Orientador: Kleber Luiz de Araujo e Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:13:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roma_LeticiaPrates_D.pdf: 1071638 bytes, checksum: 52777a4c39261ec7137298200cb2b319 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo:Introdução/Objetivos. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) faz parte de diversos processos fisiológicos. Nos últimos anos, o aumento de EROs têm sido associado ao desenvolvimento de diversas doenças, dentre elas o Diabetes Mellitus Tipo 2. As células beta pancreáticas são notadamente mais suscetíveis ao estresse oxidativo devido a sua baixa capacidade antioxidativa, resultado da menor expressão e atividade de enzimas antioxidantes como superóxido dismutase e peroxidases. A dexametasona, um glicocorticóide sintético, tem efeitos diabetogênicos e citotóxicos em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas. Entretanto, os mecanismos pelos quais a dexametasona atua sobre as células-alvo não estão bem esclarecidos. Dessa forma, nosso objetivo foi analisar se a dexametasona induz estresse oxidativo em células produtoras de insulina RINm5F e ilhotas pancreáticas. Utilizamos três modelos: 1) células RINm5F controle, que são extremamente sensíveis ao estresse oxidativo; 2) células RINm5F superexpressando a enzima catalase (RINm5F.Cat), que são resistente ao estresse oxidativo e 3) ilhotas de ratos adultos cultivadas por 72 h com dexametasona (Dexa) e ilhotas tratadas concomitantemente com dexametasona e o antioxidante N-acetilcisteína (Dexa+NAC). Resultados: Aumento na produção de EROs foi observado em células RINm5F tratadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona aumentou a atividade/clivagem da caspase-3 e apoptose em células RINm5F após 3 dias de cultura. Expressão protéica e atividade de Cu/ZnSOD estava aumentada após o tratamento com dexametasona, enquanto que a expressão/atividade de MnSOD não foi modulada pelo corticóide. A superexpressão da catalase em linhagens de célula beta previniu todos os efeitos citotóxicos da dexametasona, inclusive a morte celular. Elevados níveis de Cu/ZnSOD podem favorecer o aumento na geração de EROs e conseqüentemente, apoptose. Da mesma forma, ilhotas tratadas com dexametasona apresentaramaumento na produção de EROs, efeito que foi revertido quando as ilhotas foram tratadas concomitantemente com dexametasona e NAC. Redução na secreção de insulina estimulada por glicose foi observada em ilhotas cultivadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona e NAC restaurou a secreção de insulina a níveis próximos aos controles. Uma menor produção deNAD(P)H no grupo Dexa foi observado, sendo que o grupo Dexa+NAC mostrou níveis semelhantes ao grupo controle. Não ocorreram diferenças nas concentrações intracelulares de cálcio estimulado por glicose em nenhum dos grupos. A dexametasona reduziu a expressão gênica da sinaptotagmina VII, enquanto no grupo Dexa+NAC houve um aumento da expressão desse gene em ilhotas pancreáticas. Interessantemente, o tratamento com NAC diminuiu a expressão gênica da Cu/ZnSOD. Conclusões: Nossos resultados indicam que as ações da dexametasona em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas são mediadas através do aumento do estresse oxidativo, sendo a Cu/ZnSOD importante nesse processo. A superexpressão da catalase e o uso do antioxidante n-acetilcisteína previnem contra os efeitos citotóxicos do glicocorticóide. / Abstract: Introduction/Aims: Reactive oxygen species (ROS) play a dual role on living organisms, being involved in many physiological processes and also being linked to the development of several pathologies, including the type 2 diabetes mellitus. Pancreatic beta cells are very sensitive to oxidative stress because of their low antioxidant capacity, wich results from their low expression and activity of antioxidant enzymes, especially peroxidases. Dexamethasone is a synthetic diabetogenic glucocorticoid that induces cytotoxic effects on pancreatic beta cells. However, the precise mechanisms of dexamethasone toxicity on target cells are not fully understood. The aim of the present study was to analyzed whether dexamethasone induces oxidative stress in insulinproducing cells and pancreatic islets. Experimental design: The experiments were performed using 3 models: 1) RINm5F control cells, extremely sensitive to oxidative stress; 2) RINm5F cells overexpressing the enzyme catalase (RINm5F.Cat), very resistant to oxidative stress and 3) rat pancreatic islets cultured for 72 h with dexamethasone (Dexa) or cultured concomitantly with dexamethasone and the antioxidant N-acetylcysteine (Dexa+NAC). Results: An increased generation of reative oxygen species (ROS) was observed in dexamethasone-treated insulinproducing cells together with an increase in caspase-3 activity and apoptosis rate. Interestingly, exposure to dexamethasone increased the cytosolic superoxide dismutase Cu/ZnSOD protein expression and activity, while the mitochondrial MnSOD isoform was not affected by the glucocorticoid. Overexpression of catalase in insulin-producing cells prevented all the cytotoxic effects of dexamethasone. Pancreatic islets cultured in the presence of dexamethasone (Dexa) for 72 h showed increased ROS production. Glucose-stimulated insulin secretion was decreased after Dexa treatment. Intracellular ROS levels were decreased and the insulin secretion capacitywas recovered by concomitant treatment with Dexa+NAC. The total insulin content and intracellular Ca+2 levels were not modulated in either Dexa or Dexa+NAC groups. There was a decrease in the NAD(P)H production rate, used as an indicator of viability, after dexamethasone treatment. Concomitant incubation with NAC returned viability to control levels. Dexamethasone also decreased SYT VII gene expression; in contrast, the Dexa+NAC group showed increased expression of SYT VII compared to controls. Surprisingly, treatment with NAC decreased the gene expression of the antioxidant enzyme, Cu/ZnSOD. Conclusions: The cytotoxic effects of dexamethasone in RINm5F insulin-producing cells and pancreatic islets are primarily ROS-mediated. High levels of expression and activity of the Cu/ZnSOD might favour the generation of ROS. The overexpression of catalase and the use of the antioxidant Nacetylcysteine counteract the cytotoxic effects of dexamethasone. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:31:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CarolinaPradodeFranca_D.pdf: 11012408 bytes, checksum: 13da099b8bd43a93f7783c961a08d48f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O objetivo central dessa tese foi estudar o papel das junções comunicantes (GJs) no processo de maturação da célula B e na patogênese da diabetes tipo 2. Para isso, foram utilizados dois modelos animais. No modelo in vivo de maturação da célula B e do processo secretório de insulina foram empregados ratos em vários estágios do desenvolvimento (fetal, neonatal, jovem e adulto). No modelo de diabetes tipo 2 foram utilizados camundongos C57BL/6, wild-type e knockout para o gene do receptor de LDL (LDLR -/-), alimentados com dieta hiperlipídica. No primeiro modelo de estudo, observamos, por técnicas morfológicas (imunocitoquímica) e de biologia molecular (Western Blot, RT-PCR semi-quantitativo e qPCR) que a expressão gênica e protéica de Cx36 e Cx43, se altera durante o desenvolvimento. Os dados de microinjeção intracelular de traçadores confirmam tais resultados que sugerem que ilhotas de ratos recém-nascidos apresentam menor número de canais intercelulares associados à membrana e, conseqüentemente, um menor acoplamento intercelular mediado pelas junções comunicantes em comparação às ilhotas de adultos. Esses resultados estão de acordo com a observação de que a célula B durante o período perinatal mostra uma menor resposta secretória à glicose e sugerem a participação da comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes no processo de maturação da célula B. No caso do modelo in vivo de diabetes tipo 2, o estudo iniciou com a caracterização do quadro metabólico e de aspectos da morfologia e morfometria do pâncreas endócrino de animais submetidos ao tratamento com a dieta hiperlipídica. Os dados obtidos demonstram que os animais submetidos a essa dieta por um curto período de tempo já apresentam alterações metabólicas típicas da fase inicial da diabetes (hiperglicemia moderada, hiperinsulinemia, intolerância á glicose e resistência à insulina), bem como modificações de parâmetros da morfometria do pâncreas endócrino. Posteriormente, foi analisada a expressão e localização celular das proteínas juncionais (Cx36, Cx43 e ZO-1) e o aspecto funcional dos canais formados pela GJ, através da microinjeção de marcadores intracelulares. Observamos que os animais tratados com dieta hiperlipídica apresentam tendência de diminuição de expressão de Cx36 acompanhada por alteração no padrão de marcação para essa proteína. Esses dados estão de acordo os de microinjeção que revelam uma pequena diminuição do grau de acoplamento celular após o tratamento com a dieta hiperlipídica. As alterações observadas para Cx36 foram acompanhadas por modificações no grau de expressão e de localização celular de ZO-1, proteína envolvida em processos como a organização dos canais intercelulares da GJ na membrana e no turnover de vários subtipos de conexina. Esses resultados indicam que a comunicação intercelular, particularmente a mediada por canais formados pela Cx36 parecem desempenhar importante papel na patogênese da diabetes tipo 2, desde sua fase inicial. / Abstract: Intercellular communication and adhesion among pancreatic B-cells are crucial for a proper insulin biosynthesis and secretion. The aim of this work was to investigate the role of gap junction (GJ) mediated-intercellular communication in the processes of maturation and dysfunction of B-cells. It is well known that fetal and neonatal rat pancreatic B-cells exhibit a reduced insulin secretory response to glucose and to other secretagogues as compared to adult ones. Based on this finding, we have used Wistar rats at different stages of development (fetal, neonatal, young and adult) as a model of B-cell maturation. As a model of type 2 diabetes, C57BL/6 mice (wild-type) and LDL receptor-deficient mice were fed a high fat diet up to 60 days. The cellular expression of GJ connexin (Cx) subtypes found in the endocrine pancreas (Cx36, Cx43 and Cx45) was assessed by immunohistochemistry, Western Blot, quantitative and semi-quantitative RTPCR. Our results indicate that young and adult endocrine pancreas express relatively high levels of Cx36 on B-cells in comparison with the other groups. Meanwhile, fetal and neonatal islets express predominantly Cx43 on non B-cells located at the islet periphery. Islet microinjection of GJ tracers revealed that neonatal B-cells display lower intercellular exchange of the cationic molecule Ethidium Bromide (EB) in comparison with the adult ones, which is in accordance with their differences in Cx36 expression. No significant differences were found in expression and localization of Cx45 among all animal groups. Regarding the animal type 2 diabetic model, a metabolic characterization showed that the high-fat diet for 60 days induces glucose intolerance, insulin resistance, hyperinsulinemia and moderate hyperglycemia in both mice groups (LDLr knockout and wild-type groups). High-fat fed mice showed a subtle decrease in Cx36 islet expression and in the B-cell intercellular exchange of EB in comparison with the chow-fed group (control). We also observed an alteration in the pattern of Cx36 labeling in immunohistochemistry assays. The high-fat diet induced a redistribution of Cx36 within the islets from a disorganized pattern (more commonly seen in control mice) to a sub domain-pattern where Cx36 plaques demarcate groups of B-cells. These changes in Cx36 islet distribution observed in high-fat fed mice were accompanied by a similar pattern of immunolabeling for ZO-1, but an increase in its islet expression, a tight junctional protein that seem to be involved in Cx turnover and membrane organization of Cx-made channels. Taken all together, these findings suggest that cell-cell coupling mediated by GJ may play an important role in the pancreatic B-cell maturation observed during endocrine pancreas development as well as in the early stages of type 2 diabetes pathogenesis. / Doutorado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Luiz Fernando de Rezende / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:18:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_GustavoJorge_D.pdf: 3129731 bytes, checksum: b00bd77f6b06be14f135a76b6977ca47 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: A Cálcio-Calmodulina quinase II (CaMKII) atua tanto na regulação da secreção de insulina com de neurotransmissores pela mesma via de sinalização. Além disso, a CaMKII é conhecida por ser a "molécula da memória", pois sua atividade é fundamental em sua formação. Portanto, hipotetizamos que células ß pancreática tem a capacidade de adquirir e estocar informações contidas em pulsos de cálcio, formando uma memória metabólica. Métodos: Para comprovar nossa hipótese, desenvolvemos um novo paradigma de exposição de células ? a pulsos de 30 mM de glicose, seguido de uma período de consolidação (24 hrs) para excluir qualquer efeito agudo do metabolismo da glicose. Após esse período analizamos a secreção de insulina (RIA), expressão proteica (Western blot), a resposta secretória frente a uma "rampa de glicose" e o Ca2+ citoplasmático induzido por glicose. Resultados: Células ß expostas a pulsos de glicose (30 mM) mostraram maior secreção de insulina estimulada por glucose, evidenciando a memória metabólica a qual foi totalmente dependente a CaMKII. Esse fenômeno foi refletido na expressão proteica de proteínas importantes na sinalização do cálcio e na secreção de insulina. Além disso, células expostas ao regime de pulsos de glucose apresentaram maior expressão do MAFA, um fator de transcrição chave para a função da célula ß. Conclusão: Em suma, assim como neurônios, células ß tumorais (MIN6), ilhotas de camundongos e de humanos são capazes de adquirir, estocar e evocar informações / Abstract: Backgroun: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) functions both in regulation of insulin secretion and neurotransmitter release through common downstream mediators. Memory is the ability to acquire, to store and to evocate any kind of information. In CNS, the process behind this phenomenon in the Long-Term Potentiation (LTP) and is known that it requires Ca2+ to occur. In additional, CaMKII is necessary to store information during LTP. In pancreatic ß-cells, CaMKII plays pivotal role during GSIS process. Therefore, we hypothesized that pancreatic ß-cells acquire and store the information contained in Ca2+ pulses as a form of "metabolic memory", just as neurons store cognitive information. Methods: To test this hypothesis, we developed a novel paradigm of pulsed exposure of mice and human ß-cells to intervals of high glucose, followed by a 24-hour consolidation period to eliminate any acute metabolic effects. After this period, we analyzed insulin secretion (by RIA), protein expression (by Western blot), response to a glucose-ramp and the glucose-induced Ca2+ influx. Results: Strikingly, ß-cells exposed to this high-glucose pulse paradigm exhibited significantly stronger insulin secretion. This metabolic memory was entirely dependent on CaMKII. We also observed, in pulse group, an increase in Ca2+ influx induced by glucose. In additional, metabolic memory was reflected on the protein level by increased expression of proteins involved in GSIS and Ca2+-dependent vesicle secretion, such as GCK, Cav1.2, SNAP25, pCaMKII and pSynapsin. Finally, we observed in human islet elevated levels of the key ß cell transcription factor MAFA. Discussion: Based on or findings we conclude that pancreatic ß cells, either from mice or humans, have the ability to acquire, store and retrieve information. This process is CaMKII-dependent and is due to modifications in the glucose-sensing machinery of the cell, since we observed an increase in GSIS and Ca2+ influx together with an increase in several proteins involved in this process. Our findings suggests that MAFA is the key effector in this memory, since (a) it is a potent activator of insulin gene, (b)is activated by CaMKII and (c) its expression is increased even 24 hours after the last pulse. Conclusion: In summary, like neurons, human and mouse ß-cells are able to acquire and retrieve information / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Helena Coutinho Franco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:29:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_JaneCristinade_D.pdf: 1851485 bytes, checksum: 9bc182bf9f44ff62ddc24d9ea9603f71 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Alterações no conteúdo de colesterol celular podem contribuir para o mau funcionamento das células-beta pancreáticas. Camundongos knockout para o receptor de LDL (LDLR-/-) possuem maior teor de colesterol nas ilhotas pancreáticas e secretam menos insulina em comparação a camundongos selvagens (WT). Neste estudo, investigamos a associação entre o conteúdo de colesterol, a secreção de insulina e a movimentação de cálcio citoplasmático nessas ilhotas. Além disso, analisamos o efeito da dieta rica em gordura (HFD) sobre a homeostasia glicêmica, secreção e ação da insulina nesses camundongos. Os resultados mostraram que a primeira e segunda fase de secreção de insulina assim como a movimentação de Ca2+, estimuladas por glicose, foram reduzidas nos LDLR-/-. Camundongos LDLR-/- também apresentaram menor conteúdo de proteínas envolvidas com a extrusão dos grânulos de insulina tais como: VAMP-2 e SNAP-25 (p<0,05). A remoção do excesso de colesterol pelo uso da metil-beta-ciclodextrina (M?CD) normalizou a secreção de insulina, estimulada por glicose (GSIS) ou tolbutamida, assim como a movimentação de cálcio estimulada por glicose. A remoção do colesterol das ilhotas WT com 0.1 e 1 mmol/L de M?CD reduziu a secreção bem como a movimentação de cálcio. No entanto, ilhotas incubadas com 10 mmol/L de M?CD apresentaram aumento significativo na secreção de insulina, apesar da redução na movimentação de cálcio. A dieta hiperlipídica (H) promoveu maior ganho de peso e acúmulo de gordura visceral nos camundongos LDLR-/-H em relação aos WTH. A dieta aumentou a glicemia tanto no jejum quanto alimentado, porém não houve alterações nas concentrações plasmáticas de insulina nos camundongos LDLR-/-H. Já nos camundongos WTH, a dieta causou aumento nas glicemias de jejum e alimentado bem como na insulinemia. A área sob a curva glicêmica durante o oGTT foi 30% maior nos camundongos LDLR-/-H. A GSIS não foi significativamente alterada pela dieta hiperlipídica em ambos os grupos. Camundongos LDLR-/- em dieta padrão apresentaram maior fosforilação do receptor de insulina (IR?) e da AKT em fígado e músculo. O conteúdo da enzima que degrada a insulina (IDE) se mostrou reduzido nos LDLR-/-. A dieta hiperlipídica reduziu a sinalização da insulina em fígado, músculo e tecido adiposo dos camundongos LDLR-/-H. Nos camundongos WTH essa dieta promoveu apenas uma redução na fosforilação do IR? no músculo. A análise conjunta dos resultados nos permitiu concluir que, tanto o aumento de colesterol verificado em ilhotas LDLR-/- quanto a diminuição excessiva do conteúdo de colesterol em ilhotas WT (tratadas com M?CD) alteram a movimentação de cálcio e conseqüentemente a secreção de insulina. A redução do colesterol nas ilhotas dos camundongos LDLR-/- corrigiu a redução da secreção de insulina, apesar das concentrações reduzidas de VAMP-2 e SNAP-25. Camundongos LDLR-/-, alimentados com dieta padrão, são mais sensíveis à insulina, provavelmente como um mecanismo adaptativo a menor secreção de insulina. No entanto, estas adaptações não são suficientes para manter a homeostase glicêmica visto que estes animais são intolerantes à glicose. Quando alimentados com dieta hiperlipídica, os LDLR-/-H se tornam resistentes à insulina provavelmente devido ao aumento do tecido adiposo visceral / Abstract: Changes in cellular cholesterol levels may contribute to beta cell dysfunction. Islets from LDL receptor knockout (LDLR-/-) possess higher cholesterol content and secrete less insulin than wild type (WT) mice. Here, we investigated the association between cholesterol content, insulin secretion and Ca2+ handling in these islets. In addition, we analyzed the effects of highfat- diet (HFD) on glucose homeostasis, insulin secretion and action in these mice. Both first and second phase of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) were lower in LDLR-/- compared with WT islets. This lower secretion was paralleled by impairment in Ca2+ handling in these islets. The contents of SNAP-25 and VAMP-2 proteins, which participate in the extrusion of the insulin containing granules, were reduced in LDLR-/- compared with WT islets. Removal of the excess of cholesterol from LDLR-/- islets (Methyl-?-cyclodextrine, M?CD) normalized glucose- and tolbutamide-induced insulin release. Glucose-stimulated Ca2+ handling was also normalized in cholesterol-depleted LDLR-/- islets. Cholesterol removal from WT islets by 0.1 and 1.0 mmol/L M?CD impaired both GSIS and Ca2+ handling. However, 10 mmol/L M?CD markedly increased insulin secretion induced by glucose or tolbutamide in WT islets, despite a significant reduction in Ca2+ handling. The HFD promoted higher body weight gain and visceral fat pad depot in LDLR-/-H than in WTH. LDLR-/-H mice showed fasted and fed glucose levels significantly higher whereas no changes in fasted plasma insulin levels were observed. WTH mice also showed an increase in fasted and fed glucose levels, but a higher fasted plasma insulin level (p<0.05) was noticed. The area under the curve of the oGTT in LDLR-/-H, but not in WTH, was increased (30%) by HFD. GSIS was not significantly altered by HFD in both groups. LDLR-/- mice showed higher IR? and AKT phosphorylation in liver and skeletal muscle. Insulin degrading enzyme (IDE) protein content was lower in liver of LDLR-/-. The HFD reduced insulin signaling in liver, skeletal muscle and adipose tissue in LDLR-/-H. In WTH the HFD reduced only the IR? phosphorylation in muscle. In conclusion, our results indicate that abnormal high (LDLR-/- islets) or low (WT islets treated with M?CD) cholesterol contents alter both GSIS and Ca2+ handling. Normalization of islet cholesterol content improved Ca2+ handling and insulin secretion in LDLR-/- islets, despite the lower expression of SNAP-25 and VAMP-2. LDLR-/- mice, fed a chow diet, are more sensitive to insulin probably due adaptive mechanisms that compensate the low insulin secretion. However, these changes are not sufficient to promote glucose homeostasis since these mice were glucose intolerants. When fed a high-fat diet, they became also insulin resistant probably due to an increase in the mass of the visceral adipose tissue / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Alex Rafacho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:53:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Purificacao_ThaisAlmeida_M.pdf: 1255549 bytes, checksum: 5142cacf6ca932aa0dd1a86b9eef5074 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Administração de glicocorticóides em roedores e humanos aumenta a resistência à insulina (RI). A RI, provocada por dexametasona, leva a hiperinsulinemia por aumento da secreção do hormônio pelas ilhotas pancreáticas. Recentemente, demonstrou-se que a AS160, uma GAP (proteína ativadora de GTPase), participa no tráfego de vesículas em diferentes tipos celulares que, por sua vez, pode ser alterado por dexametasona. Neste trabalho, avaliamos possível participação da AS160 na secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona, para isto foram avaliadas proteínas envolvidas no processo de secreção; pAS160, Akt e AMPK. Ratos Wistar adultos foram tratados com o glicocorticóide (DEX) com 1mg/kg (ip) de peso corporal, ou salina (CTL), durante 5 dias. Ao final do período de tratamento, os ratos foram submetidos a um Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT) e, após sacrifício, amostras de sangue foram coletadas para dosagem de insulina. As ilhotas pancreáticas foram isoladas por digestão do pâncreas com colagenase. As proteínas insulares foram avaliadas por Western Blot e os genes por RCP-TR. A insulina, contida nas amostras de sangue e nas incubações de ilhotas, foi medida por radioimunoensaio (RIA). A razão pAS160/AS160 foi aumentada nas ilhotas DEX (P<0,05). Nestas ilhotas, resultados semelhantes foram observados para a razão pAkt/Akt (P<0,05). O tratamento com DEX também aumentou a expressão gênica e protéica da Rab27A (P<0,05), contudo, reduziu significativamente sua associação com a AS160 (P<0,05). A associação entre essas duas proteínas foi observada pela primeira vez nas ilhotas neste trabalho. O tratamento com DEX também reduziu as expressões gênica e protéica bem como a fosforilação da AMPK. A secreção de insulina foi maior nas ilhotas DEX comparado à CTL e, em ambas, a secreção foi diminuída pela wortmanina (inibidor da PI3K). Ilhotas de ratos CTL e DEX, tratados com anti-sense anti-AS160, tiveram o conteúdo protéico da AS160 reduzido em ± 80%, comparado ao CTL (P<0,05). Nas ilhotas de ratos CTL knockdown, a secreção de insulina foi maior que nos CTL e, nas ilhotas dos DEX knockdown a secreção foi semelhante às DEX. Concluindo, o aumento da secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona envolve a participação da AS160 e, essa potencialização parece ser mediada pela via PI3K/Akt. Esse aumento de secreção parece também ser diretamente proporcional ao aumento da dissociação entre a Rab27A e a AS160 / Abstract: It is well known that glucocorticoids induce insulin resistance (IR). It is also known that dexamethasone-induced IR is linked to increased levels of plasma insulin due to higher insulin secretion by pancreatic islets. Recent findings show that the Rab-GTPase AS160 plays a role in the traffic of vesicles in different cells type that, in turn, may be affected by dexamethasone. Here, we evaluated the participation of AS160 in the insulin secretion in islets from dexamethasone treated rats. Adult rats were treated with dexamethasone (DEX) with 1.0 mg/kg, body weight (ip) or saline (CTL) for 5 consecutive days. Insulin resistance was evaluated by intraperitoneal Glucose Tolerance Test (ipGTT). After, the rats were sacrificed and the islets isolated by the digestion of their pancreases with collagenase. Protein was measured by Western- Blot, and insulin by RIA. AS160 expression, phosphorylation, and the pAS160/AS160 ratio were increased in DEX islets (P<0.05). Similar results were observed for Akt (P<0.05). Dexamethasone also increased Rab27a protein and gene expression but significantly reduced its association with AS160. The association between these two proteins was observed in pancreatic islets for the first time in this work. AMPK gene and protein expression as well as phosphorylation were reduced by Dexamethasone (P<0.05). The insulin secretion was higher in DEX compared with CTL islets (P<0.05). Both secretions were reduced by wortmanin. Islets from CTL and DEX rats, treated with anti-sense anti-AS160, showed ± 80% reduction on its expression. The CTL knockdown islets secreted more insulin than CTL and the DEX knockdown secreted similar amount of insulin than DEX islets. In conclusion, these results indicated that AS160 participates in the increased insulin secretion in islets from DEX rats, and this effect seems to be dependent on the activation of the PI3K/Akt pathway. The increase in insulin secretion also depends on the dissociation between Rab27a and AS160 / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_PriscillaMunizRibeiroda_D.pdf: 2752788 bytes, checksum: a2b912ed65ab26f33708f44d094db90a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A glutamato desidrogenase (GDH) é uma enzima mitochondrial que cataliza a reação reversível de glutamato a ?-cetoglutarato. Nas ilhotas pancreáticas, está associada com a secreção de insulina por aumentar a concentração de ATP. Ratos alimentados com dieta hipoprotéica apresentam secreção de insulina diminuída. A suplementação com leucina (LEU) aumenta a secreção de insulina em resposta a agentes insulinotrópicos. O presente estudo investigou a influência da suplementação com LEU na expressão da GDH e seu envolvimento com a secreção de insulina em ratos desnutridos e suplementados com LEU. Ratos machos foram alimentados com dietas normo- (17%, NP) ou hipoprotéicas (6%, LP) por oito semanas. Após, foram divididos e suplementados com LEU (1,5%) na água de beber (NPL e LPL) pelas quatro semanas seguintes. O conteúdo protéico de GDH no cérebro, fígado, rim e músculo esquelético não diferiu entre os grupos. Nas ilhotas LP, a expressão da GDH estava diminuída e a suplementação com LEU aumentou a expressão de RNAm restaurando o conteúdo protéico a valores similares a NP. A secreção de insulina estimulada por agentes insulinotrópicos ou inibidores, combinados ou não, estava diminuída em ilhotas LP comparada com NP. A suplementação com LEU aumentou a secreção de insulina a valores similares a NP, exceto quando as ilhotas LPL foram incubadas com EGCG. Ilhotas LP tiveram diminuição na [Ca2+]i quando expostas a GLN+BCH. A suplementação com LEU restaurou esses parâmetros aos valores de NP. Frente a esses resultados, podemos concluir que a diminuição na expressão da GDH induzida pela dieta LP foi central ao pâncreas endócrino e está associada à redução da secreção de insulina observada nas ilhotas LP. A suplementação com LEU foi capaz de restaurar a expressão da GDH, contribuindo para o aumento da secreção de insulina observado nas ilhotas LPL. Além disso, a GDH pode, ainda, estar associada com a secreção de insulina pelo acoplamento estímulo/secreção via regulação da [Ca2+]i / Abstract: Glutamate dehydrogenase (GDH) is a mitochondrial matrix enzyme that catalyzes the reversible reaction of glutamate to ?-ketoglutarate. In the pancreatic islets, this enzyme is associated with insulin secretion by augmenting ATP levels. Protein malnourished rats displayed reduced insulin secretion. Leucine (LEU) supplementation augments the insulin secretion response to insulinotropic agents. The present study investigated the influence of LEU supplementation on GDH expression and its involvement with insulin secretion in malnourished rats supplemented with LEU. Male rats were fed normal- (17%, NP) or low-protein diet (6%, LP) for eight weeks. Half of rats of each group were supplemented with LEU (1.5%) in drinking water for the following four weeks (NPL and LPL groups). GDH protein content in brain, liver, kidney and skeletal muscles was not different in any group. GDH RNAm and protein content was reduced in LP islets and LEU supplementation augmented RNAm expression restoring protein content similar to NP. Insulin secretion was reduced in LP islets compared with NP when stimulated by insulinotropics agents or inhybitors, combinaned or not. LEU supplementation augmented insulin secretion to similar values as NP, an effect that was blunted when LPL islets were incubated with EGCG. LP islets showed lower [Ca2+]i when exposed to GLN+BCH. LEU supplementation augmented these patterns similar to NP. Taken together, we may conclude that diminution in GDH expression induced by LP diet was central to endocrine pancreas and was associated with reduced insulin secretion observed in LP rats. LEU supplementation was able to restore GDH expression and it was capable to restore insulin secretion via GDH restoration. Yet, GDH may contribute to insulin secretion via Ca2+ regulation stimulus/secretion coupling / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T15:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RicardoBeltramede_M.pdf: 4343326 bytes, checksum: c45de34d36b3510fa7bea078864506dc (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Tem havido um grande interesse na determinação das vias envolvidas na proliferação e função/disfunção da célula beta e a aplicação deste conhecimento em terapias moleculares e celulares da diabetes. A patogênese da diabetes melito tipo 2 (T2DM) é complexa, mas frequentemente está associada com obesidade e distúrbios do metabolismo de lipídios (hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia). A T2DM envolve o desenvolvimento de um quadro de resistência periférica à insulina parcialmente compensada por hiperinsulinemia e hiperplasia da célula beta pancreática, resultando em intolerância à glicose e hiperglicemia. Os mecanismos interligando os estados de obesidade/hipercolesterolemia e resistência à insulina ao fenômeno da hiperplasia da célula beta não são completamente conhecidos. A presente dissertação teve como objetivos: 1) caracterizar um modelo animal adequado para se estudar a proliferação e disfunção da célula beta pancreática, e 2) avaliar, no pâncreas endócrino desses animais, a possível ativação da via de sinalização Wnt/beta-catenina, conhecida por estar envolvida no processo de proliferação celular em outros tecidos/órgãos. Para tal, foram empregados camundongos C57BL/6, wild-type (WT) e knockout para receptor de lipoproteína LDL (LDLr-/-), os quais foram submetidos à dieta hiperlipídica (HF) por 60 dias. Após a dieta HF, os animais WT tornaram-se obesos e hipercolesterolêmicos, bem como moderadamente hiperglicêmicos, hiperinsulinêmicos, intolerantes à glicose e resistentes à insulina, caracterizando-os como pré-diabéticos. Além disso, os animais alimentados com dieta HF apresentaram uma diminuição significativa na resposta secretora das células beta à glicose. De modo geral, os animais LDLr-/- apresentaram uma susceptibilidade relativamente mais alta à dieta HF, sugerida pela acentuada hipercolesterolemia, intolerância à glicose, e reduzida secreção de insulina estimulada por glicose observadas nestes animais. No entanto, a dieta HF induziu, de forma semelhante em animais WT e LDLr-/-, uma diminuição significativa no conteúdo celular de Cx36, uma proteína associada à junção comunicante e um marcador de diferenciação terminal da célula beta. Ambos os grupos WT e LDLr-/- alimentados com dieta HF mostraram aumento na proliferação de células beta, como avaliada pela imunomarcação das ilhotas para a proteína Ki67, mas apenas os animais WT exibiram alterações morfométricas indicativas de hiperplasia do pâncreas endócrino, tais como aumento na massa total de ilhotas e de células beta. Uma vez estabelecido que camundongos WT alimentados com dieta HF por 60 dias consistiam em um modelo adequado para a segunda etapa deste estudo, fomos investigar a possível ativação da via Wnt/beta-catenina nas ilhotas pancreáticas desses animais, avaliando-se a distribuição e expressão celular das proteínas beta-catenina total, beta-catenina ativada, c-Myc e ciclina D. A análise por imunofluorescência para beta-catenina não mostrou acúmulo citoplasmático ou translocação para o núcleo desta proteína em ilhotas pancreáticas, que poderia indicar ativação da via Wnt/beta-catenina no nosso modelo de hiperplasia do pâncreas endócrino. No entanto, a análise por Western Blot revelou um aumento significativo na expressão de beta-catenina ativada e ciclina D em ilhotas de animais alimentados com dieta HF em relação ao grupo controle. Concluindo, a dieta HF por 60 dias induz alterações metabólicas típicas da pré-diabetes em animais WT e LDLr-/-. O estado de pré-diabetes está associado a uma diminuição da expressão de Cx36 nas células beta pancreáticas, sugerindo um possível papel da comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes na patogênese da T2DM. A maior susceptibilidade metabólica à dieta HF apresentada por camundongos LDLr-/-, em relação aos WT, pode ser explicada pela maior deficiência na secreção de insulina em resposta à glicose e ausência de hiperplasia compensatória do pâncreas endócrino. Ainda, a análise preliminar de expressão protéica de algumas proteínas da via Wnt/beta-catenina sugere que esta via parece estar ativada durante o processo de hiperplasia do pâncreas endócrino observada no nosso modelo animal / Abstract: The pathogenesis of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is often associated with obesity and dyslipidemia (hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia). T2DM involves intolerance to glucose and insulin resistance partially compensated by hyperinsulinemia and pancreatic beta cell hyperplasia. The mechanisms linking obesity/hypercholesterolemia and insulin resistance to beta cell hyperplasia are not fully known. The Wnt/beta-catenin signaling pathway has been reported to be involved in cell growth and differentiation in several tissues/organs but its role in endocrine pancreas development and function is still unclear. This work aimed at: 1) establishing an appropriate animal model of T2DM to study pancreatic beta cell proliferation and dysfunction and, 2) investigating a putative involvement of the Wnt/beta-catenin signaling pathway in the beta cell hyperplasia in this model. To this end, we employed C57BL/6 wild-type (WT) and LDL lipoprotein receptor knockout (LDLr-/-) mice, fed a high fat (HF) diet for 60 days. After feeding a HF diet, WT mice became obese, hypercholesterolemic and moderately hyperglycemic, hyperinsulinemic, glucose intolerant and insulin resistant, characterizing them as pre-diabetics. Moreover, animals fed a HF diet showed a significant decrease in beta-cell secretory response to glucose. In general, LDLr-/- animals showed a relatively higher susceptibility to HF diet, as suggested by a marked hypercholesterolemia, glucose intolerance and reduced insulin secretion stimulated by glucose observed in these animals as compared to the control ones. However, HF diet induced similarly in both WT and LDLr-/- mice a significant decrease in cellular content of Cx36, a gap junctional protein and marker of terminally differentiated beta cell. Both WT and LDLr-/- fed a HF diet showed increased proliferation of beta cells, as assessed by Ki67 immunostaining, but only WT mice exhibited morphometric changes indicative of endocrine pancreas hyperplasia, such as increased total islet and beta cell masses. After we investigated a possible activation of Wnt/beta-catenin signaling pathway in these hyperplasic pancreatic islets of WT animals fed a HF diet. This was done by assessing the distribution and cellular protein expression of some proteins associated to this pathway (i.e., total and activated beta-catenin, c-Myc and cyclin D) in islets of our animal model. Beta-catenin immunofluorescence showed no cytoplasmic accumulation or translocation into the nucleus of beta cells in HF-fed mice. However, immunoblotting revealed a significant increase of unphosphorylated beta-catenin (activated) and cyclin D expression in islets of HF diet-fed animals when compared to its control group. In conclusion, a HF diet for 60d induced pre-diabetes state in both WT and LDLr-/- mice. The pre-diabetes state is associated with a decreased expression of Cx36 in pancreatic beta cells, suggesting a possible role of intercellular communication mediated by gap junctions in the pathogenesis of T2DM. The relatively high metabolic susceptibility to the HF diet showed by LDLr-/- mice, as compared to WT, may be explained by a marked impairment of glucosestimulated insulin secretion and a lack of compensatory hyperplasia of the endocrine pancreas. In addition, the protein expression analysis suggests that the Wnt/beta-catenin pathway may be activated during the islet hyperplasia process in our animal model / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural