Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo788_1.pdf: 6555783 bytes, checksum: 65caeaca8f8ce8753df4239098b98438 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os vírus dengue (DENV) são responsáveis por um amplo espectro de manifestações clínicas em diversas partes do mundo. Muitos mecanismos moleculares da biologia do DENV, incluindo replicação do genoma e patogênese viral, ainda não foram totalmente compreendidos. Novos avanços na elucidação destes mecanismos vêm sendo facilitados pelo desenvolvimento dos sistemas de genética reversa nas últimas décadas. No presente trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um sistema de genética reversa para o vírus dengue tipo 3 (DENV3). Usando um sistema de dois plasmídeos, o genoma do DENV3 foi dividido em duas partes por PCR e os fragmentos gerados foram clonados em separado num vetor plasmidial. Um sítio de restrição foi inserido em ambas as construções, permitindo a posterior recuperação do genoma completo por ligação in vitro. Todos os plasmídeos foram construídos pela técnica de recombinação homóloga em levedura e propagados nela para prevenir qualquer instabilidade dos insertos em E. coli. A identidade das construções foi confirmada por sequenciamento, no qual foram identificadas mutações no genoma clonado. Para a recuperação do clone infeccioso in vitro, as duas partes dos genomas foram amplificadas por PCR, digeridas e unidas por ligação in vitro. Dois clones infecciosos foram recuperados e a transcrição in vitro, do produto das ligações, produziram RNAs virais genômicos. Células BHK-21, transfectadas por eletroporação com os RNAs sintetizados, foram avaliadas por ensaio de imunofluorescência, mostrando que estes RNAs são infecciosos. Após sucessivas passagens em cultivo celular, os DENV3 recuperados foram caracterizados in vitro. RT-PCR, a partir de RNA viral, e a análise de fragmentos de restrição confirmaram que ambos os vírus recuperados foram derivados do nosso sistema de dois plasmídeos. No ensaio de placa, os clones apresentaram fenótipos distintos. Após coloração convencional, enquanto o clone ICDENV3 #L43 apresentou placas com morfologia similar ao DENV3 selvagem, o clone ICDENV3 #L42 foi incapaz de formar placas. A análise de sequenciamento, a partir dos produtos de RT-PCR, identificou mutações específicas em cada um dos clones, as quais podem facilitar o crescimento dos vírus recuperados em cultivo celular. Este sistema é uma poderosa ferramenta que nos ajudará a elucidar aspectos moleculares da biologia do DENV, bem como a entender a relação entre mutações específicas e a patogênese do DENV

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:32:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8111_1.pdf: 2471883 bytes, checksum: c0fb13a5284ed20837a6628a9217346f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O diagnóstico das doenças exantemáticas virais apresenta muitas falhas quando baseado apenas em critérios clínicos, principalmente nos países onde os casos de sarampo e rubéola são raros. Estudos realizados em diversos países apontam outras viroses determinantes de doenças exantemáticas confundidas com sarampo e rubéola. Para verificar a freqüência de sarampo, rubéola, dengue e eritema infeccioso dos casos suspeitos de sarampo e rubéola no estado de Pernambuco, no período de 2001 a 2004, foram analisadas 1.161 amostras de soro encaminhadas ao Laboratório Central de Saúde Pública de Pernambuco. Ensaios imunoenzimáticos (ELISA), para detecção de anticorpos IgM específicos para os respectivos vírus foram utilizados. O diagnóstico laboratorial foi confirmado em 23,8% (276/1161) dos casos investigados. Destes, foram identificados como dengue, 16,9% (196/1161), parvovírus B19, 3,3% (38/1161), rubéola, 2,8% (32/1161) e sarampo, 0,9% (10/1161). Todos os exames positivos para sarampo e 44% dos positivos para rubéola foram decorrentes, provavelmente, de reação vacinal. Este é o primeiro estudo que evidencia a circulação de parvovírus B19 em Pernambuco, tendo sido observado que 92,1% dos casos positivos para esse agravo e 90,8% dos casos positivos para dengue, tiveram como hipótese diagnóstica a rubéola, devido à semelhança dos seus sintomas. O alto percentual de doenças exantemáticas sem a etiologia definida (76,2%), indica a necessidade de implementar o diagnóstico diferencial para que outros agravos possam ser melhor investigados. Essa conduta é importante para nortear o sistema de vigilância epidemiológica que deverá ser implantado após a erradicação do sarampo, além de dar maior credibilidade à qualidade e eficácia da vacina dupla ou tríplice viral

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-28T16:51:43Z No. of bitstreams: 1 Oliveira, Rafael Portugal Rizzo Franco de [Dissertação, 2014].pdf: 2189274 bytes, checksum: ea08452f36c971680598c7fa0742290c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T16:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira, Rafael Portugal Rizzo Franco de [Dissertação, 2014].pdf: 2189274 bytes, checksum: ea08452f36c971680598c7fa0742290c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A busca por medicamentos mais seguros e com menores efeitos adversos levou o homem a desenvolver novas tecnologias de formulação. Neste contexto, a nanotecnologia tem contribuído para o surgimento de medicamentos cada vez mais específico para a doença a qual está destinado a tratar. O vírus Herpes simplex (HSV) é um patógeno muito conhecido pelo homem e estima-se que grande parte da população já esteja contaminada de maneira assintomática. Nas infecções bacterianas têm se tornado cada vez mais comum o surgimento de cepas resistentes aos antibióticos, por isso a descoberta de novos ativos antimicrobianos se torna cada dia mais essencial. Os flavonoides são metabolitos especiais que garantem às plantas resistência a microrganismos, tornando-se por isso, bastante promissores no desenvolvimento de novos agentes antivirais e antibacterianos. O presente estudo tem como objetivo elaborar uma nanoemulsão a base do extrato rico em flavonóides extraídos das folhas de Ocotea notata e avaliar suas atividades biológicas. O extrato de O. notata foi obtido por maceração e a análise de sua atividade antiviral demonstrou que esses possuíam percentual de inibição superior a 99% frente ao HSV tipos 1 e 2. Além disto, foi demonstrada a atividade antibacteriana desse extrato frente a quatro cepas bacterianas: S. aureus (MIC = 0,31 mg/mL), E. coli (MIC = 5,0 mg/mL), P. aeruginosa (MIC = 2,5 mg/mL) e Salmonella (MIC = 2,5 mg/mL).Uma nanoemulsão estável constituída de Miristato de isopropila, Transcutol®, Tween® 80, água e 1% (p/p) dos flavonoides de O. notata foi desenvolvida e avaliada quanto às atividades descritas. Como esperado, a nanoemulsão não apresentou atividade, uma vez que a concentração do ativo incorporada à formulação foi muito pequena (1%) não sendo possível observar as atividades biológicas nos modelos testados. Faz-se necessário, portanto, mais estudos para o desenvolvimento de um produto contendo o extrato de O. notata a fim de otimizar sua eficácia / The search for safer and minor adverse effects has led man to develop new technologies formulation that increases patient comfort. In this context, nanotechnology has contributed to the emergence of more specific drugs for the disease which is intended to treat. Herpes simplex virus (HSV) is a pathogen well known by man and it is estimated that a great part of the population is already infected asymptomatically. In bacterial infections has become the emergence of antibiotic-resistant strains, so the discovery of new antimicrobial active is becoming most essential. Flavonoids are special plant metabolites which guarantee resistance to microorganisms, making it therefore very promising in the development of new antiviral and antibacterial agents. This study aims to develop a nanoemulsion base of flavonoids extracted from leaves of Ocotea notata and evaluate their biological activities. Flavonoids of O. notata were extracted by maceration and analysis of its antiviral activity demonstrated that these had higher inhibition percentage at 99% compared to HSV types 1 and 2. Furthermore, we demonstrated the antiviral activity extract against four bacterial strains: S. aureus (MIC = 0.31 mg / ml), E. coli (MIC = 5.0 mg / ml), P. aeruginosa (MIC = 2.5 mg / ml) and Salmonella (MIC = 2.5 mg / ml). A stable nanoemulsion consisting of isopropyl myristate, Transcutol®, Tween® 80, and 1% (w/w) of the flavonoids of O. notata was developed and evaluated with respect to the described activities. As expected, the nanoemulsion showed no biological activity, once the concentrations of the active incorporated in the formulation was very small (1%) in the tested models.. It is necessary, therefore, further studies to the development of a product containing extract of O. notata in order to optimize its effectiveness

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This thesis involves the study of compressive and infectious neurological diseases in dogs, including the evaluation of functional recovery with intervertebral disc disease (IVD) thoracolumbar paraplegics and without deep pain perception (DPP) underwent surgical treatment, dogs with neurological signs associated to distemper (NSAD) and neoplasms of the central nervous system (CNS). Retrospective studies were conducted by reviewing the records of Veterinary neurology department (Veterinarian Hospital), of Federal University of Santa Maria. 208 cases were analyzed between March 2003 and June 2014. The satisfactory functional recovery of paraplegic dogs without DPP was observed in 73.3% (11/15) of the dogs. Recovery time after surgery occurred in one day [9% (01)], between 15 and 30 days [63.7% (07)] and over than 30 days [27.3% (03)]. 134 dogs with NSSD were studied, 39 definitive diagnosis (Group A) and 95 presumptive diagnosis (Group B). Adults were affected in 60.4%, followed by 31.3% of young and 8.2% old dogs. Neurological signs were varied according to the site of lesions in the CNS. According to the owners, the vaccine was applied only by veterinarians in 68% of dogs and clinical examination was performed in 56%, increasing the risk of vaccine failure. The CNS neoplasms occurred mainly in Boxers (35%), and the predominantly affected age-group was 5-year-old or older (92.3%). The course of clinical signs was higher for spinal cord (7-420 days) than for intracranial neoplasms (7-115 days). The most frequently neurological signs observed in dogs with brain and spinal cord neoplasms were, respectively, changes in the conscience level (58%) and hyperesthesia (57%) in neoplasms of the spinal cord. The cortico-thalamic region and T3-L3 spinal cord segment were the most frequently anatomical sites involved (58% and 43% respectively). Meningioma was the most frequently primary neoplasms affecting the brain and the spinal cord of dogs, consisting respectively of 40% and 75% of the cases. / Esta tese envolveu o estudo de doenças neurológicas compressivas e infecciosa em cães, incluindo a avaliação da recuperação funcional com doença do disco intervertebral (DDIV) toracolombar, paraplégicos e sem percepção à dor profunda (PDP) submetidos ao tratamento cirúrgico, cães com sinais neurológicos associados à cinomose (SNAC) e com neoplasmas do sistema nervoso central. Os estudos retrospectivos foram realizados por meio de revisão dos registros neurológicos de cães atendidos pelo Setor de Neurologia Veterinária, do Hospital Veterinário Universitário (HVU) da Universidade Federal de Santa Maria. Foram analisados 208 casos, entre março de 2003 e junho de 2014. De acordo com nossos resultados, a recuperação funcional de cães paraplégicos sem PDP em decorrência da DDIV toracolombar ocorreu em 73.3% (11/15). O tempo de recuperação funcional após a cirurgia foi de um dia [9% (01)], entre 15 e 30 dias [63.7% (07)] e maior do que 30 dias [27.3% (03)]. Foram incluídos 134 cães com SNAC, sendo 39 com diagnóstico definitivo (Grupo A) e 95 com diagnóstico presuntivo (Grupo B). Os cães adultos foram acometidos em 60.4% das vezes, seguido de 31.3% dos filhotes e 8.2% dos idosos. Os SNAC variaram de acordo com a fase de infecção e distribuição das lesões no sistema nervoso central (SNC). Os resultados normais do líquido cerebroespinhal e hemograma não excluíram o diagnóstico definitivo. A vacina foi aplicada por médicos veterinários em 68% dos cães e a avaliação clínica prévia à vacinação foi realizada em 56% dos pacientes. Os neoplasmas do SNC foram observados principalmente em cães Boxer (35%), com idade entre cinco e 10 anos (92.3%). A evolução dos sinais clínicos foi maior para medula espinhal (ME) (7-420 dias) do que para os intracranianos (7- 115 dias). O sinal neurológico predominante foi a alteração do nível de consciência (58%) em cães com neoplasma encefálico e a hiperestesia espinhal (57%) naqueles com neoplasmas da ME. As regiões tálamo-cortical e segmento medular entre T3-L3 foram as mais acometidas por neoplasias do SNC (58% e 43% respectivamente). O meningioma foi o neoplasma primário mais frequente no encéfalo (40%) e na ME (75%) dos cães avaliados.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a worldwide pathogen associated with important losses to livestock production. Most of these losses come from reproductive disorders and from the ability of the virus to produce persistent infections following in utero infection of the fetus. A number of reverse genetics methodologies have been used for BVDV in order to better understand the biology of the virus, which allowed the elucidation of a number of biological features including virus replication, host-virus interaction, immune response, and the pathogenesis of fetal infection. The present study describes the construction, characterization and manipulation of an infectious clone out of a non-cytophatic Brazilian BVDV strain IBSP4-ncp. The cDNA recombinant clone was constructed by yeast homologous recombination with a low-copy vector, from three genomic fragments comprising the open reading frame (ORF). The two untranslated regions (5' and 3' UTR) were replaced by the respective UTRs of the reference strain NADL. The constructed vector was transcribed in vitro and the resulting RNA was transfected on MDBK cells to rescue infectious virus. The rescued viruses (IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 and #3) were maintained for ten passages in tissue culture and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology similar to those of the parental IBSP-4. Genomic analysis revealed five point mutations in the gene coding for Npro protein, resulting in amino acid changes. These mutations probably reflect an adaptation of the virus to the heterologous UTRs. The infectious clone IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 was further used for the construction of a recombinant virus expressing the Gaussia luciferase (Gluc) reporter gene. The reporter gene was inserted between the Npro and Core genes, being flanked by an upstream linker and a downstream sequence of the Foot and Mouth Disease virus protease (FMDV2Apro) for accurate protein processing. The recombinant vector was in vitro transcribed and the RNA was transfected on MDBK cells. Recombinant infectious viruses were rescued (IC-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 and #4) and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology similar to those of the parental IBSP-4 clone. The Gluc reporter gene was accurately expressed and processed by the recombinant virus during 15 passages in tissue culture. These studies revealed that the infectious clone constructed herein can be easily manipulated and is able to carry in its genome heterologous genes up to 555 base pairs in length in a stable fashion and without interference with its replication efficiency. Thus, the constructed clone may be very useful for genetic manipulation towards studying different aspects of the BVDV biology and its interactions with the host, and for the development of vaccine strains with attenuated phenotype and/or with antigenic markers. / O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um patógeno de bovinos distribuído mundialmente, associado com importantes perdas econômicas. As maiores perdas devem-se aos problemas reprodutivos causados pela infecção, e pela capacidade do vírus de causar persistência após infecção fetal no terço inicial da gestação. Para entender melhor a biologia desse vírus, sistemas de genética reversa foram desenvolvidos e tem permitido a elucidação de vários aspectos da replicação viral, interação vírus hospedeiro, resposta imune e patogenia da infecção fetal. O presente estudo relata a construção, caracterização e manipulação de um clone infeccioso, a partir da cepa brasileira não-citopática IBSP4-ncp. O clone de DNA recombinante foi construído pela técnica de recombinação homóloga em levedura, utilizando um vetor de baixo número de cópias, construído a partir de três fragmentos genômicos, que compreendiam a fase aberta de leitura (open reading frame, ORF) do vírus. As duas regiões não traduzidas (5 e 3 UTR) foram substituídas pelas respectivas UTRs da cepa de referência NADL. O vetor construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK para recuperação de vírus infecciosos. Os vírus recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncp#2 e #3) foram mantidos por 10 passagens em cultivo celular e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus parental IBSP-4. A análise do genoma por sequenciamento revelou cinco mutações pontuais no gene Npro, com trocas de aminoácidos, provavelmente refletindo uma adaptação do vírus às UTRs heterólogas. O clone infeccioso construído CIpBSC_ IBSP4-ncp#2, foi então utilizado para a construção de um vírus recombinante expressando o gene repórter Gaussia luciferase (Gluc). O gene repórter foi inserido entre os genes Npro e Core do vírus. Para o processamento da proteína repórter, uma sequência ligante foi adicionada anteriormente ao gene, e a sequência da protease do vírus da Febre Aftosa (FMDV2Apro) foi inserida após o gene. O vetor recombinante construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK. Vírus recombinantes infecciosos foram recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 e #4) e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus obtido do clone infecioso. O gene repórter Gluc foi corretamente expresso e processado pelo vírus recombinante durante 15 passagens em cultivo celular. Com os resultados obtidos nestes estudos, conclui-se que o clone infeccioso construído pode ser facilmente manipulado e é capaz de carrear em seu genoma, e expressar de forma estável, genes heterólogos com até 555 pares de base, que parecem não interferir com sua capacidade replicativa. Dessa forma, o clone obtido pode ser muito útil para manipulação genética visando estudar diferentes aspectos da biologia do BVDV e de suas interações com o hospedeiro, assim como para a produção de cepas vacinais com fenótipo atenuado e/ou com marcadores antigênicos.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese sabrina.pdf: 5211450 bytes, checksum: 0bc9c15d9e2f434943a2738627937629 (MD5) Previous issue date: 2009-03-31 / Paracoccidioides brasiliensis causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis presenting clinical manifestations ranging from mild to severe forms. A P. brasiliensis cDNA expression library was produced and screened with pooled sera from PCM patients adsorbed against antigens derived from in vitro-grown P. brasiliensis yeast cells. Sequencing DNA inserts from clones reactive with PCM patients sera indicated 35 open reading frames presenting homology to genes involved in metabolic pathways, transport, among other predicted functions. The complete cDNAs encoding aromatic L-amino acid decarboxylase (Pbddc), lumazine synthase (Pbls) and a homologue of the high affinity copper transporter (Pbctr3) were obtained. Recombinant proteins PbDDC and PbLS were obtained; a peptide was synthesized for PbCTR3. The proteins and the synthetic peptide were recognized by sera of patients with confirmed PCM and not by sera of healthy patients. Using the vivo-induced antigen technology (IVIAT) we identified immunogenic proteins expressed at high levels during infection. Quantitative real - time RT-PCR demonstrated high transcript levels of Pbddc, Pbls and Pbctr3 in yeast cells infecting macrophages. Transcripts in yeast cells derived from spleen and liver of infected mice were also measured by qRT-PCR. Our results suggest a putative role for the immunogenic proteins in the infectious process of P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, prevalente nos países da América Latina. Uma biblioteca de cDNA de expressão de Paracoccidioides brasiliensis foi construída e rastreada com soros de pacientes acometidos por paracoccidioidomicose (PCM). Foram identificados 35 clones de cDNAs que codificam proteínas relacionadas com metabolismo celular, transporte, energia, transcrição, endereçamento de proteínas, transdução de sinal e componentes celulares. Os cDNAs codificantes da L- aminoacido aromatico - descarboxilase (Pbddc), da lumazina sintase (Pbls) e do transportador de cobre de alta afinidade foram obtidos. As proteínas recombinantes PbDDC e PbLS e o peptídio sintético PbCTR3 foram reconhecidos por soros de pacientes com PCM e não reagiram com soros controle. A técnica de IVIAT (tecnologia de antígenos induzidos in vivo) propiciou a identificação de proteínas imunogênicas mais expressas durante o processo infecçioso. RT-PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) demostrou altos níveis de transcritos de Pbddc, Pbls e Pbctr3 em células leveduriformes infectando macrófagos. O transcritos de células leveduriformes de P. brasiliensis recuperadas de fígado e baço de camundongos foram medidos por qRT-PCR. Estes resultados sugerem o provável papel das proteínas imunogênicas no processo infeccioso de P. brasiliensis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was isolated for the first time in 1991 and since then it has been associated with significant economic losses to the pig industry worldwide. Although vaccination against PRRSV is widely used, an important advance would be the development of marker vaccines allowing serologic discrimination between vaccinated and naturally infected animals. The present study aimed to identify immunogenic and conserved regions dispensable to viral replication in different PRRSV proteins, which could be used as negative serologic markers in a new generation of liveattenuated vaccines. A fine mapping of B-cell linear epitopes in different PRRSV proteins by Pepscan is presented in the first part of this thesis. The results indicated the presence of several B-cell linear epitopes in the non-structural protein 2 (Nsp2) and in all structural proteins encoded by PRRSV, which were consistently recognized by antibodies raised in pigs experimentally infected with a North American strain of the virus (NVSL97-7895). The Nsp2 was found to harbor the highest frequency of immunodominant epitopes (n=18) when compared to structural proteins. In the structural proteins, epitopes consistently recognized by immune sera were located in all studied proteins. Overall, the highest degree of immunogenicity and conservation was exhibited by two epitopes identified in the C-terminal end of the M protein (ORF6). The antibodies recognizing the immunodominant epitopes of each protein were detected as early as days 7 to 15 post-infection (p.i.) and remained detectable until the end of the experiment (day 90 p.i). Based on their immunodominance and level of amino acid (aa) conservation, two target epitopes were selected to serve as serological marker candidates in each of the following PRRSV proteins: Nsp2, GP3 and M. These epitopes were deleted in the wild-type cDNA infectious clone (FL-12) by site-directed mutagenesis. The results of this study are presented in the second part of this thesis. A Nsp2 mutant virus (FLdNsp2/44) was successfully rescued following RNA transfection in MARC 145 cells. This epitope deletion mutant fulfilled the requirements for a differential vaccine virus such as efficient growth in vitro and in vivo and induction of active seroconversion as measured by a commercial ELISA kit associated with the absence of a marker-specific peptide-ELISA response in 100% (n=15) of the vaccinated animals. In vitro and in vivo characterization of the mutant virus clearly showed that removal of a 15-mer Nsp2 epitope had no effect on the immunogenicity, growth properties or virulence when compared to the wild type virus. On the other hand, deletions of previously identified peptide marker candidates within GP3 and M genes were shown to be lethal for virus viability in vitro. Alternatively, by substitution of 5aa at a time within a M peptide marker candidate, a viable mutant virus could be recovered although it still resulted in a positive marker virus. In summary, our results provide proof of concept that PRRSV marker vaccines can be developed using such methodology. Taken together, these data indicate that the combination of a mutant virus carrying a deletion of an immunodominant epitope and the corresponding peptide ELISA represents an attractive approach for the development of PRRSV differential modified-live vaccines. / O vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) foi isolado pela primeira vez em 1991 e, desde então, tem sido associado a perdas significativas para a suinocultura mundial. Apesar da vacinação contra o PRRSV ser amplamente utilizada, um grande avanço seria alcançado com a elaboração de vacinas diferenciais que permitam a discriminação sorológica entre animais vacinados e naturalmente infectados. O presente estudo teve como objetivo a identificação de regiões imunogênicas, conservadas e dispensáveis a replicação viral, em diferentes proteínas do PRRSV, que pudessem ser utilizadas como marcadores sorológicos negativos em uma nova geração de vacinas atenuadas. Na primeira parte desta tese estão apresentados os resultados de um mapeamento de epítopos lineares de linfócitos B em diferentes proteínas do PRRSV, pelo uso da tecnologia de Pepscan. Os resultados indicam a presença de diversas regiões imunodominantes na proteína não estrutural 2 (Nsp2) e em todas as proteínas estruturais do vírus. Essas regiões foram consistentemente reconhecidas pelo soro de suínos experimentalmente infectados com uma cepa norte-americana do PRRSV (NVSL97-7895). A maior freqüência de epítopos imunodominantes foi identificada na Nsp2 (n=18) e o mais alto grau de imunogenicidade e nível de conservação de aminoácidos foi observado em dois epítopos identificados na extremidade carboxi-terminal da proteína M (ORF6). Anticorpos reagentes com epítopos imunodominantes de cada proteína foram detectados inicialmente entre os dias 7-15 pós-infecção (pi), permanecendo em altos títulos até o final do experimento (dia 90 pi). Com base na imunodominância e nível de conservação de amino ácidos (aa) das seqüências mapeadas, dois epítopos alvos foram selecionados como candidatos a marcadores sorológicos negativos em cada uma das proteínas Nsp2, Gp3 e M. Esses epítopos foram então deletados em um clone infeccioso de cDNA (FL12) por mutagênese sítio-direcionada. Os resultados desses experimentos encontram-se descritos na segunda parte da tese. Um vírus mutante carreando a deleção de um epítopo imunodominante da Nsp2 (FLdNsp2/44) foi obtido após transfeccção de RNA viral em células MARC145. A caracterização in vitro e in vivo do vírus mutante demonstrou que a remoção dos 15 aa da Nsp2 não produziu efeito sobre a imunogenicidade, replicação ou virulência quando comparado ao vírus parental. Além disso, observou-se indução de soroconversão contra o PRRSV em animais infectados, detectada pelo uso de um teste ELISA comercial. Por outro lado, não foi detectada resposta humoral específica contra a região deletada nos animais imunizados com o FLdNsp2/44, conforme resultados de um teste ELISA contendo como antígeno um peptídeo sintético correspondente a seqüência removida. Por outro lado, deleções dos epítopos previamente identificados na Gp3 e proteína M foram letais à viabilidade viral in vitro. Alternativamente, um outro vírus mutante foi gerado pela substituição de 5 aa do epítopo identificado na proteína M, embora a alteração de resíduos não tenha sido suficiente para eliminar a imunogenicidade da região. Em resumo, os resultados do presente estudo se constituem em uma prova de conceito no sentido do desenvolvimento de vacinas diferenciais contra o PRRSV. A utilização de um vírus mutante carreando a deleção de um epítopo imunodominante, associado com um teste de ELISA baseado no peptídeo sintético correspondente a região deletada, representam uma alternativa para o desenvolvimento de vacinas diferenciais atenuadas contra o PRRSV.