Tese (doutorado)-Univesidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2011. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-27T14:44:11Z No. of bitstreams: 1 2011_JansenRodrigoPereiraSantos.pdf: 2733197 bytes, checksum: 7bf99f2770c187b6ba5bc58259257e51 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-28T17:59:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_JansenRodrigoPereiraSantos.pdf: 2733197 bytes, checksum: 7bf99f2770c187b6ba5bc58259257e51 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-28T17:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_JansenRodrigoPereiraSantos.pdf: 2733197 bytes, checksum: 7bf99f2770c187b6ba5bc58259257e51 (MD5) / A cultura da bananeira tem grande importância econômica e social em todo o mundo. O Brasil é o quarto produtor mundial de banana, sendo esta cultivada de Norte a Sul do País e, praticamente toda produção é comercializada no mercado interno. Problemas fitossanitários de variadas etiologias reduzem a vida útil dos plantios e levam a perdas na produção e na qualidade dos frutos. Dentre os fitonematoides, Radopholus similis, Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria, Helicotylenchus multicinctus, Rotylenchulus reniformis e Pratylenchus coffeae são considerados os de maior importância para a bananicultura. O parasitismo dos nematoides além de levar a perdas diretas, pode acarretar perdas indiretas, como gastos com fertilizantes, outros insumos e mão de obra para evitar maiores perdas de produção. Também o uso de nematicidas pode acarretar em risco de intoxicação durante a aplicação e de contaminação do meio ambiente. Tendo em vista que o princípio da resistência de plantas a doenças constitui uma das medidas de controle mais compatíveis com a sustentabilidade agrícola, estabelecemos como objetivo deste projeto buscar uma forma de viabilizar o controle de nematoides por meio de resistência e tolerância varietal na cultura da banana, estudando a variabilidade do patógeno e do hospedeiro, além de iniciar o estudo da interação nematoide vs. Musa utilizando técnicas moleculares. O uso de métodos de multiplicação em massa de fitonematoides in vitro em condições axênicas permite intensificar os estudos de taxonomia, biologia, epidemiologia e controle desses patógenos. Portanto, devido a necessidade de multiplicação massal de R. similis para a produção de inóculo com a finalidade de atender aos experimentos, tentou-se otimizar o método de multiplicação do inóculo para o nematoide, já que há variação da eficiência entre diferentes métodos de multiplicação. Foram avaliadas duas metodologias de multiplicação in vitro para R. similis e Pratylenchus brachyurus em três períodos de avaliação (20, 40 e 60 dias). Ambas as metodologias utilizam cilindros de cenoura em frascos com tampas, sendo que em uma delas foi adicionado meio agar-água no interior dos frascos. O método com agar-água mostrou-se mais efetivo que o método sem agar-água, para ambas as espécies, com um aumento populacional em torno de 280 vezes para R. similis e 226 vezes para P. brachyurus, enquanto o outro método aumentou 5 e 2 vezes, respectivamente, após 60 dias. O grau de resistência de oito acessos de bananeiras a diferentes populações de R. similis foi verificado e a diferença de agressividade entre as populações do nematoide também foram avaliadas. Plantas dos acessos 4249-05, 4279-06, Yangambi Km5, 0323-03, 0337-02, 1304-06, Borneo e Grande Naine foram inoculadas com 400 nematoides por planta e mantidas em casa de vegetação por 60 dias. Cada acesso foi inoculado com três populações de R. similis provenientes de Pernambuco, Distrito Federal e Santa Catarina, separadamente, com 5 repetições. Os acessos 4249-05, Yangambi Km5, 0323-03 e 4279-06 apresentaram níveis diferentes de resistência ao nematoide cavernícola com base na percentagem de redução do fator de reprodução. A população de PE foi considerada a mais agressiva em relação às demais, enquanto que a do DF foi mais agressiva que a de SC. Foi avaliada também a reação de clones diploides e triploides de bananeira em relação aos nematoides R. similis (nematoide cavernícola) e M. incognita (nematoide das galhas), em condições de campo com base nas taxas de multiplicação de cada nematoide e no desenvolvimento das plantas. As plantas foram previamente inoculadas com 200 juvenis, machos e fêmeas de R. similis, ou 2500 ovos e juvenis de M. incognita em vasos distintos. Os acessos foram avaliados após 13 meses da inoculação, em condições de campo. Os acessos 1304-04, 4223-06, 1318-01, 1319-01, Tjau Lagada e N118 se mostraram tolerantes ao nematoide cavernícola e os acessos N118, Pipit e Birmanie tolerantes ao nematoide das galhas, sendo que estes acessos permitiram a multiplicação do nematoide e não tiveram o desenvolvimento afetado. Para o entendimento de componentes da resistência horizontal-vertical e da agressividade-virulência do patossistema Musa spp. vs. R. similis, foram utilizadas as populações de Santa Catarina (SC), Distrito Federal (DF) e Pernambuco (PE) do nematoide, além dos acessos 4249-05, Yangambi Km5, 0323-03, 4279-06, Grande Naine, 0337-02, Borneo e 1310-06. De cada população de R. similis foram inoculados 400 nematoides por planta em casa de vegetaçao. Os nematoides foram extraídos das raízes e do solo 60 dias após a inoculação. O fator de reprodução (FR) para cada acesso em relação a cada população de nematoide foi determinado. Na análise dos dados utilizou-se o modelo IV de Griffing (1956), no esquema de dialelo parcial, com quatro repetições. Os acessos com maior resistência horizontal foram 4249-05 e Yangambi Km5 e a população mais agressiva do patógeno foi a de Pernambuco. Marcadores moleculares SSR e RAPD foram utilizados para a análise molecular de 11 acessos de Musa contrastantes para os fenótipos de resistência aos nematoides R.similis, M. incognita, M. javanica e M. arenaria, visando identificar primers e selecionar marcadores moleculares promissores para futuros trabalhos de mapeamento genético da resistência, além de estudar a diversidade genética dos acessos. Os acessos Birmanie, Pisang Nangka, Borneo, Grande Naine, Yangambi Km5, 1304-06, 4279-06, 4223-06, 8694-15, 1304-04 e 4249-05 foram selecionados conforme a percentagem de redução do fator de reprodução de cada espécie de nematoide de acordo com Santos (2007) e Teixeira (2007). O DNA genômico dos onze acessos foi extraído, sendo utilizados 13 primers RAPD e 14 pares de primers microssatélites. Um total de 195 marcadores RAPD e 59 alelos microssatélites foram gerados. Do total de marcadores, 183 RAPD e 56 SSR foram polimórficos e, 44 e 17, respectivamente, mostraram-se promissores para trabalhos futuros de mapeamento genético para resistência a M. incognita, M. javanica, M. arenaria e R. similis. Entre todos os primers utilizados, 92 % para RAPD e 78 % para SSR geraram ao menos uma banda ou alelo promissor para estudos de mapeamento genético. Os primers decâmeros para RAPD OPE-09, OPG-12 e OPG-05 e, os pares de primers SSR AGMI25/AGMI26 e AGMI101/AGMI102 apresentaram o maior número de alelos promissores e se destacaram para futuros trabalhos de mapeamento genético. As distâncias genéticas entre os diferentes acessos baseadas nos marcadores RAPD variaram de 0,29 a 0,62 e, com base nos microssatélites variaram de 0,33 a 0,78. Os acessos Pisang Nangka e Grande Naine apresentaram a menor distância genética com base nos marcadores RAPD e os acessos Yangambi Km5 e 4223-06 com base nos marcadores SSR. Os acessos contrastantes para a resistência, 4279-06 e Borneo apresentaram, respectivamente distância genética de 0,48 e 0,60 e um total de 37 marcadores RAPD e 10 alelos SSR polimórficos e promissores para o mapeamento genético. Para os acessos contrastantes 4279-06 e 1304-04, as distâncias genéticas foram, respectivamente, de 0,47 e 0,46 e o total de bandas polimórficas promissoras para o mapeamento foi de 36 e 9 para os marcadores RAPD e microssatélites. Para analisar a expressão de genes análogos de resistência (RGAs) em acessos resistente (Yangambi Km5) e suscetível (Grande Naine) ao nematoide R. similis, na presença e ausência do patógeno em momentos diferentes após a inoculação, um bioensaio foi realizado com duração de 7 dias em casa de vegetação. As raízes foram coletadas em quatro períodos distintos, 0, 3, 5 e 7 dias após inoculação. Doze pares de primers desenhados a partir de sequências de RGAs da família NBS-LRR (sítio de ligação a nucleotídeos e região de repetição rica em leucina) foram utilizados para a análise de expressão diferencial via RT-PCR a partir do RNA extraído das raízes. Seis protocolos de extração de RNA foram testados. O protocolo do Concert Plant RNA Reagent foi selecionado, pois possibilitou a extração de RNA em quantidade e qualidade ideais. Os genes RGC5 e RGA14 não foram expressos em nenhum dos dois acessos. Os genes RGA10, Franc_MbPKW_RGA08L, Franc_MbPKW_RGA08O, se revelaram como constitutivos e expressos em todos os tempos para ambos os acessos. Outros genes que apresentaram uma expressão basal foram os RGA37, RGA41, RGC3 e RGC1, sendo que o primeiro foi expresso de forma constitutiva apenas para Yangambi Km5, os dois seguintes apenas para Grande Naine, e o últimos para ambos os acessos. O gene Franc_MbPKW_RGA08E teve um aumento na concentração a partir do tempo 3 para o acesso resistente, sendo que para a planta suscetível este gene só foi começar a ser expresso no tempo 7. O gene RGC2 foi expresso apenas no acesso resistente no tempo 5. O gene Franc_MbPKW_RGA08K foi expresso tardiamente em Grande Naine e para Yangambi Km5 foi constitutivo, mas deixou de ser expresso a partir do período de tempo 3. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Banana plantations have great economic and social importance worldwide. Brazil is the fourth largest producer of bananas, which is planted from North to South, and almost total fruit produced is sold domestically. Phytosanitary problems of varied etiologies reduce crop life span and lead to yield losses and poor fruit quality. Among the plant-parasitic nematodes, Radopholus similis, Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria, Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae and Rotylenchulus reniformis are considered the most important for banana production. Parasitism by nematodes also lead todirect and indirect losses, such as spending on fertilizers, and other inputs and labors to mitigate crop losses. Furthermore, the use of nematicides can carry risks of intoxication during application, and environmental contamination. Considering that the principle of plant resistance to diseases is one of the most consistent strategy with sustainable farming, the goal for this project is to achieve control of nematodes in banana through varietal resistance or tolerance. For that, we analyzed the variability of the pathogen and host, and studied the interaction Musa vs. nematode at molecular level. The use of mass multiplication methods of plant-parasitic nematodes in vitro allows to intensify studies on taxonomy, biology, epidemiology and control of these pathogens. Due to the need of mass production of nematodes for supplying inoculum for the experiments in this project, we optimized the method of multiplication of R. similis, since the efficiency of the methods of multiplication varies widely. Therefore, two methods for in vitro multiplication of R. similis and Pratylenchus brachyurus were evaluated in three time periods (20, 40 and 60 days). Both methods used carrot cylinders in closed lid jars. In one of them, it water-agar was added covering the bottom of the jars, whilst in the second method no water-agar was added. For both species the method with water-agar proved to be more the most efficient, with a population increase of 280 times for R. similis and 226 times for P. brachyurus, whilst by the other method, the nematode populations increased 5 and 2 times, respectively, after 60 days. ix The degree of resistance of eight accessions of banana to three different populations of R.similis has been verified, and the difference in aggressiveness between populations of the nematode has also been evaluated. Plants of accessions 4249-05, 4279-06, Yangambi Km5, 0323-03, 0337-02, 1304-06, Borneo and Grande Naine were inoculated with 400 nematodes per plant and maintained under greenhouse for 60 days. Each access was inoculated with three populations of R.similis from Pernambuco (PE), Federal District (DF) and Santa Catarina (SC), separately, with five replicates. Accessions 4249-05, Yangambi Km5, 0323-03 and 4279-06 expressed different levels of resistance to the burrowing nematode. The population from PE was considered the most aggressive. The population from DF was more aggressive whe compared to the one from SC. The reaction of clones of diploid and triploid bananas was evaluated to the burrowing nematode (R. similis), and to the root-knot nematode (Meloidogyne incognita), under field conditions, based on the multiplication rates of each nematode and plant development. Plants were inoculated with 200 juveniles, males and females of R.similis, or 2500 eggs and juveniles of M. incognita in pots, separately. The accessions were evaluated 13 months after inoculation under field conditions. Accessions 1304-04,4223-06, 1318-01, 1319-01, Tjau Lagada and N118 reacted as tolerant to the burrowing nematode, while N118, Birmanie, Pipit as tolerant to the root-knot nematode. To understand the components of horizontal-vertical resistance and of virulence-aggressiveness in the pathosystem Musa spp. vs. R. similis were used, three populations of R. similis, from Santa Catarina (SC), Federal Distrito (DF), Pernambuco (PE), and eight accessions of banana (4249-05, Yangambi KM5, 0323-03, 4279-06, Grande Naine, 0337-02, Borneo, and 1310-06). Each accession was inoculated with 400 nematodes per plant under greenhouse. The nematodes were extracted from roots and soil 60 days after inoculation. The reproduction factor (RF) for each accession and each nematode population was determined. The model IV of Griffing (1956) was adopted for analyzing the data, in partial diallel scheme with four replications. The accessions with higher horizontal resistance were 4249-05 and Yangambi Km5, and PE was the most aggressive population of the pathogen. Evidence of vertical and horizontal resistance were observed. RAPD and SSR markers were used for molecular characterization of 11 genotypes of Musa with contrasting phenotypes of resistance to the nematodes R. similis, M. incognita, M. javanica and M. arenaria, aiming to select primers and molecular markers for future work on genetic mapping of the resistance. In addition the genetic diversity of the banana genotypes was studied. These accessions were selected from a working x collection of 26 accessions of banana, based on the evaluation of the reproduction factor for each nematode species. Genomic DNA was extracted from the selected acessions, and used 13 RAPD primers and 14 pairs of microsatellite primers for obtaining molecular markers. A total of 195 RAPD markers and 59 microsatellite alleles were generated. Of the total markers, 183 RAPD and 56 SSR were polymorphic, and 44 and 17, respectively, have shown to be promising for future studies of genetic mapping for resistance to M. incognita, M. javanica, M. arenaria and R. similis. Among all primers used, 92% RAPD, and 78% SSR primers generated at least one band or allele promising for genetic mapping. Decamer primers for RAPD, OPE-09, OPG-12 and OPG-05 and the pairs of SSR primers AGMI25/AGMI26 and AGMI101/AGMI102 showed the highest number of alleles promising for future works of genetic mapping. The genetic distances between the different accessions based on RAPD markers ranged from 0.29 to 0.62 and, based on microsatellites ranged from 0.33 to 0.78. Accessions Grande Naine and Pisang Nangka showed the smallest genetic distance based on RAPD markers, and accessions Yangambi Km5 and 4223-06 the smallest distance based on SSR markers. For the contrasting accessions for resistance, Borneo and 4279-06 the genetic distances were respectively 0.48 and 60 and, with a total of 37 RAPD and 10 SSR polymorphic alleles promising for genetic mapping. For the contrasting accessions 4279-06 and 1304-04, genetic distances were, respectively, 0.47 and 0.46, and the total number of polymorphic bands promising for genetic mapping was 36 and 9 for the RAPD and microsatellites. To analyze the expression of RGAs in banana accenssions, resistant (Yangambi Km5) and susceptible (Grande Naine) to the nematode R. similis in the presence and absence of the pathogen, were used at different time periods after inoculation. A bioassay was conducted for 7 days in a greenhouse. Roots were collected in four distinct periods, 0, 3, 5 and 7 days after inoculation. Twelve pairs of primers designed from sequences of RGAs from the NBS-LRR family were used for analysis of differential expression by RT-PCR from RNA extracted from roots. Six RNA extraction protocols were tested. The protocol Concert™ Plant RNA Reagent was selected since it allowed the extraction of RNA in ideal quantity and quality. The genes RGC5 and RGA14 were not expressed in any of the two accessions. The genes RGA10, Franc_MbPKW_RGA08L, Franc_MbPKW_RGA08O, were revealed as constitutive and expressed in all times for both accessions. Other genes that showed a basal expression were RGA37, RGA41, RGC3 and RGC1. The first one was expressed constitutively only in Yangambi Km5, the next two only in Grande Naine, and the last one was expressed in both accessions. The gene xi Franc_MbPKW_RGA08E had an increased concentration starting from time 3 in the resistant accession, while in the susceptible one, this gene was only beginning to be expressed at time 7. The gene RGC2 was expressed only in the resistant accession, beginning at time 5. The gene Franc_MbPKW_RGA08K was expressed late in Grande Naine, and it proved to be constitutive in Yangambi Km5, but it stopped to be expressed at time 3.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-11-08T16:45:34Z No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-11T14:43:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-11T14:43:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / O objetivo foi avaliar o efeito de sistemas de cultura definidos na maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos utilizando um procedimento em duas etapas: inibição e a subsequente retomada do bloqueio meiótico. Na primeira etapa os CCOs foram cultivados em meio controle, MIV-B ou MIV-C por 24h. Na segunda etapa, o cultivo continuou até 32, 40 ou 48 horas para os CCOs cultivados em MIV-B ou MIV-C para avaliação tempo-dependente do estágio da meiose dos oócitos. O meio controle utilizado foi TCM-199 suplementado com SFB e FSH. Já MIV-C foi constituído por meio Alpha –MEM suplementado com PVA, insulina, IGF-I, androstenediona, aminoácidos não essenciais, trasnferrina e selênio, e a constituição de MIV-B foi semelhante à de MIV-C, porém sem a adição dos hormônios e fator de crescimento. A maturação citoplasmática foi avaliada por microscopia eletrônica de transmissão (MET) nos tempos de 0, 24 e 48h de cultivo e também pela expressão dos genes HSP70.1, PRDX1, GDF9 e IFF1R. Os resultados mostraram que tanto MIV-C quanto MIV-B inibiram a meiose em cerca de 70% dos CCOs cultivados por 24h. Nas 24h de cultivo subsequentes, apenas 30% dos CCOs cultivados em MIV-C alcançaram o estágio maduro (MII). Já MIV-B apresentou cerca de 50% dos CCOs em MII após 32h de cultivo. Ao microscópio eletrônico o grupo controle apresentou características de maturação tais como a presença de espaço perivitelínico (PvS) desenvolvido, microvilosidades (Mv) eretas, grânulos corticais (GC) alinhados à membrana plasmática e mitocôndrias despersas pelo citoplasma. O grupo 0h apresentou características de imaturidade como pequeno PvS, Mv deitadas, GC em grumos e mitocôndrias no córtex do oócito. Os sistemas de cultura definidos proporcionaram, no entanto a presença de características intermediárias entre o grupo 0h e o grupo controle, como as Mv eretas em 83,3% dos CCOs, presença de mitocôndrias ligeiramente dispersas pelo citoplasma e GC se alinhando à membrana plasmática em 50% dos CCOs cultivados em MIV-C, apesar do bloqueio da meiose. Após 24h de cultivo em MIV-B foram observadas algumas características de maturação semelhantes ao controle maduro, como o alinhamento dos GC e a dispersão das mitocôndrias (p<0,05). As Mv ficaram num estágio intermediário e o PvS seguiu o padrão imaturo (p<0,05). Com 48h de cultivo nenhum outro avanço foi observado para os CCOs cultivados em MIV-B. O cultivo por 48h com MIV-C, no entanto promoveu a dispersão das mitocôndrias e o alinhamento dos GC como no controle maduro (p<0,05). Para a quantificação da expressão gênica por real-time-PCR, os oócitos cultivados nos meios descritos acima foram separados após 24 ou 48h de cultivo em oócitos com (CP) e sem corpúsculo polar (SCP), ou maduros e imaturos respectivamente. Oócitos frescos (0h) foram usados como controle imaturo. O resultado da quantificação da expressão dos genes em geral mostrou que tanto o cultivo com MIV-C, quanto o cultivo com MIV-B apresentou os oócitos imaturos com maior abundância relativa que os oócitos maduros, sendo que a quantificação dos oócitos maduros foi igual ao controle maduro (TCM-199) e a quantificação dos oócitos imaturos foi semelhante ao controle imaturo (0h). As exceções a essa regra foram: O grupo C48SCP (oócitos sem CP cultivados por 48h em MIV-C) para o gene PRDX1, apresentou-se semelhante ao controle maduro (p<0,05); o grupo B24CP (oócitos com CP cultivados por 24h em MIV-B) apresentou maior abundância relativa que o controle maduro para os genes PRDX1 e HSP70.1. Com relação ao gene GDF9, o cultivo dos CCOs por 24h tanto em MIV-B, quanto em MIV-C promoveu maior abundância relativa nos grupos maduros cultivados por 24h (B24CP e C24CP), quando comparados ao controle maduro (p<0,05). A abundância relativa do gene IGFIR não apresentou diferença significativa após o cultivo em MIV-C. No entanto, na comparação da quantificação desse gene após o cultivo em MIV-B por 24h foi observado que o controle maduro apresentou menor abundância relativa do que os demais grupos (p<0,05). No presente estudo, concluiu-se que o cultivo de CCOs em MIV-B ou MIV-C, por se tratar de dois meios estritamente definidos e que, portanto permitem a obtenção de respostas consistentes, constituem bons modelos para o estudo dos eventos que ocorrem durante a maturação oocitária sem necessidade do uso de inibidores da meiose. A manutenção dos CCOs em estágio imaturo in vitro sem qualquer efeito prejudicial pode ser usada para fornecer tempo adicional para estudar o processo de sincronização entre a maturação citoplasmática e nuclear durante a MIV. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The objective was to evaluate the effect of defined culture systems on nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes using a two-step procedure: inhibition and the subsequent resumption of meiotic arrest. In the first step the CCOs were cultured in control medium, MIV-B or MIV-C for 24h. In the second step, the culture continued until 32, 40 or 48 hours for the CCOs cultivated in MIV-B or MIV-C for the time-dependent evaluation of oocytes meiosis stage. The control medium used was TCM-199 supplemented with FCS and FSH. The MIV-C constitution was MEM-Alpha Medium supplemented with PVA, insulin, IGF-I, androstenedione, non-essential amino acids, transferrin and selenium, and the MIV-B constitution was similar to MIV-C, but without the addition of hormones and growth factor. The cytoplasmic maturation was evaluated by transmission electron microscopy (TEM) at 0, 24 and 48 h of cultivation, and by gene expression (HSP70.1, PRDX1, GDF9 and IFF1R). The results showed that MIV-C and MIV-B inhibited the meiosis in about 70% of the CCOs cultivated by 24h. In the subsequent 24h of culture, only 30% of MIV-C CCOs reached the mature stage (MII). MIV-B already has filed about 50% of the CCOs in MII after 32 h of culture. The control group presented ultaestructural characteristics of maturation such as the presence of conspicuous perivitelline space (PvS), erect microvilli (Mv), aligned cortical granules (CG) and spread mitochondria through the cytoplasm. The 0h group has shown characteristics of immaturity as small PvS, bent Mv, clusters of CG and cortical mitochondria. Defined culture systems provided, however the presence of intermediate characteristics between the 0h group and the control group, as the erect Mv in 83.3% of CCOs, the presence of mitochondria cortical/evenly distributed by cytoplasm and aligned/cluster GC in 50% of CCOs cultivated in MIV-C, despite the meiosis arrest. After MIV-B culture for 24h were observed some maturation characteristics similar to control group, as the alignment of the CG and the spread mitochondria (p < 0.05). The Mv were in an intermediate stage and the PvS followed the immature pattern (p < 0.05). With 48h of culture no other advance was observed for the CCOs cultivated in MIV-B. The culture for 48 h with MIV-C, however promoted the dispersion of mitochondria and the alignment of the GC as in mature control (p < 0.05). For the quantification of gene expression by real-time-PCR, the oocytes cultured in the media described above were separated after 24 or 48h of culture in oocytes with (PB) and without polar body (WPB), or mature and immature respectively. Fresh oocytes were used as immature control. The result of the quantification of gene expression in general showed that MIV-C and MIV-B culture presented the immature oocytes with greatest relative abundance that the mature oocytes, and the quantification of mature oocytes was equal to the mature control (TCM-199) and the quantification of immature oocytes was similar to the immature control. The exceptions to this rule were: the C48WPB Group (oocytes without PB cultured for 48 hours MIV-C) for PRDX1 gene appeared similar to mature control (p < 0.05); the B24PB Group (oocytes with PB cultivated in MIV-B for 24h) showed higher relative abundance for PRDX1 and HSP 70.1.genes than the mature control. With respect to GDF9, 24h of culture in MIV-B or MIV-C promoted greater relative abundance in mature groups (B24PB and C24PB), than the mature control (p < 0.05). The relative abundance of IGFIR gene showed no significant difference after cultivation in MIV-C. However, the quantification of this gene after 24h of culture in MIV-B showed lower relative abundance in mature control group than the other groups (p < 0.05). In the present study, it was concluded that MIV-B and MIV-C, can be used in lieu of meiosis inhibitors and furthermore, can provide extra time to study nuclear and cytoplasmic maturation synchrony of IVM.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Environmental issues have supported the interest in renewable sources and agroindustrial residues became a significative resource for the production of new materials, chemicals and energy. This thesis proposes the use of agroindustrial residues (cashew juice and sisal liquid waste) to obtain bacterial cellulose (BC) for further elaboration of nanocomposites with hydroxyapatite (HA). The production of BC membranes by Gluconacetobacter hansenii occurred in Hestrin & Schramm medium (containing mainly glucose as carbon sources), cashew juice and sisal liquid waste cultivated under static conditions. After the incubation period, the BC membranes were purified and nanocomposites prepared by successive immersion of the purified membranes in solutions of Calcium Chloride (CaCl2), and Sodium Phosphate (NaHPO4), followed by drying and subsequent characterization. The materials obtained were characterized by X-ray Diffraction (XRD), Fourier Transform Spectroscopy (FTIR), Energy Dispersive Spectroscopy (EDS), Thermogravimetric Analysis (TGA), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Scanning Electron Microscopy (SEM) and mechanical tests. Additionally, in vitro tests were performed for nanocomposites. The results showed the production of cellulose from the three substrates studied, without the need for further supplementation or pH change. In all characterizations, structure and typical behavior of bacterial cellulose were found. Scanning electron microscopy allowed investigation of morphology of cellulose fibers and observation of deposition of hydroxyapatite particles. The mechanical properties of nanocomposites based on BC and HA showed decrease in elastic modulus compared to pure films with increase in elongation. The composites showed bioactivity, stability in solution and the adsorption capacity of proteins, which lead to potential biocompatibility of these materials. / QuestÃes ambientais tÃm suscitado o interesse por fontes renovÃveis e os resÃduos agroindustriais tornaram-se uma importante matÃria prima para a produÃÃo de novos materiais, de produtos quÃmicos e de energia. Esta tese propÃe o uso de resÃduos agroindustriais (suco de caju e lÃquido de sisal) na obtenÃÃo de celulose bacteriana (CB) para posterior preparo de nanocompÃsitos com hidroxiapatita (HA). A obtenÃÃo de CB se deu por cultivo de Gluconacetobacter hansenii em meio Hestrin & Schramm (contendo principalmente glicose como fonte de carbono), suco de caju e resÃduo lÃquido de sisal, sob condiÃÃes estÃticas. ApÃs o perÃodo de incubaÃÃo, as membranas de CB foram purificadas e os nanocompÃsitos preparados por imersÃo sucessiva das membranas purificadas em soluÃÃes de Cloreto de CÃlcio (CaCl2) e Fosfato de SÃdio (NaHPO4), seguida de secagem e posterior caracterizaÃÃo. As membranas de CB e os materiais nanocompÃsitos obtidos foram caracterizados por DifraÃÃo de Raios X (DRX), Espectroscopia de Transformada de Fourier (FTIR), Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS), AnÃlise TermogravimÃtrica (ATG), Calorimetria ExploratÃria Diferencial (DSC), Microscopia EletrÃnica de Varredura (MEV) e ensaios mecÃnicos. Adicionalmente, foram realizados testes in vitro para os nanocompÃsitos. Os resultados mostraram que houve produÃÃo de celulose a partir dos trÃs substratos estudados, sem a necessidade de suplementaÃÃo adicional ou alteraÃÃo do pH. Por meio das caracterizaÃÃes, foi possÃvel verificar que as pelÃculas obtidas apresentaram estrutura e comportamento tÃpicos de celulose bacteriana. A microscopia eletrÃnica de varredura permitiu investigar a morfologia das fibras de celulose e observar a deposiÃÃo das partÃculas de hidroxiapatita. As propriedades mecÃnicas dos nanocompÃsitos, baseados em CB e HA, apresentaram diminuiÃÃo do mÃdulo elÃstico, comparativamente Ãs pelÃculas puras, com aumento da elongaÃÃo na ruptura. Os compÃsitos apresentaram bioatividade, estabilidade em soluÃÃo e capacidade de adsorÃÃo de proteÃnas, aspectos que servem de indicativo para a biocompatibilidade desses materiais.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2017-12-26T18:34:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE-PPGCF-BC-UFPE.pdf: 10588160 bytes, checksum: d80cceb99be1ce649a6d1c41562ac460 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-26T18:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE-PPGCF-BC-UFPE.pdf: 10588160 bytes, checksum: d80cceb99be1ce649a6d1c41562ac460 (MD5) Previous issue date: 2016-11-30 / FACEPE / A anfotericina B (AnB) é um antibiótico macrolídeo derivado de uma cepa de Streptomyces nodosus, de reconhecida atividade antifúngica e leishmanicida. No entanto, tem seu uso limitado em razão da elevada toxicidade. Para tentar reduzir essa toxicidade na forma convencional tem se estimulado o desenvolvimento de novos sistemas de liberação. A via tópica oferece algumas vantagens, todavia a eficácia tópica só é obtida quando o fármaco apresenta adequado grau de penetração na pele. As microemulsões (MEs) são uma proposta interessante para a veiculação por via tópica da AnB, pois atuam como promotores de permeação, devido ao reduzido tamanho das gotículas formadas, assim como pelo seu alto conteúdo de tensoativos, que desorganiza os lipídeos da pele. Além disso, as MEs podem proporcionar uma modificação na biodisponibilidade e na diminuição da toxicidade dos fármacos, visto que esses sistemas apresentam-se como reservatórios capazes de liberar e direcionar os fármacos para tecidos e células específicas do organismo. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver e comparar as características biofarmacêuticas e potencial irritante de MEs e sistemas convencionais (SCs) contendo óleo de Syagrus cearensis para administração tópica de AnB. Diagramas de fase pseudo-ternários foram construídos utilizando o método de titulação de água para desenvolver as MEs e os SCs foram preparados de acordo com a técnica clássica de inversão de fase. No estudo de permeação e retenção cutânea, pele de porco dermatomizada sem estrato córneo foi utilizada como um modelo de biomembrana lesionado. O potencial de irritação foi avaliado utilizando três métodos alternativos, os ensaios da membrana corioalantóide (HET-CAM e CAM-TBS) e o teste de opacidade e permeabilidade em córnea bovina (BCOP). A formulação otimizada (ME02) consistiu em Anfotericina B a 0,1% (p/p), óleo catolé 9,1% (p/p), Smix (1:1, Tween 20 e Kolliphor EL) 81%, tamanho de gotícula de 31,02 ± 0,9 nm, potencial zeta de -23,4 mV e viscosidade 0,63 ± 0,1 Pa.s. A ME02 exibiu maior retenção de AnB nas camadas de pele (84,79 ± 2,08 μg.cm-2) do que todas as outras formulações. Em geral, as MEs apresentaram maior liberação e retenção do fármaco do que os SCs e todas as formulações mostraram maior retentividade que permeabilidade. Apenas as MEs desenvolvidas usando Labrasol/Plurol (L/PO) como par de tensoativos exibiram um potencial de irritação moderado, todas as outras formulações foram classificadas como não-irritantes ou levemente irritantes. Os resultados indicam que as formulações contendo óleo de S. cearensis são alternativas promissoras para a administração tópica da AnB visando o tratamento da leishmaniose cutânea. / Amphotericin B is a macrolide antibiotic derived from a strain of Streptomyces nodosus, known for its antifungal and antileishmanial activity. However, it has limited use due to the high toxicity. In order to reduce the toxicity in the conventional way, the development of new delivery systems has been stimulated. Topical administration of active drugs is a route that offers certain advantages, however, topical efficacy is only obtained from drugs with a suitable degree of penetration into the skin. Microemulsions are an interesting proposal for topical administration of Amphotericin B, because they act as permeation enhancers, due to the small size of the droplets formed, as well as to its high content of surfactants, which disrupts the skin lipids. Moreover, the MEs can also provide a change in bioavailability and by decreasing the toxicity of drugs, since such systems are presented as reservoirs capable of releasing drugs and targeting tissues and specific cells of the organism. Therefore, the aim of this study was to compare the biopharmaceutical characteristics and irritation potentials of microemulsions (MEs) and conventional systems (CSs) containing oil from Syagrus cearensis for intradermal delivery of Amphotericin B (AmB). Pseudo-ternary phase diagrams were constructed using a water titration method to develop the MEs, and the CSs were prepared according to the classical technique of phase inversion. In the skin permeation and retention study, dermatomed pig skin without stratum corneum was used as an alternative disturbed skin model. The irritation potential was evaluated using three different methods, chorioallantoic membrane assays (HET-CAM and CAM-TBS), and bovine corneal opacity and permeability test (BCOP). The optimized formulation (ME02) consisting of 0.1% (w/w) Amphotericin B, 9.1% (w/w) catolé oil, 81% (w/w) Smix (1:1, Tween 20 and Kolliphor EL) possessed droplet size of 31.02 ± 0.9 nm, zeta potential of -23.4 mV and viscosity 0.63 ± 0.1 Pa.s. ME02 exhibited greater retention of AmB in to skin layers (84.79 ± 2.08 μg.cm-2) than all the others formulations. In general, MEs showed higher drug release and retention than CSs and all of the formulations showed greater retentivity than permeability. Only MEs developed using Labrasol/Plurol Oleique (L/PO) as the surfactant and co-surfactant exhibited a moderate irritation potential, all other MEs and CSs were classified as non-irritants or slight irritants. The results indicate that formulations containing oil from S. cearensis are promising alternatives for the delivery of AmB targeting the treatment of cutaneous leishmaniasis.

Orientador: Simone L. K. Shepherd / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T11:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chang_ClaudiaIsabelPaolaHinojosa_M.pdf: 4927794 bytes, checksum: 5ccce4e9def72c2c8c1b99efa043f932 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A malária, um dos maiores problemas de saúde pública dos países tropicais, vem sendo combatida através de medicamentos sintéticos como a cloroquina e derivados, os quais apresentam sérios efeitos colaterais e cuja eficácia é afetada principalmente pela resistência do agente causador da malária a estes medicamentos. Um extrato vegetal de Artemisia annua, contendo artemisinina vem sendo utilizado à milhares de anos na China e tem-se mostrado eficaz no combate às febres, entre elas a malária. A influência da concentração dos nutrientes dos meios padrão Murashige & Skoog (1962), Gamborg et al (1968)e White (1943), adicionados de fitoreguladores (GA3 e AIA), na produção de artemisinina e do seu precursor, o ácido artemisininico foi observada através dos estudos de cultivo in vitro de Artemisia annua L. Os cultivos in vitro das plântulas foram realizados em períodos de 14 e 28 dias. Os experimentos mostraram que dentre os meios padrões utilizados o meio White (com nutrientes em menor concentração) promoveu um maior efeito tanto no crescimento das plântulas, como na produção de artemisinina. Para otimizar a produção in vitro de artemisinina e do ácido artemisinínico, 80 meio de White foi adicionado o retardante de crescimento (CCC) e foram reduzidos os níveis de fosfato e nitrato das concentrações originais do meio constatando-se que não afetaram significativamente o teor de artemisinina. Já a diminuição pela metade da concentração original de nitrato do meio White aumentou significativamente a produção de ácido artemisininico na parte aérea. A adição do retardante CCC (com o ótimo da concentração de 150 mg/l) no meio padrão de White aumentou significativamente a produção do ácido artemisininico, notadamente na parte aérea. Assim, o estudo da composição nutricional do cultivo in vitro permite uma otimização da produção de artemisinina e do respectivo precursor, visando a obtenção de um medicamento antimalarico, oferecendo pois, uma importante perspectiva para a indústria farmacêutica já que a sintese quimica de artemisinina até hoje, tem-se mostrado técnica e economicamente inviável / Abstract: Malaria, one of tbe major public health poblems in tropical countries, has been counteracted by syntbetic drogs such as chloroquine and their derivatives, presenting serious side effects. In addition their efficacy is affected mainly by the resistance of the malaria causing agent to these drugs. A plant extract from Artemisia annua, containing artemisinin, has been used for millenium in China, showing great efficacy against fevers including malaria. The influence of the nutrient concentrations in the standatd basal media of Murashige & Skoog (1962), Gamborg et al (1968) and White (1943), supplemented with growth regulators GA3 and IAA an the production of artemisinin and its precursor artemisinic acid, was observed using an in vitro culture of Artemisia annua L. The experiments showed that of the different media tested, White's medium (with lower nutrieot concentrations) better enhanced the growth of seedlings and artemisinin production. In order to optimize the in vitro poduction of artemisinin and artemisinic acid, White's medium was supplemented with a growth retardant (CCC) and the phosphate and nitrate levels reduced. it being shown that this did not affect the artemisinin content significantly. A fifty percent reduction in the initial nitrate content of White's medium significantly increased the artemisinic acid productian in the serial part. The addition of CCC (optimal concentration of 150 mg/l) to White's basal medium significantly increased artemisinic acid productian, especially in the serial part. Thus the study of the nutritional composition of an in vitro culture allowed optimization of the production of artemisinin and its precursor, with the objetive of obtaining an antimalarial drug, offering a valuable perspective for the pharmaceutical industry, since nowadays the chemical synthesis of artemisinin is technically and economically inviable / Mestrado / Mestre em Ciências

O cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais, iniciado no começo do século XX, propiciou avanços no conhecimento científico e biotecnológico. O processo de regeneração in vitro depende tanto das condições de cultivo quanto da base genética dos explantes utilizados. Alguns autores postulam que a regeneração pode ser dividida em etapas e o balanço entre hormônios vegetais é responsável por determinar o destino dos explantes (e.g. formação de raízes, gemas ou calos). Em estudo realizado anteriormente, foi constatada a alta capacidade de regeneração de gemas caulinares adventícias in vitro do mutante Mouse-ears, que apresenta folhas com maior complexidade. Diante disso, neste trabalho outros mutantes que afetam a arquitetura foliar, como entire, procera, clausa, potato-leaf e Mouse-ears, foram avaliados ex vitro e in vitro, no \"background\" da cultivar Micro-Tom (MT). A caracterização fenotípica dos genótipos demonstrou que as mutações estudadas afetam vários outros aspectos do desenvolvimento, além das folhas. Muitas das diferenças observadas ex vitro, são em parte devidas à transição de estágio vegetativo para reprodutivo. Ao analisarmos os resultados de regeneração in vitro (formação de gemas caulinares e raízes adventícias; e crescimento de calos), nota-se que a capacidade organogenética de cada mutante não tem correlação com o grau de complexidade foliar, mas sim com tipo de mutação envolvida. Análises morfológicas de eventos in vitro e ex vitro quanto à formação de gemas caulinares adventícias e do meristema apical caulinar, respectivamente, denotam que ocorrem tanto similaridades quanto disparidades entre os dois processos. Os resultados indicam que provavelmente os mutantes entire (respota constitutiva a auxina por perda de função de um AUX/IAA) e Mouse-ears (super expressão do gene KNOX TKN2) atuam na etapa de indução de raízes e gemas, respectivamente, no processo de regeneração in vitro. Em contra partida, procera (resposta constitutiva a giberelina) atuaria na etapa de aquisição de competência ou retardo do desenvolvimento pós-indução. Além disso, TKN2 demonstrou ter um importante papel na formação de gemas caulinares adventícias in vitro. As vias para a formação de orgãos ex vitro (e.g. folhas, raízes, gemas axilares etc.) são diferentes da in vitro. Apesar disso, vários genes e moléculas recrutados em uma via de desenvolvimento ex vitro podem interferir na organogênese in vitro. / The in vitro culture of plant cells, tissues and organs, started at the beginning of the 20th century, has been leading to scientific and biotechnological advances ever since. The process of in vitro regeneration depends on the growth conditions as well as the genotype of the explant. Several authors postulated that regeneration can bedivided into steps and that the hormonal balance will determinate the fate of the explant (e.g. formation of roots, shoots or callus). In a previous study, it was found that the mutant Mouse-ears, which exhibits a more complex leaf architecture, has high capacity of shoot regeneration. Hence, in the present work others mutants affecting leaf architecture such as entire, procera, clausa, potato-leaf and Mouse-ears were measured ex vitro and in vitro in the MT background. These assessments aimed to investigate if there are similarities in organogenesis between in vitro and ex vitro. The phenotypic characterization of the genotypes showed that these mutations affect several aspects of plant development and not only the leaf architecture. Many differences observed ex vitro are in part due to the transition from vegetative to reproductive phase. When analyzing the results of in vitro regeneration (formation of adventitious shoots and roots; and callus growing) it is noticed that the organogenetic capacity of each mutant have no correlation with the degree of leaf complexity but with the type of mutation involved. Morphological analysis of in vitro and ex vitro events, such as formation of adventitious shoots and shaping of shoot apical meristem, respectively, denotes similarities and divergences between the processes. The results indicate that probably the mutants entire (constitutive response to auxin due to a loss-of-function in an AUX/IAA) and Mouse-ears (overexpression of a KNOX TKN2) act at the induction step of root and shoot, respectively, in the in vitro regeneration process. On the other hand, procera (constitutive response to gibberellin) acts at the competence step or the arrest of the development after induction. Furthermore, TKN2 showed an important role in the formation of in vitro adventitious shoots. The pathways for ex vitro organ formation (e.g. leaf, root, axillary buds, etc.) are different from that for in vitro. Nevertheless, genes and molecules recruited in the pathway of ex vitro development may interfere in the in vitro organogenesis.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:59:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mirian_farias_ribeiro.pdf: 619687 bytes, checksum: cf80f947861c533664196359ce7fe274 (MD5) Previous issue date: 2010-03-04 / The objective of this work was to evaluate the effect of aluminum (Al) on in vitro multiplication and rooting of pear and quince. The explants were nodal segments of pear and quince in vitro cultivated. The culture medium to pear was QL modificated by Leblay and to quince was MS, both added of Al to 0 (pH 5,7, control), 0, 15, 30, 45 e 60 mg L-1 (pH 4,0) put in jars with 1 g of cotton for multiplication and 3 g of vermiculite for rooting and 30 mL of medium. The trial had four replicates and five explants each. At 60 days the percentage of shoots, length and number of shoots, fresh and dry mass and catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) activity in pear were assessed. At 45 days the percentage of rooting, length and number of root, fresh and dry mass of shoots and roots, CAT, APX and superoxide dismutase (SOD) activity in pear and nutrients content were assessed. In the multiplication, the quince had 100% of shoot, but decreased the number of shoots. The length of shoots, fresh and dry mass decreased in MC but increased in BA 29 . The pear had high percentage of shoots. The number of shoot was higher for Conference . The length of shoots, fresh and dry mass was increased at Al. CAT activity in Conference was increased at 30 mg L-1 of Al and in Abate Fetel was increased at 30 and 45 mg L-1 of Al. APX activity in Conference was increased at 30 and 60 mg L-1 of Al and in Abate Fetel was increased at 30 mg L-1 of Al. In the rooting, the percentage of rooting, lenght and number of roots was higher for quince. The fresh mass of shoot was higher for Conference and for 30 mg L-1 of Al. The fresh mass of root was higher for BA 29 at 15 mg L-1 of Al. The dry mass of shoot was higher for Conference and for 15 and 30 mg L-1 of Al. The dry mass of root was higher for BA 29 and for 15 mg L-1 of Al. The nutrient content increased at aluminum. In the Abate Fetel the CAT and APX activity was increased and the SOD activity was decreased at aluminum. On the other hand, in the Conference the CAT activity was decreased at aluminum, the APX was decreased only at 45 mg L-1 of Al and the SOD activity was increased. As conclusion, the cultivars answered of different form at Al and, in some parameters, the presence of this metal was beneficial. / O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do alumínio (Al) na multiplicação e enraizamento in vitro de pereira e marmeleiro. Os explantes constituíram-se de segmentos nodais de pereira e marmeleiro cultivados in vitro. O meio de cultura para pereira foi o QL modificado por Leblay e para marmeleiro foi o MS, ambos adicionados de Al a 0 (pH 5,7 controle), 0, 15, 30, 45 e 60 mg L-1 (pH 4,0), colocado em frascos contendo 1 g de algodão hidrófilo para multiplicação e 3 g de vermiculita para enraizamento e 30 mL de meio. O experimento constou de quatro repetições com cinco explantes cada. A multiplicação foi avaliada aos 60 dias quanto a percentagem de explantes brotados, número e comprimento das brotações, massa fresca e massa seca total e a atividade das enzimas catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX) em pereira. O enraizamento foi avaliado aos 45 dias quanto a percentagem de explantes enraizados, número e comprimento das raízes, massa fresca e seca da parte aérea e radicular, a atividade das enzimas CAT, APX e superóxido dismutase (SOD) em pereira e teor de nutrientes. Na multiplicação, o marmeleiro teve 100% de explantes brotados, mas houve diminuição no número de brotos. O MC apresentou diminuição no comprimento dos brotos, na massa fresca e seca, já o BA 29 apresentou aumento desses parâmetros. A pereira teve alta percentagem de explantes brotados. A Conference apresentou maior número de brotos. Com relação ao comprimento dos brotos, massa fresca e seca houve aumento na presença de Al. A atividade da CAT na Conference foi aumentada em 30 mg L-1 de Al e na Abate Fetel foi aumentada em 30 e 45 mg L-1 de Al. A atividade da APX na Conference foi aumentada em 30 e 60 mg L-1 de Al e na Abate Fetel foi aumentada em 30 mg L-1 de Al. No enraizamento, o marmeleiro apresentou maior percentagem de enraizamento, maior número e comprimento das raízes. A maior massa fresca da parte aérea foi obtida pela Conference e por 30 mg L-1 de Al. A massa fresca da raiz foi maior no BA 29 em 15 mg L-1 de Al. A maior massa seca da parte aérea foi obtida pela Conference e por 15 e 30 mg L-1 de Al. A maior massa seca da raiz foi obtida pelo BA 29 e por 15 mg L-1 de Al. O teor de nutrientes aumentou na presença de Al. A atividade da CAT e APX aumentou e da SOD diminuiu em Abate Fetel na presença de Al, enquanto que na Conference a atividade da CAT diminui, da APX diminuiu somente em 45 mg L-1 de Al e da SOD aumentou. De modo geral, os cultivares responderam de vii forma diferente a presença de Al e, em alguns parâmetros, a presença desse metal foi benéfica.

The generation of high affinity, selective, and in vivo-stable peptide-based drugs is currently a major challenge in the field of drug development. Technologies exist that permit the generation of a vast diversity of chemical and conformational space and an example of such a technology is mRNA display, which utilizes protein translation machinery to produce a wide array of polypeptides starting from a combinatorial library of mRNA templates. The intention of this research was to bridge mRNA display to a reconstituted translation system using protein synthesis using recombinant elements (PURE) system for a new drug discovery platform. We hypothesized that it is possible to generate mRNA-peptidomimetic fusions using reconstituted translation system and chemo-enzymatically charged tRNAs, to incorporate unnatural amino acids into mRNA-peptidomimetic fusions. Upon demonstating that the reconstituted system was functional, we have synthesized hexapeptide fusion products containing four alanine residues and one biocytin residue. Fusions were assayed using urea-PAGE in the presence of streptavidin which allowed for unambiguous evaluation of the full length fusion fraction. It was determined that overall more fusion product was generated with template that codes for biocytin early in the coding sequence, but that the percent of biocytin-containing product stays similar regardless of the biocytin place in the coding region. We have also found that the change in template untranslated region length does not improve incorporation of biocytin in dipeptide fusions within the tested range. Finally, after first unsuccessful attempts to make sarcosine hexapeptide fusions, we investigated the effect of magnesium ion concentration on the translation reaction. As a result of four series of experiments performed involving both alanine and sarcosine fusion synthesis in parallel, we concluded that an increase in magnesium concentration from 5 mM to 20 mM coincided with enabling of the reconstituted system in making hexapeptide fusions with sarcosine in a significantly high number of cases. This research work arises from the need to enable a new drug discovery tool that will allow both synthesis and affinity maturation of peptide-based compounds. It represents our pioneering efforts to develop a new technology and ultimately help bring to existence compounds of significant therapeutic value. / Pharmaceutical Sciences, Faculty of / Graduate

>Magister Scientiae - MSc / Heterologous metagenomic screening strategies have relied largely on the construction of DNA libraries and screening in Escherichia coli to access novel enzymes. There is an increased demand for the identification of novel lignocellulose degrading enzymes with enhanced biochemical properties which are suitable for applications in industrial processes; biofuels being one of them. The use of heterologous gene expression in function based metagenomic studies has resulted in the discovery of enormous novel bioactive compounds. However, there are limitations associated with using E. coli as a heterologous host which does not allow transcription and translation of all genes in the metagenome. E. coli can only express 40% of the environmental DNA because of promoter recognition, codon usage, and host toxicity of gene products. Therefore alternative strategies for expressing or producing novel enzymes are needed, which can also be employed in metagenomic gene discovery. In vitro protein synthesis is an important tool in molecular biology and used to obtain proteins from genes for functional and expression studies. These systems may hold the key to unlock more of the potential in metagenomic DNA. The broader aim of the study is to develop non- E. coli based cell-free protein synthesis systems to further the metagenomics screening. In this study, Rhodococcus erythropolis H8 was evaluated for its suitability in cell-free expression. Crude extracts containing the macromolecular components (70S or 80S ribosomes, tRNAs, initiation, elongation and termination factors) fromR. erythropolis were prepared using existing crude extract based cell-free protein synthesis (CFPS) protocols. Three genes were selected and used as templates for synthesis: cell11, xp12 and acetyl xylan esterase (axe10), all previously isolated from metagenomic libraries screened inE. coli. As judged by zymograms and enzyme assays, all enzymes were successfully expressedfrom their native promoters and in recombinants clones using the PtipA promoter, and wereactive. Furthermore, the amounts of XP12 protein produced using pFos-XP_12 was 1.2mg/mlfrom E. coli and 1.67mg/ml from R. erythropolis CFPS, showing that the R. erythropolismachinery was more efficient in the expression of XP12 than the E. coli machinery. To the best of our knowledge this is the first demonstration of a cell-free expression using an actinomycete.

Introduction: Understanding the relationship between muscle loads crossing the knee joint and knee joint mechanics is critical for understanding knee stability and the effects of altered muscle forces on healthy and ACL injured knees. In vitro measurement can be used to elucidate this if the simulation is biofidelic, allowing the physiological levels of applied loads to dictate the tibiofemoral kinematics in all degrees of freedom (DoF). The objectives of this study were to describe and apply the University of Ottawa knee simulator as well as measure the reliability of the device. In addition, this device was used to quantify the effect of muscle loads and anterior cruciate ligament (ACL) resection on contact mechanics and kinematics of the tibiofemoral joint. Methods: Muscle forces were determined from an electromyography-driven musculoskeletal model of a healthy male during gait. Six knee specimens were loaded into the simulator and subjected to 100%, 75% and 50% in vivo muscle forces applied through the 6 simulated muscles, in addition to a quadriceps weakness and a hamstring weakness condition. Tibiofemoral mechanics were measured with all 5 loading conditions before and after ACL transection. Results: With the ACL intact, very high reliability in contact area and pressures among loading conditions were observed as the intra-class correlation coefficients (ICC) ranged from 0.932 to 0.99. After ACL transection, reliability remained very high as ICCs ranged from 0.926 to 0.99. In all simulated conditions, muscle forces maintained the knee joint in a stable position resulting in minimal kinematic differences, but altered contact mechanics in both the ACL and non-ACL condition. Removal of the ACL significantly reduced both the medial and lateral contact areas in all loading conditions compared to the ACL intact condition. Conclusion: In summary, the UOKS has demonstrated high reliability within repeated measures. Additionally, small, normally undetectable alterations in joint kinematics resulted in significant alterations to contact mechanics, which can be linked to the degenerative process.