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Estudo da fotocitotoxicidade dos corantes ciânicos com dois cromóforos em culturas de células neoplásicas / Photocytotoxicity study of cyanine dyes with two chromophores toward neoplasic cell cultures .

Luciana Sayuri Murakami 29 October 2009 (has links)
Os corantes ciânicos com dois cromóforos possuem características espectrais e energéticas vantajosas para aplicação em Terapia Fotodinâmica (TFD) do câncer. Entretanto, sua fotoatividade contra neoplasias não foi ainda estudada nem in vivo nem in vitro. Nesta tese apresentamos os resultados dos estudos in vitro dos mecanismos da fotocitotoxicidade dos corantes ciânicos com dois cromóforos (BCD) com ângulos entre os cromóforos = 1800, 1500 e 900 contra células neoplásicas, com a finalidade de avaliar a potencialidade da aplicação dos BCD como fotossensibilizadores (FS) em TFD. Os estudos foram realizados em comparação com o fotossensibilizador Photogem®,que já está sendo aplicado em TFD. Foram estudados o efeito fototóxico, a distribuição intracelular do BCD e a contribuição de apoptose e necrose na morte celular induzida por ele. Além disso, foi realizada a busca da formulação farmacêutica adequada para aplicação tópica do BCD180. Nos estudos da fotocitotoxicidade foram utilizadas as células neoplásicas de melanoma murino B16F10, melanoma humano C8161, adenocarcinoma de colo retal humano HT29, leucemia T humano (Jurkat) e leucemia mielóde aguda humana Hl-60. A citotoxicidade foi estudada em função da dose da irradiação, da concentração do FS e do tempo de incubação das células com FS. Todos os compostos testados apresentaram baixa citotoxicidade no escuro, quando sob irradiação com luz visível (? > 600 nm) sua citotoxicidade aumentou consideravelmente. Observamos que para todos os tipos de células neoplásicas a fotocitotoxicidade dos BCD, depois de atingir seu máximo na variação do tempo de incubação, é igual ou ultrapassa a fotocitotoxicidade do Photogem® nas mesmas condições experimentais. O estudo comparativo do BCD180 e dos BCD150 e BCD90 mostrou que nas mesmas condições experimentais os dois últimos possuem fotocitotoxicidade maior do que o BCD180. O conjunto dos resultados obtidos mostra que os BCD? podem ser considerados promissores FS para TFD do câncer. Os estudos através de microscopia de fluorescência da distribuição intracelular do BCD180 e dos marcadores fluorescentes das mitocôndrias Mitotracker GreenTM e Rodamina 123 e do núcleo 4\',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mostraram que o BCD180 se localiza preferencialmente na região das mitocôndrias. Os mecanismos da morte celular induzida pelo BCD180 foram analisados através do estudo da morfologia das células Jurkat, liberação da fosfatidilserina, liberação do citocromo c, ativação da caspase-3 e do efeito na citotoxicidade do BCD180 da proteína Bcl-2 (inibidor do citocromo c). A análise mostrou que a apoptose é a principal responsável pela morte celular induzida pelo BCD180 no escuro, enquanto que, sob irradiação luminosa, tanto a apoptose quando a necrose contribuem para a morte celular, e a contribuição da necrose aumenta com o aumento da concentração do BCD180 e do tempo de pós-irradiação. A apoptose ocorre, provavelmente, pela via intrínseca ou mitocondrial. Além disso, foram realizados os testes de permeação cutânea do BCD180 utilizando várias formulações farmacológicas e foi determinado que a mistura de 10% de monoleína em propilenoglicol possui melhores características entre todas as formulações testadas. / Cyanine dyes with two chromophores possess vantage spectral and energetic characteristics for application in Photodynamic Therapy (PDT) of cancer. At the same time, their photoactivity against neoplasias was not yet studied neither in vivo, nor in vitro. In this thesis, we present the results of in vitro studies of photocytotoxicity mechanisms of cyanine dyes with two chromophores (BCD) with angles = 180,150 and 90 between chromophores against neoplasic cells, with the objective to evaluate BCD potentiality to be applied as photosensitizers (PS) to Photodynamic Therapy (PDT). The studies were realized in comparison with photosensitizer Photogem®, which is already applied to PDT. The BCD? phototoxic effect, their intracellular distribution and contribution of the apoptosis and necrosis in the cell death induced by BCD were studied. Besides, the search of adequate pharmaceutical formulation for BCD180 topic application was realized. The neoplasic cell lines of melanoma B16F10 in mice, human melanoma C8161, human colon adenocarcinoma HT29, human T-cell leukemia (Jurkat) and human leukemia Hl-60, were used in the study of photocytotoxicity, which was studied as a function of irradiation dose, PS concentration and incubation time of cells with PS. All tested compounds demonstrated low cytotoxicity in the darkness, while under irradiation by visible light (? > 600 nm) their cytotoxicity considerably increased. It was observed that for all types of neoplasic cells BCD photocytotoxicity under the same experimental conditions is equal or exceeds that of Photogem® when reaches the maximum with the incubation time variation. The comparative study of BCD180 with BCD150 and BCD90 demonstrated that under the same experimental conditions two latter compounds possess photocytotoxicity exceeding that of BCD180. A set of the results obtained demonstrates that BCD can be considered as promising PS for PDT of cancer. The study of intracellular distribution of BCD180, and of mitochondria and nucleus fluorescence selective probes Mitotracker GreenTM, Rhodamine 123 and 4\',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) show that BCD180 is mostly localized in the region of mitochondria. The mechanisms of the cell death induced by BCD180 were analyzed in the study of Jurkat cells morphology, phosphatidyl serine and cytochrome c liberation, caspase-3 activation, and by protein Bcl-2 (cytochrome c inhibitor) effect on BCD180 cytotoxicity. The analysis demonstrated that apoptosis is the main responsible for the cell death induced by BCD180 in darkness, while under light irradiation both apoptosis and necrosis contribute to the cell death, and necrosis contribution increases with BCD180 concentration and post-irradiation time.The apoptosis is probably realized by an intrinsic or mitochondrial way. Besides, the tests of BCD180 cutaneum permeation were realized using various pharmacological formulations. It was determined that among all formulations tested, the mixture of 10% of monoleine in propylene glycol possesses the best characteristics.
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Dieta normocalórica de ácidos graxos de cadeia média: Efeitos sobre a secreção de insulina, tecido adiposo e fígado de ratos jovens / Medium chain fat acid normocaloric diet: effects upon insulin secretion, adipose tissue and liver of young rats

Anderson Carlos Marçal 21 September 2009 (has links)
A suplementação dietética com AGCM induz resistência à insulina, redução de peso ponderal e aumento da adiposidade em ratos Wistar. Adipócitos isolados apresentam reduzidas captação de glicose estimulada por insulina e atividade/fosforilação da proteína AMPK. A expressão protéica do IR no tecido hepático está aumentada em animais tratados com AGCM com redução do grau de fosforilação, enquanto que o grau de fosforilação da proteína AKT permaneceu semelhante entre os grupos. Ilhotas pancreáticas isoladas apresentam redução na secreção de insulina quando incubadas com altas concentrações de glicose, diminuição do conteúdo total de insulina, hipersensibilidade a leucina e/ou arginina e aumento do percentual de morte celular com diminuída expressão da proteína AKT_1 . Desta forma, utilização em longo prazo dessa estratégia nutricional pode interferir no crescimento normal do indivíduo, na sensibilidade à insulina e possívelmente, desenvolvimento e instalação do diabetes. / The introduction of MCFA into diet induces insulin resistance, reduced body weight gain, and increased adiposity in Wistar rats. Isolated adipocytes have reduced insulin induced glucose uptake and phosphorylation/activation of AMPK protein. The insulin receptor protein expression is increased in liver of MCFA fed rats accompanied by reduced tyrosine phosphorylation, with similar AKT serine phosphorylation. Isolated pancreatic islets had reduced glucose stimulated insulin secretion due to high glucose exposure and reduced insulin content; higher insulin secretion induced by leucine and arginine, and increased apoptosis with reduced AKT protein level. In these regard, the chronic ingestion of MCFA may interfere with normal body growth, with the insulin sensitivity and may participate with the development of diabetes.
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Efeito da fração aquosa das folhas de Costus spiralis (Jacq.) Roscoe sobre a função contrátil do coração de mamíferos / EFFECT OF AQUEOUS FRACTION OF LEAVES DE COSTUS SPIRALIS (JACQ.) ROSCOE CONTRACTILE FUNCTION ON HEART MAMMALS.

Britto, Raquel Moreira de 25 March 2011 (has links)
Teas and infusions from C. spiralis leaf have largely been used by folk medicine as diuretic, hypotensor, cytotoxic, immunomodulator, antilithiasic, antidiarrheic, antispasmodic, antiurolitic, antimicrobian, antifungic, antioxidant, antileishmania activity, antiinflamatory, and antiedematogenic activity. In spite of these biological effects attributed to the extracts of C. spiralis, nothing so far could be found in the scientific literature dealing with its effects on the mammalian myocardium.The present study aimed to describe the inotropic effects produced by extracts from the C. spiralis leaf on isolated guinea pig atrium, as well as to contribute for a better understanding about its mechanism of action in that tissue. In isolated mouse cardiomyocytes, the effect produced by those extracts on the intracellular calcium transient and on the sarcolemal L-type calcium current were also measured. Experiments performed to evaluate the contractile effects were carried out on isolated atrium from guinea pig (Cavia porcellus). Firstly, our purpose was to determine the most potent fraction obtained from the C. spiralis leaf. This was done by comparing the hydroalchoolic crude extract with the following ones: aqueous, chloroform, and ethyl acetate. A phytochemical analysis was performed on the fraction exhibiting the greater potency. This evaluation followed the procedures proposed by Matos (1997). The content of sodium and potassium in the most potent fraction was determined by flame photometry. In the contractile experiments, the atrial force was measured isometrically. Biological signals were captured, amplified, and then stored in computer to be processed off line. Intracellular calcium transients were studied by confocal microscopy with laser scanning by using the fluorescent dye FLUO 4AM. Calcium inward currents were measured in mouse cardiomyocytes by using patch clamp technique in the whole cell configuration. Yield percentage of the aqueous fraction (AqF) was 69,40%. This fraction showed the most potent depressor effect on the myocardial contractility (EC50 = 305 ± 41,00 mg/L, Hill constant = 1,46 ± 0,19). The following metabolites were found in the AqF: tannins, saponins, and polifenols (flavonol, flavononol, flavone, xanthone, phenol, and flavonoid). The potassium and sodium contents in 1 g/L of AqF were 1,91 and 0,15 mM, respectively. This was not enough to change the myocardial inotropism, even in the highest concentration of AqF used in the experiments. The contraction and the relaxation time, as well as the time related to the excitation-contraction coupling (stimulus-response) were not modified by adding AqF to the organ bath. However, AqF reduced the Efficiency Index for the contraction and relaxation phases. The Neyler & Merrillees protocol was employed to evaluate the AqF effect on the calcium inward current in myocardial cells. Our results showed that AqF is able to completely abolish the Bowditch phenomenon, suggesting that it could be acting by reducing the sarcolemal calcium current. Supported by those experimental evidences, experiments were proposed to better understand the relationship between AqF and calcium mechanisms in cardiac cells. The following results were obtained with 1,5 g/L AqF: 1) AqF completely abolished the positive inotropic effect induced by isoproterenol (10-1 to 103 pM); 2) AqF shifted rightwardly the concentration-effect curve for CaCl2 (0.5 to 7.0 mM) and increased the EC50 from 1.12 ± 0.07 (Hill = 1.5) to 7.23 ± 0.47 mM (Hill = 7.4) (n = 3; p < 0.05); 3) AqF completely abolished the positive inotropic effect of (-) BAY K8644 (5 to 2000 nM); 4) AqF reduced the intracellular fluorescence from 4.66 ±1.17 to 3.74 ± 1.0 a.u. (n = 30 cells, 4 mice, p < 0.05); 5) AqF did not modify the decay rate of the fluorescent signal (892 ± 37 to 930 ± 30 ms, n = 30 cells, 4 mice, p > 0.05), indicating that it does not interfiere with the calcium removal from the sarcoplasm; 6) AqF reduced the calcium inward current through L-type calcium channels from 6,29 ± 0,34 to 4,9 ± 0,2 A/F (23% , n = 5 animals, p < 0,05). This study brought us unto the following conclusions: 1) AqF is the most potent fraction obtained from C. spirallis leaves; 2) AqF contains the following secondary metabolites: tannins, saponins, and poliphenols; 3) AqF reduces the contraction force of the guinea pig left atrium; 4) AqF acts on the myocardium contractility by reducing the calcium entry in myocardial cells during contraction. / Preparados de Costus spiralis têm sido usados pela medicina popular (diurético, hipotensor, citotóxico, imunomodulador, antilitiásico, antidiarréico, antiespasmódico, antiurolítico, antimicrobiano, antifúngico, antioxidante, antileishmânia, anti-inflamatório e antiedematogênico). Apesar da gama de ações a eles atribuídas, nada pôde ser encontrado na literatura científica com respeito ao possível efeito dos Este trabalho visou determinar os efeitos inotrópicos obtidos das folhas de C. spiralis, que apresentava maior potência, bem como contribuir para o mecanismo de ação desse preparado no miocárdio de mamíferos. Os experimentos sobre contração foram realizados em átrio esquerdo de cobaia (Cavia porcellus), enquanto que as medidas de transiente de cálcio intracelular e de corrente de membrana foram feitas em cardiomiócitos de camundongo. A investigação fitoquímica do preparado mais ativo foi conduzida segundo Matos (1997). Os teores de sódio e de potássio presentes na fração mais potente, foram determinados por fotometria de chama. A força de contração atrial foi captada isometricamente e, depois amplificada, foi armazenada em computador. O transiente de cálcio intracelular foi avaliado com microscopia confocal de varredura a laser. As correntes de cálcio sarcolemais foram medidas em cardiomiócitos submetidos à técnica do patch clamp ( whole cell ). A fração aquosa (FAq) foi a que apresentou maior rendimento (69,40%) e a que exerceu maior efeito inotrópico negativo (CE50 = 305 ± 41,00 mg/L, Hill = 1,46 ± 0,19). Na sua constituição foram detectadas as seguintes classes de metabólitos secundários: taninos e saponinas, com reação fortemente positiva, e os polifenóis, com reação positiva (flavonóis, flavononóis, flavonas, xantonas, fenóis e flavonóides). Em 1 g/L de FAq foram encontrados 1,91 mM de potássio e 0,15 mM de sódio. A adição de FAq ao Tyrode não modificou significativamente a concentração desses íons. Os tempos de contração e de relaxamento, bem como o tempo de acoplamento eletromecânico não foram alterados pela FAq. Contudo, ela reduziu os Índices de Eficiência da contração e do relaxamento. A FAq aboliu completamente o fenômeno de Bowditch induzido por alta frequência de estimulação, indicando que ela reduz a entrada desse íon nas células. Com base nessa evidência, foram realizados protocolos para aprofundar o conhecimento sobre a participação das correntes de cálcio no mecanismo cardiodepressor da FAq. Esta fração produziu os seguintes resultados: 1) aboliu completamente o efeito inotrópico positivo do isoproterenol (10-1 a 103 pM); 2) deslocou para a direita a curva concentração-efeito para o CaCl2 (0,5 a 7,0 mM), aumentando a CE50 de 1,12 ± 0,07 (Hill = 1,5) para 7,23 ± 0,47 mM (Hill = 7,4) (n = 3; p < 0,05); 3) aboliu completamente o efeito inotrópico positivo do (-) BAY K8644 (5 a 2000 nM); 4) reduziu em cerca de 20% o pico da fluorescência intracelular correspondente ao transiente de cálcio citoplasmático (controle: n = 30 células; teste: n = 27 células; 4 animais); 5) não modificou a velocidade de decaimento do sinal de fluorescência, o que significa que ela não interfere com o funcionamento da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático; 6) reduziu em 23% a densidade de corrente de cálcio tipo-L que variou de -6,29 ± 0,34 para -4,9 ± 0,2 A/F (n = 5 animais, p < 0,05). 1) a FAq foi a fração com maior potência inotrópica; 2) os principais metabólitos secundários presentes na FAq foram taninos, saponinas e polifenóis; 3) a FAq reduz a força de contração do átrio; 4) o mecanismo da ação cardiodepressora da FAq sobre a contratilidade miocárdica se deve à diminuição da disponibilização do cálcio durante a contração.
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Hemopoese em desnutrição proteica: caracterização do estroma medular e avaliação da participação do cálcio / Hematopoiesis in protein malnutrition: characterization of bone marrow stroma and evaluation of calcium participation.

Ed Wilson Cavalcante Oliveira Santos 11 April 2018 (has links)
A desnutrição proteica continua sendo um dos principais problemas nutricionais do mundo. Trabalhos de nosso laboratório e de outros autores evidenciam que entre as alterações presentes na desnutrição proteica, está a alteração do tecido hemopoético, com modificações em componentes da matriz extracelular, alterações no ciclo celular da célula tronco/progenitora hemopoética, redução da produção de precursores hemopoéticos, tanto na série eritrocitária como na série leucocitária, levando a anemia e leucopenia. Os mecanismos de participação do Ca2+ nas células da medula óssea são pouco conhecidos, porém, sabe-se que ele atua no processo de hemopoese. Têm sido descrito que elevações da concentração de Ca2+ citoplasmático induzem a proliferação e diferenciação de células mielóides. A ação dessa via em indivíduos desnutridos também é pouco conhecida. Este estudo tem como objetivo avaliar o estabelecimento da celularidade medular in vitro, bem como investigar mecanismos moleculares envolvidos na proliferação e diferenciação dessa celularidade, além de avaliar a ação do cálcio na presença da interleucina-3 em células-tronco hemopoéticas murinas e sua modulação para avaliar alterações na via das MAPKs. Camundongos C57BL/6, machos e adultos foram submetidos à desnutrição proteica e, após a perda de aproximadamente 20% de seu peso corporal, as células da medula óssea foram colhidas. Essas células foram imunofenotipadas, além de reagirem com anticorpos específicos para caracterização da célula-tronco hemopoética e proteínas da via de sinalização de cálcio intracelular. Observamos que a celularidade do estroma medular em cultura de longa duração de animais desnutridos é alterada, principalmente em células de origem mesenquimal, que aparecem em maior número em desnutridos ao longo dos dias de cultura. Além disso, as ondas de cálcio intracelular estavam diminuídas em animais desnutridos, bem como as proteínas p-PKC, p-PLCy, CAMKII, p-AKT e p-STAT5 não respondem ao estímulo de IL-3, levando a uma deficiência da expressão das MAPK: ERK 1/2, JNK e p38. A desnutrição proteica pode causar alterações na celularidade estromal da medula óssea e na diferenciação das células tronco hemopoéticas pela via das MAPKs estimulada por IL-3. / Protein malnutrition remains one of the world\'s major nutritional problems. Studies from our laboratory and others shown that alterations in protein malnutrition include hemopoietic tissue alterations, changes in extracellular matrix components, changes in the hemopoietic stem/progenitor cell tissue, reduction in the production of hemopoietic precursors, in the erythroid series as in the mieloyd series, leading to anemia and leukopenia. Mechanisms of Ca2+ participation in bone marrow cells are poorly understood, but no hemopoiesis has been developed. Elevations of cytoplasmic Ca2+ concentration in proliferation and differentiation of myeloid cells were included. Such an action through malnourished animals is also a little known. This study aims to evaluate the establishment of cellularity in vitro as well as investigate the molecular involvement in cell proliferation and differentiation, as well as to evaluate the action of calcium in the presence of IL-3 in hemopoietic stem cells and its modulation by analytical evaluations in the MAPKs pathway. C57BL/6, male adult mices were subjected to protein restriction and, after loss of approximately 20% of their body weight, bone marrow cells were harvested. These were immunophenotyped in addition to specific activation terms for the hemopoietic stem cell and intracellular signaling pathway proteins. We observed that the bone marrow cells in long-term culture of malnourished animals is altered, mainly in cells of mesenchymal origin, which appears in greater numbers in undernourished throughout the days of culture. In addition, as intracellular calcium waves decreased in malnourished animals, as well as the p-PKC, p-PLC, CAMKII, p-AKT and p-STAT5 proteins did not respond to IL-3, sugesting expression of the expression of MAPK: ERK 1/2, JNK and p38. Protein malnutrition may have changes in bone marrow capacity and differentiation of hemopoietic stem cells through IL-3-stimulated MAPKs.
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A eritropoietina protege a função sistólica de corações neonatais submetidos a isquemia e reperfusão regional = trabalho experimental / Erythropoietin protects the systolic function of neonatal hearts against ischemiareperfusion injury

Vilarinho, Karlos Alexandre de Sousa, 1976- 30 July 2008 (has links)
Orientador: Orlando Petrucci Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T04:53:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vilarinho_KarlosAlexandredeSousa_D.pdf: 8722911 bytes, checksum: 025ab56f3339aaf3caf0958e795ae882 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As lesões de isquemia e reperfusão miocárdica continuam sendo um desafio ao cirurgião cardíaco. A eritropoietina tem demonstrado efeito protetor contra lesões por isquemia e/ou reperfusão em corações adultos. Seu papel em corações neonatais ainda não foi esclarecido. Objetivo: avaliar o uso da eritropoietina em corações neonatais submetidos a isquemia e reperfusão. Material e métodos: suínos neonatos foram divididos em grupos de acordo com o momento da administração da eritropoietina (EPO- administrada três minutos antes da isquemia; EPO24- administrada 24 horas antes da isquemia; Controlenão recebeu eritropoietina) e submetidos a 45 minutos de isquemia miocárdica por oclusão da art. interventricular anterior e 90 minutos de reperfusão e avaliados índices de contratilidade derivados de curvas de volume vs. pressão obtidas por meio de cristais sonomicrométricos e pressão intraventricular. As vias da Akt e ERK ½ foram avaliados por western blot. Resultados: os grupos foram semelhantes na avaliação antes da isquemia. Não observamos diferenças entre os grupos em relação a frequência cardíaca, débito cardíaco e volume sistólico do ventrículo esquerdo. Observamos melhora da elastância máxima no grupo EPO aos 60 e 90 minutos de reperfusão, e melhora do trabalho sistólico prérecrutável e da dP/dt máxima nos dois grupos que receberam eritropoietina ao final da isquemia e durante toda a reperfusão. Não houve diferença entre os grupos nos índices de função diastólica. A eritropoietina promoveu fosforilação da Akt, mas não da ERK, e menor expressão de proteínas pró-apoptóticas. Conclusão: A eritropoietina protegeu a função sistólica do ventrículo esquerdo de corações neonatais submetidos a isquemia e reperfusão. Este resultado foi provavelmente mediado por ativação da via Akt / Abstract: Background: The effect of erythropoietin (EPOT) on neonatal hearts is not well understood. The current hypothesis is that erythropoietin has protective effects against ischemia-reperfusion when administered prior to ischemia induction. Methods: Systolic and diastolic indices, as well as the Akt and extracellular regulated kinase (ERK) signaling pathways, were studied in vivo using a neonatal pig heart model. Regional ischemia was induced for 45 min by ligation of the left anterior descending artery, followed by 90 min of reperfusion. The treatment groups consisted of: 1) untreated controls, 2) treatment with erythropoietin 3 min prior to ischemia, and 3) treatment with erythropoietin 24 h before ischemia. Sophisticated myocardial contractility indices were assessed by pressure/volume loops of the left ventricle. The Akt and ERK pathways were evaluated via western blot. Results: Elastance was found to be higher in the group receiving erythropoietin 3 min prior to ischemia. In addition, preload recruitable stroke work was higher for both groups receiving erythropoietin prior to ischemia when compared to controls. The time constant of the isovolumic relaxation and end diastolic pressure volume relationship did not differ between the three groups after 90 min of reperfusion. Furthermore, erythropoietin treatment enhanced phosphorylation of Akt, but not ERK, and erythropoietin treated animals showed lower levels of apoptosis-related proteins. Conclusions: Erythropoietin had a protective effect on neonatal systolic function after ischemia/reperfusion injury, but no effect on diastolic function. This cardioprotective effect might be mediated by activation of the Akt pathway / Doutorado / Fisiopatologia Cirúrgica / Doutor em Ciências
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Avaliação do sistema de mobilização de poli-3-hidroxibutirato em Burkholderia sacchari. / Evaluation of poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) mobilization system in Burkholderia sacchari.

Nuri Andrea Merchan Castellanos 19 October 2010 (has links)
O sistema de mobilização intracelular de poli-3-hidroxibutirato (P3HB) em Burkholderia sacchari foi analisado. A busca em genomas de Burkholderia spp. identificou duas oligômero hidrolases (PhaY1 e PhaY2) e pelo menos três P3HB despolimerases intracelulares (PhaZa1, PhaZa2 e PhaZd1). Mutantes de B. sacchari afetados na mobilização de P3HB e complementados com genes de Ralstonia eutropha apresentaram um aumento expressivo nas taxas de mobilização de P3HB, especialmente quando o gene phaZa1 foi superexpresso. A superexpressão dos genes phaZa2 ou phaZa3 também conduziu a aumentos nas taxas de mobilização embora em um grau menor que os valores obtidos com phaZa1. Dois mutantes afetados na mobilização de P3HB foram obtidos utilizando o transposon mini-Tn5 (NAM03 e NAM04). NAM03 apresentou interrupção em gene que codifica uma P3HB despolimerase intracelular (PhaZa1). NAM04 apresentou interrupção em gene anotado como serino peptidase LonA. Este pode representar um ativador da mobilização ou uma nova P3HB despolimerase intracelular. / The intracellular poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) mobilization system in Burkholderia sacchari was analyzed. A search in Burkholderia spp. genomes identified two oligomer hydrolases (PhaY1 and PhaY2) and at least three intracellular P3HB depolymerase (PhaZa1, PhaZa2 e PhaZd1). B. sacchari mutants affected on P3HB mobilization and complemented by Ralstonia eutropha genes showed an expressive increase on P3HB mobilization rates, especially when phaZa1 was overexpressed. The overexpression of phaZa2 or phaZa3 also increased the mobilization rates though to a lesser extent than phaZa1. Two mutants affected on P3HB mobilization were obtained using the transposon mini-Tn5 (NAM03 and NAM04) .NAM03 was disrupted in a gene encoding an intracellular P3HB depolymerase (PhaZa1). NAM04 was disrupted in a gene annotated as a serine peptidase LonA. This could be a mobilization activator or a new intracellular P3HB depolymerase.
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Efeito da glicose sobre os mecanismos de extrusão de prótons em células MDCK. / Effect of glucose on mechanisms of proton extrusion in MDCK cells.

Damasceno, Rosélia dos Santos 14 June 2010 (has links)
Este estudo investigou o efeito da glicose sobre a atividade e expressão da isoforma 1 do trocador Na+/H+ (NHE1) e da H+-ATPase do tipo vacuolar, em células MDCK (Mardin Darby Canine Kidney), linhagem derivada de rim de cão, que apresenta características similares às células principais e intercalares das porções distais do néfron. Por microscopia de fluorescência, se avaliou a velocidade de recuperação do pHi (dpHi/dt) e a capacidade tamponante (<font face=\"symbol\">bi). A partir desses parâmetros, se calculou o efluxo de H+ (JH+). Por Western blot, se avaliou a expressão de NHE1 e da subunidade E da H+-ATPase do tipo vacuolar. Resultados: Na condição controle o efluxo de H+ foi de 6.27 ± 0.51 mM/min (n = 9). O tratamento agudo com glicose (25 mM) aumentou o efluxo de H+ via NHE1, o qual foi modulado pela PI3 cinase. Na mesma condição, não se observou alterações na atividade da H+-ATPase. O tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu significante aumento do efluxo de H+, via NHE1 e H+-ATPase. O efeito estimulador da glicose sobre a atividade de NHE1 e H+-ATPase foi dependente da atividade da p38 MAP cinase. Além disso, o tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu fosforilação do sistema ezrin/radixin/moesin (ERM) e Akt. Conclusões: Nossos resultados indicam que no tratamento agudo com glicose (25 mM), o NHE1 foi modulado pela PI3 cinase. Contudo, no tratamento crônico com glicose (25 mM), a atividade do NHE1 foi modulada pelo sistema ERM/Akt e a atividade da H+-ATPase foi modulada pela p38 MAP cinase. / This study investigated the effect of glucose on the activity and expression of Na+/H+ exchanger isoform 1 (NHE1) and vacuolar H+-ATPase, in Mardin Darby Canine Kidney (MDCK) cells from dog kidney, with similar characteristics to principal and intercalated cells of the distal nephron. The pHi recovery rate (dpHi/dt) and the buffering capacity (<font face=\"symbol\">bi) was evaluated through fluorescence microscopy. From these parameters the H+ efflux (JH+) was calculated. By Western blot, the NHE1 and H+-ATPase (E subunit) expression was evaluated. Results: In the control situation the H+ efflux was 6.27 ± 0.51 mM/pH units (n = 9). Acute treatment with glucose (25 mM) increased the H+ efflux via NHE1, which was modulated by PI3 kinase. In the same condition, the H+-ATPase activity did not change. Chronic treatment with glucose (25 mM) induced significant increase in H+ efflux via NHE1 and H+-ATPase. The stimulatory effect of glucose on the NHE1 and H+-ATPase activity was dependent on p38 MAP kinase activity. Furthermore, chronic treatment with glucose (25 mM) induced Ezrin/radixin/moesin (ERM) and Akt phosphorylation. Conclusions: Our results indicate that during the acute treatment with glucose (25 mM), the NHE1 is modulated by PI3 kinase. However, during chronic treatment with glucose (25 mM), NHE1 activity was modulated by the ERM/Akt system and of H+-ATPase activity was modulated by p38 MAP Kinase.
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Avaliação da resposta imune após estimulação de monócitos via Toll-Like Receptor 2 (TLR-2) em recém-nascidos a termo e pré-termo / Evaluation of the immune response after stimulation of monocytes via Toll-Like Receptor 2 (TLR-2) in preterm and term newborns

Faria, Camila Cristina Quinello Gomes de 26 September 2013 (has links)
O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis
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Arrranjos supramoleculares de lípide catiônico, antibióticos e polímeros: preparação, caracterização e atividade contra bactérias multirresistentes e micobactérias de crescimento rápido / Supramolecular assemblies of cationic lipid, antibiotics and polymers: preparation, characterization and activity against multidrug resistant bacteria and fast growing mycobacteria.

Carrasco, Letícia Dias de Melo 08 July 2016 (has links)
Arranjos supramoleculares combinando o lípide catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DOD) com polímeros, como carboximetilcelulose (CMC) e cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA), foram preparados na forma de nanopartículas (NPs), na ausência ou presença de antimicrobiano tradicional, como a claritromicina (CLA). NPs preparadas por atração eletrostática entre os fragmentos de bicamada (BF) de DOD, CMC e PDDA foram avaliadas, in vitro, quanto à atividade contra isolados clínicos de micro-organismos multirresistentes (MR) a antimicrobianos, como Pseudomonas aeruginosa MR, Klebsiella pneumoniae produtora da enzima carbapenemase do tipo KPC, Staphylococcus aureus resistente à meticilina/oxacilina (MRSA) e Candida albicans resistente ao fluconazol, através do método de plaqueamento e contagem de viáveis. As NPs de DOD BF/CMC/PDDA apresentam alta atividade de amplo espectro contra micro-organismos MR, em que o PDDA é o componente responsável pela excelente atividade biocida das NPs. O mecanismo de ação antimicrobiana indica a dissociação dessas NPs na presença dos micro-organismos, com a remoção de biopolímeros da parede celular microbiana pelo PDDA, conforme visualizado por microscopia eletrônica de varredura, ocorrendo lise da membrana microbiana e liberação de compostos fosforilados para o meio extracelular. Também foram desenvolvidas neste trabalho NPs carreadoras de CLA à base de DOD e polímeros. Solução etanólica contendo CLA/DOD foi injetada em solução aquosa de CMC, formando arranjos coloidalmente estáveis e aniônicos, que posteriormente foram adicionados de solução de PDDA, para a obtenção de arranjos estáveis e catiônicos. CLA/DOD/CMC e CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporaram CLA em quantidade suficiente para inibir o crescimento de M. abscessus no interior de macrófagos bem como evitar a formação de biofilmes, sendo que altas doses de CLA foram tóxicas aos macrófagos, enquanto doses menores apresentaram baixa toxicidade e boa atividade antimicrobiana. NPs catiônicas carreando CLA foram tóxicas aos macrófagos nas concentrações de PDDA testadas. A natureza particulada das CLA NPs possivelmente aumenta a retenção intracelular de CLA em comparação com CLA livre, podendo prolongar atividade da CLA contra patógenos intracelulares. Desta maneira, arranjos supramoleculares combinando lípide e polímeros, com ou sem antimicrobianos tradicionais poderão encontrar diversas aplicações nas áreas farmacêutica, médica, alimentícia e biotecnológica. / Supramolecular assemblies combining cationic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DOD) and polymers, such as sodium carboxymethylcellulose (CMC) and poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDDA), were prepared as nanoparticles (NPs), in the absence or presence of traditional antibiotic, such as clarithromycin (CLA). NPs prepared by electrostatic attraction between DOD bilayer fragments (BF), CMC and PDDA were evaluated against clinical strains of multidrug resistant (MDR) microorganisms, such as Pseudomonas aeruginosa MDR, Klebsiella pneumoniae producer of KPC carbapenemase enzyme, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Candida albicans fluconazole resistant, by plating and colony forming unities counting. DOD BF/CMC/PDDA NPs display high and broad-spectrum activity against MDR microrganisms, and PDDA is the excellent biocidal component in the NPs. The mechanism of antimicrobial action shows that NPs disassembly in the presence of microrganisms, with biopolymers withdrawn from the cell wall, as observed by scanning electron microscopy, consecutively lysing bacterial membrane as determined from the leakage of inner phosphorylated compounds. In this work there have also been developed NPs, based on lipid and polymers, as carriers for CLA. Ethanolic solution co-solubilizing CLA/DOD was injected in CMC aqueous solution, yielding colloidaly stable and anionic NPs, that were further added of PDDA solution, yielding stable and cationic NPs. CLA/DOD/CMC NPs and CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporated CLA at doses high enough to inhibit M. abscessus growth inside macrophages or in biofilms. Larger CLA doses were toxic to macrophages while lower CLA doses reduced toxicity to macrophages despite their high antimicrobial activity. Cationic CLA NPs exhibited substantial toxicity against macrophages at the PDDA concentrations tested. The particulate nature of these CLA NPs possibly increases intracellular CLA retention in comparison to free CLA, probably extending CLA activity against intracellular pathogens. In conclusion, supramolecular assemblies combining cationic lipid and polymers, with or without traditional antibiotics, may find multiple possibilities of applications at pharmaceutical, medical, food and biotecnological fields.
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Avaliação da resposta imune após estimulação de monócitos via Toll-Like Receptor 2 (TLR-2) em recém-nascidos a termo e pré-termo / Evaluation of the immune response after stimulation of monocytes via Toll-Like Receptor 2 (TLR-2) in preterm and term newborns

Camila Cristina Quinello Gomes de Faria 26 September 2013 (has links)
O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis

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