[pt] Neste trabalho, os limites atuais de densidade de fluxo de potência do Artigo 21 do Regulamento de Radiocomunicações da UIT para sistemas não-GEO operando na banda 3.7-4.2 GHz são analizados. Estes limtes visam proteger os receptores do Serviço Fixo Terrestre, operando na mesma faixa de frequência, das interferências produzidas por sistemas de satélites não geoestacionários. A análise foi motivada pela Resolução 157 [1] da Conferência Mundial de Radiocomunicações de 2015, que reconheceu a necessidade de uma revisão do Artigo 21 para que sistemas não-GEO possam operar nestas faixas de frequências assegurando, ao mesmo tempo, que os serviços primários existentes continuem protegidos. Na análise, cinco estruturas de constelações de satélites não-GEO do tipo Walker Delta, adequadamente escolhidas, foram consideradas. Resultados mostraram que os atuais limtes de pfd podem impor restrições indevidas aos sistemas não-GEO operando nesta faixa. Assim, uma metodologia para investigar uma máscara limitante de pfd mais adequada é apresentada. A aplicação desta metodologia leva a uma máscara alternativa que se aproxima dos limites atuais de pfd para satélites geoestacionários quando o número de satélites no sistema interferente não-GEO é igual a um. Uma avaliação da máscara de pfd proposta mostra que ela não impõe restrições desnecessárias aos sistemas de satélites não-GEO. Isto, junto a outros fatos, indica que os limites de pfd propostos são, de fato, muito mais adequados do que os atuais. / [en] In this work, the current power-flux density limits in Article 21 of the ITU-R Radio Regulations for non-GSO systems operating in the 3.7-4.2 GHz band are analyzed. These limits aim the protection of Fixed Service receivers, operating in the same frequency band, from the interference produced by non-GSO satellite systems. The analysis was motivated by Resolution 157 [1] of the World Radiocommunication Conference 2015, that recognized the need for a revision of Article 21 with a view to enabling non-GSO systems to operate in these FSS frequency bands while ensuring that existing primary services are protected. In the analysis, five different Walker Delta type satellite constellation structures, adequately chosen, were considered. Results have shown that the current pfd limits may impose undue constraints to non-GSO systems operating in this band. Therefore, a methodology to investigate a more adequate pfd limiting mask is presented. The application of this methodology leads to an alternative mask that approaches the current pfd limits for the geostationary satellites when the number of satellites in the non-GSO interfering system is equal to one. An evaluation of the proposed pfd mask shows that it does not impose unnecessary constraints to the non-GSO satellite systems. This, along with other facts, indicates that the proposed pfd limits are, indeed, much more adequate than the current ones.

[pt] O bunching de fótons é um dos mais celebrados efeitos de interferência de dois fóotons, associado à tendéncia de fótons indistinguíveis de tomarem o mesmo caminho quando há uma superposição dos pacotes de onda em um combinador de feixes óptico simétrico. Nós exploramos o fenômeno de interferência de dois fótons e mostramos que: a característica espectral de uma fonte de luz pode ser determinar através da técnica de Espectroscopia de Transformada de Fourier de Poucos Fótons de alta resolução que se mostra como uma técnica útil para a caracterização espectral de fontes ópticas débeis abaixo do limite coberto por técnicas clássicas de batimento heteródino; uma fonte de fótons com estatística sub-Poisson, a Fonte de Fótons Anunciadas com Óptica Linear, pode ser construída baseada apenas em óptica linear e estados coerentes atenuados uma vez que os anúncios sejam sintonizados nos picos de coincidência de um interferograma de Hong-Ou-Mandei quando o interferômetro é alimentado com estados em frequências diferentes; uma modificação do interferômetro de Hong-Ou-Mandel produz um aumento no número de coincidências, ao invés de sua diminuição, quando os pacotes de onda estão perfeitamente superpostos no interferômetro e o anúncio de fótons sintonizados nesse pico gera um feixe com distribuição sub-Poisson. A descrição matemática de cada experimento é detalhada e uma revisão extensa das ferramentas teóricas e práticas necessárias para o entendimento dos resultados é apresentada. / [en] Photon bunching is one of the most celebrated effects of two-photon interference, related to the tendency of indistinguishable photons to take the same path when there is a wave-packet overlapping in a symmetric beam splitter. Photon antibunching, the counterpart of photon bunching is, on turn, a desired effect in many applications such as single-photon generation. We explore the two-photon interference phenomena and show that: the spectral characteristics of a light source can be determined with a high resolution Few-Photon Fourier Transform Spectroscopy which proves to be a useful asset for spectral characterization of faint optical sources below the range covered by classical heterodyne beating techniques; a sub-Poisson photon source, the Linear-Optic Heralded Photon Source, can be constructed based only on linear optics and weak coherent states by time-tuning a Hong-Ou-Mandel interferometer fed with frequency-displaced coherent states and yields a second-order correlation function at zero time below one; a modified version a the Hong-Ou-Mandel interferometer produces a peak of coincidences instead of dip when the wave-packets are perfectly overlapped and the announcement of photons time-tuned to this coincidence peak yield an antibunched photon stream. The mathematical description of each experiment is detailed and an extensive review of the most important theoretical and practical tools for understanding of the results is presented.

Cette thèse s’inscrit au sein de la recherche sur l’analyse d’erreurs en espagnol langue seconde et dans une démarche d’enseignement de la langue à des apprenants non natifs dans le cadre universitaire français. A partir d’un corpus de données écrites centrées sur des productions dirigées en espagnol d’étudiants francophones spécialistes de l’université française, nous avons entrepris un travail d’analyse des erreurs des catégories grammaticales de l’espagnol pour en créer des types. En nous focalisant sur les typologies des erreurs lexico-orthographiques, lexico-sémantiques, lexico-syntaxiques et lexico-morphologiques, cette analyse a débouché sur un travail d’étiologie basé sur les erreurs d’interférence et de transfert négatif des langues connues de nos informateurs, erreurs les plus fréquentes. En vue d’une remédiation de ces erreurs pour le développement de la compétence linguistique voire plurilingue des apprenants, nous proposons des pistes didactiques tenant compte des objectifs et des compétences requises afin qu’ils acquièrent le niveau B1 du CECRL. / This work is about error analysis in Spanish as a second language and is aimed at improving language teaching to non-native learners in the French university system. Based on the study of a corpus of supervised written productions in Spanish from French-speaking specialist students in French universities, we analysed grammatical errors in Spanish in order to create an original typology. By focusing on the lexicon and the spelling, the lexicon and the semantics as well as lexical and morphological typologies of errors, this analysis allowed us to produce a work of etiology, mostly based on the errors of interference and negative transfer caused by the foreign languages already known to our students. So as to help the students deal with these errors and help them improve at their linguistic – and also multilingual – competences, we made didactic suggestions taking into account the goals and skills expected from students necessary to reach the B1 level of CECRL. / Esta tesis se inscribe en el seno de la investigación sobre el análisis de errores en español lengua segunda y en un enfoque de enseñanza de la lengua a aprendices no nativos en el marco universitario francés. A partir de un corpus de datos escritos centrados en producciones dirigidas en español de estudiantes francófonos especialistas de la universidad francesa, hemos iniciado un trabajo de análisis de los errores de las categorías gramaticales del español para crear diferentes tipos de ellas. Con el foco puesto en las tipologías de los errores léxico-ortográficos, léxico-semánticos, léxico-sintácticos y léxico-morfológicos, este análisis ha llevado a un trabajo de etiología basado en los errores de interferencia y transferencia negativa de las lenguas conocidas por nuestros informantes, errores más frecuentes. Con miras a una remediación de estos errores para lograr el desarrollo de la competencia linguística incluso plurilingüe de los aprendices, proponemos pistas didácticas teniendo en cuenta los objetivos y las competencias requeridas para que éstos adquieran el nivel B1 del CECRL.

Este trabajo analiza la idoneidad de dos de los principales métodos de asignación de tareas en entornos con restricciones temporales. Se pondrá de manifiesto que ambos tipos de mecanismos presentan carencias para tratar tareas con deadlines, especialmente cuando los robots han de formar coaliciones. Uno de los aspectos a los que esta tesis dedica mayor atención es la predicción del tiempo de ejecución, que depende, entre otros factores, de la interferencia física entre robots. Este fenómeno no se ha tenido en cuenta en los mecanismos actuales de asignación basados en subastas. Así, esta tesis presenta el primer mecanismo de subastas para la creación de coaliciones que tiene en cuenta la interferencia entre robots. Para ello, se ha desarrollado un modelo de predicción del tiempo de ejecución y un nuevo paradigma llamado subasta doble. Además, se han propuesto nuevos mecanismos basados en swarm

En el presente estudio se ha analizado la actuación lingüística por parte de 22 estudiantes universitarios suecos en una prueba de traducción del sueco al español y una prueba de producción semi-libre en español. Fueron creadas dos pruebas distintas con los mismos ocho verbos, con la intención de suscitar construcciones verbales específicas en español, de manera que fuera posible, mediante un análisis de errores, comparar la actuación lingüística de los estudiantes y medir la proporción de errores atribuibles a la influencia interlingüística e intralingüística, a modo de comparación porcentual en ambas pruebas.  La transferencia de satélite direccional del sueco al español, motivada por la diferencia entre las lenguas- S y lenguas V, ha sido evidente en la prueba de traducción, mientras que en la prueba de producción semi-libre permanece prácticamente inexistente. De igual manera, se ha constatado la transferencia del sufijo -iv, -iva del sueco al español. Ambos rasgos mencionados se atribuyen a la influencia interlingüística, incrementada en un ejercicio de traducción. Los resultados indican que el ejercicio de traducción complica la exactitud gramatical e idiomática en la LM debido a una marcada influencia interlingüística, mientras que en el uso exclusivo de la LM en el ejercicio de producción semi-libre no parece ocurrir dicho fenómeno. Por consiguiente, la actividad contrastiva, en este caso, puede dificultar la exactitud gramatical y semántica en español como lengua extranjera. / In the present study, the linguistic performance of 22 Swedish university students in a translation test from Swedish to Spanish and a semi-free production test in Spanish has been analyzed. Two different tests were created with the same eight verbs, with the intention of eliciting specific verbal constructions in Spanish, so that it would be possible, through an analysis of errors, to compare the linguistic performance of the students and measure the proportion of errors attributable to the interlinguistic and intralinguistic influence, as a percentage comparison in both tests. Directional satellite transfer from Swedish to Spanish, motivated by the difference between S-languages ​​and V-languages, has been evident in the translation test, while in the semi-free production test it remains practically non-existent. Similarly, the transfer of the suffix -iv, -iva from Swedish to Spanish has been confirmed. Both features mentioned are attributed to the interlinguistic influence, increased in a translation exercise. The results indicate that the translation exercise complicates the grammatical and idiomatic accuracy in the ML due to a marked interlinguistic influence, while in the exclusive use of the ML in the semi-free production exercise this phenomenon does not seem to occur. Therefore, the contrastive activity, in this case, can hinder grammatical and semantic accuracy in Spanish as a foreign language.

[pt] Este trabalho tem como finalidade o estudo das possibilidade do sistema GFDM (Generalized Frequency Division Multiplexing). Para o estudo feito foi apresentado um modelo matricial para representar os sinais gerados no sistema GFDM, a semelhança do modelo de sinal do sistema OFDM (Orthogonal Frequency Division Multiplexing). Tal modelo permitiu a obtenção de expressões analíticas para a Densidade Espectral de Potência (DEP, Spectral Power Density) dos sinais e sua comparação com a DEP dos sinais transmitidos em sistemas OFDM. A partir do modelo matricial apresentado são estudados o desempenho de diferentes tipos de equalizadores/detectores lineares clássicos passíveis de utilização neste sistema de comunicações digitais, tais como Zero Forcing, Minimum Mean Square Error e Matched Filter. Além disso o trabalho propõe e analisa o desempenho resultante da aplicação de técnicas de supressão de interferência PIC (Parallel Interference Cancellation) em conjunto com os detectores lineares mencionados e dos detectores LAS (Likelihood Ascent Search) precedidos por equalizadores Matched Filter (MF-LAS). O número de estágios PIC realizados em cada detecção é controlado por uma estratégia de parada baseada na métrica de distância. Diferentes esquemas de detecção MF-LAS em conjunto com PIC são também propostos e examinadas. Finalmente, partindo do modelo matricial desenvolvido neste trabalho é realizada a estimação de canal empregando a estratégia de símbolos pilotos ortogonais. As diferentes estratégias de detecção examinadas para o sistemas GFDM são comparadas em termos de desempenho BER (Bit Error Rate) e da complexidade computacional associada aos respectivos detectores. Comparações entre os sistemas GFDM e OFDM com destaque na complexidade na geração de sinais, eficiência espectral e desempenho estão também incluídos nesta dissertação. / [en] The main goal of the presented work is to study the possibilities of the GFDM system (Generalized Frequency Division Multiplexing). For achieving this purpose, a matrix model is presented which represents the signals generated in the GFDM system, similar to the signal model of the OFDM (Orthogonal Frequency Division Multiplexing) system. This model allows the obtainment analytical expressions for the Spectral Power Density (DEP) of the signals and their comparison with the DEP of the signals transmitted in OFDM systems. Furthermore, we study the performance of different types of classical linear equalizers/detectors that can be used in the digital communications systems, such as Zero Forcing, Minimum Mean Square Error and Matched Filter. In addition, we propose and analyze the performance resulting from the application of PIC (Parallel Interference Cancellation) interference suppression techniques together with the linear detectors mentioned and LAS (Likelihood Ascent Search) detectors preceded by Matched Filter (MF-LAS) equalizers. The number of PIC stages performed at each detection is controlled by a stop strategy based on the distance metric. Different MF-LAS detection schemes together with PIC are also proposed and examined. Finally, the channel estimation is performing based on the matrix model developed in this work and using orthogonal pilots symbols. The differents strategies of detection examined for GFDM systems are compared in terms of BER performance (Bit Error Rate) and the computational complexity associated with the respective detectors. Comparisons between GFDM and OFDM systems based on criterions as the complexity of the signal generation, spectral efficiency and performance are also included in this dissertation.

[ES] La biogénesis ribosomal es uno de los procesos más complejos, esenciales y costosos energéticamente de la célula eucariota. La formación de las subunidades ribosomales en levaduras comienza en el nucléolo con la transcripción del ARNr. En este proceso se requiere la participación de más de doscientos factores de ensamblaje y ARNs pequeños nucleolares (snoARNs) que no formarán parte del ribosoma maduro aunque son necesarios para un apropiado procesamiento del ARNr y organización estructural de las subunidades ribosomales. Los estudios estructurales de los estadios de maduración de la subunidad 60S han permitido la identificación de algunas interacciones funcionales entre los distintos factores de ensamblaje. Entre ellos se encuentran las proteínas Nop7, Erb1 e Ytm1 que forman un heterotrímero discreto denominado subcomplejo Nop7 en levaduras, o complejo PeBoW en mamíferos, compuesto por los ortólogos Pes1, Bop1 y WDR12, respectivamente. Este complejo puede detectarse de forma aislada de las partículas prerribosomales. La formación de este heterotrímero es esencial para el ensamblaje de la subunidad 60S ya que garantizan la correcta maduración del extremo 5' del ARNr 5,8S facilitando así su asociación con el ARNr 25S, aunque se desconoce en detalle el papel exacto en la biogénesis ribosomal. En este trabajo se ha realizado un análisis de las interacciones entre los componentes del PeBoW así como una aproximación a la resolución estructural del complejo en solución. Usando una combinación de técnicas biofísicas, nuestros resultados indican que la conformación estructural que adopta el complejo PeBoW en el nucleoplasma es diferente a la descrita en el contexto prerribosomal. Además, se han identificado posibles funciones que podría estar ejerciendo el complejo PeBoW o bien las distintas proteínas del complejo de forma aislada fuera del prerribosoma. Asimismo se conoce que la biogénesis ribosomal es un mecanismo altamente regulado y estrechamente relacionado con crecimiento y proliferación celular. La imperiosa necesidad de síntesis de ribosomas y proteínas que tiene una célula tumoral convierte a este proceso en un punto débil de la misma. Por esta razón, hay un gran interés para estudiar la biogénesis ribosomal como diana terapéutica contra el cáncer. Se ha observado que la paralización de esta vía es capaz de promover la activación no genotóxica del supresor tumoral p53, a diferencia de los efectos indeseados que provocan las terapias convencionales contra el cáncer. Como primer paso hacia el desarrollo de herramientas inhibidoras de la biogénesis del ribosoma, hemos utilizado la información cristalográfica que poseíamos del complejo de Chaetomium thermophilum entre los factores de ensamblaje Erb1 e Ytm1 para realizar una selección guiada por la estructura de péptidos de interferencia. Los péptidos de interferencia han sido analizados in vitro para determinar su capacidad de interacción utilizando técnicas biofísicas. Además, se han generado péptidos de interferencia con la secuencia humana de Erb1/Ytm1 para evaluar sus efectos en cultivo de células de cáncer de colon HCT-116. Nuestros resultados indican que el estrés ribosómico se puede inducir en diferentes etapas del proceso de maduración al dirigirse a las interacciones proteína-proteína, elevándolas como una alternativa al uso de inhibidores de la ARN pol I. / [CA] La biogènesi ribosomal és un dels processos més complexos, essencials i costosos energèticament de la cèl·lula eucariota. La formació de les subunitats ribosomals en llevats comença en el nuclèol amb la transcripció de l'ARNr. En aquest procés es requereix la participació de més de dos-cents factors d'assemblatge i ARNs xicotets nucleolars (snoARNs) que no formaran part del ribosoma madur encara que són necessaris per a un apropiat processament de l'ARNr i organització estructural de les subunitats ribosomals. Els estudis estructurals dels estadis de maduració de la subunitat 60S han permès la identificació d'algunes interaccions funcionals entre els diferents factors d'assemblatge. Entre ells es troben les proteïnes Nop7, Erb1 i Ytm1 que formen un heterotrímer discret denominat subcomplex Nop7 en llevats, o complex PeBoW en mamífers, compost pels ortòlegs Pes1, Bop1 i WDR12, respectivament. Aquest complex pot detectar-se de forma aïllada de les partícules prerribosomals. La formació d'aquest heterotrímer és essencial per a l'assemblatge de la subunitat 60S ja que garanteix la correcta maduració de l'extrem 5' de l'ARNr 5,8S facilitant així la seua associació amb l'ARNr 25S, encara que es desconeix detalladament el paper exacte en la biogènesi ribosomal. En aquest treball s'ha realitzat una anàlisi de les interaccions entre els components del PeBoW així com una aproximació a la resolució estructural del complex en solució. Utilitzant una combinació de tècniques biofísiques, els nostres resultats indiquen que la conformació estructural que adopta el complex PeBoW en el nucleoplasma és diferent a la descrita en el context prerribosomal. A més, s'han identificat possibles funcions que podria estar exercint el complex PeBoW o bé les diferents proteïnes del complex de forma aïllada fora del prerribosoma. Així mateix es coneix que la biogènesi ribosomal és un mecanisme altament regulat i estretament relacionat amb creixement i proliferació cel·lular. La imperiosa necessitat de síntesi de ribosomes i proteïnes que té una cèl·lula tumoral converteix a aquest procés és un punt feble d'aquesta. Per aquesta raó, hi ha un gran interès per a estudiar la biogènesi ribosomal com a diana terapèutica contra el càncer. S'ha observat que la paralització d'aquesta via és capaç de promoure l'activació no genotòxica del supressor tumoral p53, a diferència dels efectes indesitjats que provoquen les teràpies convencionals contra el càncer. Com a primer pas cap al desenvolupament d'eines inhibidores de la biogènesi del ribosoma, hem utilitzat la informació cristal·logràfica que posseíem del complex de Chaetomium thermophilum entre els factors d'assemblatge Erb1 i Ytm1 per a realitzar una selecció guiada per l'estructura de pèptids d'interferència. Els pèptids d'interferència han sigut analitzats in vitro per a determinar la seua capacitat d'interacció utilitzant tècniques biofísiques. Així mateix, s'han generat pèptids d'interferència amb la seqüència humana de Erb1/Ytm1 per a avaluar els seus efectes en cultiu de cèl·lules de càncer de còlon HCT-116. Els nostres resultats indiquen que l'estrès ribosòmic es pot induir en diferents etapes del procés de maduració en dirigir-se a les interaccions proteïna-proteïna, elevant-les com una alternativa a l'ús d'inhibidors de l'ARN pol I. / [EN] Ribosomal biogenesis is a complex, essential and one of the most energy-costing process in eukaryotic cells. The assembling of the ribosomal subunits, in yeast, starts with the RNA transcription inside the nucleolus. This process requires the participation of more than two hundred assembly factors and small nucleolar RNAs (snoRNAs) that will not be part of the mature ribosome, however, they are still necessary to perform the appropriate rRNA processing and structural management. The structural studies on the maturation stages of the 60S subunit have shown functional interactions between different assembling factors. In this group, we find Nop7, Erb1 and Ytm1, that both form a discrete heterotrimer called Nop7 subcomplex in yeast, or PeBoW in mammalian, composed by the respective orthologues Pes1, Bop1 and WDR12. This complex can be found isolated from the pre-ribosomal particles. The presence of this complex is crucial to the 60S subunit assembling, once it ensures the correct maturation of the 5' tip of the rRNA 5,8S, supporting the association with the 25S rRNA. Yet, the details of the PeBoW complex roll in ribosomal biogenesis remain unknown. Hereafter, there are some analysis of interaction assays between the PeBoW component proteins, as well as an approach to structural of the complex in solution. Using different biophysical techniques, the results suggest that PeBoW complex adopts a different conformation in the nucleoplasm than the described in the pre-ribosomal context. Furthermore, it hints some other functions of the PeBoW complex, or the isolated component proteins out of the pre-ribosome path. Besides that, the ribosomal biogenesis is a highly regulated process and strictly related with cellular growth and proliferation. The mandatory demand of ribosome and protein synthesis of tumoral cells make this process a weak point of it. This is the reason why ribosomal biogenesis as cancer treatment target is a point of great interest. According to some studies, it is expected that the interruption of this pathway can lead the non-genotoxic activation of the tumor suppressor p53, unlike other conventional cancer therapies. As a first step to development of ribosomal biogenesis inhibiting tools, the structural information of Erb1 and Ytm1 in Chaetomium thermophilum complex, was taken to design structure-guided interfering peptides. Using biophysical techniques, the interfering peptides were evaluated in vitro to determine their interaction ability. Then, human-sequenced Erb1/Ytm1 interfering peptides were designed to look over the effects on colon cancer cells HCT-116. The results indicate that the ribosomal stress can be induced in different stages of the maturation process, by approaching protein-protein interactions, planting it as an alternative to RNA pol I inhibitors. / Este trabajo ha sido realizado con el apoyo económico de los proyectos de investigación enumerados a continuación: SAF2015-67077-R, SAF2017-89901-R y PROMETEO/2018/0 Durante el periodo de realización de esta tesis, la autora, Lidia Orea Ordóñez, ha sido beneficiaria de una subvención para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral denominada “Ayudas para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral”, (ACIF) (ACIF/2016/103), otorgada por la Generalitat Valenciana, Conselleria de Innovación, Universidades, Ciencia y Sociedad Digital, concedida en la convocatoria 2016. / Orea Ordóñez, L. (2022). Estructura y función del complejo PeBoW como modelo en el desarrollo de posibles herramientas terapéuticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182347

[ES] Los viroides, genomas mínimos de RNA circular no codificante, monocatenarios y muy estructurados, parasitan factores celulares de las plantas para replicarse autónomamente, establecer infecciones sistémicas y usualmente causar enfermedades. Los de la familia Avsunviroidae se replican y acumulan en cloroplastos por un mecanismo de círculo rodante simétrico. Una RNA polimerasa cloroplástica produce concatémeros lineales de polaridad complementaria que son reducidos a monómeros por las ribozimas de cabeza de martillo (HHR) del concatémero. Producen extremos 5'-hidroxilo y 2',3'-fosfodiéster cíclico, que la isoforma cloroplástica de la tRNA ligasa convierte en enlaces 5',3'-fosfodiéster intramoleculares, generando viroides circulares de polaridad complementaria que pueden entrar en otra ronda de transcripción, simétrica a ésta. En esta Tesis se han analizado las secuencias y estructuras viroidales esenciales para su circularización, usando como modelo el viroide latente de berenjena (ELVd), que induce infecciones asintomáticas en berenjena. Expresamos en Escherichia coli precursores del ELVd(+) lineales flanqueados por dos copias de su HHR. Su procesamiento genera monómeros con los extremos adecuados para la ligación por la tRNA ligasa de la berenjena, que es coexpresada. Mutaciones puntuales y deleciones en el sitio nativo de ligación sugieren que solo el dominio HHR es esencial para la circularización. La conservación de la secuencia y estructura de la HHR con las del sustrato natural del enzima (los tRNAs) nos hacen proponer que la HHR del ELVd secuestra la ligasa mimetizando las características generales del bucle anticodón de los tRNAs. Este sistema de expresión permite también producir RNAs recombinantes, insertándolos en una posición particular del RNA del ELVd. Las quimeras son procesadas por las HHRs flanqueantes y sus extremos ligados por la tRNA ligasa. El andamiaje viroidal circular, compacto y posiblemente asociado a la ligasa, permite aumentar la vida media del RNA de interés y su acumulación en la bacteria. En esta Tesis adaptamos el sistema para producir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferencia por RNA (RNAi), un mecanismo de defensa y regulación génica eucariota basado en la complementariedad de bases entre RNAs. dsRNAs complementarios a genes endógenos reducen los niveles de sus transcritos y generan fenotipos de pérdida de función. Los insectos pueden tomar dsRNAs del ambiente, internalizarlos en sus células y distribuirlos sistémicamente, haciendo al RNAi una estrategia prometedora para el control de plagas. Para producir dsRNAs, separamos las repeticiones invertidas del gen diana que genera la horquilla con el cDNA de un intrón autocatalítico del grupo I de Tetrahymena thermophila, aumentando la estabilidad de los plásmidos de expresión. El intrón es eliminado tras la transcripción, resultando en una molécula viroidal de la que protruye el dsRNA de interés. Flanquear las repeticiones invertidas con una copia adicional permutada del intrón permite separar el ELVd del producto final, un dsRNA circular cerrado en ambos lados por pequeños bucles. Ambas moléculas poseen actividad reguladora: las quimeras viroide-dsRNA con homología al gen de la unión septada suave 1 del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera virgifera) exhiben actividad insecticida oral contra las larvas similar a la de horquillas sintetizadas in vitro, y los dsRNAs circulares sin andamiaje viroidal homólogos al gen de la ATPasa vacuolar (subunidad A) y la proteína ribosomal S13 silencian eficientemente estos genes en adultos de la mosca del Mediterráneo (Ceratitis capitata); este caso es de especial relevancia al ser la primera demostración del RNAi para el control de esta plaga. En conclusión, a pesar de su limitada relevancia agrícola, el ELVd es útil para investigar la biología molecular de la familia Avsunviroidae y una poderosa herramienta biotecnológica en combinación con el sistema de expresión en E. coli. / [CA] Els viroides, genomes mínims d'RNA circular no codificant, monocatenaris i molt estructurats, parasiten factors cel·lulars de les plantes per a replicar-se autònomament, establir infeccions sistèmiques i usualment causar malalties. Els de la família Avsunviroidae es repliquen i acumulen en cloroplasts per un mecanisme de cercle rodant simètric. Una RNA polimerasa cloroplàstica produeix concatèmers lineals de polaritat complementària que són reduïts a monòmers per els ribozims de cap de martell (HHR) del concatèmer. Produeixen extrems 5'-hidroxil i 2',3'-fosfodièster cíclic, que la isoforma cloroplàstica de la tRNA lligasa converteix en enllaços 5',3'-fosfodièster intramoleculars, generant viroides circulars de polaritat complementària que poden entrar en una nova ronda de transcripció, simètrica a la primera. En aquesta Tesi s'han analitzat les seqüències i estructures viroidals essencials per a la seua circularització, emprant com a model el viroide latent d'albergínia (ELVd), que indueix infeccions asimptomàtiques en albergínia. Expressem en Escherichia coli precursors de l'ELVd(+) lineals flanquejats per dos còpies del seu HHR. El seu processament produeix monòmers amb els extrems apropiats per a la lligació mediada per la tRNA ligasa de l'albergínia, que és coexpressada. Mutacions puntuals i delecions en el lloc nadiu de lligació suggereixen que només el domini HHR és essencial per a la circularització. La conservació de la seqüència i estructura del HHR amb les del substrat natural de l'enzim (els tRNAs) ens fan proposar que el HHR de l'ELVd segresta la lligasa mimetitzant les característiques generals del bucle anticodó dels tRNAs. Aquest sistema d'expressió també permet produir RNAs recombinants, inserint-los en una posició particular de l'RNA de l'ELVd. Les quimeres són processades pels HHR flanquejants i els seus extrems lligats per la tRNA lligasa. L'RNA viroïdal circular, compacte i possiblement associat a la lligasa, permet augmentar la vida mitjana de l'RNA d'interés i la seua acumulació en els bacteris. En aquesta Tesi adaptem el sistema per a produir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferència per RNA (RNAi), un mecanisme de defensa i regulació gènica eucariota basat en la complementarietat de bases entre RNAs. dsRNAs complementaris a gens endògens redueixen els nivells dels seus transcrits i generen fenotips de pèrdua de funció. Els insectes poden prendre dsRNAs de l'ambient, internalitzar-los en les seues cèl·lules i distribuir-los sistèmicament, fent a l'RNAi una estratègia prometedora en el control de plagues. Per a produir dsRNAs, separem les repeticions invertides del gen diana que genera la forqueta amb el cDNA d'un intró autocatalític del grup I de Tetrahymena thermophila, augmentant l'estabilitat dels plasmidis d'expressió. L'intró és eliminat després de la transcripció, resultant en una molècula viroïdal de la qual protrueix el dsRNA d'interés. Flanquejar les repeticions invertides amb una còpia addicional permutada de l'intró permet separar l'ELVd del producte final, un dsRNA circular tancat als dos costats per xicotets bucles. Els dos tipus de molècules posseeixen activitat reguladora: les quimeres viroide-dsRNA amb homologia al gen de la unió septada suau 1 del cuc de l'arrel de la dacsa (Diabrotica virgifera virgifera) exhibeixen activitat insecticida oral contra les larves similar a la de forquetes sintetitzades in vitro, i els dsRNAs circulars sense l'RNA viroïdal homòlegs al gen de la ATPasa vacuolar (subunitat A) i la proteïna ribosomal S13 silencien eficientment aquests gens en adults de la mosca del Mediterrani (Ceratitis capitata); aquest cas és d'especial rellevància perquè és la primera demostració de l'RNAi per al control d'aquesta plaga. En conclusió, malgrat la seua limitada rellevància agrícola l'ELVd és útil per a investigar la biologia molecular de la família Avsunviroidae i una poderosa ferramenta biotecnològica en combinació amb el sistema d'expressió en E. coli. / [EN] Viroids, minimal genomes of non-coding circular RNA, single-stranded and highly structured, parasitize plant cellular factors to replicate autonomously, establish systemic infections, and typically cause disease. Those of the family Avsunviroidae replicate and accumulate in chloroplasts by a symmetrical rolling circle mechanism. A chloroplast RNA polymerase produces linear concatemers of complementary polarity that are reduced to monomers by the hammerhead ribozymes (HHR) of the concatemer. They produce 5'-hydroxyl and 2',3'-cyclic phosphodiester ends, which the chloroplastic isoform of tRNA ligase converts to intramolecular 5',3'-phosphodiester bonds, generating circular viroids of complementary polarity that can enter another round of transcription, symmetric to the first one. In this Thesis, the viroid sequences and structures essential for its circularization have been analyzed, using as a model the eggplant latent viroid (ELVd), which induces asymptomatic infections in eggplant. We expressed in Escherichia coli linear ELVd(+) precursors flanked by two copies of its HHR. Its processing generates monomers with suitable ends for ligation by the eggplant tRNA ligase, which is co-expressed. Point mutations and deletions at the wild-type ligation site suggest that only the HHR domain is essential for circularization. The conservation of the sequence and structure of the HHR with those of the natural substrate of the enzyme (the tRNAs) lead us to propose that the HHR of the ELVd hijacks the ligase, mimicking the general characteristics of the anticodon loop of the tRNAs. This expression system also allows the production of recombinant RNAs, inserting them into a particular position of the ELVd RNA. Chimeras are processed by flanking HHRs and their ends ligated by the tRNA ligase. The compact, circular viroidal scaffold, possibly associated with the ligase, allows increasing the half-life of the RNA of interest and its accumulation in the bacteria. In this Thesis we adapt the system to produce double-stranded RNAs (dsRNAs) that trigger RNA interference (RNAi), a eukaryotic gene regulation and defense mechanism based on base complementarity between RNAs. dsRNAs complementary to endogenous genes reduce the levels of their transcripts and generate loss-of-function phenotypes. Insects can take dsRNAs from the environment, internalize them into cells, and distribute them systemically, making RNAi a promising pest control strategy. To produce dsRNAs, we separated the inverted repeats of the target gene that generates the hairpin with the cDNA of a group-I autocatalytic intron from Tetrahymena thermophila, increasing the stability of the expression plasmids. The intron is removed after transcription, resulting in a viroidal molecule from which the dsRNA of interest protrudes. Flanking the inverted repeats with an additional copy of the intron in a permuted form allows the ELVd molecule to be separated from the final product, a circular dsRNA molecule capped on both sides by small loops. Both molecules have regulatory activity: the viroid-dsRNA chimeras with homology to the smooth septate junction 1 gene of the corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) exhibit oral insecticidal activity against larvae similar to that of in vitro synthesized hairpins, and the circular dsRNAs without the viroid scaffold homologous to the vacuolar ATPase (subunit A) and ribosomal protein S13 genes efficiently silence those genes in adult Medfly (Ceratitis capitata); this case is of special relevance as it is the first demonstration of RNAi for the control of this pest. In conclusion, despite its limited agricultural relevance, the ELVd is useful for investigating the molecular biology of the Avsunviroidae family and a powerful biotechnological tool in combination with the E. coli expression system. / This work was supported by the Ministerio de Ciencia e Innovación (Spain; co-financed by the European Regional Development Fund) [BIO2017-83184-R] and [BIO2017‐ 91865‐EXP]; Universitat Politècnica de València [PAID-01-17]. We acknowledge support of the publication fee by the CSIC Open Access Publication Support Initiative through its Unit of Information Resources for Research (URICI). / Ortolá Navarro, B. (2023). Heterologous expression of circular RNAs in Escherichia coli for analyzing the ligation process of chloroplastic viroids and producing double-stranded RNAs with insecticidal activity [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192635

The resonance in ports is the phenomenon of energy amplification that takes place in a port or a basin if the incident waves have frequencies close to those of the natural oscillation of the mass of water in the port or basin, typically in the range 30<T[s]<300. These low frequency waves, under resonant conditions, are standing waves that magnifies the amplitudes of the oscillations and currents, in the mouth and inside the port. The effects on operational and safety conditions range from the cessation of port activities, damage to mooring systems and ships to floods in areas adjacent to the perimeter of port basins. Countermeasures to mitigate the effects of resonance in ports and basins introduce geometry or bathymetry modifications, reduce energy entering the port or enhance dissipation mechanisms inside the port. Nevertheless, the dissipation of low-frequency waves requires extensive friction mechanisms in the direction of incident waves or turbulent dissipation mechanisms, which are difficult to cope with the demanding maritime space requirements inside the ports and with the berthing functionality of inner port structures. The typical anti-reflective structures for wave attenuation in gravity wall quays of commercial ports are Jarlan-type vertical structures, which consists of a perforated front wall, through which the wave penetrates the hollow interior chamber of the structure, propagating along till reflexing in the reflective rear face, again towards the front wall, and finally passing through it to interfere with the incident waves. The excessive width required for effective damping by phase-interference dissipative mechanism makes it ineffective for low frequency waves. The present Doctoral Thesis suggests the extension of the dissipative technical effects of the Jarlan-type structures for attenuation of low frequency waves with use of long dissipative circuits. Therefore, the Jarlan-type structure with long dissipative circuits for attenuation of resonance in ports is an effective solution in low frequency wave dissipation; it is functional as a quay, as well as constructively and economically feasible. Once concept of circuit is stablished, the Doctoral Thesis systematically progresses through the compulsory stages to obtain the characterization of long-circuit dissipative structure, to end with an optimization model for the dissipative design of such structures. The Doctoral Thesis combines an original experimental methodology, which takes advantage of the inevitable multi-reflections in the 2D flumes for the simulation of the resonant conditions in an isolated narrow rectangular basin, with an exponential model of energy decay, introducing the length-effective circuit concept, as an indicator of efficiency and design parameter. A number of dissipative efficiency indicators including an estimation of the reflection coefficient of the tested antireflective structures and even the individual dissipative circuits, are defined with the exponential decay model, so making possible the comparison with other methodologies. Finally, a novel technique which combines the exponential decay model, with the experimental results, is used in this Doctoral Thesis to estimate the optimal circuit length according to the type of cell and to obtain the a theoretic optimum design of the anti-reflective structures of long dissipative circuits for the attenuation of the resonance in ports. / La resonancia en puertos es el fenómeno de amplificación de energía que tiene lugar en un puerto o dársena cuando las ondas incidentes tienen frecuencias próximas a las naturales de oscilación de la masa de agua en el puerto o dársena, típicamente en el rango 30<T[s]<300. Estas ondas de baja frecuencia, en condiciones de resonancia, se manifiestan como ondas estacionarias magnificando las amplitudes de las oscilaciones y las intensidades de las corrientes en la bocana y en el interior del puerto. Los efectos sobre las condiciones operativas y de seguridad abarcan desde el cese de actividades portuarias, daños en los sistemas de amarre y buques, hasta inundaciones de las áreas contiguas al perímetro de las dársenas portuarias. Las medidas para paliar los efectos de la resonancia en puertos y dársenas introducen cambios en la geometría o en el fondo, reducen la energía que entra al puerto o mejoran los mecanismos de disipación en el interior del puerto. Pero la disipación de las ondas de baja frecuencia requiere mecanismos de fricción de gran extensión en la dirección de las ondas incidentes o mecanismos de disipación turbulenta, difícilmente compatibles con los exigentes requerimientos de espacio marítimo en el interior de los puertos y con la funcionalidad operativa de atraque de las estructuras portuarias. En muelles de gravedad para uso comercial, las estructuras antirreflejantes habituales para la atenuación de oleaje son las estructuras verticales tipo Jarlan, que consisten en un paramento frontal perforado, a través del cual la ola penetra en la cámara hueca interior de la estructura, propagándose hasta ser reflejada en el paramento trasero impermeable, nuevamente hacia el paramento frontal, que atraviesa para interferir con el oleaje incidente. Este mecanismo de disipación por interferencia de ondas en oposición de fase se muestra ineficaz para ondas de baja frecuencia, debido a que requieren unos anchos excesivos para una amortiguación efectiva. La presente Tesis Doctoral plantea la extensión de los efectos técnicos disipativos de las estructuras Jarlan para la atenuación de las ondas de baja frecuencia mediante el uso de circuitos disipativos largos. La estructura tipo Jarlan con circuitos largos para la atenuación de la resonancia en puertos se muestra una solución eficaz en la disipación de ondas largas, directamente funcional como muelle, así como viable constructiva y económicamente. A partir de la definición de circuito, la Tesis Doctoral desarrolla sistemáticamente los pasos necesarios para obtener la caracterización disipativa de una estructura disipativa de circuitos largos, estableciendo finalmente un modelo para la optimización del diseño de dichas estructuras. La presente Tesis Doctoral combina una nueva metodología experimental, que aprovecha las inevitables multirreflexiones en los canales de ensayos 2D para la simulación de las condiciones resonantes de una dársena rectangular estrecha aislada, con un modelo exponencial de disipación de energía introduciendo el concepto de longitud de circuito efectiva, como indicador de la eficiencia y parámetro de diseño. El modelo exponencial de amortiguación permite la definición de diversos indicadores de la eficiencia disipativa de las estructuras antirreflejantes ensayadas así como de los propios circuitos disipativos independientemente, incluyendo la estimación del coeficiente de reflexión con lo que es posible la comparación con otras metodologías. Por último, el modelo exponencial combinado con los resultados experimentales es utilizado en esta Tesis Doctoral para estimar la longitud óptima de circuito en función del tipo de celda, así como para obtener el diseño óptimo teórico de las estructuras antirreflejantes de circuitos disipativos largos para la atenuación de la resonancia en puertos. / La ressonància en ports és el fenomen d'amplificació d'energia que té lloc en un port o dàrsena quan les ones incidents tenen freqüències pròximes a les naturals d'oscil·lació de la massa d'aigua en el port o dàrsena, típicament en el rang 30<T[s]<300. Aquestes ones de baixa freqüència, en condicions de ressonància, es manifesten com ones estacionàries magnificant les amplituds de les oscil·lacions i les intensitats de les corrents en la bocana i en l'interior del port. Els efectes sobre les condicions operatives i de seguretat van des del cessament d'activitats portuàries i danys en els sistemes d'amarratge i vaixells, fins a inundacions de les àrees contigües al perímetre de les dàrsenes portuàries. Les mesures per a pal·liar els efectes de la ressonància en ports i dàrsenes introdueixen canvis en la geometria o en el fons, redueixen l'energia que entra al port o milloren els mecanismes de dissipació en l'interior del port. Però la dissipació de les ones de baixa freqüència requereixen mecanismes de fricció de gran extensió en la direcció de las ones incidents o mecanismes de dissipació turbulenta, difícilment compatibles amb els exigents requeriments d'espai marítim en l'interior dels ports i amb la funcionalitat operativa d'atracada de les estructures portuàries. En molls de gravetat per a ús comercial, les estructures antireflectants habituals per a l'atenuació d'onatge són les estructures verticals tipus Jarlan, que consisteixen en un parament frontal perforat, a través del qual l'ona penetra en la cambra buida interior de l'estructura, propagant-se fins a ser reflectida en el parament posterior impermeable, de nou cap al parament frontal, que travessa per a interferir amb l'onatge incident. Aquest mecanisme de dissipació per interferència d'ones en oposició de fase es mostra ineficaç per a ones de baixa freqüència, a causa de que requereixen uns amples excessius per a un amortiment efectiu. La present Tesi Doctoral planteja l'extensió dels efectes tècnics dissipatius de les estructures Jarlan per a l'atenuació de las ones de baixa freqüència mitjançant l'us de circuits dissipatius llargs. L'estructura tipus Jarlan amb circuits llargs per a l'atenuació de la ressonància en ports es mostra com una solució eficaç en la dissipació d'ones llargues, directament funcional com a moll, i a més a més, viable constructiva i econòmicament. A partir de la definició de circuit, la Tesi Doctoral desenvolupa sistemàticament els passos necessaris per obtindre la caracterització dissipativa d'una estructura antireflectant de circuits llargs, establint finalment un model per a l'optimització del disseny de dites estructures. La present Tesi Doctoral combina una nova metodologia experimental, que aprofita les inevitables multirreflexions en els canals d'assajos 2D per a la simulació de les condicions ressonants d'una dàrsena rectangular estreta aïllada, amb un model exponencial de dissipació d'energia, introduint el concepte de longitud de circuit efectiva, com a indicador d'eficiència i paràmetre de disseny. El model exponencial d'amortiment permet la definició de diversos indicadors de l'eficiència dissipativa de les estructures assajades i, fins i tot dels propis circuits dissipatius independentment, incloent l'estimació del coeficient de reflexió amb el qual es possible la comparació amb altres metodologies. Per últim, el model exponencial combinat amb els resultats experimentals, es utilitzat com a novetat en esta Tesi Doctoral per a estimar la longitud òptima de circuit en funció del tipus de cel·la, així com per a obtindre el disseny òptim teòric de les estructures antireflectants de circuits dissipatius llargs per a l'atenuació de la ressonància en ports. / González Escrivá, JA. (2017). ANÁLISIS DE LA EFECTIVIDAD DE LAS ESTRUCTURAS ANTIRREFLEJANTES EN LA ATENUACIÓN DE LA RESONANCIA EN PUERTOS [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86183