BEZERRA, Maria Júlia Barbosa. Resolução da estrutura tridimensional da lectina de Dioclea violacea Mart para estudo da relação estrutura-função. 2011. 71 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-29T12:46:55Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:12:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:12:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) Previous issue date: 2011 / Lectins from subtribe Diocleinae belong to the family from Leguminosae and are characterized by high homology among their amino acid sequences. Despite this high structural similarity the same is not true in the biological activities from this lectin family. Studies show that the modification of a few amino acids can cause large changes in biological activities of these lectins. Thus more detailed understanding of three dimensional structures of these proteins is essential for structure/function analyses. The Dioclea violacea lectin was purified by affinity chromatography on a column of Sephadex G-50. The protein was crystallized in the presence of the ligand X-Man and the crystals were obtained by the vapor diffusion method in hanging drop by sparse matrix. Crystallization kits “Crystal Screen I and II” from Hampton Research were used to obtain protein crystals and the better condition was 33 from kit I4 M sodium formate. The crystal was diffracted to 2.61Å with space group I222 with unit cell dimensions a = 61.34; b = 66.11; c = 106.69Å and α = β = γ = 90º. It was observed the presence of a monomer in asymmetric unit containing 42.04% of solvent in the crystal. The molecular replacement was made using Dioclea rostrata structure (PDB: 2ZBJ). The final refinement obtained Rfactorof 0.23 and Rfree of 0.27 in absence of any amino acid in regions not allowable in Ramachandran plot. The structure of X-Man was co-crystallized and observed perfectly placed in the carbohydrate recognition domain. Regarding the balance of the dimmer-tetramer associations of plant lectins, the lectin from Dioclea violacea has the amino acid HIS 131 and the position of HIS 51 is similar to the same amino acid in Dioclea grandiflora lectin, characterizing these lectins as a tetramer even at low pH. It was made comparisons between the differences in biological activities of other lectins from Diocleainae and the distances of the residues from carbohydrate site. It was observed that differences in biological activities in vasorelaxant effects on vascular smooth muscle are probably related to the distances between the residues that compose the carbohydrate domain. / As lectinas da subtribo Diocleinae pertencem à família de Leguminosas e são caracterizadas pela alta homologia entre suas sequências de aminoácidos. Apesar da alta similaridade estrutural o mesmo não acontece nas atividades biológicas das lectinas dessa família. Estudos mostram que a modificação de poucos aminoácidos em suas sequências é capaz de provocar grandes alterações nas atividades biológicas dessas lectinas, dessa forma o entendimento mais detalhado das estruturas tridimensionais dessas proteínas é essencial para a análise da relação entre estrutura e função. A lectina de Dioclea violacea foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50. A proteína foi cristalizada na presença do ligante X-Man e os cristais foram obtidos pelo método de difusão de vapor em matriz esparsa por gota suspensa. Foram utilizando os kit “cristal screen” I e II da Hampton Research e a condição que obteve melhor cristal foi a condição 33 do kit I composta por 4M Formato de sódio. O cristal foi difratado a 2,61Å e apresenta grupo espacial I222 com cela unitária com dimensões de a = 61,34, b = 66,11, c = 106,69Å e ângulos de α = β = γ = 90º. Foi observada a presença de um monômero na unidade assimétrica contendo 42,04% de solvente no cristal. A substituição molecular foi feita utilizando a estrutura da lectina de Dioclea rostrata (PDB: 2ZBJ). O refinamento final obteve Rfactor de 0,23 e Rfree de 0,27 com ausência aminoácidos em regiões não permitidas do gráfico de Ramachandran. O ligante X-Man foi co-cristalizado e sua estrutura foi observada perfeitamente encaixada no domínio de reconhecimento a carboidratos. Em relação ao equilíbrio dímero tetrâmero, a lectina de Dioclea violacea apresenta o aminoácido HIS 131 e a posição da HIS 51 é semelhante ao mesmo aminoácido da Dioclea grandiflora, caracterizando esta lectina como tetrâmero mesmo em pH baixo. Foram feitas comparações entre as atividades biológicas de outras lectinas do gênero Dioclea e as distâncias entre os resíduos do sítio de ligação a carboidrato. Essa analise mostrou que a variação nessas distâncias influi no efeito e eficácia da atividade vasorelaxante em aorta de ratos.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T17:05:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JorgeGomesGoulartFerreira.pdf: 1660507 bytes, checksum: f8f7845b0fe11483b4ccf916a903b743 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T17:05:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JorgeGomesGoulartFerreira.pdf: 1660507 bytes, checksum: f8f7845b0fe11483b4ccf916a903b743 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T17:05:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JorgeGomesGoulartFerreira.pdf: 1660507 bytes, checksum: f8f7845b0fe11483b4ccf916a903b743 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-18T17:05:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JorgeGomesGoulartFerreira.pdf: 1660507 bytes, checksum: f8f7845b0fe11483b4ccf916a903b743 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / A família Bunyaviridae consiste em uma das maiores e mais diversificadas famílias de vírus de RNA, contendo cerca de 350 vírus sorologicamente distintos. O Apeu virus (APEUV) é um vírus da família Bunyaviridae que se destaca por seu grande potencial emergente. Isolado pela primeira no Brasil, este vírus pode causar uma doença que apresenta sintomas semelhantes aos da gripe, como febre alta, dor de cabeça e mialgia, associadas geralmente a náuseas, vômitos, fraqueza e fotofobia. Entretanto, apesar de seu potencial patogênico, pouco se sabe sobre a sua interação com o sistema imunológico humano. Com o objetivo de estudar alguns aspectos da resposta imune, principalmente a reposta inata desencadeada pela infecção do APEUV, a expressão de 19 genes (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MyD88, IRF3, IRF5, IRF7, IRF9, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TICAM1, JUN, ROBO-3(RIG-1), IFIH1(MDA-5), IFNα, IFNβ, IFNy) foi analisada. Para tal, foram feitos ensaios de qPCR baseados na metodologia TaqMan®, utilizando cDNA obtido a partir de RNA total extraído de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e de células A549 (linhagem derivada de carcinoma pulmonar humano), infectadas ou não com APEUV por períodos de 4 ou 8 horas. Como controles, foram utilizadas células infectadas com o vírus da estomatite vesicular (VSV) como controle positivo de uma infecção por vírus de RNA fita simples, e células tratadas com o mock das amostras de vírus como controle negativo. Os dados obtidos foram analisados em software específico. Nossos resultados indicam que PBMC infectadas com APEUV por 4 horas (m.o.i.=1 e m.o.i.=3) induzem um aumento na expressão de TLR9 e IFNβ. Quando quantificada a expressão de genes em células A549 infectadas com APEUV (m.o.i.=1 por 4 horas) comparadas com o mock, verificou-se um aumento da expressão dos genes TLR9, IRF3 e IRF7 e no período de 8 horas, também comparando com o mock, verificou-se aumento de forma significativa na expressão de TLR 9, além de um aumento na expressão de TLR3, TLR7, TRAF3 , IRF7 e IFNβ. Verificamos ainda que, após escolher um gene housekeeping através de método estatístico, células A549 infectadas com APEUV em uma m.o.i.=1, tende a aumentar a expressão dos genes IFNβ eTICAM-I, fundamentais na indução de um estado celular antiviral. Estudos posteriores são necessários para a determinação dos mecanismos envolvidos na resposta imune inata humana contra o Apeu virus / The Bunyaviridae family consists of the largest and most diverse families of RNA viruses, containing about 350 serologically distinct viruses. The Apeu virus (APEUV) is a member of the Bunyaviridae family that stands out for its large emerging potential. First isolated in Brazil, this virus can cause a flu-like disease with symptoms such as fever, headache and myalgia, usually associated with nausea, vomiting, weakness and photophobia. However, despite their pathogenic potential, little is known about their interaction with the human immune system. In order to study some aspects of the immune response, especially the innate response triggered by APEUV infection, the expression of 19 genes (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MyD88, IRF3, IRF5, IRF7, IRF9, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TICAM1, JUN, robot-3 (RIG-1) IFIH1 (MDA-5), IFNα, IFNβ, IFNy) was analyzed. For that, qPCR assays were performed based on the TaqMan method using cDNA obtained from mRNA extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and A549 cells (cell line derived from human lung carcinoma) infected or not by APEUV for 4 or 8 hours. Cells infected with vesicular stomatitis virus (VSV) were used as a positive control of infection with single stranded RNA viruses; also mock infected cells were used as controls. The data were analyzed using specific software. Our results suggested that APEUV infection on PBMC induce an increase of TLR9 and IFNβ expression on both situations with m.o.i=1 or m.o.i=3. On the A549 cell line, APEUV infection increased the expression of TLR9, TLR3, TLR7, TRAF3, IRF7 and IFNβ using m.o.i=1 and 4h infection condition, compared to mock control. After using a statistical methodology to choose a housekeeping gene, we verified that APEUV infection with m.o.i=1, increase the expression of IFNβ and IRF9 in A549 cells. A cell antiviral state is induced by the presence of IFNβ and IRF9. Further studies are needed to determine the mechanisms involved in human innate immune response against APEUV.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:01:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dantas_LarissaElizabethCordeiro_M.pdf: 38127772 bytes, checksum: f284c501fcf1d07b55c32c7da40e08c1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A sinalização celular é o mecanismo que as células possuem para se comunicar com suas vizinhas, tecidos distantes ou mesmo em processos internos. Portanto, entender como a sinalização está organizada em uma célula sadia é de extrema importância para o entendimento de processos vitais normais. Desta forma, ter suporte para avaliar as bases moleculares das doenças, uma vez que muitas delas originam-se de disfunções na transmissão de sinais celulares. A proteína SIVA1, superexpressa em neoplasias de células do sangue, interage com a proteína p53, com membros da superfamília dos receptores de necrose tumoral, estatimina, dentre outros. Estas proteínas estão relacionadas com diversas vias de sinalização em câncer e, portanto, SIVA1 faz-se um forte candidato para estudos de desenho racional de novos fármacos. O objetivo deste estudo foi caracterizar as propriedades biofísicas do domínio C-terminal de SIVA1 a fim de contribuir futuramente com o descobrimento de novos alvos para drogas alvo-dirigidas. O domínio C-Terminal (resíduos de 84 a 175), fusionados à Glutationa-S-Transferase (GST) e expressos em um sistema de expressão heteróloga de E.coli, produziu um recombinante GST-SIVA-C-Terminal, que foi em seguida purificado por colunas de afinidade a proteínas fusionada à GST (GSH sefarose) e por filtração em fel. A capacidade biológica de ligar-se a outras proteínas, das famílias supramencionadas, foi testada em extrato de células da linhagem Jurkat. Ensaios bioquímicos e biofísicos mostraram que a proteína apresentava-se monodispersa em solução com um formato predominante não enovelado e alongado. No entanto, em altas concentrações, a proteína apresenta tendência de formar agregados solúveis. Espera-se que estes resultados possam levar a um melhor entendimento das propriedades de SIVA1, possibilitando o desenho de compostos químicos alvo-específicos. As coletas de dados para o estudo foram feitas no Laboratório de Bioquímica de Proteínas do Instituto de Química (IQ-Unicamp), no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) e no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio-LEC) / Abstract: Siva1 protein interacts with tumor protein p53 and with the member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, stathmin, among others. These proteins are related to several pathways involved in cancer and are therefore, strong targets for drug design. Thus, the aim of this study was to characterize the biophysical properties of Siva 1 C-terminal domain in order to contribute to the discovery of new target directed drugs. The C-terminus Siva1 domain (residues 84-175) was fused to gluthatione S-transferase (GST) and expressed in an E coli system and the recombinant GST-Siva C-terminus was purified using GST-Tagged Protein affinity and gel filtration chromatography. We tested the biological activity of the purified Siva C-terminus domain in an extract of the Jurkat cell line that contained natural SIVA binders. Biophysical and biochemical assays showed that the protein was monodisperse in solution with a predominant unfolded and elongated shape. However, at high concentrations, the protein showed a tendency to form soluble aggregates. These results are expected to lead to further progress in better understanding of SIVA1 properties and target-directed drug design. Experiments took place at "Laboratório de Bioquímica de Proteínas" at Institute of Chemistry (IQ-Unicamp), "Laboratório Nacional de Luz Síncrotron" (LNLS) and "Laboratório Nacional de Biociências" (LNBio-LEC) / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-18T19:14:53Z No. of bitstreams: 1 paloma_m_mendonca_ioc_bp_0035_2010.pdf: 5136216 bytes, checksum: 96c991db74df0f84ca5c4542f83fd6f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-18T19:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paloma_m_mendonca_ioc_bp_0035_2010.pdf: 5136216 bytes, checksum: 96c991db74df0f84ca5c4542f83fd6f4 (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq E FAPERJ / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os dípteros muscóides são insetos com notável importância econômica e na entomologia médica e veterinária devido às diversas formas como eles podem estar relacionados ao homem, seja vetorando patógenos, causando miíases ou participando da degradação da matéria orgânica. A entomologia forense é uma ciência que estuda o papel dos insetos na decomposição de cadáveres e uma das principais aplicações destes nesta área é a estimativa do intervalo pós-morte, baseada no período mínimo de atividade dos insetos no corpo. No caso dos dípteros muscóides, que são os primeiros a chegar e podem ovipor logo após encontrar o cadáver, o conhecimento morfológico das fases imaturas desses insetos será mais uma ferramenta que auxiliará peritos e pesquisadores, pois em alguns casos, ovos e larvas são as únicas evidências presentes. A microscopia eletrônica de varredura é um instrumento que permite uma visualização mais detalhada dos caracteres morfológicos. Algumas espécies de muscóides destacam-se devido a sua preferência alimentar, pois buscam a matéria orgânica em decomposição para se alimentar, dentre elas podemos destacar os califorídeos Chrysomy albiceps, Chrysomya putoria e Chrysomya megacephala. Este trabalho teve como objetivo a identificação de ovos, larvas de primeiro, segundo e terceiro instar e pupários destas espécies de dípteros de grande importância forense e disseminadores de patógenos, através da utilização de microscopia eletrônica de varredura. Foram analisados 30 exemplares de cada estágio correspondente a cada espécie, provenientes de colônias de laboratório, estabelecidas a partir de adultos capturados no campus da Fundação Oswaldo Cruz, RJ. Ovos e larvas foram transferidos para placas de Petri contendo hidróxido de sódio e lavados com H 2O destilada. Depois foram fixados com solução de glutaraldeído em tampão cacodilato de sódio e pós-fixados em tetróxido de ósmio, desidratados em séries crescentes de acetona e submetidos ao método de secagem pelo ponto crítico usando CO2 em aparelho de Balzers, montados em suportes metálicos e cobertos por ouro, para permitir a visualização ao microscópio eletrônico de varredura. Pupas com 48 a 72 horas de formação foram lavadas, congeladas e depois montadas em suportes metálicos e cobertas por ouro para observação. Neste trabalho foi observado que a linha mediana termina arredondada na porção anterior dos ovos de C. putoria, enquanto nas outras duas espécies esta termina bifurcada. As ornamentações da micrópila são do tipo projeções nos ovos de C. megacephala e C. albiceps e do tipo depressões em C. putoria. O corpo da larva em todos os instares é muito semelhante entre as três espécies analisadas. No entanto, somente C. albiceps apresentou o tegumento recoberto por tubérculos organizados em fileiras ao longo do corpo da larva. No ápice dos tubérculos são encontrados espinhos que são característicos dessa espécie. Os pupários são formados a partir do endurecimento da cutícula da larva de terceiro instar, sendo assim, apresentaram estruturas muito semelhantes ao instar anterior. Este estudo permitiu destacar diversas características que podem ser utilizadas para identificar as espécies de importância sanitária e forense, além de fornecer subsídios para a elaboração de uma chave dicotômica específica para estes imaturos. / Muscoids diptera are insects with considerable economic importance and also in medical and veterinary entomology because of the way that they are related to man, as vectors of pathogens, causing myiasis or participating in organic matter degradation. Forensic entomology is a discipline that studies the role of insects in corpse’s decomposition and one of the most commom applications is to estimate postmortem interval by determining a minimum period of insect activity on a decomposing body. Flies are the first visitors to a dead body and are able to oviposit on carrion within a few hours after death. And the morphologic knowledge from imatures can be used as a tool in crime scene investigations because, sometimes, only eggs and larvae can be found in corpses. Scanning electron microscopy gives detailed information about morphologic characters. Some species of diptera are important because their larvae grow up at organic matter, such the blowflies Chrysomya albiceps, Chrysomya putoria and Chrysomya megacephala. The aim of this study was identify eggs, larvae of first, second and third instar and puparium of these species of flies of forensic importance and pathogens vectors, by using scanning electron microscopy. All the imatures examined in this study were obtained from culture set up from wild flies trapped at Fundação Oswaldo Cruz campus, Rio de Janeiro, RJ. Thirty samples from each species were observed. Eggs and larvae were transferred to a Petri dish with sodium hydroxid and then washed with destilated water. After it, imatures were fixed in glutaraldehyde in sodium cacodylate and postfixed in osmium tetroxide. They were dehydrated in a series of acetone for critical point drying, using CO 2 in Balzers apparatus. Specimens were adhered in metalic support and gold-coated for SEM examination. Pupae within 48 to 72 hours-age were washed, frozen and adhered in metalic support and gold- coated for SEM examination. Median area ends rounded anteriorly in C. putoria, whereas ended bifurcate in others species. Micropyle showed projections at C. megecephala and C. albiceps, but at C. putoria, micropyle was adorned by depressions. Larvae bodies were very similar among all the species analyzed. However, only C. albiceps body tegument was composed by tubercles organized in lines along larval body. At the apex of these tubercles some spines are only seen at this blowfly specie. The pupae are formed from the hardening of the cuticle of third instar larvae, thus, had structures very similar to the previous instar. This study helped to highlight many features that could be used to identify the species of sanitary and forensic importance, and provides subsidies for the development of a key to these specific immature.

O tratamento de indivíduos que apresentam leishmaniose, seja ela cutânea ou visceral, é usualmente problemático, uma vez que os medicamentos utilizados na prática clínica são altamente tóxicos, requerem administração parenteral e nem sempre promovem a cura dos pacientes. Torna-se clara, portanto, a necessidade de se pesquisar novos fármacos com potencial leishmanicida. O objetivo da presente Tese de Doutorado foi caracterizar a atividade do tamoxifeno, composto utilizado no tratamento do câncer de mama há décadas, contra diferentes espécies de Leishmania in vitro e in vivo, além de identificar seu possível mecanismo de ação. As concentrações inibitórias de tamoxifeno para 50% de culturas de parasitas tanto de cepas de laboratório como de isolados recentes de pacientes variaram de 5 a 20 mM. Além disso, nossos resultados mostraram que a aplicação intraperitoneal de 20 mg/kg/dia de citrato de tamoxifeno por duas semanas levou à redução significativa no tamanho das lesões e das úlceras na base da cauda de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis, bem como à diminuição da carga parasitária. Diferentes modelos de infecção animal comprovaram ainda a eficácia de tamoxifeno contra L. (L.) chagasi e L (V.) braziliensis. Apesar da atividade deste fármaco estar diretamente relacionada à inibição da ligação de estrógeno ao seu receptor, ele exibe efeitos moduladores da atividade de proteínas sinalizadoras em concentrações próximas às efetivas contra Leishmania. Primeiramente verificamos que tamoxifeno foi capaz de induzir rapidamente a alcalinização de vacúolos de macrófagos peritoniais contendo amastigotas de L. (L.) amazonensis, sendo este um efeito observado em períodos curtos e longos de incubação com a droga. Esta alcalinização parece não estar diretamente relacionada à morte dos parasitas pela alteração imediata das condições ideais do meio necessário à sobrevivência das formas amastigotas, mas sim ligada ao aumento do efeito leishmanicida de tamoxifeno, uma vez que este composto apresentou-se mais ativo na faixa de pH neutro a moderadamente alcalino. Outro alvo investigado foi a biossíntese de isoprenóides de promastigotas. Células tratadas com tamoxifeno apresentaram redução global na biossíntese de farnesol, geraniol, dolicol, ergosterol e ubiquinona após marcação metabólica com [14C]-leucina, indicando que tamoxifeno não interfere especificamente na síntese de cada um destes produtos. Iniciamos também a investigação dos efeitos do tamoxifeno no metabolismo de ceramidas em Leishmania adotando a estratégia de marcação metabólica de promastigotas com C6-NBD-ceramida. Verificamos que promastigotas de Leishmania são capazes de incorporar eficientemente ceramida conjugada ao fluoróforo NBD. Em nossos ensaios, a incubação de promastigotas tanto com os inibidores clássicos da via de biossíntese de esfingolipídios como com tamoxifeno resultou na alteração do perfil de incorporação dos precursores utilizados. O tratamento com tamoxifeno aumentou a biossíntese de glucosilceramida acetilada, elevou os níveis de ceramida acilada e diminuiu a biossíntese de fosfoesfingolipídios de promastigotas de L. (L.) amazonensis. Finalmente, nossos dados mostraram ainda que tamoxifeno permeabiliza a membrana plasmática de promastigotas de L. (L.) amazonensis e, a partir de estudos por microscopia eletrônica de transmissão, verificamos que este fármaco alterou a estrutura mitocondrial dos parasitas e provocou intensa vacuolização do citoplasma. Os resultados apresentados neste trabalho configuram o primeiro relato da atividade de tamoxifeno contra Leishmania e justificam a realização de futuros testes deste fármaco como uma alternativa na quimioterapia da leishmaniose. / The treatment of cutaneous and visceral leishmaniasis is challenging, since the drugs used are frequently ineffective, very toxic and require parenteral administration. Therefore, the discovery of new drugs with leishmanicidal activity is in pressing need. The objective of this thesis was to characterize the activity of tamoxifen, a drug used in the treatment of breast cancer for decades, against Leishmania spp. in vitro and in vivo, and to identify its possible mechanism of action. The inhibitory concentrations of tamoxifen for 50% of parasite cultures, from reference strains and recent isolates from patients, ranged from 5 to 20 mM. Moreover, we showed that the intraperitoneal administration of 20 mg/kg/day tamoxifen citrate for two weeks led to significant reductions in the lesion and ulcer sizes and parasite burden in L. (L.) amazonensis-infected BALB/c mice. Additionally, the administration of tamoxifen in two other models of animal infection proved its effectiveness against L. (L.) chagasi and L (V.) braziliensis. In an attempt to characterize tamoxifens mechanism of action against Leishmania, we found that this drug was able to induce a rapid alkalinization of macrophage vacuoles containing L. (L.) amazonensis amastigotes. This phenomenon does not appear to be related to the death of the parasites, but rather is linked to an increased antileishmanial effect of tamoxifen. Another target investigated was the interference of tamoxifen in the biosynthesis of isoprenoids. Treated cells showed an overall reduction in the biosynthesis of farnesol, geraniol, dolichol, ergosterol and ubiquinone after metabolic labeling with [14C]-leucine, indicating that tamoxifen does not interfere specifically in the synthesis of those products. We have also studied the effects of tamoxifen on Leishmania ceramide metabolism. The strategy adopted was the metabolic labeling of promastigotes with C6-NBD-ceramide. Our results showed that Leishmania is able to incorporate NBD-ceramide. The incubation of promastigotes with classical inhibitors of sphingolipid biosynthesis as well as with tamoxifen resulted in striking modifications in the pattern of sphingolipid biosynthesis. L. (L.) amazonensis promastigotes treated with tamoxifen showed increased biosynthesis of acetylated glucosylceramide and acyl-ceramide and decreased synthesis of phosphosphingolipids. Finally, our data showed that tamoxifen induced the permeabilization of the promastigote plasma membrane and, based on studies using transmission electron microscopy, we found that this drug altered the mitochondrial structure and caused intense cytoplasmic vacuolization. The results presented here comprise the first report of the activity of tamoxifen against Leishmania and offer support for future trials to evaluate tamoxifen as an alternative for leishmaniasis chemotherapy.

A própolis é uma substância resinosa coletada pelas abelhas de diversas partes das plantas, à qual têm sido atribuídas propriedades antimicrobiana, antioxidante, antinflamatória, antiviral, entre outras. Sua composição química depende de vários fatores, como a localização geográfica. Um novo tipo de própolis brasileira, denominada de própolis vermelha, por sua coloração intensa característica, foi identificada e coletada em região de mangue do Estado de Alagoas. O objetivo deste trabalho foi fracionar e isolar compostos com atividade antibacteriana dessa nova variedade de própolis. O extrato etanólico da própolis vermelha foi fracionado pela técnica de extração líquido-líquido, originando as frações hexânica (fr-Hex) e clorofórmica (fr-Clo). A fr-Clo apresentou alta atividade antibacteriana pelos testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM), contra as bactérias Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans e Actinomyces naeslundii. Dessa forma, a fr-Clo foi refracionada por coluna seca gerando sete sub-frações. Após a avaliação da atividade antibacteriana das sub-frações pelas técnicas de CIM e CBM, a sub-fração 3, a mais bioativa, foi purificada em coluna de Sephadex LH-20. Dessa purificação foram obtidas três sub-frações bioativas, as quais foram submetidas ao isolamento dos compostos pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) preparativa. Dois compostos foram isolados e denominados de composto 1 e composto 2. O composto 2 foi o mais potente para as atividades inibitória e bactericida e sua CIM para os três tipos de bactéria testados variou entre 15,6 e 31,2 µg/mL, enquanto para o composto 1, este parâmetro variou de 31,2 a 62,5 µg/mL. As CBM do composto 1 e do composto 2 variaram entre 125 e 250 µg/mL e entre 31,2 e 62,5 µg/mL, respectivamente. Por meio da técnica Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi possível identificar o composto 1 como pertencente à classe das isoflavanas e o composto 2 como uma chalcona (isoliquiritigenina). A forte atividade antibacteriana apresentada pelos compostos isolados da própolis vermelha torna este produto uma importante fonte de compostos antibacterianos naturais. / Propolis is a resinous material, collected by honeybees from several parts of plants, known for its antimicrobial, antioxidant, anti-inflammatory, antiviral properties, among others. Its composition varies according to several factors, such as the geographical location. A novel type of Brazilian propolis, named red propolis due to its intense characteristic color, was collected in a mangrove area in the State of Alagoas. This research aimed to fractionate and isolate the compounds in this new type of propolis that present antibacterial activity. The ethanolic extract of red propolis (EEP) was fractionated using the liquid-liquid extraction technique, yielding the hexanic (Hex-fr) and the chloroformic fractions (Chlo-fr). Chlo-fr showed high antibacterial activity determined by the minimal inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) tests against Staphylococcus aureus Streptococcus mutans, and Actinomyces naeslundii. Thus, Chlo-fr was refractionated by Dry-Column Chromatography, yielding seven subfractions. After submitted to MIC and MBC techniques to assess their antibacterial activity, and subfraction 3, the most bioactive of them, was purified in Sephadex LH-20 column. After this purification, three bioactive subfractions were obtained, submitted to isolation of compounds using preparative High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Two compounds were isolated and named compound 1 and compound 2. Compound 2 presented the highest inhibitory and bactericidal activities and its MIC for the three types of bacteria tested ranged from 15.6 to 31.2 µg/mL, whereas for compound 1, this parameter ranged from 31.2 to 62.5 µg/mL. MBC of compound 1 and compound 2 ranged from 125 to 250 µg/mL and from 31.2 to 62.5 µg/mL, respectively. Through Nuclear Magnetic Resonance tecnique (NMR), it was possible to identify the compound 1 as belonging to class of isoflavans and the compound 2 as a chalcone (isoliquiritigenin). Due to the strong antibacterial activity presented by the compounds isolated from red propolis, it can be concluded that this product is an important source of natural antibacterial compounds.

Neste estudo, o extrato bruto obtido da cultura do fungo E. nigrum foi extraído com hexano (HEX), diclorometano (DCM) e acetato de etila (AE). Após fracionamento por HPLC, a atividade antifúngica das frações foi avaliada pelo ensaio de concentração inibitória mínima (CIM) contra Candida albicans (CA), Trychophyton rubrum (TR), Cryptococcus neoformans (CN) e Aspergillus fumigatus (AF). O extrato de AE não foi efetivo, e os extratos HEX e DCM inibiram os patógenos na faixa de 31,25 a 250 µg/mL. Das frações hexânicas, apenas HEX-F9 apresentou atividade antifúngica, com CIM entre 31,25 e 250 mg/mL, exceto sobre AF. As frações DCM-F3, F5, F6, F9 e F10 apresentaram atividade antifúngica com CIM de 31,25 a 500 mg/mL contra todos os patógenos testados. A fração DCM-F9 foi efetiva com CIM entre 62,5 e 250 mg/mL contra CA, TR e CN. As frações DCM-F9 e DCM-F11 estão em fase final de purificação para posterior caracterização físico-química. / The aim of this study was to purify the crude extract produced from E. nigrum and characterize antifungal isolated molecules. E. nigrum was cultivated and the culture supernatant extracted with hexane (HEX), dichloromethane (DCM) and ethyl acetate (AE). Fractions were obtained by HPLC. The antifungal activity were evaluated by minimal inhibitory concentration (CIM) against C. albicans (CA), T. rubrum (TR), C. neoformans (CN) and A. fumigatus (AF). The HEX extract inhibited all pathogens with CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL while DCM from 62,5 to 250 mg/mL. From HEX fractions only HEX-F9 showed antigungal activity with CIM from 31,25 to 250 mg/mL, except AF. The DCM-F3, F5, F6, F9 and F10 fractions showed antifungal activity, mainly DCM-F6 (CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL against all pathogens) and DCM-F9 (CIM from 62,5 to 250 mg/mL against CA, TR and CN). DCM-F6 was not produced anymore by the fungus in subsequent cultures. DCM-F9 LC/MS, CG/MS and RMN results suggested impure fraction, making difficult to determine the main compound. New approaches are being considered.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T12:25:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T12:38:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:38:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / O crescente surgimento de resistência bacteriana aos antibióticos convencionais é um grave problema que precisa ser enfrentado, seja pela descoberta de novas substâncias antimicrobianas, naturais ou sintéticas, ou através da pesquisa de terapias alternativas que sejam economicamente acessíveis. A terapia de fagos é uma dessas alternativas. Trata-se de uma forma de controle biológico, baseado em vírus específicos que infectam e destroem células bacterianas: os bacteriófagos. No entanto, esta é uma fonte terapêutica ainda pouco explorada. Esse trabalho utilizou o cultivo, isolamento e sequenciamento do genoma, além de técnicas de genômica de alto desempenho para isolar e caracterizar o genoma de bacteriófagos específicos para a linhagem enteroinvasiva de Escherichia coli ATCC 43893, visando o entendimento e a definição do ciclo de infecção desses vírus (líticos ou lisogênicos). A metodologia utilizada nessa pesquisa possibilitou o isolamento de 12 vírus. 8 diferentes linhagens virais tiveram seu material genético extraído e purificado, apresentando bom rendimento e quantidade reduzida de DNA bacteriano contaminante. O sequenciamento do genoma desses 8 vírus foi realizado usando a plataforma de nova geração MiSeq. Foi analisada a diversidade genética desses bacteriófagos e verificou-se que são vírus da ordem Caudovirales, sendo 2 da família Siphoviridae e 6 da família Myoviridae. Apenas um deles mostrou potencial de ter ciclo lisogênico, os outros sete vírus não continham nenhum gene que sugerisse isso. Entretanto, apesar dos bacteriófagos isolados não terem apresentado genes relacionados ao ciclo lisogênico, análises mais aprofundadas devem ser realizadas para comprovar que são realmente exclusivamente líticos, já que muitos não apresentam seu genoma completo e mais de 50% dos genes anotados não têm função definida. / serious problem that needs to be faced, either through the discovery of new antimicrobial substances, natural or synthetic, or by searching for alternative therapies that are affordable. The phage therapy is one of those alternatives. It is a form of biological control based on specific viruses that infect and kill bacterial cells: the bacteriophages. However, this therapeutic source is still poorly explored. This study used the cultivation, isolation and sequencing of the genome, as well as high-performance genomic techniques to isolate and characterize the genome of specific bacteriophages for enteroinvasive Escherichia coli ATCC 43893, for the understanding and the definition of the infection cycle (lytic or lysogenic) of these viruses. The methodology used in this study allowed the isolation of 12 viruses. 8 different viral strains had their genetic material extracted and purified, with good yield and reduced amount of contaminating bacterial DNA. The sequencing of the genome of these 8 viruses was conducted using the new generation MiSeq platform. The the genetical diversity of these bacteriophages was analyzed and it was found that the viruses belong to the Caudovirales order, which 2 belong to the Siphoviridae family and 6 to the Myoviridae family. Only one of them showed the potential to have lysogenic cycle, the other seven viruses contained no gene to suggest that. However, despite the isolated bacteriophages have not presented genes related to lysogenic cycle, further analysis should be conducted to demonstrate that they are really exclusively lytic, since many do not have their genome completed and more than 50% of the annotated genes have no defined function.

O tratamento de indivíduos que apresentam leishmaniose, seja ela cutânea ou visceral, é usualmente problemático, uma vez que os medicamentos utilizados na prática clínica são altamente tóxicos, requerem administração parenteral e nem sempre promovem a cura dos pacientes. Torna-se clara, portanto, a necessidade de se pesquisar novos fármacos com potencial leishmanicida. O objetivo da presente Tese de Doutorado foi caracterizar a atividade do tamoxifeno, composto utilizado no tratamento do câncer de mama há décadas, contra diferentes espécies de Leishmania in vitro e in vivo, além de identificar seu possível mecanismo de ação. As concentrações inibitórias de tamoxifeno para 50% de culturas de parasitas tanto de cepas de laboratório como de isolados recentes de pacientes variaram de 5 a 20 mM. Além disso, nossos resultados mostraram que a aplicação intraperitoneal de 20 mg/kg/dia de citrato de tamoxifeno por duas semanas levou à redução significativa no tamanho das lesões e das úlceras na base da cauda de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis, bem como à diminuição da carga parasitária. Diferentes modelos de infecção animal comprovaram ainda a eficácia de tamoxifeno contra L. (L.) chagasi e L (V.) braziliensis. Apesar da atividade deste fármaco estar diretamente relacionada à inibição da ligação de estrógeno ao seu receptor, ele exibe efeitos moduladores da atividade de proteínas sinalizadoras em concentrações próximas às efetivas contra Leishmania. Primeiramente verificamos que tamoxifeno foi capaz de induzir rapidamente a alcalinização de vacúolos de macrófagos peritoniais contendo amastigotas de L. (L.) amazonensis, sendo este um efeito observado em períodos curtos e longos de incubação com a droga. Esta alcalinização parece não estar diretamente relacionada à morte dos parasitas pela alteração imediata das condições ideais do meio necessário à sobrevivência das formas amastigotas, mas sim ligada ao aumento do efeito leishmanicida de tamoxifeno, uma vez que este composto apresentou-se mais ativo na faixa de pH neutro a moderadamente alcalino. Outro alvo investigado foi a biossíntese de isoprenóides de promastigotas. Células tratadas com tamoxifeno apresentaram redução global na biossíntese de farnesol, geraniol, dolicol, ergosterol e ubiquinona após marcação metabólica com [14C]-leucina, indicando que tamoxifeno não interfere especificamente na síntese de cada um destes produtos. Iniciamos também a investigação dos efeitos do tamoxifeno no metabolismo de ceramidas em Leishmania adotando a estratégia de marcação metabólica de promastigotas com C6-NBD-ceramida. Verificamos que promastigotas de Leishmania são capazes de incorporar eficientemente ceramida conjugada ao fluoróforo NBD. Em nossos ensaios, a incubação de promastigotas tanto com os inibidores clássicos da via de biossíntese de esfingolipídios como com tamoxifeno resultou na alteração do perfil de incorporação dos precursores utilizados. O tratamento com tamoxifeno aumentou a biossíntese de glucosilceramida acetilada, elevou os níveis de ceramida acilada e diminuiu a biossíntese de fosfoesfingolipídios de promastigotas de L. (L.) amazonensis. Finalmente, nossos dados mostraram ainda que tamoxifeno permeabiliza a membrana plasmática de promastigotas de L. (L.) amazonensis e, a partir de estudos por microscopia eletrônica de transmissão, verificamos que este fármaco alterou a estrutura mitocondrial dos parasitas e provocou intensa vacuolização do citoplasma. Os resultados apresentados neste trabalho configuram o primeiro relato da atividade de tamoxifeno contra Leishmania e justificam a realização de futuros testes deste fármaco como uma alternativa na quimioterapia da leishmaniose. / The treatment of cutaneous and visceral leishmaniasis is challenging, since the drugs used are frequently ineffective, very toxic and require parenteral administration. Therefore, the discovery of new drugs with leishmanicidal activity is in pressing need. The objective of this thesis was to characterize the activity of tamoxifen, a drug used in the treatment of breast cancer for decades, against Leishmania spp. in vitro and in vivo, and to identify its possible mechanism of action. The inhibitory concentrations of tamoxifen for 50% of parasite cultures, from reference strains and recent isolates from patients, ranged from 5 to 20 mM. Moreover, we showed that the intraperitoneal administration of 20 mg/kg/day tamoxifen citrate for two weeks led to significant reductions in the lesion and ulcer sizes and parasite burden in L. (L.) amazonensis-infected BALB/c mice. Additionally, the administration of tamoxifen in two other models of animal infection proved its effectiveness against L. (L.) chagasi and L (V.) braziliensis. In an attempt to characterize tamoxifens mechanism of action against Leishmania, we found that this drug was able to induce a rapid alkalinization of macrophage vacuoles containing L. (L.) amazonensis amastigotes. This phenomenon does not appear to be related to the death of the parasites, but rather is linked to an increased antileishmanial effect of tamoxifen. Another target investigated was the interference of tamoxifen in the biosynthesis of isoprenoids. Treated cells showed an overall reduction in the biosynthesis of farnesol, geraniol, dolichol, ergosterol and ubiquinone after metabolic labeling with [14C]-leucine, indicating that tamoxifen does not interfere specifically in the synthesis of those products. We have also studied the effects of tamoxifen on Leishmania ceramide metabolism. The strategy adopted was the metabolic labeling of promastigotes with C6-NBD-ceramide. Our results showed that Leishmania is able to incorporate NBD-ceramide. The incubation of promastigotes with classical inhibitors of sphingolipid biosynthesis as well as with tamoxifen resulted in striking modifications in the pattern of sphingolipid biosynthesis. L. (L.) amazonensis promastigotes treated with tamoxifen showed increased biosynthesis of acetylated glucosylceramide and acyl-ceramide and decreased synthesis of phosphosphingolipids. Finally, our data showed that tamoxifen induced the permeabilization of the promastigote plasma membrane and, based on studies using transmission electron microscopy, we found that this drug altered the mitochondrial structure and caused intense cytoplasmic vacuolization. The results presented here comprise the first report of the activity of tamoxifen against Leishmania and offer support for future trials to evaluate tamoxifen as an alternative for leishmaniasis chemotherapy.

A própolis é uma substância resinosa coletada pelas abelhas de diversas partes das plantas, à qual têm sido atribuídas propriedades antimicrobiana, antioxidante, antinflamatória, antiviral, entre outras. Sua composição química depende de vários fatores, como a localização geográfica. Um novo tipo de própolis brasileira, denominada de própolis vermelha, por sua coloração intensa característica, foi identificada e coletada em região de mangue do Estado de Alagoas. O objetivo deste trabalho foi fracionar e isolar compostos com atividade antibacteriana dessa nova variedade de própolis. O extrato etanólico da própolis vermelha foi fracionado pela técnica de extração líquido-líquido, originando as frações hexânica (fr-Hex) e clorofórmica (fr-Clo). A fr-Clo apresentou alta atividade antibacteriana pelos testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM), contra as bactérias Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans e Actinomyces naeslundii. Dessa forma, a fr-Clo foi refracionada por coluna seca gerando sete sub-frações. Após a avaliação da atividade antibacteriana das sub-frações pelas técnicas de CIM e CBM, a sub-fração 3, a mais bioativa, foi purificada em coluna de Sephadex LH-20. Dessa purificação foram obtidas três sub-frações bioativas, as quais foram submetidas ao isolamento dos compostos pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) preparativa. Dois compostos foram isolados e denominados de composto 1 e composto 2. O composto 2 foi o mais potente para as atividades inibitória e bactericida e sua CIM para os três tipos de bactéria testados variou entre 15,6 e 31,2 µg/mL, enquanto para o composto 1, este parâmetro variou de 31,2 a 62,5 µg/mL. As CBM do composto 1 e do composto 2 variaram entre 125 e 250 µg/mL e entre 31,2 e 62,5 µg/mL, respectivamente. Por meio da técnica Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi possível identificar o composto 1 como pertencente à classe das isoflavanas e o composto 2 como uma chalcona (isoliquiritigenina). A forte atividade antibacteriana apresentada pelos compostos isolados da própolis vermelha torna este produto uma importante fonte de compostos antibacterianos naturais. / Propolis is a resinous material, collected by honeybees from several parts of plants, known for its antimicrobial, antioxidant, anti-inflammatory, antiviral properties, among others. Its composition varies according to several factors, such as the geographical location. A novel type of Brazilian propolis, named red propolis due to its intense characteristic color, was collected in a mangrove area in the State of Alagoas. This research aimed to fractionate and isolate the compounds in this new type of propolis that present antibacterial activity. The ethanolic extract of red propolis (EEP) was fractionated using the liquid-liquid extraction technique, yielding the hexanic (Hex-fr) and the chloroformic fractions (Chlo-fr). Chlo-fr showed high antibacterial activity determined by the minimal inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) tests against Staphylococcus aureus Streptococcus mutans, and Actinomyces naeslundii. Thus, Chlo-fr was refractionated by Dry-Column Chromatography, yielding seven subfractions. After submitted to MIC and MBC techniques to assess their antibacterial activity, and subfraction 3, the most bioactive of them, was purified in Sephadex LH-20 column. After this purification, three bioactive subfractions were obtained, submitted to isolation of compounds using preparative High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Two compounds were isolated and named compound 1 and compound 2. Compound 2 presented the highest inhibitory and bactericidal activities and its MIC for the three types of bacteria tested ranged from 15.6 to 31.2 µg/mL, whereas for compound 1, this parameter ranged from 31.2 to 62.5 µg/mL. MBC of compound 1 and compound 2 ranged from 125 to 250 µg/mL and from 31.2 to 62.5 µg/mL, respectively. Through Nuclear Magnetic Resonance tecnique (NMR), it was possible to identify the compound 1 as belonging to class of isoflavans and the compound 2 as a chalcone (isoliquiritigenin). Due to the strong antibacterial activity presented by the compounds isolated from red propolis, it can be concluded that this product is an important source of natural antibacterial compounds.