Mutationen im Glycintransporter 2 (GlyT2) stellen die präsynaptische Komponente der neurologischen Erkrankung Hyperekplexie oder Startle Disease dar. Der neuronale Na+/Cl- -abhängige GlyT2 ist für das Recycling von Glycin verantwortlich und bildet an inhibitorischen glycinergen Synapsen die Hauptquelle des freigesetzten Transmitters. Dominante, rezessive und zusammengesetzte heterozygote Mutationen wurden bereits identifiziert, von denen die meisten zu einer beeinträchtigten Glycinaufnahme führen. In dieser Arbeit konnten wir eine neue pathogene Mutation innerhalb des neuronalen Glycintransporter-2-Gens (SLC6A5, OMIM604159) in einer Familie identifizieren, in der beide Elternteile heterozygote Träger waren. Ein homozygotes Kind litt an schweren neuromotorischen Defiziten, wohingegen Heterozygote keine Symptome aufwiesen. Die neue rezessive Mutation c.1286C>T erzeugte einen missense Aminosäureaustausch von Prolin gegen Leucin an Position 429 (pP429L) in der Transmembrandomäne 5. Wir haben die GlyT2P429L-Variante mittels Homologiemodellierung, immuncytochemischer Färbungen, Western Blot Analysen, Biotinylierung und funktioneller Glycinaufnahmetests charakterisiert. Der mutierte GlyT2 zeigte beim Proteintransport durch verschiedene intrazelluläre Kompartimente zur Zelloberfläche keine Defizite. Die gesamte Proteinexpression war jedoch signifikant verringert. Obwohl GlyT2P429L an der Zelloberfläche vorhanden ist, zeigte er einen Verlust der Proteinfunktion. Die Co-Expression der Mutante mit dem Wildtyp-Protein, die die Situation der Eltern widerspiegelte, hatte keinen Einfluss auf die Transporterfunktion und erklärte somit ihren nicht symptomatischen Phänotyp. Wenn jedoch die Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Protein im Überschuss exprimiert wurde, war die Glycinaufnahme signifikant verringert. Die Strukturanalyse ergab, dass der eingeführte Leucinrest an Position 429 zu Konformationsänderungen in der α-Helix 5 führt, die in unmittelbarer Nähe zur Natriumbindungsstelle des Transporters lokalisiert sind. Dies deutet darauf hin, dass die Zugangsmechanismen des GlyT2 gestört sein könnten und einen vollständigen Verlust der Transportaktivität verursachen. Unsere Ergebnisse belegen, dass P429 in GlyT2 ein strukturell wichtiger Aminosäurerest ist, der eine wichtige funktionelle Rolle beim Glycintransport spielt. / Glycine transporter 2 (GlyT2) mutations represent the presynaptic component of the neurological disease hyperekplexia or startle disease. The neuronal Na+/Cl- -dependent GlyT2 is responsible for glycine recycling and establishes the main source of releasable transmitter at inhibitory glycinergic synapses. In humans, dominant, recessive and compound heterozygous mutations have been identified, most of them leading to impaired glycine uptake. In this study, we identified a novel pathogenic mutation within the neuronal GlyT2 gene (SLC6A5, OMIM604159) in a family with both parents being heterozygous carriers. A homozygous child suffered from severe neuromotor deficits, whereas heterozygous individuals did not reveal any symptoms. The novel recessive mutation c.1286C>T generated a missense amino acid exchange of proline to leucine at position 429 (pP429L) in transmembrane domain 5 of the protein. We characterized the GlyT2P429L variant using homology modeling, immunocytochemical stainings, Western blot analysis, biotinylation, and functional glycine uptake assays. The mutated GlyT2 revealed no deficits in protein trafficking through various intracellular compartments to cellular surface. However, the whole cell protein expression was significantly decreased. Although present at cellular surface, GlyT2P429L showed a loss of protein function. Co-expression of the mutant with the wild-type protein, reflecting the situation in the parents, did not affect transporter function, thus explaining their non-symptomatic phenotype. Nevertheless, when the mutant was expressed in excess compared with the wild-type protein, glycine uptake was significantly reduced. Structural analysis revealed that the introduced leucine residue at position 429 leads to conformational changes in α-helix 5 which is localized in close proximity to the sodium-binding site of the transporter. The data suggest that the gating mechanism of GlyT2 might be disturbed and causes a complete loss of transport activity. Thus, our results support P429 in GlyT2 as structurally important residue displaying a key functional role in glycine transport.

Die Fähigkeit, Verhaltensweisen anderer Personen auf deren mentale Prozesse und Zustände zurück zu führen, entwickelt sich ab dem dritten Lebensjahr. Zeitgleich wird die Fähigkeit zur Inhibitorischen Kontrolle weiter ausdifferenziert. Die zu beobachtende Parallelität in der Entwicklung beider Konstrukte hat in den letzten 20 Jahren zahlreiche Forschungsgruppen beschäftigt. Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung des Kausalzusammenhangs zwischen der Theory of Mind sowie der Inhibitorischen Kontrolle. Es wurden Kinder mit sensorischem Integrationsdefizit einer Kontrollgruppe zwischen 3-5 Jahren gegenübergestellt (Wellmann et al., 2001), die mittels einer Testbatterie zur Theory of Mind sowie zur Inhibitorischen Kontrolle untersucht wurden.Die Annahme, dass Kinder mit sensorischer Integrationsstörung eine verzögerte Entwicklung der Theory of Mind sowie der Inhibitorischen Kontrolle haben, konnte gestützt werden. Es kann angenommen werden, dass die Entwicklung zwar zeitlich verzögert, also über Kompensationsstrategien abläuft, Kinder mit Sensorischen Integrationsstörungen diese Fähigkeiten jedoch prinzipiell entwickeln können. Hinsichtlich des Kausalzusammenhangs zwischen der Entwicklung der Theory of Mind, der Inhibitorischen Kontrolle und der Sensorischen Integrationsfähigkeit konnte gezeigt werden, dass die Sensorische Integrationsfähigkeit als Vorläuferfähigkeit für die Entwicklung der Inhibitorischen Kontrolle angesehen werden kann. Diese wiederum konnte durch die Längsschnitterhebung als Grundvoraussetzung für die Entwicklung der Theory of Mind identifiziert werden. Der spezifische Zusammenhang verliert sich jedoch bei steigenden Fähigkeiten. Es kann also mit Bjorklund & Kipp (2001; siehe auch Bjorklund & Pellegrini, 2002; Chasiotis et al., 2006; Pellicano, 2007) angenommen werden, dass ein Grundlevel an Inhibitorischer Kontrollfähigkeit als Vorraussetzung zur Entwicklung einer Theory of Mind angesehen werden kann.

This decade saw the development of new high-end light microscopy approaches. These technologies are increasingly used to expand our understanding of cellular function and the molecular mechanisms of life and disease. The precision of state-of-the-art super resolution microscopy is limited by the properties of the applied fluorescent label. Here I describe the synthesis and evaluation of new functional fluorescent probes that specifically stain gephyrin, universal marker of the neuronal inhibitory post-synapse. Selected probe precursor peptides were synthesised using solid phase peptide synthesis and conjugated with selected super resolution capable fluorescent dyes. Identity and purity were defined using chromatography and mass spectrometric methods. To probe the target specificity of the resulting probe variants in cellular context, a high-throughput assay was established. The established semi-automated and parallel workflow was used for the evaluation of three selected probes by defining their co-localization with the expressed fluorescent target protein. My work provided NN1Dc and established the probe as a visualisation tool for essentially background-free visualisation of the synaptic marker protein gephyrin in a cellular context. Furthermore, NN1DA became part of a toolbox for studying the inhibitory synapse ultrastructure and brain connectivity and turned out useful for the development of a label-free, high-throughput protein interaction quantification assay. / Neuentwickelte, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind prinzipiell geeignet, molekulare Mechanismen und zelluläre Vorgänge im niedrigen Nanometerbereich aufzulösen. Die maximal erreichbare Auflösung wird unter anderem von der eingesetzten Fluoreszenzmarkierung beeinflusst. In dieser Arbeit beschreibe ich die Synthese neuartiger, funktioneller, fluoreszierender Proben und evaluiere deren Eigenschaft Gephyrin, einen universalen Marker der neuronalen inhibitorischen Postsynapse, zu visualisieren. Hierzu wurden Peptide mittels Festphasenpeptidsyntese hergestellt und mit fluoreszierenden Farbstoffen konjugiert, die für hochauflösende Mikroskopieverfahren geeignet sind. Der Syntheseerfolg und die Reinheit der Stoffe wurde mittels massenspektrometrischer und chromatographischer Methoden bestimmt. In einem Hochdurchsatzverfahren wurden die Proben in einem zellulären Kontext untersucht, spezifisch Gephyrin zu markieren. In einem semi-automatisierten, parallelen Verfahren wurden drei ausgewählte Proben synthetisiert und deren Kolokalisation mit dem fluoreszierenden Zielprotein in transfizierten HEK-Zellen untersucht. Aus dieser Arbeit ist NN1DC hervorgegangen, eine peptidische Sonde zur Visualisierung von Gephyrin. Diese Probe weist verbesserte Färbeeigenschaften wie eine höhere Spezifität und Sensitivität, verglichen mit bisher bekannten peptidischen Gephyrinsonden, auf. Darüber hinaus kann NN1DA als hochaffiner Binder von Gephyrin zur Entwicklung neuer gephyrinbindender Moleküle in einem high-througput Verfahren genutzt werden.

Short functional peptidic probes can maximize the potential of high-end microscopy techniques and multiplex imaging assays and provide new insights into normal and aberrant molecular, cellular and tissue function. Particularly, the visualization of inhibitory synapses requires protocol tailoring for different sample types and imaging techniques and relies either on genetic manipulation or on antibodies that underperform in tissue immunofluorescence. Starting from an endogenous activity-related ligand of gephyrin, a universal marker of the inhibitory post-synapse, I developed a short peptidic multivalent binder with exceptional affinity and selectivity to gephyrin. By tailoring fluorophores to the binder, I have obtained Sylite, a probe for the visualization of inhibitory synapses, with an outstanding signal-to-background ratio, that bests the “gold standard” gephyrin antibodies both in selectivity and in tissue immunofluorescence. In tissue Sylite benefits from simplified handling, provides robust synaptic labeling in record-short time and, unlike antibodies, is not affected by staining artefacts. In super-resolution microscopy Sylite precisely localizes the post-synapse and enables accurate pre- to post-synapse measurements. Combined with complimentary tracing techniques Sylite reveals inhibitory connectivity and profiles inhibitory inputs and synapse sizes of excitatory and inhibitory neurons in the periaqueductal gray brain region. Lastly, upon probe optimization for live cell application and with the help of novel thiol-reactive cell penetrating peptide I have visualized inhibitory synapses in living neurons. Taken together, my work provided a versatile probe for conventional and super-resolution microscopy and a workflow for the development and application of similar compact functional synthetic probes. / Kurze funktionelle peptidische Sonden können das Potenzial von High-End-Mikroskopietechniken und Multiplex-Imaging-Assays maximieren und neue Erkenntnisse über normale und abweichende Molekulare-, Zelluläre- und Gewebefunktionen liefern. Insbesondere die Visualisierung inhibitorischer Synapsen erfordert eine Anpassung des Protokolls an verschiedene Probentypen und Bildgebungsverfahren und ist entweder auf genetische Manipulationen oder auf Antikörper angewiesen, die in der Gewebeimmunfluoreszenz unterdurchschnittlich abschneiden. Ausgehend von einem endogenen aktivitätsbezogenen Liganden von Gephyrin, einem universellen Marker der hemmenden Postsynapse, habe ich einen kurzen peptidischen multivalenten Binder mit außergewöhnlicher Affinität und Selektivität zu Gephyrin entwickelt. Durch die Anpassung von Fluorophoren an das Bindemittel habe ich Sylite erhalten, eine Sonde für die Visualisierung inhibitorischer Synapsen mit einem hervorragenden Signal-Hintergrund-Verhältnis, das die "Goldstandard"-Gephyrin-Antikörper sowohl in der Selektivität als auch in der Gewebe-Immunfluoreszenz übertrifft. Im Gewebe profitiert Sylite von einer vereinfachten Handhabung, bietet eine robuste synaptische Markierung in rekordverdächtig kurzer Zeit und wird im Gegensatz zu Antikörpern nicht durch Färbungsartefakte beeinträchtigt. In der Super-Resolution-Mikroskopie lokalisiert Sylite präzise die Post-Synapse und ermöglicht genaue Messungen von Prä- zu Postsynapse. In Kombination mit ergänzenden Tracing-Techniken deckt Sylite die hemmende Konnektivität auf und erstellt Profile der hemmenden Eingänge und Synapsengrößen von erregenden und hemmenden Neuronen in der periaquäduktalen Grau Hirnregion. Schließlich habe ich nach Optimierung der Sonde für die Anwendung in lebenden Zellen und mit Hilfe eines neuartigen thiolreaktiven zelldurchdringenden Peptids hemmende Synapsen in lebenden Neuronen visualisiert. Insgesamt lieferte meine Arbeit eine vielseitige Sonde für konventionelle und superauflösende Mikroskopie und einen Arbeitsablauf für die Entwicklung und Anwendung ähnlicher kompakter funktioneller synthetischer Sonden.

Bisherige Untersuchungen deuten darauf hin, dass ein höherer BMI mit einer reduzierten inhibitorischen Kontrolle verbunden sei. Allerdings sind die bisherigen Ergebnisse zum Teil widersprüchlich und die Untersuchungen erfolgten hauptsächlich bei weiblichen Versuchspersonen. Ich untersuchte gezielt die inhibitorische Kontrolle innerhalb und außerhalb des Essenskontextes bei Männern und Frauen unterschiedlichen Gewichtes. Außerdem erfolgte eine Bewertung von unterschiedlichen Essensbildern nach deren Schmackhaftigkeit und die Erhebung von Verhaltensmerkmalen zum Essverhalten und der Impulsivität mittels Fragebögen. Ich konnte zeigen, dass Frauen niedrigkalorische Nahrungsmittel schmackhafter bewerteten als Männer. Außerdem hatten Frauen eine bessere inhibitorische Kontrolle nach der Ansicht von hochkalorischen Nahrungsmittel im Vergleich zu niedrigkalorischen Nahrungsmitteln. Es gab einen statistischen Trend für eine bessere inhibitorische Kontrolle nach der Ansicht von hochkalorischen Nahrungsmitteln bei Frauen gegenüber Männern. Es konnte kein direkter Zusammenhang zwischen Gewicht und inhibitorischer Kontrolle sowohl innerhalb als auch außerhalb des Essenskontextes gefunden werden. Allerdings konnte ich zeigen, dass es einen Moderationseffekt der Merkmalsimpulsivität auf den Zusammenhang zwischen inhibitorischer Kontrolle und BMI für den hochkalorischen Essenskontext gab. Dies deutet auf einen komplexen Zusammenhang zwischen Merkmalsimpulsivität, BMI und inhibitorischer Kontrolle hin. Mit meinen Ergebnissen konnte ich zeigen, dass adipöse Personen nicht an einer verminderten inhibitorischen Kontrolle per se leiden. Die Unterdrückung einer unerwünschten Handlung scheint vielmehr von sozialen Normen und dem aktuellen Kontext abzuhängen. Zusätzlich interagieren Faktoren wie Geschlecht und Merkmalsimpulsivität mit der inhibitorischen Kontrolle. / Recent research indicates that reduced inhibitory control is associated with higher body mass index (BMI), higher food craving and increased food intake. However, experimental evidence for the relationship between response inhibition and weight status is inconsistent and to date has been investigated predominantly in women. In the current study, 56 participants (26 obese, 30 lean; 27 female, 29 male)performed a Food Picture Rating Task followed by a Stop Signal Task where pictures of palatable high or low caloric food or non-food items were presented prior to the Go signal. We further assessed participants’ self-reported eating behavior and trait impulsivity as potential factors influencing response inhibition, in particular within the food context. Independent of BMI, women showed significantly higher liking for low caloric food items than men. This was accompanied by shorter Stop Signal Reaction Times (SSRT) after high compared to low caloric food pictures for women, and shorter SSRT in women compared to men for high caloric food. No influence of gender on SSRT was observable outside of the food context. While SSRTs did not differ between obese and lean participants across the three Picture categories, we found a moderating effect of trait impulsivity on the relationship between BMI and SSRT, specifically in the high caloric food context. Higher BMI was predictive of longer SSRT only for participants with low to normal trait impulsivity, pointing at a complex interplay between response inhibition, general impulsivity and weight status. Our results support the notion that individuals with obesity do not suffer from diminished response inhibition capacity per se. Rather, the ability to withhold a Response depends on context and social norms, and strongly interacts with factors like gender and trait impulsivity.

Nikotin gilt als die Abhängigkeit verursachende Komponente im Zigarettenrauch. Zudem hat Nikotin einen Einfluss auf die Ausbildung von lang anhaltenden kortikalen Erregbarkeitsveränderungen. Diese als neuroplastisch bezeichneten Veränderungen gelten als neurophysiologische Grundlage von Lern- und Gedächtnisprozessen. Die kognitiven Fähigkeiten sind bei Rauchern im Nikotinentzug reduziert und bessern sich erst nach Nikotingabe wieder. Auch Nichtraucher zeigen verbesserte kognitive Leistungen nach Nikotingabe. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, in welchem Maße nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren bei der Induktion von inhibitorischen kortikalen Erregbarkeitsveränderungen im menschlichen Gehirn eine Rolle spielen. Daher führten wir Versuche mit dem für diese Rezeptoren spezifischen Liganden Nikotin durch. Wir untersuchten den Einfluss von schnell anflutendem Nikotin in Form von Nasenspray und eines kontinuierlich hohen Nikotinspiegels in Form eines Nikotinpflasters auf inhibitorische kortikale Erregbarkeitsveränderungen bei Rauchern und Nichtrauchern. Für die Auslösung fokaler inhibitorischer Erregbarkeitsveränderungen verwendeten wir die gepaarte assoziative Stimulation (PAS). Mittels transkranieller Magnetstimulation wurden die kortikalen Exzitabilitätsveränderungen über die Änderung der MEP-Amplituden im Musculus abductor digiti minimi erfasst. Ohne Nikotin hatten sowohl Nichtraucher als auch Raucher die Fähigkeit zur Ausbildung von inhibitorischen kortikalen Erregbarkeitsveränderungen, wobei diese bei Rauchern im Nikotinentzug deutlich schlechter ausgeprägt waren als bei Nichtrauchern. Bei Nichtrauchern wurden die inhibitorischen Nacheffekte der PAS durch Nikotin aufgehoben bzw. vermindert, während sie bei Rauchern initial kürzer anhielten, später jedoch erneut auftraten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Nikotin eine wichtige Rolle bei der Ausbildung von inhibitorischen kortikalen Erregbarkeitsveränderungen spielt. Da diese als neuroplastisch bezeichneten Veränderungen als neurophysiologisches Korrelat für Lernvorgänge und Gedächtnis angesehen werden, lässt sich ein hierdurch vermittelter Einfluss von Nikotinabhängigkeit und Nikotinentzug auf kognitive Prozesse annehmen. Zudem nimmt Nikotin einen bedeutsamen Einfluss auf die durch zerebrale Stimulationsprotokolle wie die PAS ausgelösten Effekte.

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Inhibitory control processes have intensively been studied in cognitive science for the past decades. Even though the neural dynamics underlying these processes are increasingly better understood, a critical open question is how the representational dynamics of the inhibitory control processes are modulated when engaging in response inhibition in a relatively automatic or a controlled mode. Against the background of an overarching theory of perception-action integration, we combine temporal and spatial EEG signal decomposition methods with multivariate pattern analysis and source localization to obtain fine-grained insights into the neural dynamics of the representational content of response inhibition. For this purpose, we used a sample of N = 40 healthy adult participants. The behavioural data suggest that response inhibition was better in a more controlled than a more automated response execution mode. Regarding neural dynamics, effects of response inhibition modes relied on a concomitant coding of stimulus-related information and rules of how stimulus information is related to the appropriate motor programme. Crucially, these fractions of information, which are encoded at the same time in the neurophysiological signal, are based on two independent spatial neurophysiological activity patterns, also showing differences in the temporal stability of the representational content. Source localizations revealed that the precuneus and inferior parietal cortex regions are more relevant than prefrontal areas for the representation of stimulus–response selection codes. We provide a blueprint how a concatenation of EEG signal analysis methods, capturing distinct aspects of neural dynamics, can be connected to cognitive science theory on the importance of representations in action control.

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Die Erhaltung der Gehirnfunktion trotz Veränderungen im Organismus und dessen Umwelt erfordert homöostatische Mechanismen. Inhibitorische Interneurone spielen eine Schlüsselrolle bei Berechnungen und Homöostase im Gehirn. Es ist jedoch unklar, welcher Mechanismus diese Eigenschaften erzeugen kann. Diese Arbeit hat das Ziel, die homöostatischen Fähigkeiten solcher Interneurone zu bestimmen und die daraus resultierenden funktionellen Konsequenzen mit analytischen und numerischen Techniken zu ergründen. Die zentrale Hypothese dieser Arbeit ist, dass Interneurone ihre Feuerraten modulieren, um langfristig die Aktivität exzitatorischer Neurone bei einem homöostatischen Sollwert zu halten. Wir beginnen mit einem normativen Ansatz und leiten eine Plastizitätsregel her, welche die Aktivität von Interneuronen regelt, um netzwerkweite Abweichungen vom Sollwert zu minimieren. Um die biologische Plausibilität zu erhöhen, liefern wir zwei Approximationen, bei denen jede Interneurone auf die exzitatorische Population reagiert, die sie inhibiert und zeigen, dass alle drei Varianten vergleichbare aber unterschiedliche homöostatische Fähigkeiten haben. Wir kontrastieren den normativen Ansatz mit Regeln, welche die Aktivität einer Interneurone verändern, wenn die Neuronen, die sie treiben, vom Sollwert abweichen. Diese Regeln erzeugen Konkurrenz zwischen Neuronen und führen daher zu zerstreuter Netzwerkaktivität. Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchen wir, wie eine der approximierten Regeln die funktionellen Eigenschaften des sensorischen Kortex beeinflusst. Wir zeigen, dass sie mehrere experimentell Beobachtungen erklären kann, inklusive des Ko-Tunings von exzitatorischen und inhibitorischen Strömen und der Entwicklung von Zellverbänden. Zusammenfassend liefert diese Arbeit neue Erkenntnisse darüber, wie die Regulierung der Interneuron-Aktivität für neuronale Netzwerke homöostatisch sein kann, und zeigt mögliche Auswirkungen auf die Entwicklung und Erhaltung der Gehirnfunktion auf. / Preserving brain function despite ongoing changes inside the organism, and out in the world, necessitates homeostatic mechanisms. Inhibitory interneurons play a key role in both computation and homeostasis within the brain. However, it remains unclear if there is a mechanism that can account for both of these properties. This thesis therefore aims to determine the homeostatic capabilities of such interneurons and elucidate the resulting computational consequences, using analytical and numerical techniques. The central hypothesis of this thesis is that some interneurons slowly modulate their firing rates to maintain the long-term activity of excitatory neurons at a homeostatic set-point. Thus we begin with a normative approach, deriving a plasticity rule that regulates the activity of interneurons to minimise network-wide deviations from that set-point. In the interest of biological plausibility we also provide two approximations, both of which make each interneuron responsive to the excitatory population it inhibits, and show that all three variants exhibit comparable though distinct homeostatic capabilities. We contrast this normative approach by characterising the homeostatic properties of rules which instead alter the activity of an interneuron when the neurons that drive it deviate from the set-point. Those rules induce a competition between neurons, causing network activity to become sparse. In the second part of this thesis, we investigate how one of the approximate rules affects computational properties of sensory cortex. We show that it can account for several experimentally reported results, including co-tuning of excitatory and inhibitory currents, and the development of excitatory-inhibitory cell assemblies. In summation, this thesis provides new insight into how regulating interneuron activity can be homeostatic for neuronal networks, and reveals potential implications for development and preservation of brain function.