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Možnosti a význam prodloužené kultivace embryí / Potential and significance of extended embryo cultureUher, Petr January 2011 (has links)
The aim of this dissertation thesis is to emphasize the sense of extended cultivation of embryos to the stadium of blastocyst and its influence on success of assisted reproduction and facilitation of pre implantation diagnosis, analysis of cultivation media and derivation of human embryonic stem cells. Author summarizes current literary findings in assisted reproduction and examines the currently used methods. Author also submits his own published experimental works, in which he compares his own results of infertility treatment with usage of extended cultivation to blastocyst with results of other techniques. Furthermore author submits his own published experimental works which are using extended cultivation for pre implantation diagnosis and its improvement. Another experimental works includes possibility of stem cells derivation. Usage of extended cultivation to blastocyst convincingly leads, according to author's own experiments and simultaneously to available literary findings, to higher success of infertility treatment. This is especially significant by middle-aged mothers. Sufficient term of cultivation enables not just selection, but also biopsy and its generic treatment. Long-term cultivation also enables analysis of cultivation media - but these didn't met the expectations for increase of...
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Determinação do fenótipo sexual em uma criança com Mosaicismo 45,X/46,X,Idic(Yp): importância da proporção relativa da linhagem 45,X no tecido gonadal / Determination of the sexual phenotype in a child with 45,X/46,X,Idic(Yp) Mosaicism: importance of the relative proportion of the 45,X line in gonadal tissueGuedes, Alexis Dourado [UNIFESP] 31 December 2006 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2006-12-31 / We report here on a girl who, despite her 45,X/46,X,der(Y) karyotype, showed no signs of virilization or physical signs of the Ullrich-Turner syndrome [UTS], except for a reduced growth rate. After prophylactic gonadectomy due to the risk of developing gonadoblastoma, the gonads and peripheral blood samples were analyzed by fluorescence in situ hybridization [FISH] and polymerase chain reaction [PCR] to detect Y-specific sequences. These analyses allowed us to characterize the Yderived chromosome as being an isodicentric Yp chromosome [idic(Yp)] and showed a pronounced difference in the distribution of the 45,X/46,X,idic(Yp) mosaicism between the two analyzed tissues. It was shown that, although in peripheral blood almost all cells (97.5%) belonged to the idic(Yp) line with a duplicated SRY gene, this did not determine any degree of male sexual differentiation in the patient, as in the gonads the predominant cell line was 45,X (60%). / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Differentially Expressed MicroRNAs Act As Inhibitors of BDNF in Prefrontal Cortex - Implications for Schizophrenia: A DissertationMellios, Nikolaos 13 March 2009 (has links)
During my thesis work I studied the expression and potential function of brain expressed microRNAs (miRNAs) in human prefrontal cortex (PFC). Initially, I used combinatorial computational analysis and microarray data to identify miRNAs that are predicted with high probability to target the human Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) 3’ Untranslated Region (3’UTR) and are expressed in moderate to high levels in adult human prefrontal cortex. A subset of 10 miRNAs segregating into 5 different miRNA families (miR-30a-d, miR-103/107, miR-16/195, miR-191 and miR-495) met the above criteria. I then designed a protocol to detect these miRNAs with Locked Nucleic Acid (LNA) in situ hybridization in human prefrontal cortex and determine their layer and cellular expression patterns. LNA in situ revealed differential lamina and cellular enrichment of BDNF-related miRNAs. As an example, miR-30a-5p was found to be enriched in large pyramidal neurons of layer 3, which was verified using laser capture microdissection of layer 3 pyramidal neurons and quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) following dissection of upper and deeper layers of human PFC. Parallel to this, I used miRNA qRT-PCR to determine the developmental expression of miRNAs using postmortem PFC tissues ranging from embryonic age to old adulthood and compared miRNA to BDNF protein levels. My results revealed a robust inverse correlation between BDNF-related miRNAs and BDNF protein during late maturation and aging of human prefrontal cortex. In vitro luciferase assays and/or lentivirus mediated neuronal miRNA overexpression experiments validated that at least two miRNAs, miR-30a-5p and miR-195, target human BDNF 3’UTR and mediate its translational repression.
In the second part of my thesis work I measured levels of miR-30a and miR-195 in the prefrontal cortex of patients with schizophrenia and compared them with levels of BDNF protein and BDNF-related GABAergic mRNAs. According to my results differences in miR-195 levels in a subset of subjects diagnosed with schizophrenia were found to be associated with disease related changes in BDNF protein levels and deficits in BDNF dependent GABAergic gene expression.
In the last part of my work I focused on miR-30b, another member of the miR-30 family, which I found to be reduced in the prefrontal cortex of female but not male subjects with schizophrenia. More importantly, disease related changes in miR-30b levels were strongly associated with the age of onset of the disease. Additional experiments in mouse cortex and hippocampus revealed a gender dimorphic expression pattern of this miRNA with higher expression in female brain.
Collectively, my results suggest that miRNAs could participate in novel molecular pathways that play an important role during cortical development and maturation and are potentially linked to the pathophysiology of neuropsychiatric disease.
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Associação entre o papiloma vírus humano e o carcinoma epidermóide de orofaringe : um estudo de caso-controleSchwartsmann, Carla Cuenca January 2013 (has links)
Introdução: A incidência do carcinoma epidermóide de orofaringe (CEO) aumentou em todo o mundo nos últimos 30 anos. Estudos identificaram o papiloma vírus humano (HPV) como um fator de risco para essa neoplasia. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi verificar a frequência do HPV em pacientes com CEO e em pacientes sem neoplasia maligna e avaliar a existência de uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os dois grupos. O objetivo secundário foi estudar a correlação entre a infecção pelo HPV e a localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral. Métodos: Foi realizado um estudo de caso-controle com 59 pacientes com CEO e 54 pacientes sem neoplasia, no qual foram analisados os blocos de parafina contendo material tumoral e tecido não neoplásico. Foram analisadas respectivamente a frequência do HPV e sua atividade viral utilizando a técnica de hibridização in situ cromogênica (CISH) para HPV de baixo risco (BR) e alto risco (AR) e a expressão imunoistoquímica da proteína P16. Resultados: A frequência do HPV foi maior no grupo caso em comparação ao grupo controle quando utilizamos a expressão imunoistoquímica da proteína P16 como método de detecção isolado (OR=10,3; P<0,001) e quando utilizamos a CISH e a expressão imunoistoquímica da proteína P16 em conjunto (OR=21,4; P<0,001). A CISH isoladamente não mostrou uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os grupos estudados (P=0,572). A localização tumoral na orofaringe e o estadiamento clínico não mostraram correlação com a infecção pelo HPV em nenhum dos métodos utilizados, assim como o grau de diferenciação tumoral (P>0,20). Conclusão: Utilizando-se a técnica de imunoistoquímica para P16 isolada ou combinada com a técnica de CISH, observou-se uma maior positividade para o HPV no grupo de pacientes com CEO. A localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral não tiveram correlação com a positividade para o HPV. / Introduction: The incidence of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OSCC) has increased worldwide over the last 30 years. Studies have identified human papillomavirus (HPV) infection as a risk factor for OSCC. Objectives: To compare the frequency of HPV infection in patients with OSCC and patients with benign oral or oropharyngeal disease and ascertain whether a statistically significant difference in HPV frequency exists between these two groups. As a secondary objective, to assess potential correlations between HPV positivity, anatomic site of OSCC, tumor staging, and degree of tumor differentiation. Methods: Case-control study. The sample comprised 59 patients with OSCC and 54 non-OSCC controls who underwent surgery for benign oral or oropharyngeal conditions. Paraffin-embedded specimens from cases and controls were tested for HPV positivity by chromogenic in situ hybridization (CISH) for low-risk (LR) and high-risk (HR) HPV, and HPV activity was assessed by P16 immunohistochemistry (IHC). Results: The frequency of HPV positivity was higher in the case group than in the control group when assessed by P16 IHC alone (OR=10.3, P<0.001) or by CISH and P16 IHC in combination (OR=21.4, P<0.001). CISH alone did not detect any significant between-group difference in HPV frequency (P=0.572). Tumor site, staging, and differentiation did not correlate with HPV positivity with any of the methods employed (P>0.20). Conclusion: Using a P16 IHC assay alone or combined with CISH, the authors showed a higher rate of HPV positivity among patients with OSCC, as compared with patients with benign disease. Tumor site within the oropharynx, tumor stage, and degree of differentiation did not correlate with HPV positivity.
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Abortamento humano : detecção molecular de AAV e de HPV em decídua e vilosidade coriônicaPereira, Christiane Curi 14 November 2007 (has links)
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Dissertacao Christiane Curi Pereira.pdf: 2501945 bytes, checksum: c02dc6d15d4b6729d5526b333fcb0768 (MD5)
Previous issue date: 2007-11-14 / Pregnancy failure is a common event often of unknown cause. Some viruses are suggested as cause of abortion and, among them, adeno-associated virus (AAV), that has never been implicated as a cause of disease. AAV (AAV1-11 types),
belonging to Parvoviridae family, requires helper virus function for replication, as from human papillomavirus (HPV), that belongs to Papillomaviridae family, also suggested as being an etiologic agent of abortion. Thus, this study aimed to detect nucleic acid of AAV and HPV in decidua and chorionic villi (CV) from human abortion occurred up to 22nd gestational week. A total of 118 fragments (66 decidua and 52 CV) were obtained from tissues from 81 abortion cases (68 non-intentional and 13 intentional ones). Viral DNA was extracted by DNAzolTM, TRIzolTM and/or QIAampTM DNA mini Kit methodologies and b-globina gene was amplified by PCR as a control reaction.
AAV2/5 and HPV genome were amplified (nested-PCR and PCR, respectively) using primer pairs Pan1/Pan3 and Nest1/Nest2 and MY09/11, respectively. HPV positive
cases were submitted to PCR-typing for the most common types (6, 11, 16, 18, 33). In situ hybridization (ISH) was developed in paraffin embedded tissues from AAV
positive cases, using digoxigenin labeled probe. Frequency of AAV and HPV were observed in 28% (23/81) and 10% (8/81) of the cases, respectively. Only type AAV2 was detected. AAV2 was present in 18 and in 7 decidua and CV fragments,
respectively, while HPV, in 4 and 5 fragments, respectively. AAV2 occurred in 32% (22/68) and in 8% (1/13) of non-intentional and intentional abortions, respectively, and HPV, in 10% (7/68) and 8% (1/13), respectively. Only one HPV were typed, corresponding to HPV11. ISH showed AAV DNA in 3 cases: in decidua, CV or chorionic plate and extravillous trophoblast. Co-infection rate between AAV and HPV
was 26%, and with CMV (previously studied), 9%. Significant evidence of AAV infection in abortion tissues was observed in the present study, however, in lower frequency than those found in literature. Only AAV2 type revealed in the cases,
instead of AAV5, suggests that it is the most frequent in population and/or shows tissue tropism. Infected cells with AAV2, observed by ISH in decidua and in extravillous trophoblast, suggest that cellular invasiveness of infected cells could be compromised and that gestational loss may occur. Frequency of HPV in CVs is in accordance to literature. HPV was found in similar frequency in the two abortion
groups. AAV presence found in cases without co-infection with helper virus, could represent latency, autonomous replication or co-infection with other helper virus. These results do not allow inference to a causal association between AAV and abortion, albeit mostly detected in non-intentional abortion. / O abortamento humano é um evento comum e muitas vezes considerado de causa desconhecida. Alguns vírus são sugeridos como causa da perda gestacional e, dentre eles, o vírus adeno-associado (AAV), que não está comprovadamente
associado à doença humana. Os AAVs (tipos AAV1-11), pertencentes à família Parvoviridae, necessitam de vírus helper para sua infecção produtiva e dentre eles, está o papilomavírus humano (HPV), pertencente à família Papillomaviridae, que foi também sugerido como agente etiológico de aborto. Assim, este estudo se propôs a
evidenciar a presença do ácido nucléico de AAV e de HPV em decídua e vilosidade coriônica (VC) provenientes de abortamento humano ocorridos até a 22ª semana gestacional. Foram obtidos tecidos de 81 casos de abortamento, sendo 68 não intencionais e 13 intencionais que originaram 118 fragmentos dissecados (66 decíduas e 52 VC). De todos os espécimes, o DNA foi extraído pelas metodologias de DNAzolTM, TRIzol TM e/ou QIAampTM DNA mini Kit e o gene b-globina foi amplificado por PCR como controle. O genoma dos vírus AAV2/5 e HPV foram amplificados (nested-PCR e PCR, respectivamente) usando pares de iniciadores Pan1/Pan3 e Nest1/Nest2 e MY09/11, respectivamente. Os casos positivos para HPV foram submetidos à tipagem para os tipos mais comuns 6, 11, 16, 18, 33). Hibridização in situ (HIS) foi realizada em cortes de tecidos parafinados dos casos
positivos para AAV, utilizando-se sonda marcada com digoxigenina. AAV e HPV foram observados em 28% (23/81) e em 10% (8/81) dos casos, respectivamente. Somente o tipo AAV2 foi detectado. AAV foi observado em 18 e em 7 fragmentos de decídua e de VC, respectivamente, enquanto HPV, em 4 e em 5 fragmentos, respectivamente. AAV2 ocorreu em 32% (22/68) e em 8% (1/13) dos abortos não
intencionais e intencionais, respectivamente, e HPV, em 10% (7/68) e em 8% (1/13), respectivamente. Somente um caso positivo para HPV foi tipado, correspondendo ao tipo HPV11. HIS revelou genoma do AAV em 3 casos: na decídua, VC ou placa coriônica e em trofoblastos não-vilosos. A taxa de co-infecção do AAV com o vírus helper HPV foi de 26% e com CMV (anteriormente pesquisado), de 9%. Evidência importante de infecção pelo AAV dos tecidos de abortamento foi encontrada no presente estudo, embora em freqüência menor do que a encontrada na literatura. O achado somente do tipo AAV2, em detrimento do AAV5, indica ser o mais freqüente na população e/ou apresentar tropismo pelos tecidos estudados. A detecção de AAV2 em decídua e em trofoblasto não viloso por HIS sugere que possa haver
comprometimento da invasividade das células infectadas e consequente perda gestacional. Freqüência de HPV em VC está de acordo com alguns relatos da literatura. HPV foi encontrado em freqüência semelhante nos dois tipos de aborto. Casos em que não houve co-infecção com vírus helper, presença de AAV pode ser explicada por latência, replicação autônoma ou co-infecção com outro vírus helper
não pesquisado. Os resultados encontrados não permitem inferir relação causal entre AAV e aborto, apesar de ter sido detectado principalmente em casos de aborto não intencional.
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Desarrollo de sondas acopladas a Quantum dots para analizar la localización subcelular del ARN genómico de VIH-1 mediante microscopía confocalLeyva Gutiérrez, Alejandra. January 2018 (has links)
Título de Ingeniería en Biotecnología Molecular / Los mecanismos involucrados en el control post-transcripcional del ciclo
replicativo del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), específicamente los
eventos moleculares que permiten la interacción del ARN genómico (ARNg) viral
con la maquinaria celular para su transporte, traducción o empaque dentro de la
célula, aún no han sido completamente dilucidados. Actualmente existen diversas
técnicas para el estudio de la localización sub-celular de ARNg, entre las que
destaca RNA FISH (RNA Fluorescent in situ hybridization), método ampliamente
utilizado para el estudio de la localización y cambios temporales de ARN y
ribonucleoproteínas. Generalmente, en esta técnica se utilizan sondas acopladas
a fluoróforos orgánicos que hibridan a regiones específicas para las que han sido
diseñadas. No obstante, estas sondas presentan fotoblanqueamiento
significativo, y un espectro de emisión amplio (50-100 nm), lo que limita su uso.
Es por esto que surge la necesidad de recurrir a nuevas alternativas, tales como
sondas acopladas a Quantum dots (QDs), los cuales en contraste con fluoróforos
orgánicos poseen una vida fluorescente significativamente más larga, mayor
fotoestabilidad y un amplio espectro de absorción. Considerando lo anterior, en
el presente trabajo se propone la construcción de sondas específicas asociadas
a QDs compuestos de Cadmio-Telurio recubiertos por Glutatión (QDs CdTe-
GSH) que reconocen la región pBSK-GagPol como matriz para la transcripción
in vitro, obteniendo así fragmentos de ARN, los cuales fueron desfosforilados en
su extremo 5', para luego incorporarles en su lugar un fosfato γ unido a un grupo
sulfhidrilo (SH). De esta forma, los transcritos de ARN fueron capaces de unirse
a QDs CdTe-GSH a través de enlaces disulfuro. Generando así sondas de ARN
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acoplada a QDs CdTe-GSH capaces de unirse al ARNg de VIH-1 en presencia
y ausencia de la proteína Rev,la cual actúa como un regulador clave en el control
post-transcripcional de la expresión génica viral, actuando principalmente en los
procesos de exportación nuclear y traducción. De manera que en estas
condiciones fue posible validar a través de experimentos de RNA FISH, el ingreso
citoplasmático y nuclear de la sonda de ARN acoplada a QDs CdTe-GSH,
además de una interacción específica con el ARN genómico de VIH-1. Este
hecho representa la prueba de concepto de que es posible generar una sonda
acoplada a QDs específica contra el ARN genómico de VIH-1, permitiendo el
estudio de la expresión génica del virus, lo que también abre nuevas posibilidades
para el estudio de VIH-2 u otros tipos de virus. / The mechanisms involved in the post-transcriptional control of the replicative
cycle of the Human Immudeficiency Virus (HIV), specifically the molecular events
allowing the interaction between the viral genomic RNA (gRNA) and the cellular
machinery for the transport, translation or packaging, have not been elucidated
yet. Currently, the study of localization and temporary changes of RNA and
ribonucleoproteins relies mainly on RNA FISH (RNA Fluorescent in situ
hybridization)-based strategies. RNA FISH uses specific hybridization probes
coupled to organic fluorophores. However, these fluorescent molecules
commonly present limiting characteristics such as significant photobleaching and
a wide emission spectrum (50-100 nm). Therefore, a considerable demand arises
for new alternatives, such as probed coupled to Quantum dots (QDs), which in
contrast to organic fluorophores, exhibit longer fluorescence lifetime, higher
photostability and broad absorption spectra. Considering previous facts, the aim
of this work was to develop specific probes coupled to glutathione-capped
cadmium-telluride quantum dots (QDs CdTe-GSH), able of recognizing and
associate with the Gag-Pol region present on the HIV-1 genomic RNA (gRNA).
Thus, in order to achieve this objective, the vector pBSK-GagPol was used as a
template for in vitro transcription of Gag-Pol complementary RNA, which was
fragmented and dephosphorylated at the 5' end, with the purpose to incorporate
a γ phosphate coupled to a sulfhydryl group (SH) instead. Then, the SH-containing
RNA fragments were attached to QDs CdTe-GSH by a disulfide bond. As a result,
we generated single-stranded RNA probes coupled to QDs CdTe-GSH capable
of hybridizing to HIV-1 gRNA in the presence and absence of the viral protein Rev,
which acts as a key regulator of the post-transcriptional control of viral gene
expression acting mainly during nuclear export and translation. Thereby, under
these conditions, we validated the cytoplasmic and nuclear entrance of the probe
coupled to Qds CdTe-GSH, and specific interaction between the probe and gRNA
of HIV-1. This fact represents the proof of concept that it is possible to generate
RNA probes coupled to QDs CdTe-GSH to study genetic expression of HIV-1,
and also opens up new opportunities for the study of HIV-2 or other virus types.
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Avaliação de gametas e embriões bovinos produzidos in vitro após exposição experimental ao BoHV-5Frade, Camila da Silva [UNESP] 21 December 2009 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2009-12-21Bitstream added on 2014-06-13T18:55:54Z : No. of bitstreams: 1
frade_cs_me_araca.pdf: 946830 bytes, checksum: 2ebd66c2e30b659729f39b6245809148 (MD5) / A produção in vitro (PIV) de embriões e a transferência de embriões (TE) tratam-se de biotecnologias da reprodução, as quais são rotineiramente aplicadas no melhoramento genético da espécie bovina. No entanto, resta determinar até que ponto sua utilização implica na disseminação de patógenos no rebanho. A fim de elucidar a possibilidade de transmissão do BoHV-5 através de células germinativas e/ou embriões, após exposição experimental in vitro, uma série de 3 experimentos foram realizados. Estes consistiram na exposição de oócitos, espermatozóides e embriões bovinos ao BoHV-5, tendo como critério de avaliação o desenvolvimento embrionário, bem como a detecção do vírus através de emprego da técnica de hibridização in situ (ISH) e PCR, além da apoptose, determinada pelo teste de TUNEL e pela imunomarcação dos fatores pro-apoptóticos (anexina-V, caspase-2 e -3) e antiapoptóticos (BCl-2). O experimento I foi realizado durante o período de maturação oocitária, sendo dividido em I (controle + 10% SFB), II (vírus + 10% SFB; BoHV-SFB) e III (vírus + 1 mg/mL PVA; BoHV-PVA); o experimento II foi realizado na etapa de fertilização, sendo dividido em I (controle) e II (exposto; BoHV-SPTZ); e o experimento III foi feito no período de cultura embrionária, sendo dividido em I (controle) e II (exposto; BoHV-PZ). A análise estatística para os resultados de desenvolvimento embrionário será feita pela ANOVA e teste-t de Bonferroni para os dados dos oócitos infectados e pelo teste t não pareado para os resultados de espermatozóides e embriões infectados, já para a análise da apoptose e marcadores apoptóticos será empregado o teste de Kruskal-Wallis e Dunn, diferenças serão consideradas significativas quando p<0,05. / The in vitro production (IVP) of embryos and embryo transfer (ET) are reproduction biotechnologies, which are routinely applied in breeding bovine. However, it remains to determine if these techniques can promote spread of pathogens in the herd. In order to elucidate the possibility of transmission of BoHV-5 by germ cells and/or embryos after in vitro experimental exposure, a total of 3 experiments were performed. These consisted of exposure of oocytes, sperm and embryos to BoHV-5, with the evaluation embryonic development, and detection of the virus through use of the technique of in situ hybridization (ISH) and PCR, in addition to apoptosis, determined by TUNEL test and by immunostaining of the factors pro-apoptotic (annexin-V, caspase-2 and -3) and anti-apoptotic (Bcl-2). The first experiment was conducted during the period of oocyte maturation and was divided into I (control + 10% FBS), II (virus + 10% fetal calf serum; BoHV-SFB) and III (virus + 1 mg / ml PVA, BoHV-PVA ), the second trial was conducted at the stage of fertilization, was divided into I (control) and II (exposure, BoHV-SPTZ), and experiment III was done during the growing stage, and divided into I (control) and II (exposure; BoHV-PZ). Statistical analysis for the results of embryo development will be made by ANOVA and Bonferroni-t test to the data from exposed oocytes and the unpaired t test for the results of sperm and embryos exposed, as for the analysis of apoptosis will be used the Kruskal-Wallis and Dunn, differences are considered significant when p <0.05.
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Estudos citogenéticos em espécies da família Paradontidae (Actinopterygii: Characiformes), com enfoque no papel dos DNAs repetitivos na evolução cariotípica do grupoZiemniczak, Kaline 01 July 2016 (has links)
Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-04-07T19:01:49Z
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TeseKZ.pdf: 6268573 bytes, checksum: 3d50abb73f159705b9efa45eb5cc20cf (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-19T17:57:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1
TeseKZ.pdf: 6268573 bytes, checksum: 3d50abb73f159705b9efa45eb5cc20cf (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-19T17:57:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1
TeseKZ.pdf: 6268573 bytes, checksum: 3d50abb73f159705b9efa45eb5cc20cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-19T18:05:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1
TeseKZ.pdf: 6268573 bytes, checksum: 3d50abb73f159705b9efa45eb5cc20cf (MD5)
Previous issue date: 2016-07-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Parodontidae is organized in three genera according to their morphological
characteristics: Parodon, Saccodon and Apareiodon. The diploid number is conserved
in this group with 2n=54 chromosomes, with species without heteromorphic sex
chromosomes systems and other with sex chromosomes system, with female
heterogamety, ZZ/ZW or ZZ/ZW1W2. Studies of chromosome localization using
repetitive DNAs chromosomes of species show possible origin, differentiation and
evolution of sex chromosomes in Parodontidae. However, further studies using repeats
DNAs are fundamental for a better comprehension of its pathway genomic structural or
functional. In this study were described the chromosome location of the (GATA)n and
(TTAGGG)n sequences in eight species of Parodontidae, with aim to evaluate the
probable mechanisms of chromosomal diversification, especially those related to
molecular differentiation of W chromosome. Also were mapped 16 microsatellites
sequences in five species of the family to check the accumulation of the repetitive
DNAs in the chromosomes and verify its performance in the karyotype and sex
chromosomes differentiation. Yet, partial sequences of the histone H1, H3 and H4 were
determined and had chromosomal localization in six species of Parodontidae. The data
show two H1 sequences in Parodontidae genomes, herein called H1 partial and H1+
ERV, in addition to partial sequences for the genes H3 and H4. The chromosomal
localization of histone genes show H1, H3 and H4 in main cluster and the presence of
the orphans genes for H1 + ERV. Hence, this study provide some advances in the
understanding of the repetitive DNA mechanism in the karyotypic differentiation and
evolution in the family Parodontidae. / Parodontidae é organizada em três gêneros agrupados de acordo com suas
características morfológicas: Parodon, Saccodon e Apareiodon. O número diploide é
conservado nesse grupo com 2n=54 cromossomos, com espécies sem sistemas de
cromossomos sexuais heteromórficos e outras com sistemas de cromossomos sexuais do
tipo ZZ/ZW ou ZZ/ZW1W2. Estudos com mapeamento de DNAs repetitivos por
hibridação in situ fluorescente nos cromossomos de algumas espécies demonstraram
possível origem, diferenciação e evolução dos sistemas de cromossomos sexuais desta
família. No entanto, estudos mais aprofundados são fundamentais para um maior
esclarecimento do papel genômico das sequências repetitivas. Neste estudo foram
descritas a localização das sequências (GATA)n e (TTAGGG)n em oito espécies de
Parodontidae, com o objetivo de avaliar os prováveis mecanismos de diversificação
cromossômica, especialmente aqueles relacionados à diferenciação molecular do
cromossomo W. Também foram mapeadas 16 sequências de microssatélites em cinco
espécies da família, com objetivo de verificar o acúmulo de DNA repetitivo nos
cromossomos e sua atuação na diferenciação cariotípica dos cromossomos sexuais
heteromórficos. Por fim, sequências parciais das histonas H1, H3 e H4 e também dos
DNAr 5S e 18S foram determinadas e tiveram sua localização cromossômica em seis
espécies desta família. Com os resultados, foi possível determinar duas sequências de
H1 para Parodontidae, H1 parcial e H1+ERV, além das sequências parciais para os
genes H3 e H4. Todas essas análises propiciam uma melhor compreensão dos processos
de diferenciação e evolução cariotípica na família Parodontidae.
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Associação entre o papiloma vírus humano e o carcinoma epidermóide de orofaringe : um estudo de caso-controleSchwartsmann, Carla Cuenca January 2013 (has links)
Introdução: A incidência do carcinoma epidermóide de orofaringe (CEO) aumentou em todo o mundo nos últimos 30 anos. Estudos identificaram o papiloma vírus humano (HPV) como um fator de risco para essa neoplasia. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi verificar a frequência do HPV em pacientes com CEO e em pacientes sem neoplasia maligna e avaliar a existência de uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os dois grupos. O objetivo secundário foi estudar a correlação entre a infecção pelo HPV e a localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral. Métodos: Foi realizado um estudo de caso-controle com 59 pacientes com CEO e 54 pacientes sem neoplasia, no qual foram analisados os blocos de parafina contendo material tumoral e tecido não neoplásico. Foram analisadas respectivamente a frequência do HPV e sua atividade viral utilizando a técnica de hibridização in situ cromogênica (CISH) para HPV de baixo risco (BR) e alto risco (AR) e a expressão imunoistoquímica da proteína P16. Resultados: A frequência do HPV foi maior no grupo caso em comparação ao grupo controle quando utilizamos a expressão imunoistoquímica da proteína P16 como método de detecção isolado (OR=10,3; P<0,001) e quando utilizamos a CISH e a expressão imunoistoquímica da proteína P16 em conjunto (OR=21,4; P<0,001). A CISH isoladamente não mostrou uma diferença estatisticamente significativa na frequência do HPV entre os grupos estudados (P=0,572). A localização tumoral na orofaringe e o estadiamento clínico não mostraram correlação com a infecção pelo HPV em nenhum dos métodos utilizados, assim como o grau de diferenciação tumoral (P>0,20). Conclusão: Utilizando-se a técnica de imunoistoquímica para P16 isolada ou combinada com a técnica de CISH, observou-se uma maior positividade para o HPV no grupo de pacientes com CEO. A localização do tumor na orofaringe, o estadiamento clínico e o grau de diferenciação tumoral não tiveram correlação com a positividade para o HPV. / Introduction: The incidence of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OSCC) has increased worldwide over the last 30 years. Studies have identified human papillomavirus (HPV) infection as a risk factor for OSCC. Objectives: To compare the frequency of HPV infection in patients with OSCC and patients with benign oral or oropharyngeal disease and ascertain whether a statistically significant difference in HPV frequency exists between these two groups. As a secondary objective, to assess potential correlations between HPV positivity, anatomic site of OSCC, tumor staging, and degree of tumor differentiation. Methods: Case-control study. The sample comprised 59 patients with OSCC and 54 non-OSCC controls who underwent surgery for benign oral or oropharyngeal conditions. Paraffin-embedded specimens from cases and controls were tested for HPV positivity by chromogenic in situ hybridization (CISH) for low-risk (LR) and high-risk (HR) HPV, and HPV activity was assessed by P16 immunohistochemistry (IHC). Results: The frequency of HPV positivity was higher in the case group than in the control group when assessed by P16 IHC alone (OR=10.3, P<0.001) or by CISH and P16 IHC in combination (OR=21.4, P<0.001). CISH alone did not detect any significant between-group difference in HPV frequency (P=0.572). Tumor site, staging, and differentiation did not correlate with HPV positivity with any of the methods employed (P>0.20). Conclusion: Using a P16 IHC assay alone or combined with CISH, the authors showed a higher rate of HPV positivity among patients with OSCC, as compared with patients with benign disease. Tumor site within the oropharynx, tumor stage, and degree of differentiation did not correlate with HPV positivity.
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Identificação de deleções do gene SHOX: comparação das técnicas de FISH, análise de microssatélites e MLPA / Identification of SHOX gene deletions: comparison of FISH technique, microsatellites analysis and MLPAMariana Ferreira de Assis Funari 02 October 2009 (has links)
O gene SHOX (short stature homeobox containing gene), expresso em altos níveis nas células osteogênicas, é fundamental para o desenvolvimento ósseo e para a determinação da altura. Haploinsuficiência do SHOX é responsável por vários fenótipos que envolvem a baixa estatura, como a síndrome de Turner, a discondrosteose de Léri-Weill e a baixa estatura idiopática. Cerca de dois terços das haploinsuficiências são causados por deleções. Neste trabalho, foi realizada uma comparação entre três técnicas para detecção de deleções do SHOX: a hibridação in situ com fluorescência (FISH), o estudo de microssatélites e o multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA). Nos pacientes sem deleção do SHOX, foi realizado um rastreamento para identificação de mutações de ponto no gene que levassem à sua haploinsuficiência. Foram analisados seis pacientes com discondrosteose de Léri-Weill (DLW) e 20 com baixa estatura desproporcionada (BED). Na técnica de FISH, os cromossomos metafásicos obtidos a partir de cultura de linfócitos foram hibridados com o cosmídio LLNOYCO3M34F5. DNA genômico extraído a partir de leucócitos de sangue periférico foi submetido à análise de microssatélites e MLPA. Foram amplificados seis marcadores de microssatélites (repetições CA, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 e DXYS234) e o MLPA foi realizado de acordo com as instruções dos kits SALSA MLPA P018-C1 e P018-D1 SHOX. Estes kits contêm oito sondas específicas para o gene SHOX e 13 para a área do SHOX, localizada a jusante do gene. O seqüenciamento direto da região codificadora do gene foi realizado nos pacientes sem deleção. Todos os pacientes com DLW apresentaram deleções envolvendo todo o gene. Entre os pacientes com BED, apenas um (5,0%) apresentou uma deleção intragênica envolvendo os exons 4, 5 e 6a. Os resultados das três metodologias foram concordantes na maioria dos casos, exceto em dois casos. No primeiro caso, inicialmente o FISH não identificou uma deleção envolvendo todos os éxons em um paciente com DLW. No segundo, uma deleção envolvendo os exons 4, 5 e 6a, identificada em uma paciente com BED, foi detectada apenas pelo MLPA. Ainda entre os pacientes com BED, três (15%) apresentaram deleção da região do marcador DXYS10096, a 3 do gene. Outros três (15%) pacientes apresentaram mutações de ponto identificadas pelo seqüenciamento direto: a mutação p.Tyr35X, que resulta na substituição de uma tirosina por um códon de parada prematuro; a p.Arg147His localizada na região do homeodomínio e a NM_000451:c.1236 -10T>C que se encontra a 10 nucleotídeos antes do início do éxon 5. Em uma comparação das três metodologias, o FISH foi considerado a técnica mais trabalhosa e com menor sensibilidade, levando até oito dias para sua realização. A análise por microssatélites requer o estudo dos progenitores, além de um grande número de marcadores para a análise de regiões extensas. O MLPA detectou todas as deleções, sendo considerada a metodologia mais sensível. Ele apresentou também menor custo e tempo de execução, além de possibilitar a estimativa do tamanho da deleção. Desta forma, o MLPA foi considerado a melhor metodologia para investigação inicial dos pacientes com DLW e BED. / The SHOX gene (short stature homeobox containing gene), expressed at high levels in osteogenic cells, is essential for bone development and growth process. SHOX haploinsufficiency is responsible for several phenotypes involving short stature, such as Turner syndrome, Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and idiopathic short stature. Deletions are responsible for 2/3 of SHOX haploinsufficiency. In this study, a comparison among three techniques for detection of SHOX deletions: fluorescence in situ hybridization (FISH), microsatellites analysis and multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) was performed. A screening for point mutations that could lead to haploinsufficiency was performed in patients without SHOX deletion. Six patients with Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and 20 with disproportionate short stature (DSS) were analyzed. FISH analysis was performed using the cosmid LLNOYCO3\"M\"34F5 and metaphase spreads obtained from lymphocytes culture. Genomic DNA extracted from peripheral blood leukocytes was used to microsatellite and MLPA analysis. Six microsatellite markers (CA repeats, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 and DXYS234) were amplified by PCR and MLPA was performed according to the manufacturers instructions for SALSA MLPA P018 and P018-C1-D1 SHOX kits. These kits contain 8 specific probes for SHOX gene and 13 for \"SHOX area, which is located downstream of the gene. The direct sequencing of entire encoding region was performed in patients with no SHOX deletions. All patients with LWD presented deletions involving the entire gene. One (5.0%) patient with DSS, presented an intragenic deletion involving exons 4, 5 and 6a. The results of the three methods were concordant in most cases, except in two cases. In the first case, a patient with DLW, the FISH did not identify a deletion involving all SHOX exons. In the second case, a deletion of exons 4, 5 and 6a in a patient with BED was identified only by MLPA. Other 3 (15%) DSS patients had deletion in SHOX area, in the DXYS10096 marker. Other three (15%) patients presented a point mutation identified by direct sequencing: p.Tyr35X, which replaces a tyrosine for a premature stop codon, p.Arg147His located in the homeodomain region and NM_000451: c.1236-10T> C which is 10 nucleotides before the exon 5. In a comparison of three methods, the FISH technique was considered the more laborious and less sensitive, taking until eight days to obtain the results. The microsatellite analysis requires the parents DNA study. In addition, several markers are essential for the analysis of extensive regions. The MLPA was considered the most sensitive methodology since it detected all deletions. It also presented lower cost and execution time, and allowed the estimation of the size of the deletion. Thus, the MLPA was considered the best approach for initial investigation of LWD and DSS patients.
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