ooteca, construção de refúgio para ooteca, abertura, pela fêmea, da ooteca para a saída dos filhotes e comportamentos de cuidado com os filhotes. Os critérios para homologia foram sequência das atividades da fêmea e estruturas construídas pela mesma durante o cuidado. A história evolutiva destes caracteres, mapeada em uma filogenia da superfamília Lycosoidea, mostra que os comportamentos de carregar a ooteca nas quelíceras, ajudar os filhotes abrindo o saco de ovos, construir um abrigo no cuidado com a ooteca e permanecer em guarda no cuidado com os filhotes apresentamse como plesiomórficos para a superfamília. Carregar os filhotes sobre a ooteca vazia é uma sinapomorfia de Trechalea, bem como carregar os filhotes no abdome é em Lycosidae. Discutemse delimitação do caráter referente à construção de teia berçário e as propostas de homologia para o cuidado materno presentes na literatura / Two species of spiders of the family Oxyopidae, Peucetia rubrolineata and P. flava, were observed in field and laboratory. During these observations we collected information on habitat (spiders associated with plants bearing glandular trichomes), natural enemies (egg sacs parasitized by Ichneumonidae wasps and Mantispidae) and diet (22 feeding events). Although spiders are known to be generalist predators, they can show preferences for certain types of prey. Studies indicate that prey preference in spiders of the family Oxyopidae may be related to imprintinglike processes, which occur early in the development of these animals. Nineteen adult females of the species P. rubrolineata were collected and taken to the laboratory for testing food preference. In the present study, two types of prey were offered to spiderlings of P. rubrolineata: newborn crickets (Gryllus sp.) and fruit flies (Drosophila sp.). The prey preference was tested using a choice test. Three trials were carried out, each one with four combined variables: type of prey (cricket or flies), animal\'s age (five or 15 days), time of exposure to prey (five or ten days) and the amount of prey offered (one or two). The parameters that have proven most effective in establishing food preferences were when feeding starting 15 days after the spiderlings had left the egg sacs and with 10 days of exposure to the prey. When wellfed, spiders prefer adult flies as prey instead of newborn crickets. However, when spiders are deprived of food, the preference is for the first prey type experienced, which constitutes the primacy effect, an important factor determining imprinting. We discuss which factors might be leeding to such preferences, as well as the what is underlining this learning. Spiderlings prey preferences are established during or close to the period of parental care. In the superfamily Lycosoidea, females actively care for the egg sac and spiderlings until dispersion. Categories of parental behavior in these spiders have been used as characters in some phylogenetic reconstruction studies. Due to the complexity of this type of character, its delimitation should be made carefully and based on studies specificaly about these behaviors. By gathering literature data and also laboratory observations of maternal care we propose 4 characters: Caring behaviors with the egg sac, construction of a silken shelter for the egg sac, help the spiderlings to emerge from egg sac and care for the spiderlings. We propose the homology based on the females behaviors and the structures built by her. The reconstruction of the evolutionary history of these characters shows that carrying the egg sac under the chelicerae, helping spiderlings to emerge from egg sac, building silken shelter for the egg sac and caring for and guarding the spiderlings until dispersion are plesiomorphic to the superfamily Lycosoidea. A synapomorphy of Trechalea sp. is to carry the spiderlings on the empty egg sacs. The same is true for Lycosidae (Aglaoctenus sp. and Lycosa erythrognatha) carrying young on the females abdomen. We discuss the delimitation of the nursery web character and the proposed homology for the maternal care presented in the literature