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Efecto de la suplementación de L-Glutamina sobre la expresión de genes de la respuesta inmune humoral de la mucosa intestinal de las crías de alpacas (Vicugna pacas)

Bejarano Lira, Emanuel Domingo January 2015 (has links)
En el presente estudio se determinó el efecto de la L-glutamina sobre la expresión de la inmunoglobulina A (IgA), TGF-β, IL-4, IL5, IL-6 e IL-10 en la mucosa del yeyuno de las crías de alpaca. Se formaron 2 grupos: uno de 6 crías (grupo A) y el segundo de 7 crías (grupo B) de 3 a 7 días de edad. Al primer grupo (A) se le administró 3.3mM de Lglutamina por kg peso vivo, vía oral; y se repitió a los 7 días post primera dosificación. Al segundo grupo (B), se le suministró Buffer Fosfato Salino o PBS (del inglés phosphate buffered saline) vía oral como control. Tres días después, una porción de yeyuno de cada cría fue procesada para la extracción de ARN mensajero (ARNm) y realizado la transcripción reversa (RT) y la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR tiempo real por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction) utilizando cebadores específicos. Para la cuantificación relativa de la IgA e interleucinas se usó el método 2- ΔΔct. Se determinó que en las crías tratadas con L-glutamina, el TGF-β se expresó 3 veces más (p<0.05), y la IgA 18 veces más (p<0.05) que en los controles. Las expresiones de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 tuvieron estadísticamente los mismos niveles en los animales tratados y los controles. Se concluye que la L-glutamina incrementa la expresión TGFβ e IgA mejorando la respuesta inmune adaptativa humoral de mucosa intestinal en crías de alpaca. Palabras clave: Inmunidad de mucosas, crías de alpacas, Inmunoglobulina A, interleucinas. / --- In the present study the effect of L-glutamine on expression of immunoglobulin A (IgA), TGF-β, IL-4, IL5, IL-6 and IL-10 is determined in the jejunal mucosa baby alpaca. Two groups were formed: the first group of 6 baby’s alpaca was given 3.3mM of L-glutamine per kg body weight, orally; and he repeated at 7 days post first dose. The second group (control) of 7 baby’s alpaca will be supplied phosphate buffered saline o PBS. Three days later, a portion of each breeding jejunum were processed for extracting messenger RNA (mRNA) and performing the reverse transcription (RT) and real time polymerase chain reaction o PCR using specific primers. For relative quantitation of IgA and interleukins 2-∆∆ct Method was used. It was determined that in cells treated with L-glutamine offspring, TGF-β was expressed 3 times (p<0.05), and 18 times IgA (p<0.05) than controls. Expressions of IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10 were statistically the same levels in the treated animals and controls. It is concluded that L-glutamine increases expression of IgA and TGF-β improving humoral adaptive immune response of intestinal mucosa in baby alpaca. Key words: Baby Alpaca, Immunoglobulin A, mucosae immunity, Interleukin.
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Niveles de inmunoglobulina G en saliva total como marcador biológico de la enfermedad periodontal

Bravo Castagnola, Francis Geraldo January 2008 (has links)
El estudio evaluó la concentración de inmunoglobulina G (IgG) en saliva total en la enfermedad periodontal y su papel como marcador biológico en esta patología Se incluyeron 50 individuos sanos y 40 pacientes periodontales como grupos control y estudio respectivamente. El grupo de estudio se dividió en subgrupos de 20 individuos: gingivitis y periodontitis. El examen clínico evaluó placa dentaria, sangrado al sondaje y profundidad de sondaje. Las evaluaciones se efectuaron antes y después del tratamiento periodontal de Fase I. En ambos momentos se tomaron muestras de saliva total para determinar la concentración de IgG mediante el análisis espectrofotométrico de su absorbancia. Se encontró que a mayor progresión de la enfermedad periodontal los niveles de IgG eran más elevados encontrándose una diferencia significativa entre pacientes sanos, con gingivitis y periodontitis. Sin embargo el grado de severidad de la gingivitis no constituía un factor relevante para la variación del nivel de IgG. Entre los casos leves y severos de periodontitis se encontró una diferencia significativa en los niveles de IgG. / -- This study evaluated the concentration of inmunogluline G (IgG) in whole saliva in peridontal disease and its role as a biological marker in this patology. To realize the study, 50 healthy patients and 40 patients were incluyed as control and study group respectively. The study group was divided in subgroup with 20 patients: gingivitis and periodontitis. The clinical examination was realized evaluating dental plaque, probing bleeding and probing depth. The evaluation were performed before and after the phase I periodontal treatment. At each moment, we took whole saliva samples to determine the IgG concentration through espectrophotometric analysis of its absorbance. We found that the greater progression of the periodontal disease, more elevated was the IgG level IgG establishing a significant difference between the healthy patients and individuals with gingivitis and periodontitis. However, the severity of gingivitis didn’t constitute a outstanding factor for significant differences in IgG concentration between slight and severe cases. On the other hand, between slight and severe cases of patients with periodontitis, we found a significant difference at IgG levels.
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Niveles de inmunoglobulina G en saliva total como marcador biológico de la enfermedad periodontal

Bravo Castagnola, Francis Geraldo January 2008 (has links)
El estudio evaluó la concentración de inmunoglobulina G (IgG) en saliva total en la enfermedad periodontal y su papel como marcador biológico en esta patología Se incluyeron 50 individuos sanos y 40 pacientes periodontales como grupos control y estudio respectivamente. El grupo de estudio se dividió en subgrupos de 20 individuos: gingivitis y periodontitis. El examen clínico evaluó placa dentaria, sangrado al sondaje y profundidad de sondaje. Las evaluaciones se efectuaron antes y después del tratamiento periodontal de Fase I. En ambos momentos se tomaron muestras de saliva total para determinar la concentración de IgG mediante el análisis espectrofotométrico de su absorbancia. Se encontró que a mayor progresión de la enfermedad periodontal los niveles de IgG eran más elevados encontrándose una diferencia significativa entre pacientes sanos, con gingivitis y periodontitis. Sin embargo el grado de severidad de la gingivitis no constituía un factor relevante para la variación del nivel de IgG. Entre los casos leves y severos de periodontitis se encontró una diferencia significativa en los niveles de IgG. / This study evaluated the concentration of inmunogluline G (IgG) in whole saliva in peridontal disease and its role as a biological marker in this patology. To realize the study, 50 healthy patients and 40 patients were incluyed as control and study group respectively. The study group was divided in subgroup with 20 patients: gingivitis and periodontitis. The clinical examination was realized evaluating dental plaque, probing bleeding and probing depth. The evaluation were performed before and after the phase I periodontal treatment. At each moment, we took whole saliva samples to determine the IgG concentration through espectrophotometric analysis of its absorbance. We found that the greater progression of the periodontal disease, more elevated was the IgG level IgG establishing a significant difference between the healthy patients and individuals with gingivitis and periodontitis. However, the severity of gingivitis didn’t constitute a outstanding factor for significant differences in IgG concentration between slight and severe cases. On the other hand, between slight and severe cases of patients with periodontitis, we found a significant difference at IgG levels.
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Calidad intra e interlaboratorial en la determinación de inmunoglobulina E total en suero en laboratorios de análisis clínicos de Lima-Metropolitana

Torres Guerrero, Ingrid Sarita January 2014 (has links)
Objetivo: Determinar la calidad intra e interlaboratorial en la determinación de Ig E total en laboratorios de análisis clínicos de Lima – Metropolitana. Diseño: Descriptivo. Lugar: Laboratorios de análisis clínicos nacionales y privados de Lima – Metropolitana. Materiales y métodos: Se extrajo dos muestras séricas de donantes voluntarios. Fueron alicuotadas y congeladas (-32 °C). Previo consentimiento informado, para el caso de laboratorios nacionales, se recolectó información del proceso de medición de Ig E total en una encuesta. Se entregaron dos alícuotas de la misma concentración a cada laboratorio, incluyendo a un laboratorio de referencia, siendo transportados en cadena de frío. Los resultados fueron informados de forma escrita y vía correo electrónico; y fueron analizados para obtener el coeficiente de variación (CV%), Error relativo (E%) y el índice de desviación estándar (SDI). Resultados: No hubo fluctuaciones significativas en la concentración de Ig E total según el tiempo de almacenamiento en congelación. El mayor CV% fue obtenido de la medición por ELISA y el menor, por ECLIA en las determinaciones de Ig E total en ambos sueros de estudio. El máximo valor de error relativo,para la medición de suero de nivel I, por ECLIA fue -15,131%, siendo el mínimo -2,36%; así como para nivel II, el máximo valor fue -11,180% y el mínimo, -1.848 % respecto a los valores obtenidos por el Laboratorio de referencia. El mayor SDI, formulados a partir de valores RATIO, fue obtenido por ELISA y el menor, por CLIA a partir de la medición de suero de nivel I, respecto al laboratorio de referencia. En la medición del suero de nivel II, el mayor SDI se obtuvo por ELISA y el menor, por ECLIA respecto al laboratorio de referencia. Conclusiones: La metodología ECLIA es la más precisa siendo ELISA la más imprecisa; sin embargo, la mayoría de laboratorios miden Ig E total por defecto respecto a los valores informados por el laboratorio de referencia. / Tesis
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Reconocimiento de calreticulina de Trypanosoma cruzi por subclases de inmunoglobulinas G presentes en el suero de camélidos inmunizados de la especie Lama glama

Veloso Baeza, Linda Marisol January 2017 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / Los camélidos poseen tres subclases de Inmunoglobulina G (IgG): IgG1, IgG2 e IgG3. Las dos últimas, carecen de cadena liviana, conociéndose como anticuerpos de cadena pesada (AcCP). Su sitio de unión al antígeno, formado por los dominios variables de las cadenas pesadas, posee un peso molecular de 15 kDa, pudiendo generarse biotecnológicamente (nanobody). Este hecho facilita su producción, biodistribución, penetración tisular y neutralización de proteínas de membrana que participan en el proceso de infectividad. La proteína Calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) participa en la infectividad y evasión del sistema inmune por parte del parásito. Nanobodies anti-TcCRT podrían ser utilizados para disminuir su infectividad. En este contexto, previamente, dos llamas (Lama glama) inmunizadas con TcCRT recombinante (rTcCRT) produjeron un suero anti-rTcCRT. Con el fin de averiguar qué subclase de IgG es responsable de esta reactividad, esta Memoria de Título propuso determinar la(s) subclase(s) de IgG que reconocen rTcCRT en estos sueros inmunes. Para ello, se generó una columna de sefarosa unida a rTcCRT en la que se incubaron los sueros inmunes de ambas llamas, obteniéndose fracciones purificadas cuya reactividad anti-rTcCRT fue comprobada mediante Western Blot. Los sueros purificados fueron cargados en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio al 12%, en condiciones reductoras y no reductoras, que se tiñeron con azul de Coomassie. Se observaron bandas cuyo peso molecular concuerda con IgG1. Se concluye, que las llamas inmunizadas produjeron IgG1 contra rTcCRT, sin embargo, para comprobar la generación de IgG2 e IgG3 se requerirán estudios adicionales / The camelids have three subclasses of immunoglobulin G (IgG): IgG1, IgG2 and IgG3. IgG2 and IgG3 lack of a light chain, called heavy chain antibodies (HCAbs). The site of binding to the antigen consists of the variable domains of both heavy chains and has a molecular weight of 15 kDa, being possible to generate it biotechnologically (nanobody). This fact allows its easy production, better biodistribution, tissue penetration and neutralizaztion of membrane proteins participating in the infectious process. Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT) is a protein involved in the infectivity and evasion of the host immune system. Nanobodies anti-TcCRT could be used to decrease the parasite infectivity. In this context, previously, two immunized llamas (Lama glama) with recombinant TcCRT (rTcCRT) produced an anti-rTcCRT serum. To find out the subclass of IgG responsible of this reactivity, this Undergraduate Thesis proposed to determine the IgG subclass(es) of IgG (IgG1, IgG2 and IgG3) able to recognize rTcCRT in these immune sera. For this, it was generated a Sepharose column linked to rTcCRT in which were incubated both llama immune sera. We obtained purified anti-rTcCRT fractions whose reactivity were tested by Western Blot. Purified sera were loaded on a 12% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate under reducing and non-reducing conditions and stained with Coomassie blue. Observed bands were consistent with the molecular weight of IgG1. In conclusion, both immunized llamas produced IgG1 against rTcCRT, however, additional studies may be performed to demonstrate the generation of IgG2 and IgG3
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Cinética de expresión de inmunoglobulina A en el epitelio intestinal de crías de alpaca (Vicugna pacos)

Dionisio Córdova, Juan Carlos January 2012 (has links)
El presente estudio tuvo como objetivos determinar y comparar los niveles de expresión relativa de ARN mensajero (ARNm) de IgA en el epitelio intestinal de las crías de alpacas sanas y enfermas con enteropatía hasta los 45 días de edad. Se muestrearon 70 animales: 35 sanas y 35 enfermas; 5 crías antes del consumo de calostro y 5 por cada semana de edad hasta la sexta semana. Las muestras consistieron en 2 cm de longitud del yeyuno, la cual fue inmediatamente conservada en nitrógeno líquido (-196°C). Se realizó la extracción de ARN total con Trizol®, luego se sintetizó ADN complementario (ADNc). Posteriormente se realizó la PCR convencional y la RT- PCR Tiempo Real empleando oligonucleótidos diseñados para la detección del exón 1 de de la región Fc IgA de alpaca. Se realizó la cuantificación de la expresión relativa mediante normalización con ARNm del gen GAPDH y los cálculos de la expresión relativa se realizaron utilizando el método 2-ΔΔCt. Se identificó y demostró mediante la técnica de RT PCR tiempo real que las alpacas codifican y transcriben ARNm del exón 1 de la región Fc de IgA desde el primer día de edad, mas no al nacimiento; siendo su expresión relativa detectada y producida en el epitelio intestinal de crías de alpacas a partir de un día de edad, tanto en animales sanos como enfermos. Los animales sanos presentan una tendencia de expresión constante de ARNm de IgA hasta la cuarta semana de edad, con disminución discreta en las semanas subsiguientes, mientras que en los cuadros entéricos la producción de ARNm de IgA siempre es superior a lo expresado por los animales sanos, habiendo diferencias significativas (p<0.05) entre ambos grupos sanitarios (sanos 38.8 y enfermos 113 veces respectivamente, respecto del calibrador), desde la primera hasta la sexta semana de edad. Palabras claves: Camélidos sudamericanos, inmunidad de mucosa intestinal, Inmunoglobulina A, PCR, RTPCR tiempo real, cuantificación relativa. / --- The present study had as objectives to determine and compare the levels of relative expression of messenger RNA (mRNA) of IgA in intestinal epithelium of newborn alpaca healthy and sick with enteropathy until 45 days old. Surveyed 70 animals: 35 sick and 35 healthy; 5 pups before the consumption of colostrum and 5 for each week of age until the sixth week. The samples consisted in 2 cm of length of the jejunum, which was immediately preserved in liquid nitrogen (- 196°C). The extraction was conducted with Trizol®, then was synthesized complementary DNA (cDNA). Subsequently, it was made the conventional PCR and real time RT - PCR using oligonucleotides designed for detecting the exon 1 of the Fc IgA region of alpaca. The quantification of the relative expression was made through normalization with the GAPDH gene mRNA and the relative expression calculations were conducted using method 2-ΔΔCt. It was identified and demonstrated through the real time RT - PCR technique that alpacas encoded and transcribed mRNA of exon 1 of the IgA Fc region from the first day of age, but not at the birth; being it relative expression detected and produced in intestinal epithelium of newborn alpaca from a day of age, both in healthy animals as sick. Healthy animals have a tendency of constant expression of mRNA of IgA until the fourth week of age, with slightly decrease in the subsequent weeks, whereas in enteric diseases IgA mRNA production is always superior than the expressed by the healthy animals, having significant differences (p < 0.05) between the two groups (healthy 38.8 and sick 113 times respectively, with regard to the calibrator), from the first to the sixth week of age. Key words: South American camelids, intestinal mucosal immunity, immunoglobulin A, real time RT –PCR, relative quantification.
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Dinámica de anticuerpos específicos IgG séricos en la infección por Sarcocystis sp. en crías de alpaca durante el primer año de vida

Cahuata Roldán, Octavia Carmen January 2015 (has links)
Evalúa la dinámica de expresión de inmunoglobulinas IgG específicas a Sarcocystis sp. en crías de alpaca durante el primer año de edad, con la finalidad de determinar los sucesos que acontecen durante la exposición a este parásito así como el perfil de anticuerpos transmitidos por calostro. Para ello, se utiliza 54 crías de alpacas provenientes del departamento de Huancavelica, Perú. Se realizan tomas de muestra de sangre (6 a 8 ml) en las crías de alpaca recién nacidas antes de la toma de calostro, 15 días después y posteriormente se realizan muestreos aproximadamente cada dos meses hasta el primer año de edad. Las muestras fueron analizadas mediante la prueba de ELISA SarcoTest para el diagnóstico de inmunoglobulinas IgG específicas a Sarcocystis sp. cuya expresión es obtenida a partir de valores de densidad óptica (nm), a partir de los cuales se consideran como seropositivos a Sarcocystis sp a valores de densidad >0.2 nm. / Tesis
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Falla de transferencia pasiva de inmunoglobulina G y su asociación con mortalidad por enterotoxemia en alpacas neonatas

Maximiliano Guerra, Jorge Enrique January 2014 (has links)
Determina la asociación entre FTP y la mortalidad por enterotoxemia en alpacas neonatas. La toma de muestras se realiza en comunidades y centro de producción de los departamentos de Cusco y Puno. Se realiza la cuantificación de niveles de IgG de 17 animales casos y 26 controles usando el test de Inmunodifusión Radial (IDR) mediante el método de Mancini y se confronta con una curva estándar de cinética de degradación de IgG en crías de alpaca normales. Mediante la prueba de Odds Ratio se determina que no hay una asociación estadísticamente significativa entre FTP y Enterotoxemia. / Tesis
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Synthesis and Evaluation of Antigenic Determinants for ß-lactam Allergy Diagnosis

Peña Mendizabal, Edurne 09 May 2022 (has links)
Tesis por compendio / [EN] About 10 % of all adverse drug reactions are due to allergies, with ß-lactam antibiotics causing the majority of the episodes. Although the actual incidence remains unknown, individuals suspected of being allergic to a drug end up being prescribed with other medications that are less effective, more expensive or harmful. Consequently, a correct diagnosis is key to reduce the derived economic costs and proceed to an adequate 'delabeling' of the population. At present, clinical approaches to diagnose allergies to ß-lactam antibiotics are based on in vivo and in vitro tests. These tests present limited clinical performances since they are invasive, dangerous, and provide false positives and/or negatives. Moreover, the diagnostic sensitivity is far from what is expected, possibly because the epitopes that cause the allergic episodes are still not well detected. In this respect, the preparation of antigens has commonly been determined by the direct attachment of antibiotics to carrier molecules through the formation of an amide bond between amino lysine groups of the carrier molecule and the carboxylate group of the antibiotic. Even so, specific IgE are barely detected with such antigens. This dissertation addresses the synthesis of haptens and the generation of antigens to ß-lactam antibiotics, which develop a more reliable in vitro diagnosis of allergies to these drugs. The evaluation of the antigens has been carried out by means of multiplex in vitro tests based on compact disc technology. This research begins by focusing on the synthesis and preparation of penicillin antigens. To this end, first, the effect of the incorporation of aliphatic spacer arms in the chemical structure of penicillin has been approached, considering the possibility that a better molecular recognition is obtained by moving the hapten away from the carrier protein. Thirteen haptens derived from benzylpenicillin and amoxicillin were synthesized in order to prepare antigens with human serum albumin. The evaluation of the antigens revealed that even though they were immunogenic and were detected by the raised IgG antibodies, they were not detected by specific IgE from allergic patients. Additionally, the next approach considered the cationization of the carrier proteins, human serum albumin and histone. The modification of carboxylate groups of the protein to amino groups allow for an increase of the molar hapten/protein ratio. This strategy led to the generation of five antigens, four of which (only those histone-based antigens), did increase the sensitivity of the assay. Concretely, specific IgE has been determined in sera from allergic patients at low concentrations (LOD = 0.07 IU/mL) with a diagnostic specificity of 100 % and a sensitivity of 60 and 31 % for benzylpenicillin and amoxicillin, respectively. That means a 60 % improvement in the diagnostic sensitivity when compared to the in vitro reference test. Subsequently, the idea of preparing minor antigens based on penicillin metabolites was approached. Penicilloic, penilloic, penicillic, and 6-aminopenicillanic acids, together with penicillamine, were therefore conjugated to the carrier proteins human serum albumin and histone. Except penilloic acid, the rest of antigens were selectively detected when testing a set of serum samples from allergic patients. The diagnostic specificity obtained was 100 %, 94 % in the case of penicillic acid, and the sensitivity was between 67 and 100 %. Another approach was focused on the production of antigens for other families of ß-lactam antibiotics. The generation of antigens for cephalosporins, carbapenems, monobactams or ß-lactam inhibitors is essential, since in vitro tests for the detection of allergies to these antibiotics are not commercially available. Therefore, the results obtained after the preparation of major and minor antigens for the antibiotics cefuroxime, cefotaxime, ceftriaxone, meropenem, and aztreonam were evaluated. / [ES] Alrededor del 10 % de las reacciones adversas a medicamentos son debidas a alergias, siendo los antibióticos ß-lactámicos los que más episodios alérgicos ocasionan. Aunque la incidencia real sigue siendo desconocida, los individuos sospechosos de presentar alergia a algún medicamento acaban siendo prescritos con otros medicamentos, menos efectivos, más caros o perjudiciales. Así pues, un correcto diagnóstico resulta clave para disminuir los costes económicos derivados y proceder a un adecuado 'desetiquetado' de la población. En la actualidad, las pruebas de diagnóstico de alergias a antibióticos ß-lactámicos se basan en ensayos in vivo e in vitro. Estos ensayos muestran bajas prestaciones, ya que son invasivos y peligrosos y proporcionan falsos positivos y/o negativos. Además, la sensibilidad diagnóstica está lejos de ser la esperada, posiblemente porque aún no se ha conseguido reconocer todos los epítopos causantes de los episodios alérgicos. En este sentido, la preparación de antígenos se ha basado hasta el momento, en mayor medida, en la unión directa de los antibióticos a las moléculas portadoras mediante la formación de un enlace amida entre los grupos amino de las lisinas de la molécula portadora y el grupo carboxilato del antibiótico. Aun así, las IgE específicas son vagamente detectadas con estos antígenos. En esta tesis se ha abordado la síntesis de haptenos y la generación de determinantes antigénicos a antibióticos ß-lactámicos con los que poder realizar un diagnóstico in vitro más fiable de alergias a estos fármacos. La evaluación de los mismos se ha llevado a cabo mediante ensayos in vitro multiplex basados en tecnología de disco compacto. Esta investigación comienza centrándose en la síntesis y preparación de antígenos de penicilina. Para ello, en una primera fase se ha estudiado el efecto de la incorporación de brazos espaciadores alifáticos en la generación de antígenos, considerando la posibilidad de que se obtenga un mejor reconocimiento molecular al alejar el hapteno de la proteína portadora. Se sintetizaron trece haptenos derivados de bencilpenicilina y amoxicilina con los que se prepararon antígenos con la proteína albumina de suero humano. La evaluación de los antígenos reveló que a pesar de ser suficientemente inmunogénicos y ser reconocidos por anticuerpos IgG de conejo, éstos no fueron reconocidos por IgE específicas de muestras de pacientes alérgicos. Así bien, por otro lado, la estrategia de cationización de las proteínas albumina de suero humano e histona fue abordada teniendo en cuenta que la modificación de grupos carboxilatos de la proteína a grupos amino aumenta la relación molar hapteno/proteína. Esta estrategia permitió la generación de 5 antígenos, 4 de los cuales (los antígenos de histona), esta vez sí, incrementaron la especificidad de la respuesta inmunológica obtenida, reconociendo IgE específicas. Concretamente, se han determinado IgE específicas en suero de pacientes alérgicos a bajas concentraciones (LOD = 0.07 IU/mL) con una especificidad diagnóstica del 100 % y una sensibilidad del 60 y 31 % para bencilpenicilina y amoxicilina, respectivamente, mejorando la sensibilidad un 60 % en comparación con el ensayo in vitro de referencia. A pesar de las mejoras obtenidas con las estrategias llevadas a cabo, se estudiaron otras vías no clásicas para la síntesis de nuevos haptenos con mayor diversidad química. Este enfoque se basa en la generación de antígenos en librerías químicas de compuestos con diversidad estructural para encontrar nuevos haptenos biológicamente activos. Dichas estrategias, hasta el momento, no han sido empleadas para la generación de antígenos y el análisis de muestras de suero de pacientes alérgicos. Con el fin de incorporar diversidad estructural, se sintetizaron, mediante la técnica combinatoria diversity-oriented synthesis, 22 compuestos de los precursores de las penicilinas y cefalosporinas, ácido 6-aminopenicilánico y ácido 7-amino-desacetoxicefalosporánico, respectivamente, y de los antibióticos amoxicilina y ampicilina. Su evaluación con el inmunoensayo in vitro basado en disco compacto ha demostrado que la incorporación de diversidad permite el reconocimiento de epítopos causantes de episodios alérgicos. Concretamente, se observó que estos antígenos eran capaces de detectar anticuerpos tipo IgG e IgE específicos procedentes de suero de conejos inmunizados y de suero humano de pacientes alérgicos, siendo especialmente selectivos los determinantes de amoxicilina y ampicilina. Concretamente, se obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 79 % y una especificidad diagnóstica del 100 % / [CA] Al voltant del 10% de les reaccions adverses a medicaments són degudes a al·lèrgies, sent els antibiòtics ß-lactàmics aquells que més episodis al·lèrgics ocasionen. Encara que la incidència real continua sent desconeguda, els individus sospitosos de presentar al·lèrgia a algun medicament acaben sent prescrits amb altres medicaments, menys efectius, més cars o perjudicials. Així doncs, un correcte diagnòstic resulta clau per a disminuir els costos econòmics derivats i procedir a un adequat 'desetiquetatge' de la població. En l'actualitat, les proves de diagnòstic d'al·lèrgies a antibiòtics ß-lactàmics es basen en assaigs in vivo i in vitro. Aquests assaigs mostren baixes prestacions, ja que són invasius i perillosos i proporcionen falsos positius i/o negatius. A més a més, la sensibilitat diagnòstica està lluny de ser l'esperada, possiblement perquè encara no s'ha aconseguit reconéixer tots els epítopes causants dels episodis al·lèrgics. En aquest sentit, la preparació d'antígens s'ha basat fins al moment, en major mesura, en la unió directa dels antibiòtics a les molècules portadores mitjançant la formació d'un enllaç amida entre els grups amino de les lisines de la molècula portadora i el grup carboxilat de l'antibiòtic. Així i tot, les IgE específiques són vagament detectades amb aquests antígens. En aquesta tesi s'ha abordat la síntesi d'haptens i la generació de determinants antigènics a antibiòtics ß-lactàmics amb els quals poder realitzar un diagnòstic in vitro més fiable d'al·lèrgies a aquests fàrmacs. La seua avaluació s'ha dut a terme mitjançant assaigs in vitro multiplex basats en tecnologia de disc compacte. Aquesta investigació comença centrant-se en la síntesi i preparació d'antígens de penicil·lina. Per a això, en una primera fase s'ha estudiat l'efecte de la incorporació de braços espaiadors alifàtics en la generació d'antígens, considerant la possibilitat que s'obtinga un millor reconeixement molecular en allunyar l'haptè de la proteïna portadora. Es van sintetitzar tretze haptens derivats de bencilpenicil·lina i amoxicil·lina amb els quals es van preparar antígens amb la proteïna albúmina de sèrum humà. L'avaluació dels antígens va revelar que malgrat ser prou immunogènics i ser reconeguts per anticossos IgG de conill, aquests no van ser reconeguts per IgE específiques de mostres de pacients al·lèrgics. Així bé, d'altra banda, l'estratègia de cationització de les proteïnes albúmina de sèrum humà i histona va ser abordada tenint en compte que la modificació dels grups carboxilats de la proteïna a grups amino augmenta la relació molar hapten/proteïna. Aquesta estratègia va permetre la generació de 5 antígens, 4 dels quals (els antígens d'histona), aquesta vegada sí, van incrementar l'especificitat de la resposta immunològica obtinguda, reconeixent IgE específiques. Concretament, s'han determinat IgE específiques en sèrum de pacients al·lèrgics a baixes concentracions (LOD = 0.07 IU/mL) amb una especificitat diagnòstica del 100 % i una sensibilitat del 60 i 31 % per a bencilpenicil·lina i amoxicil·lina, respectivament, millorant la sensibilitat un 60 % en comparació amb l'assaig in vitro de referència. Malgrat les millores obtingudes amb les estratègies dutes a terme, es van estudiar altres vies no clàssiques per a la síntesi de nous haptens amb major diversitat química. Aquest enfocament es basa en la generació d'antígens en llibreries químiques de compostos amb diversitat estructural per a trobar nous haptens biològicament actius. Aquestes estratègies, fins al moment, no han sigut emprades per a la generació d'antígens i l'anàlisi de mostres de sèrum de pacients al·lèrgics. Amb la finalitat d'incorporar diversitat estructural, es van sintetitzar, mitjançant la tècnica combinatòria diversity- oriented synthesis, 22 compostos dels precursors de les penicil·lines i cefalosporines, àcid 6-aminopenicilànic i àcid 7-amino-desacetoxicefalosporànic, respectivament, i dels antibiòtics amoxicil·ina i ampicil·lina. La seua avaluació amb l'immunoassaig in vitro basat en disc compacte ha demostrat que la incorporació de diversitat permet el reconeixement d’epítops causants d'episodis al·lèrgics. Concretament, es va observar que aquests antígens eren capaços de detectar anticossos tipus IgG i IgE específics procedents de sèrum de conills immunitzats i de sèrum humà de pacients al·lèrgics, sent especialment selectius els determinants d’amoxicil·lina i ampicil·lina. Concretament, es va obtindre una sensibilitat diagnòstica del 79 % i una especificitat diagnòstica del 100 %. / This work was supported by the H2020 program (project COBIOPHAD, grant agreement No. 688448 awarded to A.M.), being an initiative of the Photonics Public Private Partnership; Agencia Estatal de Investigación Agencia Estatal de Investigación (CTQ2016-75749-R, FEDER) (PID2019-110713RB-I00, FEDER) awarded to S.M.; Generalitat Valenciana (PROMETEO/2020/094 awarded to A.M. & S.M.); program UPV-La FE 2019 (P105 VALBIOAL awarded to S.M & E. I-E.); and the National Institute of General Medical Sciences (GM-1R35GM127045 awarded to S.L.S.). E.P.M. was supported by a FPU fellowship from the Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (FPU15/01738 and EST18/00360). B.K.H. was supported by a fellowship from the National Science Foundation (DGE1144152 and DGE1745303). The authors acknowledge the Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, Valencia, Spain, which provided the samples from both allergic patients and controls. / Peña Mendizabal, E. (2022). Synthesis and Evaluation of Antigenic Determinants for ß-lactam Allergy Diagnosis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182979 / TESIS / Compendio
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Control of enteric parasitic diseases of farmed gilthead sea bream: New insights into Enteromyxum leei (Myxozoa) and Enterospora nucleophila (Microsporidia) infections

Picard Sánchez, María Amparo 30 May 2021 (has links)
Tesis por compendio / [ES] La producción en acuicultura se ha visto menguada por aparición de enfermedades en los sistemas de cría de peces. En concreto, en la dorada (Sparus aurata), hay dos parásitos destacados: Enteromyxum leei (Myxozoa) y Enterospora nucleophila (Microsporidia). Hasta la fecha, para ninguno de los dos se ha establecido un cultivo in vitro, y solo para E. leei se ha conseguido establecer un modelo de mantenimiento de la infección in vivo. La presente tesis pretende incrementar el conocimiento sobre estos parásitos y sus relaciones con el hospedador, sentando las bases para generar soluciones que puedan ser aplicadas en la acuicultura. El objetivo con E. leei fue estudiar la inmunidad adquirida inducida en la dorada y la posibilidad de generar herramientas de diagnóstico y vacunas frente a esta enfermedad. Para ello, primero se demostró la resistencia del pez al parásito tras una segunda exposición, la cual duró hasta 16 meses. Además, la resistencia parece estar correlacionada con altos niveles de inmunoglobulina (Ig) M específica en sangre, y una alta expresión de Igs, incluso antes de la re-exposición al parásito. El siguiente paso fue afinar el protocolo de infección con E. leei. Los resultados mostraron que una semana es suficiente para transmitir la infección de E. leei por efluente, independientemente de la temperatura. Tras la demostración de la respuesta adaptativa eficaz frente a E. leei, y al disponer de un modelo de infección refinado, se realizó un ensayo de inmunización pasiva. Aquí, los resultados mostraron que los anticuerpos especi'ficos efectivamente consigue ralentizar la invasión del intestino por el parásito y disminuir los síntomas de la enfermedad. Paralelamente, el resultado del análisis del repertorio de las regiones variables de la IgM e IgT del intestino peces resistentes mostró la inducción de una respuesta policlonal en las ce'lulas B. En base a estos resultados, se realizó una búsqueda de antígenos de E. leei que pudieran ser utilizados como candidatos para la producción de vacunas (análisis proteómico) o herramientas de diagnóstico (análisis in silico). Para ello, se ensambló un transcriptoma de novo utilizando una muestra mixta de intestino de dorada y parásito. Los resultados dieron lugar a 7 y 12 candidatos en la búsqueda in silico y proteómica, respectivamente. En los estudios de E. nucleophila, debido a que fue descrita muy recientemente, el punto de partida fue más básico. Las muestras de este parásito solo se pueden obtener de brotes naturales en piscifactorias. Por ello, primero se realizó un estudio de caracterización de la patología de la infección a partir de peces infectados naturalmente. En etapas tempranas de la infección, el parásito se localiza principalmente en el intestino, pero meses después, la prevalencia en intestino baja e incrementa en los órganos hematopoyéticos y el esto'mago. Los signos clínicos de la infección consistieron en una reducción significativa del crecimiento, emaciación, y palidez de las paredes intestinales. A nivel celular, en los casos ma's graves se observó hipercelularidad en el epitelio intestinal y proliferación de ce'lulas rodlet, un elevado número de linfocitos en la base del epitelio e infiltración de granulocitos acidófilos en el epitelio intestinal. Finalmente se probaron varias formas de transmisión horizontal de E. nucleophila (cohabitación, efluente, intubación oral y anal) con para desarrollar un modelo de mantenimiento in vivo. Se consiguió la transmisión el parásito por todas las vías, pero con una disminución de prevalencia a lo largo del tiempo. Variables como la temperatura, la dosis, y el estado de los peces donantes parecen ser más determinantes que la ruta seleccionada para la transmisión. Entre las rutas probadas, la intubación anal parece ser la más prometedora, pero ninguna de ellas fue capaz de reproducir los signos clínicos observados en las infecciones naturales. / [CA] La producció en aqüicultura s'ha vist minvada per aparició de malalties en els sistemes de cria de peixos. En concret, en l'orada (Sparus aurata), hi ha dos paràsits destacats: Enteromyxum leei (Myxozoa) i Enterospora nucleophila (Microsporidia). Fins avui, per a cap dels dos s'ha establert un cultiu in vitro, i només per a E. leei s'ha aconseguit establir un model de manteniment de la infecció in vivo. La present tesi pretén incrementar el coneixement sobre aquests paràsits i les seves relacions amb l'hoste, establint les bases per a generar solucions que puguin ser aplicades en l'aqüicultura. L'objectiu amb E. leei va ser estudiar la immunitat adquirida induïda en l'orada i la possibilitat de generar eines de diagnòstic i vacunes enfront d'aquesta malaltia. Per a això, primer es va demostrar la resistència del peix al paràsit després d'una segona exposició, la qual va durar fins a 16 mesos. A més, la resistència sembla estar correlacionada amb alts nivells d'immunoglobulina (Ig) M específica en sang, i una alta expressió de Igs, fins i tot abans de la re-exposició al paràsit. El següent pas va ser afinar el protocol d'infecció amb E. leei. Els resultats van mostrar que una setmana és suficient per a transmetre la infecció de E. leei per efluent, independentment de la temperatura. Després de la demostració de la resposta adaptativa eficaç enfront de E. leei, i en disposar d'un model d'infecció refinat, es va realitzar un assaig d'immunització passiva. Aquí, els resultats van mostrar que els anticossos específics efectivament aconsegueix alentir la invasió de l'intestí pel paràsit i disminuir els símptomes de la malaltia. Paral·lelament, el resultat de l'anàlisi del repertori de les regions variables de la IgM i IgT de l'intestí peixos resistents va mostrar la inducció d'una resposta policlonal en les cèl·lules B. Sobre la base d'aquests resultats, es va realitzar una cerca d'antígens de E. leei que poguessin ser utilitzats com a candidats per a la producció de vacunes (anàlisis proteómico) o eines de diagnòstic (anàlisi in silico). Per a això, es va assemblar un transcriptoma de novo utilitzant una mostra mixta d'intestí d'orada i paràsit. Els resultats van donar lloc a 7 i 12 candidats en la cerca in silico i proteòmica, respectivament. En els estudis de E. nucleophila, pel fet que va ser descrita molt recentment, el punt de partida va ser més bàsic. Les mostres d'aquest paràsit només es poden obtenir de brots naturals en piscifactorias. Per això, primer es va realitzar un estudi de caracterització de la patologia de la infecció a partir de peixos infectats naturalment. En etapes primerenques de la infecció, el paràsit es localitza principalment en l'intestí, però mesos després, la prevalença en intestí baixa i incrementa en els òrgans hematopoètics i l'estómac. Els signes clínics de la infecció van consistir en una reducció significativa del creixement, emaciació, i pal·lidesa de les parets intestinals. A nivell cel·lular, en els casos més greus es va observar hipercelularidad en l'epiteli intestinal i proliferació de cèl·lules rodlet, un elevat nombre de limfòcits en la base de l'epiteli i infiltració de granulòcits acidòfils en l'epiteli intestinal. Finalment es van provar diverses formes de transmissió horitzontal de E. nucleophila (cohabitació, efluent, intubació oral i anal) amb per a desenvolupar un model de manteniment in vivo. Es va aconseguir la transmissió el paràsit per totes les vies, però amb una disminució de prevalença al llarg del temps. Variables com la temperatura, la dosi, i l'estat dels peixos donants semblen ser més determinants que la ruta seleccionada per a la transmissió. Entre les rutes provades, la intubació anal sembla ser la més prometedora, però cap d'elles va ser capaç de reproduir els signes clínics observats en les infeccions naturals. / [EN] Aquaculture production is hampered by the emergence of parasite diseases in fish farming systems. Among them, in Sparus aurata, there are two important enteric parasites described: Enteromyxum leei (Myxozoa) Enterospora nucleophila (Microsporidia). To date, no in vitro culture has been established for either parasite, and only for E. leei was it possible to establish a model for maintaining the infection in vivo. The aim of this thesis is to gain new knowledge about these parasites and their relationship with the host, also the basic foundations for generating solutions that can be applied in aquaculture. The general objective for E. leei was to study the acquired immunity induced in gilthead bream and the possibility of generating diagnostic tools and vaccines against this disease. To this end, resistance against the parasite was assessed with a second exposure against the parasite, which showed a resistance for at least 16 months. Besides resistance seemed to be correlated with high levels of specific immunoglobulin (Ig) M in blood, and a high expression of Igs, in particular, the soluble forms, even before re-exposure to the parasite. The next step was refining the protocol for effluent infection with E. leei by studying infection at different exposure time points, temperatures and population densities. The results showed that one week of exposure is sufficient to spread E. leei infection by effluent, regardless of temperature. After demonstrating the resistance against E. leei, and with a refined infection model, a passive immunization assay was performed. The results showed that the serum with specific antibodies effectively slows down the invasion of the gut by the parasite and reduces the symptoms of the disease. At the same time, the analysis of the repertoire of the variable regions of intestinal IgM and IgT showed an induction of a polyclonal response in B cells. On the basis of these results, a research was carried out for E. leei antigens that could have use as candidates for the production of vaccines (proteomic study) or diagnostic tools (in silico study) using the parasite transcriptomic data. To do this, a de novo transcriptome was assembled using a mixed sample of gilthead sea bream and parasite, with a posterior filtrate of the sequences. The In silico and proteomic analysis search resulted in 7 and 12 transcripts, respectively, which are being used for diagnostic and vaccine production. The starting point was more basic in E. nucleophila studies, since this is a recently described disease. The samples of this parasite can only be obtained from natural outbreaks in fish farms. Therefore, first study was carried out to characterize the pathology of the infection of naturally infected fish. In the early stages of the infection, the parasite is mainly located in the intestine, but months later, the prevalence is lower in the intestine and increases in the hematopoietic organs and the stomach. Clinical signs of infection were significant reduction in growth, wasting, and intestinal walls paleness. At the cellular level, in the most severe cases hypercellularity in the intestinal epithelium, proliferation of rodlet cells, high number of lymphocytes at the base of the epithelium and infiltration of acidophilic granulocytes in the intestinal epithelium were observed. Finally, horizontal transmission of E. nucleophila was tried using different transmission methods: cohabitation, effluent, and oral and anal intubation. Transmission of the parasite was achieved with all routes, but there was a decrease in prevalence over time in all cases except for the anal route. Variables such as temperature, dose, and the status of the donor fish appear to be more important than the selected route. Among the routes tested, anal intubation seemed to be the most promising, as it was sustained over a longer period of time, but none of them was able to reproduce the same clinical signs of infection observed in natural infections. / The authors kindly acknowledge the collaboration of anonymous fish farming companies allowing access to the animals during the disease outbreaks. We thank J. Monfort and L. Rodríguez (IATS-CSIC) for the technical assistance on histological processing.This work has been carried out with financial support from the European Union and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) under grant projects ParaFishControl (H2020-634429) and AGL2013-R-48560-C2-2-R, respectively. APS was contracted under ParaFishControl project. Primer sequences and access to the gilthead sea bream transcriptomic database were kindly provided by Prof. J. Pérez-Sánchez of the IATS- Nutrigenomics group. The authors thank I. Vicente for fish maintenance and technical assistance during samplings. The authors thank P. Boudinot (INRAE) for his help in designing and interpreting the immunoglobulin repertoire study and results, J. Pérez-Sánchez (IATS-CSIC) for providing access to the gilthead sea bream genome sequences to perform the repertoire analysis.This work was funded by the European Research Council (ERC Consolidator Grant 2016 725061 TEMUBLYM). / Picard Sánchez, MA. (2021). Control of enteric parasitic diseases of farmed gilthead sea bream: New insights into Enteromyxum leei (Myxozoa) and Enterospora nucleophila (Microsporidia) infections [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167035 / TESIS / Compendio

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