A infecção por Toxoplasma gondii, em hospedeiros imunocompetentes, resulta no desenvolvimento de anticorpos específicos e resposta imune celular que, frequentemente, induzem imunidade protetora e duradoura, prevenindo reinfecção. Entretanto, casos de toxoplasmose congênita em mulheres imunocompetentes em fase crônica de infecção indicam a possibilidade de reinfecção em humanos. Em modelos experimentais, reinfecção por T.gondii já foi descrita em casos de infecção por cepa de genótipo distinto ao da infecção primária e por cepas recombinantes, porém os estudos envolvendo genótipos clonais, em modelo murino, restringem-se à utilização de cepas do genótipo II na infecção primária, com desafio subsequente por cepas do mesmo genótipo, ou dos genótipos I e III, com ausência de informações sobre as cepas do tipo III, que correspondem ao genótipo de maior frequência e distribuição mundial. Procuramos explorar vários modelos de infecção sequencial com cepas clonais dos tipos I, II e III, buscando dados mais consistentes para compreensão dos seguintes questionamentos: (i) A infecção primária por um genótipo de T.gondii é capaz de proteger o hospedeiro da reinfecção por genótipo distinto? (ii) A imunidade induzida pela infecção primária pode prevenir a progressão da infecção causada pela cepa secundária, impedindo doença aguda e mortalidade dos animais? (iii) A imunidade da infecção primária previne a colonização do cérebro por cistos teciduais da cepa secundária? Nossos dados mostram que a imunidade induzida pela infecção primária por cepas clonais de T.gondii não protege o hospedeiro da reinfecção por cepa de genótipo distinto, já que foram detectados anticorpos contra as cepas das infecções primária e secundária em todos os modelos propostos. Somente a imunidade induzida pela infecção primária por cepa do tipo III foi capaz de prevenir a progressão da infecção secundária causada pelas cepas do tipo I e do tipo II, impedindo a mortalidade e colonização do cérebro dos animais por cistos teciduais da cepa secundária. Esses achados são extremamente importantes para auxiliar estudos vacinais e terapêuticos da toxoplasmose. / Toxoplasma gondii infection in immunocompetent hosts results in the development of specific antibodies and cellular immune responses that often induce protective and lifelong immunity, preventing reinfection. However, cases of congenital toxoplasmosis in immunocompetent women at a chronic phase of infection indicate the possibility of reinfection in humans. In experimental models, reinfection by T.gondii has been described in cases of infection by genotype distinct from that of primary infection and by recombinant strains, but studies involving clonal genotypes in the murine model are restricted to the use of type II genotype in primary infection, with subsequent challenge by strains of the same genotype, or genotypes I and III, without information about type III strains, which correspond to the genotype with the highest frequency and worldwide distribution. We explore several models of sequential infection with clonal strains of types I, II and III, looking for more consistent data to understand the following questions: (i) Primary infection by a T.gondii genotype is able to protect the host from reinfection by different genotype? (ii) Does the immunity induced by the primary infection prevent the progression of infection caused by the secondary strain, preventing acute disease and animal mortality? (iii) Does the immunity of primary infection prevent colonization of the brain by tissue cysts of the secondary strain? Our data show that the immunity induced by primary infection by T.gondii clonal strains does not protect the host from reinfection by a distinct genotype strain, since antibodies against the strains of primary and secondary infections were detected in all proposed models. Only the immunity induced by the primary infection by type III strain was able to prevent the progression of the secondary infection caused by type I and type II strains, preventing the mortality and colonization of the brains of the animals by tissue cysts of the secondary strain. These findings are extremely important to support vaccine and therapeutic studies of toxoplasmosis.

O Herpesvírus equino tipo -1 (EHV-1) pertence ao gênero Varicellovírus da subfamília Alphaherpesvirinae pertencente à Família Herpesviridae. É um vírus envelopado, de DNA linear fita dupla, composto por 76 genes distintos. O EHV-1 é responsável por grandes prejuízos econômicos na equinocultura mundial. Responsável por doença neonatal fatal, mieloencefalopatia, rinopneumonite e abortamento, encontra-se amplamente distribuído pela população equina do território nacional. O objetivo do presente estudo foi o de padronizar uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do EHV-1 em tecidos incluídos em parafina a fim de permitir estudos retrospectivos em arquivos de amostras histopatológicas. Assim, foram inoculados experimentalmente 12 camundongos com 21 dias de idade da linhagem CH3/Rockfeller com três diferentes isolados de EHV-1, dois provenientes da Argentina e um do Brasil. Esses animais foram observados por quatro dias e, após sacrifício por sobre dose de uma associação de ketamina e xilazina, foram submetidos à necropsia e colhidos o pulmão e sistema nervoso central (SNC). Os órgãos colhidos foram divididos em duas partes aproximadamente iguais: uma mantida a -20ºC até processamento e a outra fixada em formalina 10% tamponada e posteriormente incluída em parafina. A extração foi realizada com nove fragmentos contínuos de 4µm cada, a partir do protocolo de extração com proteinase K/ fenol/ clorofórmio. Foi realizada avaliação da sensibilidade analítica da PCR com oito diluições na base 10 para os três isolados utilizados. A amplificação do DNA viral foi realizada utilizando primers direcionados para a ORF64. A fim de descartar a eventual presença de inibidores da reação de PCR e assegurar a adequada extração de DNA, foram incluídos primers direcionados para o gene da beta-actina. A PCR mostrou-se capaz de amplificar DNA viral alvo numa diluição de até 10-5, sendo positiva entre 10-1 a 10-2 DICT50/25µL. Com a PCR padronizada, foi possível detectar o DNA do EHV-1 em: a) 100% (12/12) das amostras de pulmão congeladas e 100% (12/12) das amostras de pulmão incluídas em parafina; b) em 91% (11/12) das amostras de SNC congeladas e 41% (5/12) das amostras de SNC incluídas em parafina. A aplicação da PCR padronizada em uma coleção de amostras incluídas em parafina do Laboratório de Anatomia Patológica do IB/SP, colhidas de cinco casos de abortamento em equinos, revelou que o DNA do EHV-1 foi detectado em: a) um caso em que originalmente foi possível isolar o EHV-1; b) em 4/4 amostras que revelaram-se originalmente negativas. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que a PCR padronizada teve bom desempenho na detecção de DNA viral em amostras incluídas em parafina de animais experimentalmente infectados e, provavelmente, uma sensibilidade diagnóstica mais elevada que os métodos utilizados para o diagnóstico do EHV-1 na coleção de amostras de equino testada. / The equine herpesvirus type 1 (EHV-1) belongs to Varicellovírus genus, Alphaherpesvirinae subfamíly of the Herpesviridae Famíly. It is an enveloped virus, double stranded linear DNA, composed of 76 distinct genes. The EHV-1 is responsible for great losses in horsebread world. Responsible for neonatal death, mieloencephalopaty, rinopneumonite and abortion, it is widely distributed into brasilian equine population. The purpose of this study was to standardize a polymerase chain reaction (PCR) for EHV-1detection in paraffin- embedded tissues allowing retrospective studies based on the collection histopatological samples. Thus, 12 mice (CH3/Rockfeller) with 21 days of age were inoculated with 3 different isolates of EHV-1, 2 from Argentina and one from Brazil. These mice were observed for 4 days and, after sacrifice by overdose of a combination of ketamine and xylazina, it were subjected to necropsy and collected the lung and central nervous system (SNC). The collected tissues were divided into 2 approximately equal parts: 1one stored at -20ºC until processing, and another set at 10% buffering formalin and later paraffin-embedded. The extraction was performed with continuous 9 fragments of 4µm each, using the extration protocol with proteinase K/ fenol/ clorofórmio. The assessment of analytical sensitivity of PCR were determined using 8 dilutions for all 3 virus isolates. The viral DNA amplification was performed using primers targeted to ORF64. In order to rule out the possible presence of PCR inhibitors and to ensure adequate extraction of DNA, primers directed to the gene for beta-actin were included It was possible to amplify viral DNA until 10-5 dilution, corresponding to 10-1 to 10-2 DICT50/25µL. With the standardized PCR, it was possible to detect the EHV-1 DNA in: a) 100% (12/12) of lung frozen sample and 100% (12/12) of the paraffin-embedded lung; b) 91% (11/12) of the frozen CNS and 41% (5/12) CNS paraffin-embedded. Moreover, the standardized PCR was tested in a collection of paraffin-embedded specimens from Pathological Anatomy Laboratory od Biological Institute Sao Paulo State, taken 5 cases of the abortion in horses. It were possible to detect EHV-1 DNA in: a) 1 sample from a case in that originally was possible to isolate the EHV-1, b) 4/4 sample originally negative diagnosed. Based on these results, it is possible to conclude that the standardized PCR performed well for detection viral DNA in paraffin-embedded tissues of experimentally infected animals, and probably a higher diagnostic sensitivity than the methods used for diagnosis of EHV-1 in the collection samples tissues tested for equine.

Ecstasy é o nome popular do 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), uma droga de abuso utilizada por adultos jovens. Diversos relatos têm mostrado existência de correlações positivas entre o abuso do Ecstasy e o aparecimento de doenças infecciosas. Muitos estudos em modelos animais mostram que o MDMA induz alterações de imunidade inata e adquirida; entretanto pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais estes efeitos ocorrem. Desta forma, buscamos neste trabalho os mecanismos neuroimunes pelos quais o MDMA diminui a atividade de neutrófilos e altera a distribuição de leucócitos nos diferentes compartimentos imunes. Além disso, avaliamos se os efeitos induzidos pelo MDMA afetam a resposta a uma infecção experimental induzida por Listeria monocytogenes. Nossos resultados mostram que 60 minutos após a administração de MDMA na dose 10mg/kg, houve 1) diminuição do burst oxidativo de neutrófilos induzido por SAPI e PMA e, também, da porcentagem e da intensidade da fagocitose dos neutrófilos sanguíneos; 2) diminuição da celularidade total da medula óssea e aumento da mesma no baço, além de diminuição do peso relativo do baço; 3) aumento na porcentagem de neutrófilos e diminuição na porcentagem de linfócitos sanguíneos; e 4) diminuição da expressão de NFB de neutrófilos sanguíneos. O tratamento com metirapona ou RU-486 prévio ao tratamento com MDMA foi capaz de inibir 5) os efeitos observados em todos os parâmetros avaliados na diminuição da atividade de neutrófilos; 6) as alterações das porcentagens de neutrófilos e linfócitos sanguíneos e 7) a diminuição da expressão de NFB. Observamos, ainda, que o tratamento com 6-OHDA ou ICI-118,551 prévio ao tratamento com MDMA 8) não foram capazes de inibir os efeitos induzidos pelo MDMA na atividade de neutrófilos e na contagem diferencial de leucócitos sanguíneos; no entanto, 9) preveniram as alterações de celularidade induzidas por MDMA na medula óssea e no baço, e 10) a diminuição do peso relativo do baço. Por fim, observamos em um modelo de infecção experimental por LM que o MDMA 11) induziu mielosupressão (diminuição do CFU na medula óssea e aumento no baço); 12) diminuiu o número de leucócitos sanguíneos e a celularidade da medula óssea; 13) aumentou a celularidade do baço; 14) diminuiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) e quimiocina (MCP-1) nas primeiras 24 h; e 15) aumentou a produção das mesmas citocinas e quimiocina após 72 h da indução da infecção. Desta forma, concluímos que os efeitos induzidos pelo MDMA sobre a atividade de neutrófilos foram provavelmente mediados pela diminuição da expressão de NFB induzido pela ação da corticosterona e que a corticosterona, também está envolvida com as alterações na contagem diferencial de neutrófilos e linfócitos. As catecolaminas periféricas responderam pelas alterações na distribuição de leucócitos entre baço e medula óssea, e diminuição do peso relativo do baço. Além disso, o MDMA pode ser considerado uma droga imunossupressora visto que diminuiu a resistência a uma infecção por LM por mecanismos neuroimunes / Ecstasy is the popular name of 3,4-metylendioxymetamphetamine (MDMA), a drug of abuse mainly used by young adults. Several reports have shown the existence of a positive correlation between Ecstasy abuse and increased susceptibility to infectious diseases. Some studies using animal models report that MDMA induces alterations in both innate and adaptive immunity, however little is known about the mechanisms that generate such alterations. Therefore, we sought for neuroimmune mechanisms that could be involved in the previously reported decreasing on neutrophil activity and alteration in the leukocyte distribution. Moreover, we analyzed the host resistance to Listeria monocytogenes after MDMA treatment. We show that MDMA (10 mg/kg), 60 min after administration: 1) decreases SAPI and PMA-induced oxidative burst and percentage/intensity of phagocytosis of circulating neutrophils; 2) decreases bone marrow cellularity while increases it in the spleen, and also decreases spleen relative weight; 3) increases neutrophil percentage while decreases lymphocyte percentage in the blood; and 4) decreases NFB expression on circulating neutrophils. Metyrapone or RU-486 prior to MDMA treatment abrogates 5) the MDMA effects previously reported on neutrophil activity; 6) alterations in the percentage of circulating neutrophils and lymphocytes, and 7) decreasing of NFB expression. We also show that 6-OHDA or ICI-118,551 prior to MDMA treatment were not able to 8) abrogated the MDMA effects previously reported on neutrophil activity and blood leukocyte differential counts; nevertheless, 9) they abrogated the previously reported alterations on bone marrow and spleen cellularity, and 10) reduction on spleen relative weight. Finally, in a model of host resistance to Listeria monocytogenes we show that MDMA: 11) induces myelosuppression by decreasing CFU on bone marrow while increasing it on spleen; 12) decreases circulating leukocytes and bone marrow cellularity; 13) increases spleen cellularity; 14) decreases pro-inflammatory cytokines production (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) and chemokine (MCP-1) after 24h of the infection; and 15) increases the production of the pro-inflammatory cytokines and chemokines previously reported after 72h of the infection. Thus, we conclude that the MDMA effects on neutrophil activity were mediated by the reduction of NFB expression, and this effect was induced by corticosterone elevation in the serum. Corticosterone is also involved in the alterations on neutrophil and lymphocyte counts. Catecholamines were shown to be involved in the alterations on leukocyte distribution in the bone marrow and spleen, and in the reduction of relative weight of spleen. Additionally, MDMA reduced the host resistance to Listeria monocytogenes. Therefore, MDMA can be considered an immunosuppressive drug and those effects are mediated by neuroimmune mechanisms

O trabalho teve por objetivo diagnosticar a infecção experimental e natural por Toxoplasma gondii em pombos (Columba livia), por técnicas sorológicas, biológicas e moleculares. Pombos foram infectados com oocistos esporulados de T. gondii e acompanhados por 60 dias com coleta de soro semanal para o acompanhamento da curva de anticorpos séricos e eutanásia quinzenal para avaliar a presença do parasito em diferentes tecidos. Observou-se concordância em todas as técnicas utilizadas, indicando serem eficazes no diagnóstico da infecção nessa espécie. Pombos de vida livre foram capturados nos municípios de São Paulo, Sorocaba e Ibiúna e anticorpos anti-T. gondii não foram observados. Nestas aves o bioensaio em camundongos foi realizado, independente da ausência de anticorpos e em nenhuma foi possível o isolamento do parasito. / The study aimed to diagnose the experimental and natural infection by Toxoplasma gondii in pigeons (Columba livia), by serological, biological and molecular techniques. Pigeons were infected with sporulated oocysts of T. gondii and monitored for 60 days with weekly serum collection for monitoring the curve of serum antibodies and euthanasia two weeks to assess the presence of parasites in different tissues. Agreement was observed in all the techniques used, indicating to be effective in the diagnosis of infection in this species. Free-living pigeons were captured in the municipalities of São Paulo, Sorocaba and Ibiúna and anti-T. gondii antibodies were not observed. In birds the bioassay was conducted in mice, regardless of the absence of antibodies and none was possible to isolate the parasite.