Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:15:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327081.pdf: 1814011 bytes, checksum: 9525d01655f716852e76e8e4db235b3b (MD5) Previous issue date: 2014 / Introdução: O metilmercúrio (MeHg) tem sido especulado como contaminante ambiental envolvido em efeitos tóxicos em modelos animais e seres humanos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito protetor da inosina, uma purina endógena, diante dos efeitos promovidos pelo MeHg em camundongos. Métodos: Foram utilizados camundongos Swiss machos adultos (45 - 60 dias). Os animais foram expostos a uma solução de MeHg (40 mg/L) diluída na água de beber, durante 15 dias. A ingestão de líquidos foi monitorada diariamente. Concomitantemente, os animais foram tratados com inosina pela via intraperitoneal (i.p.), em doses de 3, 10, 30 ou 100 mg/kg, uma vez por dia, durante 15 dias consecutivos. No 15º dia, os animais foram submetidos a diferentes testes comportamentais, a fim de avaliar o desempenho motor e coordenação motora (teste da barra giratória, teste da retração dos membros posteriores, teste da caminhada na viga e teste do poste), cada animal foi usado em apenas um teste. Após os testes comportamentais, os animais foram eutanaziados por decapitação e o cerebelo foi coletado para a determinação subsequente dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-1ß, TNF-a e IL-6), anti-inflamatória (IL-1ra) e BDNF, por ELISA, bem como para determinação da atividade da glutationa peroxidase e glutationa redutase. Em outro conjunto de experimentos, os animais foram tratados pela via i.p. com inosina (10 mg/kg) ou uma mistura de inosina (10 mg/kg) e cafeína (3 mg/kg, antagonista não-seletivo de receptores para adenosina), uma vez ao dia durante 15 dias consecutivos, visando investigar o possível envolvimento de receptores de adenosina nos efeitos promovidos pela inosina. Vinte e quatro horas após a última injeção, os animais foram submetidos ao teste da barra giratória e testados frente à manifestação e o grau de retração dos membros posteriores. O efeito da inosina também foi investigado diante dos efeitos hepatotóxicos (atividade sérica de ALT e AST) e genotóxicos (ensaio do micronúcleo) do MeHg, bem como diante das alteraçoes nos níveis séricos de lipídeos (colesterol total, HDL e não-HDL) induzidos pelo MeHg. Resultados: O consumo de líquidos não diferiu entre os grupos avaliados. A inosina (10 mg/kg, i.p.) preveniu parcialmente os efeitos deletérios do MeHg em relação ao desempenho motor no teste da barra giratória, no grau de retração dos membros posteriores e no teste da caminhada na viga. No entanto, a inosina não foi capaz de prevenir os efeitos deletérios do MeHg, observados no teste do poste. A co-administração de inosina (10 mg/kg,i.p.) com cafeína (3 mg/kg, i.p.) reverteu totalmente o efeito protetor da inosina no teste da barra giratória e parcialmente no grau de retração dos membros posteriores. Inosina (10mg/kg, i.p.) foi capaz de previnir a redução nos níveis de IL-6 e o aumento nos níveis de BDNF induzidos pelo MeHg no cerebelo. MeHg (40 mg/L) reduziu a atividade cerebelar da glutationa peroxidase, a qual não foi prevenida pelo tratamento com inosina, mas não afetou a atividade cerebelar da glutationa redutase, quando comparado com o grupo não-exposto. Animais expostos ao MeHg apresentaram níveis cerebelares de Hg total mais elevados, quando comparados com animais não-expostos, o tratamento com inosina (10 mg/kg, i.p.) não preveniu o aumento nos níveis cerebelares de Hg total induzido pela exposição ao MeHg. Além disso, a inosina (10 mg/kg, i.p.) preveniu a redução na atividade sérica da ALT induzida pelo MeHg. Com relação aos níveis séricos de lipídeos, a inosina (10 mg/kg, i.p.) não foi capaz de prevenir o aumento dos níveis de colesterol total induzido pelo MeHg, no entanto, previniu o aumento dos níveis de colesterol não-HDL e promoveu um aumento nos níveis de colesterol HDL, quando comparado com animais expostos ao MeHg tratados com veículo (10 ml/kg, i.p.). Finalmente, a inosina foi capaz de prevenir o efeito genotóxico do MeHg, observado no ensaio do micronúcleo em cultura primária de linfócitos humanos, reduzindo o número de células binucleadas micronucleadas quando comparado com o grupo exposto ao MeHg tratado com veículo (10 ml/kg, i.p.). Conclusões: Em conjunto, os resultados do presente estudo sugerem que a inosina apresenta efeito protetor diante das alterações comportamentais (desempenho motor e coordenação) e bioquímicas no sistema nervoso central induzidas pela exposição ao MeHg. Além disso, esses efeitos parecem ser mediados por receptores de adenosina. A inosina também apresenta efeito protetor contra os efeitos hepatotóxicos e genotóxicos do MeHg, bem como sobre as alterações nos níveis séricos de lipídeos induzidos pelo MeHg. Em síntese, nossos dados demonstram que a inosina foi capaz de prevenir as alterações comportamentais e bioquímicas induzidas pelo MeHg, além disso, contribuem para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na toxicidade do MeHg.<br> / Abstract : Introduction: Methylmercury (MeHg) has been speculated as environmental contaminants involved in toxic effects in both animals models and humans. The objective of the present study was to evaluate the protective effect of inosine, an endogenous purine, in face of MeHg-promoted effects in mice. Methods: Were used adult male Swiss mice (45 ? 60 days old). Animals were exposed to MeHg solution (40 mg/L) in drink water during 15 days. Liquid ingestion was monitored daily. Concomitantly, animals received inosine intraperitoneally (i.p.) at doses of 3, 10, 30 or 100 mg/kg, once a day during 15 consecutive days. On the 15th day, animals were submitted to different behavioral tests in order to evaluate motor performance and coordination (rotarod test, hind limb clasping phenomenon, beam walking test and pole test), each animal was used in only one test. After behavioral tests, animals were sacrificed by decapitation and the cerebellum was collected for subsequent measurement of pro-inflammatory (IL-1ß, TNF-a and IL-6), antiinflammatory citokynes (IL-1Ra) and BDNF levels by ELISA, as well as glutatione peroxidase and glutatione reductase activity. In another set of experiments, animals were treated by i.p. route with inosine (10 mg/kg) or a mixture of inosine (10 mg/kg) and caffeine (3 mg/kg, non selective adenosine receptors antagonist), once a day during 15 consecutive days, to investigate the possible involvement of adenosine receptors in the effects promoted by inosine. Twenty-four hours after the last injection animals were submitted to the rotarod test and tested for the manifestation and the degree of hind limb clasping phenomenon. The effect of inosine was also investigated in face of the hepatotoxic (ALT and AST serum activity) and genotoxic (micronucleus assay) effects of MeHg, as well as on the changes in serum lipid levels (total cholesterol, HDL and non-HDL levels) induced by MeHg. Results: Liquid consumptions did not differ between groups. Inosine (10mg/kg, i.p.) partially protected against the deleterious effects of MeHg toward motor performance in the rotarod test, in face of the hind limb clasping phenomenon and in the beam walking test (87 ± 10%; mean=21.57 ± 3.06 s vs 46.88 ± 11.93 s). However, inosine was not able to prevent the deleterious effects of MeHg observed in the pole test. Co-administration of inosine (10 mg/kg, i.p.) with caffeine (3 mg/kg, i.p.) completely prevented inosine protective effect in rotarod test and partially in the hind limb clasping phenomenon. Inosine (10 mg/kg, i.p.) was able to prevented MeHg-induced IL-6 decreased andalso prevented MeHg-induced BDNF increased levels in cerebellum. MeHg (40 mg/L) reduced glutathione peroxidase activity, wich was not prevented by inosine treatment, but did not affect glutathione reductase cerebellar activity when compared with non-exposed group. MeHg-exposed animals exhibited higher total Hg levels in cerebellum when compared to non-exposed animals. Inosine did not prevent total Hg-increased level induced by MeHg in cerebellum. Furthermore, inosine (10 mg/kg, i.p.) prevented the reduction in ALT serum activity induced by MeHg. Regarding serum lipid levels, inosine (10 mg/kg, i.p.) did not prevent MeHg-increased total cholesterol levels, however, was able to prevent MeHg-increased non-HDL cholesterol levels and promoted an increase in HDL cholesterol levels when compared with MeHg-exposed animals treated with vehicle (10 ml/kg, i.p.). Finally, inosine was able to prevent the genotoxic effect of MeHg, observed in the micronucleus assay in primary culture of human limphocytes, reducing the number of binucleated micronucleated cells when compared with the MeHg-exposed group treated with vehicle (10 ml/kg, i.p.). Conclusions: Taken together these results suggest that inosine presents protective effect in face of MeHg-behavioral (motor performance and coordination) and biochemical effects in the central nervous system. Whereas, inosine also presents protective effects against hepatotoxic and genotoxic effects of MeHg, as well as on the changes in serum lipid levels induced by MeHg. In summary, our data demonstrate that inosine was able to prevent behavioral and biochemical changes induced by MeHg, furthermore, contribute to understanding mechanisms mediating MeHg-toxicity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-20T03:13:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334854.pdf: 2860022 bytes, checksum: 643fe2079353e3f48cf9496a60580321 (MD5) Previous issue date: 2015 / A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune mediada por linfócitos T e caracterizada por inflamação e degeneração do sistema nervoso central (SNC). As terapias atualmente disponíveis possuem ações parcialmente efetivas e inúmeras reações adversas. A inosina tem demonstrado importante ação imunomoduladora, neuroprotetora e anti-hiperalgésica. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da inosina no desenvolvimento e progressão da encefalomielite autoimune experimental (EAE), o modelo experimental de EM. Métodos: Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas com 6 a 12 semanas. A EAE foi induzida pela inoculação de emulsão contendo glicoproteína de mielina do oligodendrócitos (MOG 35-55) suplementada com 500 µg de Mycobacterium tuberculosis (Mt) H37Ra em ambos os flancos traseiros nos dias 0 e 7. Em adição, cada animal recebeu 300 ng de Bordetella toxina Pertussis em 100 µL de solução salina por via intraperitoneal (i.p.) no dia 0 e no dia 2 pós-imunização (p.i.). Os animais foram tratados pela via i.p., 2x dia, com inosina (1 ou 10 mg/kg) ou solução salina (0,9% NaCl, 10 mL/kg). O tratamento, juntamente com a avaliação do peso corporal e dos sinais clínicos, ocorreu diariamente por 40 dias. Entre o 1º e 14º dia p.i. os animais foram submetidos a diferentes testes comportamentais a fim de avaliar a hiperalgesia mecânica e térmica ao frio, comportamento tipo-ansioso e depressivo e sinais tipo-fadiga. No 40º dia p.i., os animais foram eutanaziados; a medula espinhal foi coletada para a avaliação histológica do processo inflamatório e desmielinizante, imuno-histoquímica para atividade astrocitária e western blot para a expressão dos receptores A1 e A2A, proteína cinase ERK1 e p-ERK1; os linfonodos foram coletados para análise da citocina IL-17 por ELISA. Resultados: A indução da EAE foi evidenciada pela presença de sinais clínicos, a partir do 12° dia p.i. no grupo EAE + veículo. A inosina (1 e 10 mg/kg) retardou o surgimento dos escores clínicos e inibiu a progressão da doença, com destaque para a dose de 1 mg/kg. Além disso, a inosina na dose de 1 mg/kg inibiu a hiperalgesia mecânica e térmica ao frio, e a dose de 10 mg/kg inibiu apenas a hiperalgesia térmica evidenciadas durante a fase pré-motora da doença. Ainda observou-se que a EAE induziu comportamentos do tipo-ansioso no teste do labirinto em cruz elevado (LCE) e sinais tipo-fadiga no teste de nado forçado com sobrecarga durante a fase pré-motora da doença, os quais não foram revertidos pelo tratamento com inosina (1 mg/kg). Não observou-se comportamento tipo-depressivo nos animais EAE, poréma inosina (1 mg/kg) demonstrou efeito ansiolítico no teste de suspensão pela cauda (TSC). Além disso, verificou-se no teste do LCE ausência de alterações locomotoras no período avaliado. A análise histológica demonstrou que a inosina (1 e 10 mg/kg) bloqueou a neuroinflamação e a desmielinização, sendo a dose de 1mg/kg efetiva em inibir ainda a ativação astrocitária na medula espinhal após indução da EAE. Nos órgãos linfoides periféricos, a inosina (1 e 10 mg/kg) reduziu os níveis de IL-17 exacerbada pela EAE. Ademais, a EAE aumentou a expressão do A2AR na medula espinhal e a inosina (1 e 10 mg/kg) inibiu esse efeito. Em contrapartida, a indução da EAE culminou com a diminuição significativa na expressão de A1R no SNC, a qual não foi modulada pelo tratamento com inosina. A EAE não alterou a expressão da ERK1, porém aumentou, de maneira significativa, a expressão de p-ERK1 na medula espinhal no 40° dia p.i. Entretanto, o tratamento com inosina (1 e 10 mg/kg) não modulou a fosforilação de ERK1 no SNC. Conclusões: Os resultados do presente trabalho demonstram que a inosina, com destaque para a dose de 1 mg/kg, retardou e reduziu os sinais clínicos motores, bem como a hiperalgesia induzidos pela EAE. O efeito da inosina na dose de 1mg/kg ocorreu, em parte, pela inibição da neuroinflamação e desmielinização, bem como por redução da atividade astrocitária, do nível de IL-17 em tecido linfoide periférico e expressão do A2AR no SNC.<br> / Abstract : Multiple Sclerosis (MS) is a T cells-autoimmune, inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Currently available therapies have partially effective actions and numerous side reactions. Inosine showed immunomodulatory, neuroprotective and anti-hyperalgesic action. The aim of this study was to evaluate the inosine effect in the development and progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a MS experimental model. Methods: Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in female C57BL/6 mice (6?10 weeks of age) by immunization with MOG 35-55 peptide supplemented with 500 µg of Mycobacterium tuberculosis extract H37Ra into the flanks on days 0 and 7. All animals were also injected intraperitoneally (i.p.) on days 0 and 2 with 300 ng of Pertussis toxin. During 40 days, the animals received inosine (1 or 10 mg/kg) or saline solution (0,9% NaCl, 10 mL/kg). The weight and clinical signs were evaluated daily. Among 1 and 14 days post immunization (p.i.) animals were subjected to different behavioral tests to evaluate the mechanical and cold thermal hyperalgesia, anxious and depressive-like behavior and fatigue-like signs. Forty days p.i., the animals were euthanized; the spinal cord was collected for inflammatory and demyelinating histological evaluation, astrocyte activity immunohistochemistry and expression of A1 and A2A receptors, protein kinase ERK1 and p-ERK1 by western blot; lymph nodes were collected for IL-17 cytokine analysis by ELISA assay. Results: In this present study, we report that EAE induction has been evidenced by clinical signs appeared on day 12 p.i. on EAE + vehicle group. Inosine (1 and 10 mg/kg) delayed the scores onset as well as the disease progression and weight loss, particularly at 1 mg/kg dose. Furthermore, inosine 1 mg/kg inhibited mechanical and cold thermal hyperalgesia, 10 mg/kg dose inhibited only thermal allodynia evidenced during the pre-motor stage of the disease. It was also found that EAE induced anxious-like behavior on the elevated plus maze test (ECL) and fatigue-like sign in the weight load swimming test (WLST) on the pre-motor stage, which were not reversed by treatment with inosine (1mg/kg). It was not observed depressive-like behavior in EAE + vehicle group, however, inosine (1 mg/kg) showed anxiolytic effect in the tail suspension test (TST). In addition, it was found in the EPM test lack of locomotor changes on the evaluated period. Histological analysis showed that inosine (1 and 10 mg/kg) blocked neuroinflammation anddemyelination in the spinal cord after EAE induction, and 1mg/kg inosine also inhibited astrocytic activity. In the secondary lymphoid tissue, inosine (1 and 10 mg/kg) inhibited the IL-17 levels exacerbated by EAE. Furthermore, EAE increased A2AR expression in the spinal cord and inosine (1 and 10 mg/kg) inhibit this up-regulation. On the order hand, EAE immunization induced down-regulation of A1R in the CNS, which was not modulated by inosine treatment. EAE did not alter the ERK1 expression, but increased p-ERK1 expression in the spinal cord at day 40 p.i. Treatment with inosine (1 and 10 mg/kg) did not modulate the ERK1 phosphorylation in the CNS. Conclusions: These results indicate that inosine, with emphasis on the 1mg/kg dose, delayed and reduced EAE clinical symptoms and hyperalgesia. The inosine effect is mediated, in part, by reducing neuroinflammation and demyelination, as well as reduction of astrocytic activity, IL-17 levels and A2ARs expression.

A isquemia cerebral é uma doença grave, sendo a segunda causa mais comum de morte e a principal causa de incapacidade em todo o mundo. A redução repentina do fluxo sanguíneo cerebral leva à diminuição do fornecimento de oxigênio e de glicose, resultando em uma falha no metabolismo energético cerebral. Este desequilíbrio no metabolismo energético é claramente o elemento chave no processo isquêmico, resultando em danos celulares e comprometimento das funções neurológicas. A excitotoxicidade glutamatérgica, o estresse oxidativo e processo inflamatório desempenham papéis importantes na lesão cerebral isquêmica, levando a danos teciduais que comprometem a integridade do tecido durante a isquemia. A guanosina e a inosina são conhecidas por desempenhar um papel neuroproteção ao sistema nervoso central, agindo como um modulador negativo do sistema glutamatérgico e possuindo efeitos tróficos em células neurais. Desta forma, nesta tese, avaliaram-se diversos mecanismos que são modulados pela guanosina e inosina em modelos experimentais de isquemia cerebral in vivo. Inicialmente, demonstrou-se que a guanosina é efetiva na neuroproteção contra a isquemia cerebral focal em ratos, causando redução de danos neuronais e astrogliais, diminuindo a peroxidação lipídica e o volume de enfarte cerebral e, consequentemente, recuperando a função motora do membro anterior debilitado pela isquemia. Esta neuroproteção estaria envolvida na manutenção do ambiente redox celular, na modulação da resposta inflamatória e na modulação do sistema glutamatérgico, mecanismos ligados à lesão isquêmica. A isquemia cerebral causou um aumento do número total de células micróglias e também uma maior ativação destas células, efeito inibido pela administração de guanosina. Nesta tese, também investigamos os efeitos agudos relacionados à neuroproteção da administração de guanosina e de inosina como reposição volêmica em um modelo de choque hemorrágico (que, potencialmente, diminui a perfusão sanguínea cerebral) em suínos. A guanosina e a inosina foram capazes de diminuir os níveis de glutamato mais rapidamente do que o controle e de modular o ambiente de citocinas pró-inflamatórias, diminuindo os níveis de IL-1β e TNF-α (apenas inosina) após choque hemorrágico. Esta supressão pode estar associada com diminuição na morte neuronal tardia, o que implicaria em uma melhora no prejuízo cognitivo que ocorre choque hemorrágico. No geral, nosso trabalho representa uma importante contribuição para o conhecimento sobre os possíveis mecanismos neuroprotetores da guanosina e da inosina em modelos de isquemia cerebral. / Cerebral ischemia is a devastating disease, being the second most common cause of death and the major cause of disability worldwide. The sudden reduction in cerebral blood flow leads to decreased oxygen and glucose supplies, resulting in a failure of cellular bioenergetics. Disruption of brain energetics metabolism is clearly a key element in stroke, resulting in cellular damage and impairment of neurological functions. Glutamate excitotoxicity, oxidative stress and neuroinflammation play important roles in ischemic brain injury, with harmful impacts on ischemic cerebral tissue. As guanosine and inosine play an important neuroprotective role in the central nervous system, exerting glutamatergic system antagonism and trophic effects on neural cells, in this study, it was evaluated the neuroprotective effects of guanosine and inosine against in vivo cerebral ischemia models. Initially, we demonstrated that guanosine was neuroprotective against cerebral focal ischemia in rats causing reduction of neuronal and astroglial damage, decreasing lipid peroxidation and cerebral infarct volume, and consequently recovery in the function of impaired forelimb. These neuroprotection could be involved in the maintenance of the cellular redox environment, modulating the inflammatory response and the glutamatergic systems. Furthermore, ischemia increased the total number of microglial cells, and changed the morphological characteristics. These effects were inhibited by guanosine treatment. Additionally, it was also investigated the acute neuroprotective effects of guanosine and inosine as a fluid resuscitation in a model of hemorrhagic shock in swines. The treatment with guanosine or inosine was able to decrease glutamate levels faster than control group and also was able to modulate the proinflammatory cytokines environment, decreasing IL-1β and TNF-α (only inosine) levels after hemorrhagic shock. These effects could be associated with reduction delayed neuronal cell damage, improving cognitive impairment that occurs in hemorrhagic shock. Overall, our work represents an important contribution to the knowledge regarding the putative neuroprotective mechanisms of guanosine and inosine in cerebral ischemia models.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T23:17:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267127.pdf: 926438 bytes, checksum: 6c1008cacf198911112e2dacfae70cc7 (MD5) / A inosina, um nucleosídeo endógeno, e o primeiro metabolito da adenosina, e e sintetizada atraves da adenosina pela adenosina desaminase. O presente estudo investigou as propriedades antinociceptivas da inosina em modelos quimicos de nocicepcao em animais, bem como alguns dos prováveis mecanismos de acao antinociceptiva da inosina. A inosina (0,1-100 mg/kg), administrada pela via i.p., 30 min antes do agente algogenico, produziu inibicao significativa e dependente da dose da nocicepcao visceral induzida pelo acido acetico, com valor de DI50 de 2,0 (0,6 - 6,0) mg/kg. Quando administrada pela via oral, 60 min antes, a inosina (10-300 mg/kg) tambem inibiu de forma significativa e dependente da dose a nocicepcao visceral induzida por acido acetico com DI50 de 140,0 (106 - 164) mg/kg. Alem disso, a inosina administrada via i.p. (10 mg/kg) ou oral (100 mg/kg) produziu efeito antinociceptivo que permaneceu significativo ate 6 e 2 horas apos o tratamento dos animais, respectivamente. Alem disso, a adenosina (10-300 mg/kg, i.p.) tambem foi capaz de reduzir de forma significativa e dependente da dose a nocicepcao causada pelo acido acético com DI50 de 25 mg/kg. No entanto, a inosina foi cerca de 12 vezes mais potente que a adenosina no modelo de nocicepcao induzida por acido acetico. A inosina (0,01-10 Tg/sitio), administrada pela via i.t. e pela via i.c.v. (0,1-10 Tg/sitio), 15 min antes, produziu inibicao significativa e dependente da dose da nocicepcao induzida pelo acido acetico com DI50 de 4,2 (3,5 - 5) e 0,3 (0,2 - 0,4) Tg/sitio, respectivamente. Na nocicepcao induzida pela formalina, a inosina (0.1-100 mg/kg, i.p.) inibiu significativamente e de forma dependente da dose a fase inflamatoria com DI50 de 6,4 (5,4 - 7,5) mg/kg, mas nao foi capaz de inibir a fase neurogenica da nocicepcao induzida pela formalina. Da mesma forma, a inosina (0,1-10 mg/kg, i.p.) inibiu de forma dependente da dose e significativamente a nocicepcao induzida por glutamato com DI50 de 0,6 (0,4 - 0,9) mg/kg. Quando administrada perifericamente, via intraplantar, a inosina (1- 100 Tg/sitio) tambem foi capaz de reduzir de maneira dependente da dose a nocicepcao causada pelo glutamato, com DI50 de 12,4 (6,9 - 18,3) Tg/sitio. No entanto, a administracao de inosina (1-100 mg/kg, i.p.), em doses que foram efetivas nos modelos de nocicepcao, nao causou alteracao na atividade locomotora dos animais no teste do campo aberto. No teste do acido acetico, a antinocicepcao causada pela inosina (10 mg/kg, i.p.) foi revertida pelo pre-tratamento com capsaicina (50 mg/kg, s.c., no periodo neonatal, depletor de fibras C), toxina Pertussis (1Tg/sitio, i.t., inativador da proteina Gi/0), 8-PT (antagonista seletivo do receptor A1, 1 mg/kg, i.p.) e pelo ZM241385 (antagonista seletivo do receptor A2A, 3 mg/kg), mas não pelo tratamento com aloxazina (antagonista seletivo do receptor A2B, 0,1 mg/kg, i.p.). Perifericamente, a antinocicepcao causada pela inosina (10 Tg/sitio, i.pl.) co-administrada com glutamato, foi revertida significativamente pela injeção intraplantar com 8-PT (10 Tg/sitio), mas nao pelo ZM241385 (15 Tg/sitio, i.pl.). Em sintese, estes resultados indicam que a inosina produz antinocicepcao de forma dependente da dose em varios modelos de nocicepcao quimica atraves de mecanismos que envolvem interacoes com fibras aferentes sensiveis a capsaicina, receptores acoplados a proteina Gi/0, receptores A1 e A2A (sistemicamente) e receptor A1 (perifericamente).

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-09-05T04:12:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348185.pdf: 6307419 bytes, checksum: 976aebbc8c18a6da3525304afb32e542 (MD5) Previous issue date: 2017 / Inosina é um nucleosídeo purinérgico endógeno, formada a partir da adenosina, em uma reação catalisada pela enzima adenosina deaminase. Já foram descritos efeitos antinociceptivos, anti-inflamatórios, neuroprotetores e antidepressivos para inosina, que podem estar associados à ativação de receptores de adenosina. Contudo, existem poucas evidências na literatura relacionando às vias de sinalização intracelular envolvidas nesses efeitos, bem como de outros mecanismos neuroquímicos associados aos efeitos dessa purina. Baseado nisso, o presente trabalho investigou alguns dos mecanismos associados aos efeitos tipo-antidepressivo de inosina em camundongos e no efeito neuroprotetor da inosina in vitro. Primariamente, um dos objetivos desse trabalho foi investigar a modulação de vias de sinalização intracelular e de receptores glutamatérgicos no efeito tipo-antidepressivo de inosina, através do teste da suspensão pela cauda (TSC), e na atividade locomotora, através do teste do campo aberto (TCA). Adicionalmente, foi verificado o efeito da administração de inosina sobre o imunoconteúdo e fosforilação (ser-133) do fator de transcrição CREB, imunoconteúdo das proteínas sinápticas PSD95 e sinapsina I, bem como da subunidade GluA1 do receptor glutamatérgico AMPA e A1 e A2A dos receptores de adenosina. Nenhum dos tratamentos alterou a locomoção dos animais no TCA. Inosina administrada pela via intraperitoneal (i.p.) induziu um efeito antiimobilidade no TSC nas doses de 1 mg/kg e 10 mg/kg. O efeito tipoantidepressivo de inosina foi abolido pelo pré-tratamento dos animais com U0126 [inibidor de MEK, 5µg/sítio administrado pela via intracerebroventricular (i.c.v.)], KN-62 (inibidor de CaMKII, 1µg/sítio, i.c.v.), H-89 (inibidor de PKA, 1µg/sítio, i.c.v.), wortmanina (inibidor de PI3K, 0,1µg/sítio, i.c.v.), rapamicina (inibidor de mTORC1, 0,2nmol/sítio, i.c.v.), NMDA [agonista dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (NMDAR) 0,1pmol/sítio, i.c.v.] e D-serina (coagonista de NMDAR, 30µg/sítio, i.c.v.). Também foi observado um efeito tipoantidepressivo sinérgico entre doses sub-efetivas de inosina (0,1 mg/kg, i.p.) e AR-A014418 (inibidor de GSK-3b, 0,001µg/sítio, i.c.v.), cetamina (antagonista NMDAR, 0,1 mg/kg, i.p.) ou MK-801 (antagonista NMDAR, 0,001 mg/kg, administrado por gavagem). Contudo, o pré-tratamento com DNQX (antagonista dos receptores AMPA, 2,5 µg/sítio, i.c.v.), não alterou o efeito anti-imobilidade de inosina (10 mg/kg, i.p.). No período de 24 h após a administração de inosina (10 mg/kg, i.p.) foi verificado um aumento de fosforilação de CREB no hipocampo dos animais, sem alterações no imunoconteúdo de CREB nessa estrutura, ou na fosforilação e imunoconteúdo no cortéx pré-frontal (CPF). Também não foram verificadas alterações na fosforilação e imunoconteúdo de CREB no CPF e hipocampo 30 minutos após a administração de inosina. Adicionalmente, não foram encontradas alterações no imunoconteúdo de PSD95, GluA1, sinapsina I e dos receptores A1 e A2A de adenosina no hipocampo e CPF 30 min e 24 horas após a administração de inosina. Esses resultados demonstram o envolvimento da inibição de NMDAR e GSK-3b e da ativação de MEK/ERK 1/2, CaMKII, PKA, PI3K/AKT e mTORC1 no efeito tipo-antidepressivo de inosina. Notavelmente, uma única dose de inosina foi capaz de induzir um aumento na fosforilação de CREB no hipocampo. Outro objetivo desse trabalho envolveu o estudo do potencial neuroprotetor da inosina contra a morte celular induzida por metilmercúrio (MeHg) em cultura primária de astrócitos corticais provenientes de ratos neonatos. O co-tratamento com inosina (50-1000µM) e MeHg (5 µM) por 6 h preveniu a redução na viabilidade celular induzido por esse toxicante, avaliada pelo método de redução do MTT. Não foram verificados efeitos protetores após o co-tratamento por 24 h, mas foi observado um efeito protetor após o pré-tratamento com inosina (50-1000µM) por 24 h seguido do co-tratamento com inosina nas mesmas concentrações e MeHg (5 µM) por 24 h adicionais. O tratamento das culturas celulares com inosina (500 µM) por 6 h, também preveniu o aumento na geração de espécies reativas de oxigênio induzidos por MeHg (5 µM) avaliado pela sonda H2DCFDA. Contudo, não foram verificadas alterações nos níveis de glutationa total e reduzida induzidos pelos tratamentos com inosina e/ou MeHg. O tratamento com inosina estimulou a expressão do RNAm para NQO-1, Nrf2 e BDNF além de aumentar o imunoconteúdo de Nrf2 no núcleo celular. Também foi verificado um aumento transitório na fosforilação de AKT (ser-473) por inosina (500 µM), e o prétratamento com wortmanina (1 µM) preveniu o efeito neuroprotetor de inosina (500 µM) frente à neurotoxicidade do MeHg (5 µM). Não foram verificadas alterações na fosforilação de ERK1/2 após o tratamento com inosina e o prétratamento com U0126 (10 µM) não preveniu o efeito neuroprotetor dessa purina. Adicionalmente, o efeito neuroprotetor de inosina (500 µM) foi prevenido pelo pré-tratamento com MRS1523 (antagonista dos receptores A3 de adenosina, 1µM), mas não foram verificadas alterações pelo pré-tratamento com PSB36, (antagonista dos receptores A1 de adenosina, 10 nM) ou pelo pré-tratamento com SCH58261, (antagonista dos receptores A2A de adenosina, 100 nM). Assim, esses resultados indicam que inosina pode exercer um efeito protetor contra a toxicidade induzida por MeHg em astrócitos, possivelmente ativando o receptor A3 de adenosina e a sinalização de PI3K/AKT, além da ativação do fator de transcrição Nrf2. Em conjunto, os resultados desse trabalho demonstram novos mecanismos moleculares referentes aos efeitos antidepressivos e neuroprotetores de inosina, ressaltando a participação do sistema purinérgico em diferentes processos no sistema nervoso central.<br> / Abstract : Inosine is an endogenous purinergic nucleoside formed by the adenosine breakdown in a reaction catalyzed by the enzyme adenosine deaminase. It has been reported antinociceptive, anti-inflammatory, neuroprotective, and antidepressant effects for inosine that may occur through adenosine receptors activation. However, there is little evidence regarding the signaling pathways and others neurochemical mechanisms associated to the effects elicited by this purine. The present study investigated the neurochemical mechanisms associated to inosine antidepressant-like and neuroprotective effects. First, it was investigated, in adult mice, the participation of intracellular signaling pathways and glutamatergic receptors on the inosine antidepressant-like effect, evaluated by tail suspension test (TST) and the locomotor activity was evaluated by the open field test (OPT). Moreover, the effect of inosine administration in the phosphorylation levels and imunocontent of the transcription factor CREB and the imunocontent of synaptic proteins PSD95 and synapsin-I, as well as GluA1 subunit of AMPA receptor and A1 and A2A adenosine receptors was also evaluated. None of the treatments changed the locomotor activity in the OPT. Inosine administered by the intraperitoneal route (i.p.) in the doses of 1 and 10 mg/kg induced an antidepressant-like effect in the TST. The anti-immobility effect of inosine was prevented by pre-treatment of mice with U0126 [MEK inhibitor, 5µg/site administered by intracerebroventricular route (i.c.v.)], KN-62 (CaMKII inhibitor, 1µg/site, i.c.v.), H-89 (PKA inhibitor, 1µg/site, i.c.v.), wortmanin (PI3K inhibitor, 0.1µg/site, i.c.v.), rapamycin (mTORC1 inhibitor, 0.2 nmol/site, i.c.v.), NMDA [agonist of NMDA glutamatergic receptors (NMDAR) 0.1 pmol/site, i.c.v.] and D-serine (NMDAR co-agonist, 30µg/site, i.c.v.). It was also observed a synergic antidepressant-like effect elicited by subeffective doses of inosine (0.1mg/kg, i.p.) and AR-A014418 (GSK-3b inhibitor, 0.001µg/site, i.c.v.), ketamine (NMDAR antagonist, 0.1 mg/kg, i.p.), MK-801 (NMDAR antagonist, 0.001 mg/kg, administered by gavage). However, the pretreatment with DNQX (AMPA receptors antagonist, 2.5 µg/site, i.c.v.), did not changed inosine antidepressant-like effect (10 mg/kg, i.p.). 24 h after inosine administration (10 mg/kg, i.p.) an increase in CREB phosphorylation without alterations in CREB imunocontent was found in mice hippocampus. No alterations in CREB imunnocontent and phosphorylation were found 30 minutes after the administration of inosine. Furthermore, the imunocontent of synaptic proteins (PSD95, GluA1 and synapsin-I), as well as A1 and A2A adenosine receptors, was not altered 30 min and 24 h after inosine administration. These results suggest the participation of NMDAR and GSK-3b inhibition, and MEK/ERK 1/2, CaMKII, PKA, PI3K/AKT and mTORC1 activation in the antidepressant-like effect of inosine in the TST. Moreover, a single administration of inosine was able to induce an increase in CREB phosphorylation in the hippocampus. Another aim of the study was to determine the neuroprotective effect of inosine against methylmercury (MeHg) toxicity in cortical astrocyte primary culture from newborn rats. The co-treatment with inosine (50-1000µM) and MeHg (5 µM) for 6 h prevented the decrease in cell viability induced by MeHg. No protection was observed after the co-treatment with inosine (50-1000µM) and MeHg (5 µM) for 24 h, but a neuroprotective effect, assessed by MTT reduction method, was observed after inosine pretreatment (50-1000µM) for 24 h followed by co-treatment with inosine (in the same concentrations) and MeHg (5 µM) for additional 24 h. Inosine (500 µM) prevented the increase in the oxygen reactive species generation (evaluated by H2DCFDA probe) induced by MeHg (5 µM) for 6 hours, but no changes in the reduced and total glutathione levels were observed. Inosine treatment (500 µM) also induced an increase in NQO-1, Nrf2, BDNF mRNA expression and Nrf2 immunocontent in cell nucleus. It was also observed a transient increase in AKT (ser-473) phosphorylation induced by this purine, and wortmanin pre-treatment (1 µM) prevented the inosine neuroprotective effect. No alterations were observed in ERK 1/2 phosphorylation after the treatment with inosine and the neuroprotective effect of this purine was not prevented by the pre-treatment with U0126 (10 µM). Additionally, the neuroprotection elicited by inosine was prevented by MRS1523 (A3 adenosine receptor antagonist, 1µM), but no changes were observed after the pre-treatment with PSB36 (A1 adenosine receptor antagonist, 10 nM) nor SCH58261 (A2A adenosine receptor antagonist). These results indicated that inosine induced a neuroprotective effect against MeHg in astrocytes that may occur by A3 adenosine receptor and PI3K/AKT activation, and this purine can also activate Nrf2. Taken together, our results showed new mechanisms for inosine antidepressant and neuroprotective effects, reinforcing the participation of the purinergic system in various processes in the central nervous system.

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.

A isquemia cerebral é uma doença grave, sendo a segunda causa mais comum de morte e a principal causa de incapacidade em todo o mundo. A redução repentina do fluxo sanguíneo cerebral leva à diminuição do fornecimento de oxigênio e de glicose, resultando em uma falha no metabolismo energético cerebral. Este desequilíbrio no metabolismo energético é claramente o elemento chave no processo isquêmico, resultando em danos celulares e comprometimento das funções neurológicas. A excitotoxicidade glutamatérgica, o estresse oxidativo e processo inflamatório desempenham papéis importantes na lesão cerebral isquêmica, levando a danos teciduais que comprometem a integridade do tecido durante a isquemia. A guanosina e a inosina são conhecidas por desempenhar um papel neuroproteção ao sistema nervoso central, agindo como um modulador negativo do sistema glutamatérgico e possuindo efeitos tróficos em células neurais. Desta forma, nesta tese, avaliaram-se diversos mecanismos que são modulados pela guanosina e inosina em modelos experimentais de isquemia cerebral in vivo. Inicialmente, demonstrou-se que a guanosina é efetiva na neuroproteção contra a isquemia cerebral focal em ratos, causando redução de danos neuronais e astrogliais, diminuindo a peroxidação lipídica e o volume de enfarte cerebral e, consequentemente, recuperando a função motora do membro anterior debilitado pela isquemia. Esta neuroproteção estaria envolvida na manutenção do ambiente redox celular, na modulação da resposta inflamatória e na modulação do sistema glutamatérgico, mecanismos ligados à lesão isquêmica. A isquemia cerebral causou um aumento do número total de células micróglias e também uma maior ativação destas células, efeito inibido pela administração de guanosina. Nesta tese, também investigamos os efeitos agudos relacionados à neuroproteção da administração de guanosina e de inosina como reposição volêmica em um modelo de choque hemorrágico (que, potencialmente, diminui a perfusão sanguínea cerebral) em suínos. A guanosina e a inosina foram capazes de diminuir os níveis de glutamato mais rapidamente do que o controle e de modular o ambiente de citocinas pró-inflamatórias, diminuindo os níveis de IL-1β e TNF-α (apenas inosina) após choque hemorrágico. Esta supressão pode estar associada com diminuição na morte neuronal tardia, o que implicaria em uma melhora no prejuízo cognitivo que ocorre choque hemorrágico. No geral, nosso trabalho representa uma importante contribuição para o conhecimento sobre os possíveis mecanismos neuroprotetores da guanosina e da inosina em modelos de isquemia cerebral. / Cerebral ischemia is a devastating disease, being the second most common cause of death and the major cause of disability worldwide. The sudden reduction in cerebral blood flow leads to decreased oxygen and glucose supplies, resulting in a failure of cellular bioenergetics. Disruption of brain energetics metabolism is clearly a key element in stroke, resulting in cellular damage and impairment of neurological functions. Glutamate excitotoxicity, oxidative stress and neuroinflammation play important roles in ischemic brain injury, with harmful impacts on ischemic cerebral tissue. As guanosine and inosine play an important neuroprotective role in the central nervous system, exerting glutamatergic system antagonism and trophic effects on neural cells, in this study, it was evaluated the neuroprotective effects of guanosine and inosine against in vivo cerebral ischemia models. Initially, we demonstrated that guanosine was neuroprotective against cerebral focal ischemia in rats causing reduction of neuronal and astroglial damage, decreasing lipid peroxidation and cerebral infarct volume, and consequently recovery in the function of impaired forelimb. These neuroprotection could be involved in the maintenance of the cellular redox environment, modulating the inflammatory response and the glutamatergic systems. Furthermore, ischemia increased the total number of microglial cells, and changed the morphological characteristics. These effects were inhibited by guanosine treatment. Additionally, it was also investigated the acute neuroprotective effects of guanosine and inosine as a fluid resuscitation in a model of hemorrhagic shock in swines. The treatment with guanosine or inosine was able to decrease glutamate levels faster than control group and also was able to modulate the proinflammatory cytokines environment, decreasing IL-1β and TNF-α (only inosine) levels after hemorrhagic shock. These effects could be associated with reduction delayed neuronal cell damage, improving cognitive impairment that occurs in hemorrhagic shock. Overall, our work represents an important contribution to the knowledge regarding the putative neuroprotective mechanisms of guanosine and inosine in cerebral ischemia models.

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.

A isquemia cerebral é uma doença grave, sendo a segunda causa mais comum de morte e a principal causa de incapacidade em todo o mundo. A redução repentina do fluxo sanguíneo cerebral leva à diminuição do fornecimento de oxigênio e de glicose, resultando em uma falha no metabolismo energético cerebral. Este desequilíbrio no metabolismo energético é claramente o elemento chave no processo isquêmico, resultando em danos celulares e comprometimento das funções neurológicas. A excitotoxicidade glutamatérgica, o estresse oxidativo e processo inflamatório desempenham papéis importantes na lesão cerebral isquêmica, levando a danos teciduais que comprometem a integridade do tecido durante a isquemia. A guanosina e a inosina são conhecidas por desempenhar um papel neuroproteção ao sistema nervoso central, agindo como um modulador negativo do sistema glutamatérgico e possuindo efeitos tróficos em células neurais. Desta forma, nesta tese, avaliaram-se diversos mecanismos que são modulados pela guanosina e inosina em modelos experimentais de isquemia cerebral in vivo. Inicialmente, demonstrou-se que a guanosina é efetiva na neuroproteção contra a isquemia cerebral focal em ratos, causando redução de danos neuronais e astrogliais, diminuindo a peroxidação lipídica e o volume de enfarte cerebral e, consequentemente, recuperando a função motora do membro anterior debilitado pela isquemia. Esta neuroproteção estaria envolvida na manutenção do ambiente redox celular, na modulação da resposta inflamatória e na modulação do sistema glutamatérgico, mecanismos ligados à lesão isquêmica. A isquemia cerebral causou um aumento do número total de células micróglias e também uma maior ativação destas células, efeito inibido pela administração de guanosina. Nesta tese, também investigamos os efeitos agudos relacionados à neuroproteção da administração de guanosina e de inosina como reposição volêmica em um modelo de choque hemorrágico (que, potencialmente, diminui a perfusão sanguínea cerebral) em suínos. A guanosina e a inosina foram capazes de diminuir os níveis de glutamato mais rapidamente do que o controle e de modular o ambiente de citocinas pró-inflamatórias, diminuindo os níveis de IL-1β e TNF-α (apenas inosina) após choque hemorrágico. Esta supressão pode estar associada com diminuição na morte neuronal tardia, o que implicaria em uma melhora no prejuízo cognitivo que ocorre choque hemorrágico. No geral, nosso trabalho representa uma importante contribuição para o conhecimento sobre os possíveis mecanismos neuroprotetores da guanosina e da inosina em modelos de isquemia cerebral. / Cerebral ischemia is a devastating disease, being the second most common cause of death and the major cause of disability worldwide. The sudden reduction in cerebral blood flow leads to decreased oxygen and glucose supplies, resulting in a failure of cellular bioenergetics. Disruption of brain energetics metabolism is clearly a key element in stroke, resulting in cellular damage and impairment of neurological functions. Glutamate excitotoxicity, oxidative stress and neuroinflammation play important roles in ischemic brain injury, with harmful impacts on ischemic cerebral tissue. As guanosine and inosine play an important neuroprotective role in the central nervous system, exerting glutamatergic system antagonism and trophic effects on neural cells, in this study, it was evaluated the neuroprotective effects of guanosine and inosine against in vivo cerebral ischemia models. Initially, we demonstrated that guanosine was neuroprotective against cerebral focal ischemia in rats causing reduction of neuronal and astroglial damage, decreasing lipid peroxidation and cerebral infarct volume, and consequently recovery in the function of impaired forelimb. These neuroprotection could be involved in the maintenance of the cellular redox environment, modulating the inflammatory response and the glutamatergic systems. Furthermore, ischemia increased the total number of microglial cells, and changed the morphological characteristics. These effects were inhibited by guanosine treatment. Additionally, it was also investigated the acute neuroprotective effects of guanosine and inosine as a fluid resuscitation in a model of hemorrhagic shock in swines. The treatment with guanosine or inosine was able to decrease glutamate levels faster than control group and also was able to modulate the proinflammatory cytokines environment, decreasing IL-1β and TNF-α (only inosine) levels after hemorrhagic shock. These effects could be associated with reduction delayed neuronal cell damage, improving cognitive impairment that occurs in hemorrhagic shock. Overall, our work represents an important contribution to the knowledge regarding the putative neuroprotective mechanisms of guanosine and inosine in cerebral ischemia models.