La promiscuité des enzymes joue un rôle primordial pour l’évolution des protéines et la divergence des fonctions catalytiques. Comprendre les déterminants moléculaires qui régissent cette promiscuité enzymatique représente un enjeu scientifique majeur pour identifier les trajectoires évolutives pouvant entrainer l’émergence de nouvelles fonctions. L’objectif de cette thèse a consisté d’une part à sonder la promiscuité catalytique de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, une transglucosidase d’intérêt biotechnologique majeur, dans le but d’identifier des substrats alternatifs et d’autre part à étendre ses capacités naturelles par des techniques d’évolution moléculaire. Une trentaine de molécules ont été testées et ont permis de mettre en évidence la forte spécificité de l’enzyme pour son substrat donneur ainsi que sa large promiscuité vers les substrats accepteurs. Le rôle des résidus impliqués dans la reconnaissance des substrats a par la suite été considéré au travers d’une stratégie rationnelle basée sur des prévisions de stabilité thermodynamique. Deux histidines (H187 et H392), ont ainsi été ciblées par mutagénèse à saturation. La stabilité de ces mutants a été étudiée ainsi que ainsi que leur activité envers différents substrats. Des enzymes à la stabilité améliorée ou montrant des changements de spécificité de produits ont ainsi été identifiées. Afin d’étudier plus amplement la promiscuité de cette amylosaccharase, une deuxième stratégie d’ingénierie a été menée pour mimer in vitro les mécanismes moléculaires de la dérive génétique neutre. Ce phénomène dit de “Neutral-Drift” a préalablement été décrit comme un facteur impliqué dans les changements de promiscuité catalytique. Quatre cycles de mutagénèse ont ainsi été réalisés et 440 clones ont été sélectionnés pour avoir conservé leur fonction originelle (i.e. leur activité sur saccharose). Des variants aux propriétés catalytiques améliorées envers des substrats alternatifs ont été caractérisés et des groupes de positions corrélées ont été identifiés. L’effet des mutations neutres sur la thermostabilité a également été étudié. Enfin, de façon remarquable, une nouvelle activité envers un substrat non reconnu par l’enzyme native, le méthyl-α-L-rhamnopyranoside, a été détectée. Ce variant possédant quatre substitutions a été caractérisé et la résolution de sa structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons-X permettra d’approfondir les relations unissant séquence, structure et activité de l’enzyme / Investigation of substrate promiscuity is of prime interest to understand the way enzymes evolve. Understanding the molecular determinants involved in substrate promiscuity is challenging to determine the evolutionary trajectories that lead to the emergence of catalytic functions and to take further advantage of their evolvability to develop original biocatalysts. The objective of this thesis aimed to investigate the substrate promiscuity of the amylosucrase from Neisseria polysaccharea, a transglucosidase of prime biotechnological interest, to identify alternative donor and acceptor molecules and further extend its catalytic properties through enzyme engineering. About thirty molecules were assayed and the strong specificity for the natural donor sucrose was emphasized, as well as the broad acceptor promiscuity. The rational engineering of active site residues responsible for substrate recognition was undertaken through thermodynamic stability predictions. Two residues, namely H187 and H392, were rationally targeted for site-directed mutagenesis. The stability of these variants was investigated as well as their activity toward both natural and promiscuous substrates. Variants with enhanced stability or altered product distribution were identified. These results highlighted that mutations responsible for stability changes may also lead to substrate promiscuity or product specificity changes. To further investigate the promiscuity of amylosucrase, we considered another engineering strategy to mimic in vitro the neutral enzyme evolution. Neutral genetic drift was previously shown to be related to promiscuity changes. On this basis, four repeated round of mutagenesis were performed and 440 clones were selected because they maintained the protein original function (i.e. the activity on sucrose). Variants with enhanced properties towards promiscuous donors and acceptors were characterized and clusters of correlated amino acid substitutions were identified. The impact of neutral mutations on thermodynamic stability was also discussed. Remarkably, a totally new activity towards methyl-α-L-rhamnopyranoside, an acceptor not recognized by the parental wild-type enzyme, was detected. The variant harboring four amino acid substitutions was characterized and the determination of its three-dimensional structure by X-ray crystallography will be useful to further investigate the structure-sequence-activity relationships of this enzyme

Les procédés de bioraffinerie, et notamment les agrocarburants, sont aujourd'hui reconnus comme essentiels pour sortir de l'économie actuelle basée sur le pétrole. Dans le cas du bioéthanol produit à partir de biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique par les enzymes de Trichoderma reesei est le principal point faible du procédé et doit être améliorée. Ces travaux de thèse s'intègrent dans le cadre du projet Futurol, et ont pour objectif d'identifier de nouvelles enzymes capables d'améliorer l'activité de T. reesei sur la lignocellulose. Une analyse post-génomique réalisée sur les secrétomes de vingt souches fongiques s'est révélée particulièrement prometteuse pour l'identification d'enzymes lignocellulolytiques d'intérêt. Une approche de génomique comparative a également abouti à la sélection de deux endo-mannanases de famille GH5 et GH26 chez le champignon Podospora anserina. Ces hémicellulases ont permis d'améliorer significativement la libération de glucose par T. reesei à partir d'épicéa. Une étude fondamentale approfondie a permis de résoudre les structures cristallographiques et de mettre en évidence les relations entre les spécificités enzymatiques de chaque enzyme et leurs caractéristiques structurales. La structure tridimensionnelle de la mannanase GH26 couplée à son CBM35 présente un linker court et rigide et une organisation du site actif atypique. Les deux mannanases ont également fait l'objet d'un travail d'ingénierie aléatoire qui a abouti à des variants des deux enzymes présentant une amélioration de l'efficacité catalytique et/ou une modification de spécificité. / Biorefineries such as biofuels are nowadays considered as essential to reduce our dependence on oil products. In the production process of bioethanol from lignocellulosic biomass, enzymatic hydrolysis performed by Trichoderma reesei enzymes is the main bottleneck of the process and requires improvements.The present work is part of the Futurol project, and aims at identifying new enzymes to improve the activity of T. reesei toward lignocellulose. Post-genomic analyses on twenty fungal strains have revealed the potential of this approach to identify lignocellulolytic enzymes of interest. Comparative genomics also led to the selection of two endo-mannanases from families GH5 and GH26 from the fungus Podospora anserina. These hemicellulases significantly improved glucose release upon T. reesei hydrolysis of spruce. An in-depth fondamental study allowed the solving of cristallographic structures and revealed the relationships between enzymatic specificities and structural characteristics. The structure of GH26 catalytic module appended to CBM35 highlighted a short and rigid linker and an atypical active site organization. The two mannanases were subjected to molecular engineering. Variants displaying improved catalytic efficiency and/or modified specificity were identified for both enzymes.

Une stratégie d’ingénierie du métabolisme de C. acetobutylicum a été développée afin de construire une souche capable de produire de l’isopropanol à partir de sucres en C5, en C6 ou de substrats plus complexes. Dans un premier temps, une souche de C. acetobutylicum a été ingénieriée pour la production d’un mélange isopropanol/butanol/éthanol (IBE), ce microorganisme n’étant pas capable de produire naturellement de l’isopropanol. Différents opérons, exprimant une voie synthétique de production d’isopropanol, ont été construits et introduits à partir d’un plasmide dans une souche chez laquelle la voie de synthèse du butyrate a été supprimée (C. acetobutylicum ATCC 824 Δcac15ΔuppΔbuk). La souche la plus performante a été sélectionnée à partir de cultures réalisées en fermenteur, en mode discontinu à pH 5,0 et s’est avérée être celle exprimant la voie de l’isopropanol sous la dépendance du promoteur thl. Une optimisation des paramètres de culture a conduit à la production d’un mélange IBE, à partir de glucose, à une concentration de 21 g.l-1, un rendement de 0,34 g.g-1 et une productivité de 0,8 g.l-1.h-1. La production du mélange IBE à partir de xylose ou de xylane comme unique source de carbone a également été démontrée et permet une production IBE de 10,4 g.l-1 avec un rendement de 0,31 g.g-1 sur xylose et une production IBE de 4,28 g.l-1 avec un rendement de 0,28 g.g-1 sur xylane. Enfin, l’analyse des flux passant par la voie de l’isopropanol a permis d’identifier l’étape limitant la production de ce composé. Cette dernière semble être liée à la concentration en acétate intracellulaire et aux propriétés catalytiques la CoA-transférase, qui possède une faible affinité pour l’acétate. Ainsi, une CoA-transférase synthétique basée sur les caractéristiques de la CoA-transférase AtoAD d’E. coli, qui est décrite comme ayant un Km pour l’acétate plus faible, a été conçue et exprimée dans la souche précédement construite afin de tenter de lever la limitation de la voie de synthèse de l’isopropanol. Dans un deuxième temps, des modifications supplémentaires du métabolisme de C. acetobutylicum ont été effectuée afin de produire de l’isopropanol comme unique produit de fermentation à partir de glucose ou de xylose. Différentes stratégies ont alors été évaluées dans le but de contourner le déséquilibre rédox causé par la délétion des voies parasites consommatrices de carbone. Ainsi, des outils permettant la mesure d’activité hydrogénase, in-vivo et in-vitro, ont été développés pour tester la fonctionnalité de 3 hydrogénases, utilisant la bifurcation d’électrons pour la production d’H2 à partir de NADH et de ferrédoxine. Une deuxième stratégie utilisant les potentialités de la voie des phosphocétolases pour la métabolisation du xylose en acétyl-CoA a été étudiée et des résultats prometteurs ont été obtenus malgré les limitations actuellement rencontrées / First, C. acetobutylicum was metabolically engineered to produce a biofuel consisting of an isopropanol/butanol/ethanol (IBE) mixture. Different synthetic isopropanol operons were constructed and introduced on plasmids in a butyrate minus mutant strain (C. acetobutylicum ATCC 824 Δcac15ΔuppΔbuk) in which the butyrate pathway was deleted. The best strain expressing the isopropanol operon from the thl promoter was selected from batch experiments at pH 5.0. By further optimizing the pH of the culture, an IBE mixture with almost no by-products was produced at a titer of 21 g.l-1, a yield of 0.34 g.g-1 and productivity of 0.8 g.l-1.h-1, values never reached before. IBE production was also shown to be efficient using xylose or xylan as the sole carbon source with 10.4 g.l-1 IBE produce at a yield of 0.31 g.g-1 from xylose and 4.28 g.l-1 IBE produce at a yield of 0.28 g.g-1 from xylan. Furthermore, by performing in vivo and in vitro flux analysis of the synthetic isopropanol pathway, this flux was identified to be limited by acetate intracellular concentration and the high Km of CoA-transferase for acetate. A synthetic CoA-transferase based on the AtoAD E. coli characteristics was designed, synthesized and evaluated in vivo. This enzyme, that displays a lower Km for acetate, was found to be a good candidate to alleviate the bottleneck of the isopropanol pathway. Secondly, several strategies were evaluated to redraw C. acetobutylicum metabolism and finally construct a strain able to produce isopropanol as the only fermentation product from glucose or xylose. To overcome the severe redox imbalance caused by homo-isopropanolic fermentation, several strategies were investigated. On the one hand, a new class of electron bifurcating enzyme, the NADH hydrogenases, that can use NADH and ferredoxin to produce H2, were evaluated in C. acetobutylicum. This strategy opens the alternative to produce isopropanol and H2 from glucose without any carbon lost. On the other hand, the use of an alternative catabolic pathway, the phosphocetolase pathway, for xylose utilization and acetyl-CoA production was evaluated. These results allow the identification of the metabolic bottlenecks to overcome to obtain a C. acetobutylicum strain able to produce only isopropanol from xylose at high yield

Les lésions de cartilage ne cicatrisent pas spontanément et la réparation de ce tissu est un challenge. Les techniques chirurgicales restant insatisfaisantes, la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire sont maintenant envisagées. La transplantation de chondrocytes autologues (TCA) existe déjà mais cette procédure nécessite l'amplification des chondrocytes qui s'accompagne d'une perte du phénotype différencié (dont l'indicateur est le collagène de type II), au profit d'un phénotype fibroblastique (dont l'indicateur est le collagène de type I, retrouvé dans les tissus fibreux). La TCA conduit donc à une greffe de chondrocytes dédifférenciés produisant un fibrocartilage, dont les propriétés mécaniques sont différentes du cartilage hyalin natif. L'objectif de mes travaux était de développer un nouveau kit d'ingénierie tissulaire du cartilage par association de chondrocytes humains, de biomatériaux et d'une sélection de facteurs solubles. Nous avons utilisé le cocktail FGF-2/insuline (FI) pour l'amplification cellulaire et le cocktail BMP-2/insuline/T3 (BIT) pour redifférencier les chondrocytes dans des éponges de collagène. Nos résultats ont montré que cette combinaison permet la synthèse d'une matrice cartilagineuse dans les supports collagène. Cependant, cette synthèse s'est trouvée favorisée en périphérie des éponges cultivées en conditions statiques. Nous avons ensuite utilisé un bioréacteur pour perfuser les éponges et nos résultats ont révélé alors un dépôt plus homogène de cartilage dans ces supports. De manière très intéressante, nous avons aussi observé l'arrêt de l'expression du collagène de type I. Ainsi, notre approche multifactorielle combinant des chondrocytes humains, des biomatériaux collagène, une combinaison FI-BIT et une culture en perfusion permet la reconstruction d'un cartilage non fibrotique / Cartilage lesions are irreversible and cartilage repair is challenging. Actual surgical techniques remain unsatisfactory and therefore, cell therapy and tissue engineering approaches are now considered. The Autologous Chondrocytes Transplantation (ACT) already exists but this procedure requires chondrocytes amplification. During this amplification, a dedifferentiation process occurs: chondrocytes lose their differentiated phenotype (characterized by type II collagen) towards a fibroblastic phenotype (characterized by type I collagen, a component of fibrous tissues). ACT leads to the graft of dedifferentiated chondrocytes, hence provoking the production of a fibrocartilage that presents different mechanical properties than native hyaline cartilage. The aim of my work was to develop a new kit of tissue engineering for cartilage repair using human chondrocytes, biomaterials and a selection of soluble factors. We used a cocktail of FGF-2 and insulin (FI) for cell amplification and a cocktail of BMP-2, insulin and T3 (BIT) for chondrocyte redifferentiation in collagen sponges. Our results showed that the combination allows the synthesis of a cartilaginous matrix in collagen scaffolds. However, matrix production is favored in periphery of the sponges cultivated in static conditions. A perfusion bioreactor was then used to perfuse the sponges and our results revealed a more homogeneous deposition of cartilage in the scaffolds. Very interestingly, we also noticed a stop of type I collagen expression. Thus, our multifactorial approach combining human chondrocytes, collagen scaffold, the combination FI-BIT and culture under perfusion allows the reconstruction of a non-fibrotic cartilage

Les enjeux planétaires du développement durable et du réchauffement climatique remettent en cause le fonctionnement de nos sociétés. La transition énergétique se traduit notamment par l’augmentation de l’utilisation des énergies renouvelables et constitue ainsi le contexte de nos travaux. Dans le cadre d’un contrat CIFRE avec l’entreprise VALOREM, nous proposons des méthodologies pour le développement et la conception d’installations renouvelables soutenables. L’approche d’Ingénierie Des Modèles mise en place nous permet de garder une démarche scientifique cohérente entre une vue très générale du contexte d’insertion des renouvelables et une vision plus technique et opérationnelle pour le développement d’installations renouvelables. Dans un premier temps, nous avons décrit de manière macroscopique le contexte d’insertion des énergies renouvelables en France, en proposant un cadre conceptuel pour le développement de projet d’aménagement du territoire. Il permet l’analyse des systèmes sociotechniques en transition grâce à une formalisation UML2 d’une part, et une méthode d’évaluation de la durabilité d’un processus d’autre part. Nous avons illustré ce cadre sur deux cas d’étude : le succès du développement de la centrale hydro-éolienne de l’île d’El Hierro dans les Canaries et l’échec du barrage de Sivens dans le Tarn en France. Par comparaison, nous montrons que l’implication des parties prenantes sur l’ensemble du processus de développement est cruciale pour le succès d’un projet. Nous avons ensuite proposé une implémentation logicielle permettant le suivi et le pilotage de projet d’aménagement du territoire en temps réel à l’aide d’outils d’intelligence artificielle. Conscient des limites opérationnelles de notre proposition, nous avons décidé de changer de point de vue pour adopter une vision plus technique sur les énergies renouvelables. La transition énergétique fait évoluer le système électrique français d’un modèle centralisé vers un modèle décentralisé, ce qui amène VALOREM à reconsidérer ses propositions techniques de production d’énergies renouvelables. Entre autre, l’entreprise tend vers l’hybridation de ses centrales et constate le besoin d’un outil de dimensionnement en phase d’avant-projet, afin d’identifier les opportunités d’activités. Nous faisons donc la proposition d’un prototype logiciel qui se veut flexible en termes de modélisation des centrales de production hybrides renouvelables et en termes de définition des objectifs et contraintes à satisfaire. Il est codé en C++ et basé sur des modèles d’optimisation linéaires. Nous illustrons son opérationnalité sur quatre cas d’étude : deux orientés marché électrique et deux en autoconsommation (l’un isolé, l’autre connecté au réseau). Les résultats des études montrent que les coûts de stockage batterie sont trop élevés pour pouvoir envisager l’installation de batteries dans les centrales hybrides renouvelables. Les systèmes en autoconsommation connectés au réseau semblent être plus prometteurs. Enfin, nous terminons par une analyse environnementale de différentes sources de production électrique afin de déterminer celles vers lesquelles la transition énergétique doit être axée. Les résultats montrent que la biomasse, l’éolien et le PV au sol sont les moyens de production les plus propres. La conclusion de la thèse propose une réflexion ascendante en complexité vers l’implication des acteurs dans les modèles de processus de développement territoriaux.

La performance d'un projet est considérée comme un facteur important pour en assurer le succès. Les entreprises s'intéressent à l'utilisation de pratiques efficaces au moyen de méthodes et d'outils efficaces pour concevoir et offrir des produits et des services novateurs et réduire le temps de mise sur le marché. La durée, les coûts et le rendement du projet sont des aspects qui font normalement face à des changements au cours de l'élaboration du projet. Ces changements doivent être traités en utilisant des processus adaptés et optimisés afin de mieux contrôler, coordonner, gérer et améliorer les projets. Les méthodes agiles semblent être efficaces pour la gestion de projets réussis, mais elles sont surtout utilisées dans les entreprises où le domaine d'activité est le logiciel. Les méthodes agiles ont récemment suscité un intérêt croissant de la part de l'industrie et sont maintenant bien acceptées et déployées en génie logiciel. Cette thèse aborde donc l'intérêt de transférer les méthodes agiles du logiciel à l'ingénierie des systèmes, et les enjeux qui y sont induits.Le travail de thèse introduit d'abord la notion d'agilité et la naissance du mouvement agile ainsi que les principes et les valeurs du développement logiciel agile. Il présente également les principales méthodes agiles, ainsi que d'autres philosophies qui partagent un certain nombre de similitudes avec l'agile. Il y a des attributs de projet, dans la littérature, qui aident à caractériser les projets agiles, ces attributs de projet sont décrits et utilisés pour comparer différentes méthodes agiles pour identifier les différences entre elles. Agile et Lean sont comparés pour déterminer pourquoi Lean est utilisé dans le développement logiciel, et en quoi il diffère des autres méthodes agiles. Enfin, nous identifions plusieurs problèmes de transfert de méthodes agiles dans le contexte de l'ingénierie des systèmes.Nous nous concentrons ensuite sur la compréhension de l'agilité en ingénierie des systèmes. Deux sens d’agile se retrouvent dans la littérature. Considérant que l'agilité est centrée sur le changement rapide de processus de produits et de systèmes convaincants, conçus et mis en œuvre de manière simple, nous explorons la question de l'introduction de l'agilité en ingénierie des systèmes. Une première analyse est menée pour identifier toute notion d'agilité dans les normes d'ingénierie des systèmes. Les résultats de cette analyse nous aident à mettre en évidence les enjeux et les défis du transfert de l'agilité dans l'ingénierie des systèmes. En nous concentrant sur les enjeux, nous présentons ensuite une méthodologie de recherche en quatre étapes. La première étape vise à définir un modèle contextuel pour le développement de l'ingénierie des systèmes. Le modèle contextuel contient les facteurs organisationnels et les attributs des projets d'ingénierie. Ensuite, la sélection d'une méthode agile qui pourrait être utilisée pour la gestion de projets d'ingénierie est proposée à l'étape deux. La troisième étape introduit l'utilisation de Scrum. Les pratiques Scrum sont définies et évaluées en fonction des attributs de projet pour les projets d'ingénierie. Les difficultés sont identifiées et répertoriées lors de l'utilisation des pratiques Scrum dans les projets d'ingénierie. Enfin, la quatrième étape propose des alternatives pour résoudre un ensemble de difficultés.Ce travail propose enfin l'utilisation des pratiques Scrum dans deux projets d'ingénierie. Un projet éducatif est d'abord analysé. Ce projet vise à développer un robot connecté. En partant du modèle contextuel pour le développement de l'ingénierie des systèmes, nous caractérisons le projet pour identifier le type de projet, puis nous proposons l'utilisation de la vue graphique de Scrum pour planifier le développement du robot. Suivant le même schéma, un deuxième projet industriel est analysé. Le second projet vise à développer une application automobile pour la gestion du moteur. / Project performance is considered as an important factor to ensure the success of a project. Companies are interested in the use of efficient practices through efficient methods and tools to design and deliver innovative products and services and decrease the time to market. Project duration, costs, and performance are aspects that normally face changes during the project development. These changes should be treated by using adapted and optimized processes in order to better control, coordinate, manage, and improve projects. Agile methods seem to be efficient for the management of successful projects, however they are mainly use in companies where the business domain is software. Agile methods recently received a growing interest from industry and now are well accepted and deployed in software engineering. This thesis thus tackles the point of transferring the agile methods from software to systems engineering, and issues that are induced.The report first introduces the notion of agility and the birth of the agile movement as well as the principles and values of agile software development. It also presents the main agile methods, as well as other philosophies that share a number of similarities with Agile. Project attributes can be defined, from the literature, to help contextualizing agile projects; we describe and use these project attributes to compare different agile methods and identify the differences between them. Agile and Lean are compared to determine why Lean is used in software development, and how it differs from other agile methods. Finally, we identify several issues to transfer agile methods in the context of systems engineering.We then focus on the understanding of agility in systems engineering. Two meanings of "agile" are found in literature. Considering that agility is focused in the rapid change of convincing, designing, and implementing processes of products and systems in an easy way, we explore the question of introducing agility in systems engineering. A first analysis is led to identify any notion of agility in systems engineering standards. The results of this analysis help us to highlight the issues and challenges of transferring agility into systems engineering. Focusing on the issues, we then present a four steps research methodology. The first step aims to define a contextual model for systems engineering development. The contextual model contains the organizational factors and the project attributes for engineering projects. This contextualization lead us to identify if and which agile method could be used for the management of engineering projects (step two). The step three justifies our selection of the Scrum Framework, between agile methods, for the management of engineering projects. Scrum Practices are defined and evaluated in the project attributes for engineering projects. However, several difficulties are identified and listed while using the Scrum Practices in engineering projects. Finally, the step four proposes some solutions to solve a set of difficulties.This work finally proposes the use of Scrum Practices in two engineering projects. An educational project is analyzed first. This project aims to develop a connected robot. By starting from the contextual model for systems engineering development (cf. section III.4.2.d), we characterize the project to identify what type of project is, then we propose the use of the graphical view of the Scrum Framework to plan the development of the robot. Following the same schema, a second industrial project is analyzed. The second project aims to develop an automotive application for engine management.

L'ingénierie tissulaire osseuse est un domaine multidisciplinaire qui vise à produire des substituts tissulaires pour la médecine régénératrice. Ce travail visait à produire des substituts osseux structurés tridimensionnels grâce à un système d'impression d'éléments biologiques par laser développé au laboratoire Inserm U577 (Projet LASIT: LASer pour L'Ingénierie Tissulaire). Les étapes de la thèse ont consisté tout d'abord à préparer des matériaux adaptés à l'impression par laser et à les caractériser au niveau physico-chimique et biologique. Il s'agissait d'hydroxyapatite nano-cristalline, de cellules humaines et d'hydrogels (alginate, matrigel). Ensuite des impressions structurées combinant ces matériaux ont été réalisées en 3 dimensions avant d'être implantés in vivo chez la souris. Les résultats ont montré que l'impression par laser d'éléments biologiques est une méthode efficace pour organiser des matériaux tridimensionnels à plusieurs composants pour l'ingénierie tissulaire. / Bone Tissue Engineering is a multidisciplinary field which aims to produce artificial tissues for regenerative medicine. The purpose of this work was to produce three-dimensional bone substitute using a laser-assisted bioprinting (LAB) workstation developped in the laboratory INSERM U577 (TEAL Project: Tissue Engineering Assisted by Laser). The first step of the work consisted in the synthesis of specific materials for LAB and in the characterization of their biological and physico-chemical properties. We have prepared a nano-hydroxyapatite bioink, human cells bioinks and hydrogels bioinks. Then, three-dimensional materials have been prepared using LAB and have been implanted in vivo in mice. The results have shown that Laser Assisted Bioprinting is an efficient method fo patterning 3-D materials using biolgical elements.

Les systèmes modernes sont caractérisés par l’intégration de plusieurs composants de technologies diverses interagissant dans le but d’offrir de plus en plus de fonctionnalités aux utilisateurs. La complexité croissante dans ces systèmes pluridisciplinaires dits mécatroniques nécessite la mise en place de nouveaux processus, outils et méthodes pour la conception, l’analyse et la validation de ces derniers en respectant les contraintes de coût et de délais imposés par la concurrence. Ces systèmes doivent également satisfaire des contraintes de fiabilité et surtout de sûreté de fonctionnement. Seule une intégration du processus d’analyse de sûreté de fonctionnement tout au long du processus de développement peut assurer la satisfaction de ces contraintes de manière optimale.Les travaux de cette thèse ont pour objectif de contribuer à l’intégration des analyses de sûreté de fonctionnement dans le processus d’ingénierie système basée sur SysML afin de rendre ces analyses plus rapides et plus efficaces. Pour ce faire, nous avons traité les axes suivants : la formalisation d’une méthodologie de conception basée sur SysML et qui sera le support des analyses de sûreté de fonctionnement ; l’extension du langage SysML afin de pouvoir intégrer des spécificités des systèmes mécatroniques ainsi que des aspects de sûreté de fonctionnement dans le modèle système; l’exploration automatique des modèles SysML afin d’en extraire les données nécessaires pour l’élaboration des artefacts de la SdF et la génération (semi)/automatique de ces derniers (FMEA et FTA). Nous avons également intégré la vérification formelle d’exigences de sûreté de fonctionnement.Cette méthodologie nommée SafeSysE a été appliquée sur des cas d’étude du domaine de l’aéronautique : EMA (Electro-Mechenical Actuator) et WBS (Wheel Brake System). / Modern systems are getting more complex due to the integration of several interacting components with different technologies in order to offer more functionality to the final user. The increasing complexity in these multi-disciplinary systems, called mechatronic systems, requires new appropriate processes, tools and methodologies for their design, analysis and validation whilst remaining competitive with regards to cost and time-to-market constraints.The main objective of this thesis is to contribute to the integration of safety analysis in a SysML-based systems engineering approach in order to make it more efficient and faster. To achieve this purpose, we tackled the following axes: formalizing a SysML-based design methodology that will be the support for safety analyses; providing an extension of SysML in order to enable the integration of specific needs for mechatronic systems modeling as well as safety concepts in the system model; allowing the automated exploration of the SysML models in order to extract necessary information to elaborate safety artefacts (such as FMEA and FTA) and the semi-automated generation of the latters. We have also integrated formal verification to verify if the system behaviors satisfy some safety requirements.The proposed methodology named SafeSysE was applied to case studies from the aeronautics domain: EMA (Electro Mechanical Actuator) and WBS (Wheel Brake System).

L'ingénierie tissulaire a vu émerger dans la dernière décennie, la nanomédecine régénérative en combinant non seulement les cellules souches mais aussi les facteurs de croissance. Le but de ce travail a été d'utiliser les techniques de l'ingénierie osseuse et cartilagineuse pour améliorer ou créer des biomatériaux en les rendant bioactifs et vivants à une échelle nanométrique. Durant ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés au développement de biomatériaux (naturels ou synthétiques), tridimensionnels (3D), implantables et utilisables pour le traitement de diverses pathologies de l'appareil loco-moteur, qui sont capables d'induire une meilleure différenciation cellulaire et une régénération tissulaire plus stable. Nous avons développé 3 types d'implants nanostructurés, à base de titane recouvert d'hydroxyapatite et de nanotubes de carbone, de capsules ou de membranes nanofibreuses nanofonctionnalisées par des facteurs de croissance, qui ont permis d'obtenir une régénération osseuse ou ostéo-articulaire, in vitro comme in vivo / During the last ten years, tissue engineering has merged with regenerative nanomedecine by combination, not only of stem cell technology but also of growth factors. The goal of this thesis was to use bone and cartilage engineering as a model, in order to improve and to develop active and living nanostructured implants. During this PhD studies, we were interested in the development of biomaterials (natural or synthetic), tridimentionnal (3D), transplantable for bone and cartilage diseases treatments, that are able to induce more cellular differentiation and improved tissue regeneration. In this thesis, we have developed 3 types of nanostructured implants, (i) titanium implants coated with hydroxyapatite and carbone nanotubes; (ii) active capsules functionalized by growth factors and stems cells for bone induction (in vitro/in vivo); (iii) electrospun nanofibrous membranes functionalized by growth factors and (Osteoblasts/Chondrocytes) for bone and cartilage regeneration, in vitro and in vivo

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) issues de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical sont immuno-privilégiées et immunosuppressives. Dans le cadre d’une utilisation en ingénierie vasculaire, la persistance de ces propriétés après différenciation endothéliale a été explorée. La différenciation a été induite par ensemencement des CSM-GW sur des films multicouches de polyélectrolytes en présence du milieu EGM-2. L’immunogénicité des cellules endothéliales-« like » (CEL) a été vérifiée en évaluant l’expression de 2 marqueurs immunologiques HLA-DR et CD86. Afin d’évaluer l’effet immunosuppresseur des CSM-GW avant et après différenciation, celles-ci ont été cultivées en premier lieu en présence de cellules mononucléées stimulées en contact cellulaire direct ou séparées, puis avec des cellules Natural Killer (NK) et lymphocytes T (LT). Les résultats ont montré que les CEL expriment les marqueurs endothéliaux, n’expriment pas HLA-DR et CD86 et qu’elles inhibent la prolifération des différentes populations immunitaires selon un mécanisme dépendant de facteurs solubles tels que IDO, les IL-6 et -1β et de la PGE2, et de contacts cellulaires. La co-culture de LT avec les CEL a induit l’apparition d’une population de LT régulateurs de manière similaire aux CSM-GW. La co-culture des cellules NK en présence de CEL a induit une diminution du récepteur activateur NKG2D et a aussi induit un transfert du CD73 à leur surface, suggérant leur capacité à produire de l’adénosine, un puissant immunosuppresseur. Les CEL maintiennent le caractère immunoprivilégié et immunosuppresseur des CSM-GW, suggérant leur possible utilisation en ingénierie vasculaire / Umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) are immune-privileged and immunosuppressive. Our study sought to determine the effect of endothelial differentiation on the immunomodulatory capacities of WJ-MSC. Endothelial-like cells (ECL) differentiation was performed by seeding MSC on polyelectrolyte multilayer films as substrate and stimulating them by EGM-2 culture medium. The expression of two immunological markers HLA-DR and CD86 was followed during the differentiation time. The effect of co-culture with ELC or MSC either in contact or separated by a transwell on different immune cells (peripheral blood mononuclear cells, T Lymphocytes (LT), Natural Killer (NK) cells) was assessed by evaluating immune cells proliferation. The results showed that ELC expressed endothelial markers, expressed low level of HLA-DR and CD86 and inhibited the proliferation of the different immune cell populations, and this inhibition is thought to be mediated by soluble factors as IDO, IL-6, IL-1β and PGE2, and by direct cellular contact. We reported also the capacity of ELC to generate a population of regulatory T cells and to decrease the expression of activating receptor NKG2D by NK cells. Moreover, we demonstrated that co-cultures with ELC induce CD73 expression on NK cells, a mechanism that may induce adenosine (a potent immunosuppressor) secretion by NK cells. Thus, ELC maintain the hypo-immunogenic and immunosuppressive characters of WJ-MSC suggesting their possible use in vascular engineering