Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2008. / Title from first page of PDF file (viewed on June 8, 2009). Includes bibliographical references.

Orientador: Carlos Amilcar Parada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T09:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_AndreSchwambach_D.pdf: 871138 bytes, checksum: fc1ecaa5a27015a5ae9ed72d9687b540 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A hiperalgesia inflamatória resulta da sensibilização de nociceptores aferentes periféricos induzida por mediadores inflamatórios. A prostaglandina E2 (PGE2) é uma das principais moléculas sinalizadoras envolvidas na hiperalgesia, sendo capaz de agir diretamente em nociceptores, induzindo mudanças nas propriedades de transdução sensorial destas células. A Janus Quinase 2 (JAK2) é uma molécula sinalizadora intracelular geralmente associada ao mecanismo de ação de citocinas, sendo que sua atividade pode ser induzida em nociceptores após uma inflamação periférica. Entretanto, não existem evidencias do envolvimento direto da JAK2 na sensibilização de nociceptores mediada pela PGE2. Assim o objetivo deste trabalho foi de explorar o possível papel da JAK2 na sensibilização mediada pela PGE2. Em neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) em cultura foi observado que a PGE2 altera o influxo de cálcio induzido pela capsaicina, e a pré-incubação das células com o inibidor seletivo da JAK2, AG490, foi capaz de bloquear este efeito. Adicionalmente, a administração intratecal de AG490 em ratos reduziu a hiperalgesia induzida pela administração subcutânea e local de PGE2 ou carragenina. A administração intratecal de AG490 também bloqueou a ativação da PKCepsilon induzida no DRG L5 ispsilateral após inflamação na pata. Em conclusão o presente trabalho demonstra que a JAK2 expressa no DRG pode possuir um papel na sensibilização de nociceptores induzida por um evento inflamatório periférico. Desta forma a inibição da JAK2 pode ser um novo alvo farmacológico para o controle da hiperalgesia inflamatória / Abstract: Inflammatory hyperalgesia results from the sensitization of peripheral afferent nociceptors by inflammatory mediators. Prostaglandin E2 (PGE2) is one of the major signaling molecules involved in hyperalgesia, being able to act directly on nociceptors, inducing sensitization. The Janus Kinase 2 (JAK2) is an intracellular signaling molecule generally associated with cytokines signaling pathway, and its activity can be increased in nociceptors after peripheral inflammation. However, there are no evidences about the role JAK2 directly plays in PGE2-induced sensitization of nociceptors. Therefore, the aim of the present study was to explore a possible role for JAK2 in PGE2 mediated sensitization. The data of this study showed in cultured dorsal root ganglion (DRG) neurons, that the administration of PGE2 alters capsaicin-induced calcium transients, and the pre-incubation of the cells with the JAK2 selective inhibitor AG490 blocks this effect. In addition, the intrathecal administration of AG490 in rats reduces the hyperalgesia induced by local administration of PGE2 or carrageenan in the hindpaw. AG490 intrathecal administration also blocks PKCepsilon activation in the ipsilateral L5 DRG induced by inflammation of peripheral tissue. In conclusion, the present study indicates that the JAK2 expressed in the DRG may have a role in the sensitization of nociceptors by a peripheral inflammatory event. Moreover, the inhibition of JAK2 may be a possible novel pharmacological target for the control of the inflammatory hyperalgesia / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Luiz Henrique de Araújo Machado / Resumo: Dermatite atópica (DA) canina é uma enfermidade alergoinflamatória de caráter crônico, da pele e orelha externa, geralmente de cães adultos jovens, induzida por distintos alérgenos. A afecção tem etiopatologia complexa e ainda não totalmente elucidada, dificilmente atingindo cura. Porém, há hoje, várias opções medicamentosas para o seu controle. O oclacitinib faz parte da recente remessa de medicamentos para tratamento e controle do prurido dos cães atópicos, com poucos efeitos colaterais. É um fármaco inibidor de janus quinase, com rápida ação e que age na ligação das citocinas aos receptores JAKs. Este trabalho teve como intuito avaliar a resposta inflamatória da pele de animais atópicos, antes e 30 dias após o tratamento com Oclacitinib comercial (Apoquel®), através da mensuração das interlucinas IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-31, TNF-, IFN- e filagrina, pela técnica de imuno-histoquímica, além da resposta clinica ao tratamento pela avaliação do CADESI-4 e escore do prurido. Os 10 cães utilizados no estudo são provenientes do atendimento dermatológico do HV da UNESP-Botucatu e clínica particular de Sorocaba-SP. Apenas os escores do CADESI-4, do prurido e da IL-1, citocina inflamatória chave da imunidade inata e na patogênese da DA, apresentaram redução na análise estatística. Concluise que a IL-1 pode ter um papel importante na farmacocinética do oclacitinib e maiores estudos são necessários para confirmar a ação do oclacitinib sobre a produção e ligação da IL-1 aos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Canine atopic dermatitis (DA) is a chronic inflammatory alergo disease of the skin and external ear, usually of young adult dogs, induced by distinct allergens. The disease has complex and still not fully elucidated etiopatology, hardly reaching cure. However, there are today several drug options for your control. Oclacitinib is part of the recent consignment of medications for treatment and control of the itching of atopic dogs, with few side effects. It is an inhibitor drug of Janus Kinase, with rapid action and acting in the binding of cytokines to jaks receptors. The objective of this work was to evaluate the inflammatory response of the skin of atopic animals before and 30 days after treatment with commercial oclacitinib (Apoquel®), through the measurement of interlukines il-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-31, TNF-α, IFN-γ and Filagrin, by immunohistochemistry technique, in addition to clinical response to treatment by evaluation of Cadesi-4 and pruritus score. The 10 dogs used in the study are from the dermatological treatment of HV of UNESP-Botucatu and private Clinic of Sorocaba-SP. Only the scores of Cadesi4, pruritus and IL-1, the key inflammatory cytokine of innate immunity and the pathogenesis of DA, showed a reduction in the statistical analysis. It is concluded that IL-1 may play an important role in the pharmacokinetics of oclacitinib and further studies are needed to confirm the action of oclacitinib on the production and binding of IL-1 to cutaneous receptors... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Licio Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T01:56:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calegari_VivianCristine_D.pdf: 2365593 bytes, checksum: 17171722b251d41a9c53c2c50de4723d (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O hormônio angiotensina II (ANGII) através de seu receptor AT1 é capaz de ativar a via de sinalização JAK/STAT. Estudos demonstram que esta via encontra-se hiper-ativada durante o desenvolvimento da hipertensão. Os mecanismos pelos quais esta via é regulada pela ANGII ainda não foram totalmente elucidados. Relatos demonstram que hormônios, citocinas e fatores de crescimento que transduzem seus sinais através da via JAK/STAT, acabam por induzir a expressão de proteínas da família SOCS e que estas, por sua vez, promovem a regulação do sinal de seus indutores. Estudos epidemiológicos demonstram que a hipertensão é um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento da resistência à insulina (RI). Embora seja conhecido que a ANGII apresenta importante papel no desenvolvimento da hipertensão e da RI, uma vez que a inibição de sua ação, não somente reduz a pressão sanguínea como também melhora a sensibilidade à insulina em indivíduos hipertensos e resistentes à insulina, muito pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares pelos quais este hormônio pode causar RI. No presente estudo, examinamos o papel da ANGII sobre os mecanismos de ativação e regulação da via JAK/STAT em coração de ratos Wistar adultos (RWA) e em cardiomiócitos ventriculares isolados de ratos neonatos (CVIN). Nossos resultados revelaram que, após a ligação da ANGII ao receptor AT1, ocorre ativação de JAK2 e STAT1 e, subsequentemente, a expressão de SOCS3 é induzida. Verificamos ainda que a ativação da via JAK/STAT e a expressão de SOCS3 são dependentes da ativação de AT1 pela ANGII e que a expressão de c-jun pode ser induzida também pelo receptor AT2. Além disso, observamos que SOCS3 pode participar do mecanismo de desensibilização ou refratariedade do sinal da ANGII através da via JAK/STAT como demonstrado pelo seu bloqueio com oligonucleotídeo antisense contra SOCS3 (AS SOCS3). Também investigamos se a proteína SOCS3, induzida por ANGII, pode participar do cros-talk molecular entre o sinal da ANGII e da insulina. Observamos que o tratamento com ANGII causa queda significativa na atividade de proteínas da via PI 3-K/AKT da insulina e que SOCS3, induzida por ANGII, associa-se a IR, IRS1 e IRS2. O uso de AS SOCS3 restaura os níveis de fosforilação em tirosina de IRS1 e IRS2 induzidos pela insulina, aumenta a associação entre IRS1 e IRS2 com PI 3-K, e a subseqüente atividade desta enzima e da proteína AKT e leva a um aumento na translocação de GLUT4 para a membrana celular. O presente estudo demonstra, pela primeira vez, que o hormônio ANGII é capaz de induzir a expressão de uma proteína supressora da sinalização das citocinas, SOCS3, e que esta proteína, além de participar do controle das ações fisiológicas de seu indutor, também participa do cros-talk negativo entre o sinal de dois hormônios, ANGII e insulina, podendo se constituir, desta forma, em mais um mecanismo de interconexão entre hipertensão arterial e RI e/ou diabetes mellitus tipo II / Abstract: Intracellular interactions between different signaling systems may function as mechanisms for enhancing or counter-regulating hormone action. The hormone angiotensin II (ANGII) is involved in the development of both, hypertension and insulin resistance. Several studies demonstrate that in signaling systems that use the JAK/STAT pathway, proteins of the suppressor of cytokine signaling (SOCS) family participate in signal regulation. In the present study we demonstrate that ANGII is able to activate the JAK/STAT pathway and, subsequently, the expression of SOCS3. SOCS3 is constitutively expressed at a low level in the heart of rats and neonatal rat ventricular myocytes. ANGII, at a physiological concentration, enhances the expression of SOCS3 mRNA and protein, mainly via AT1 receptors. After induction, SOCS3 associates with JAK2 and impairs further activation of the JAK2/STAT1 pathway. Pretreatment of rats with a specific phosphorthioate antisense oligonucleotide against SOCS3, reverses the desensitization to angiotensin signaling, as detected by a fall in c-jun expression after repetitive infusions of the hormone. We also demonstrate the interaction of ANGII-induced SOCS3 with the insulin signaling pathway in cardiac tissue in vivo and in isolated cell system. ANGII-induced SOCS3 interacts with the IR, JAK2, IRS1 and IRS2. The inhibition of SOCS-3 expression by antisense oligonucleotide partially restores the ANGII-induced inhibition of insulin-induced IR, IRS- 1 and IRS-2 tyrosine phosphorylation, IRS1 and IRS2 association with p85- phosphatidylinositol 3-quinase and AKT [Ser473] serine phosphorylation. Moreover, the inhibition of SOCS3 expression partially reverses ANGII- induced inhibition of insulinstimulated GLUT-4 translocation to the cell membrane. Thus, ANGII-induced SOCS3 in rat heart and neonatal rat ventricular myocytes may actively participate in the control of the ANGII signaling, and also, as a late event, in the negative cross-talk between ANGII and insulin signaling pathways / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

L'action ubiquitaire de l'interféron de type I (IFN- alpha/beta , ici IFN) dans la physiologie et la pathologie est aujourd'hui certaine. Une réponse dérégulée à l'IFN peut entraîner des interféronopathies ou des maladies auto-immunes. Dans mon travail de thèse j'ai étudié trois éléments de la voie de signalisation de l'IFN afin de comprendre comment une dérégulation peut se produire. TYK2 est une tyrosine kinase de la famille Janus impliquée dans la signalisation de cytokines immunorégulatrices (IFN de type I, IL-10, IL-12, IL-23). Selon le récepteur, TYK2 est co-activé avec JAK1 ou JAK2. L'interaction moléculaire entre les deux kinases juxtaposées est peu connue. J'ai caractérisé deux variants de TYK2 associés à des maladies auto-immunes, TYK2 I684S et TYK2 P1104A. J'ai démontré que ces deux variants ont un défaut catalytique, mais soutiennent la réponse à l'IFN. Mes résultats suggèrent un modèle d'activation réciproque des deux kinases. Par des études de signalisation dans les cellules EBV-B j'ai montré que l'homozygotie TYK2 P1104A a un impact différent selon la cytokine étudiée. L'analyse de deux autres polymorphismes de TYK2 associés à des maladies auto-immunes (rs12720270, rs2304256) a montré un impact sur la rétention de l'Exon 8, ce qui augmente l'expression de TYK2. J'ai aussi contribué à la dissection du mécanisme moléculaire contrôlant la réponse à l'IFN dans les cellules de patients déficients pour USP18 ou ISG15 et souffrant d'interféronopathies. Ces travaux ont démontré le rôle essentiel d'USP18 pour restreindre la réponse à l'IFN et ont mis en évidence ISG15 comme un nouvel inhibiteur de l'IFN chez l'humain mais pas chez la souris. / Today, the pervasive action of type I IFN (IFN-alpha/beta, here IFN) in human physiology and pathology has become evident. Dysregulated IFN response can lead to interferonopathies and auto-immune diseases (AID). My thesis work has focused on the study of three elements of the IFN response pathway, aiming to understand how dysregulation occurs. TYK2 belongs to the Janus tyrosine kinase family and is involved in signaling of several immunoregulatory cytokines, such as type I IFN, IL-10, IL-12 and IL-23. Depending on the receptor complex, TYK2 is co-activated with either JAK1 or JAK2. A detailed molecular characterization of the interplay between the two juxtaposed enzymes is missing. In my study, I characterized two rare AID-associated human variants TYK2 I684S and TYK2 P1104A. I found that both variants are catalytically impaired but rescue signaling in response to IFN in fibroblasts. My results support a model of reciprocal activation of Janus kinases. Through signaling studies I showed that TYK2 P1104A homozygosity has a cytokine-specific impact in EBV-B cells. My studies of two other AID-associated TYK2 SNPs (rs12720270 and rs2304256) suggest that they promote Exon 8 retention and increase TYK2 expression. In the second part of my thesis work, I contributed to dissecting the molecular mechanism that tunes down IFN response in cells from rare USP18- and ISG15-deficient patients that suffered of interferonopathies. This work substantiated the essential role of USP18 in downregulating the IFN response and highlighted ISG15 as a novel IFN inhibitor in humans, but not in mice.

Prolactin (PRL) and its receptor (PRLr) have been implicated in the development and progression of human breast cancer. PRL activates its receptor and induces activation of proximal Janus kinase 2 (Jak2) for signal transduction. Here, we sought to determine the role of PRLr-associated peptidyl-prolyl isomerase, cyclophilin A (CypA), in modulating structure/function relationships of the PRLr. It was demonstrated that CypA mediated PRL-induced conformational change of the CFP- and -YFP tagged forms of the PRLr cytoplasmic-tail, whereas CypA inhibition by NIM811 (N-methyl-4-isoleucine cyclosporin) or knockdown blocked the conformational change of the PRLr assessed by Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) signal or efficiency. To further investigate the consequences of CypA inhibition or knockdown on the PRLr/Jak2 complex mediated signaling/functions, analyses of phospho-tyrosine residues that are believed to be important for interactions/signaling were investigated. It was found that NIM811 inhibition or CypA shRNA knockdown significantly reduced prolactin-stimulated phosphorylation of PRLr/Jak2 intermediates and their association with the PRLr in breast cancer cells. A microarray analysis revealed that NIM811 inhibited approximately 66% of the top 50 PRL-induced genes. NIM811 inhibited breast cancer cell proliferation, survival, migration and anchorage-independent growth. Subsequent NIM811 treatment of a triple negative breast cancer xenograft inhibited primary tumor growth, outgrowth of macro-metastasis and induced central tumor necrosis. Furthermore, loss of CypA in the MMTV-PyMT mouse model demonstrated inhibition of tumorigenesis with significant reduction in lung and lymph node metastasis. Overall, CypA modulates PRL-induced conformational change of the C-terminus of the PRLr through its isomerase activity, altering PRLr/Jak2 complex signaling/functions in breast/mammary tumorigenesis and metastasis.

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Yes / Exaggerated Janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAKSTAT) signalling is key to the pathogenesis of pro-inflammatory disorders, such as rheumatoid arthritis and cardiovascular diseases. Mutational activation of JAKs is also responsible for several haematological malignancies, including myeloproliferative neoplasms and acute lymphoblastic leukaemia. Accumulating evidence links adenosine 5′-monophosphate (AMP)–activated protein kinase (AMPK), an energy sensor and regulator of organismal and cellular metabolism, with the suppression of immune and inflammatory processes. Recent studies have shown that activation of AMPK can limit JAK-STAT-dependent signalling pathways via several mechanisms. These novel findings support AMPK activation as a strategy for management of an array of disorders characterised by hyper-activation of the JAKSTAT pathway. This review discusses the pivotal role of JAK-STAT signalling in a range of disorders and how both established clinically used and novel AMPK activators might be used to treat these conditions. / British Heart Foundation; Diabetes UK; Chief Scientist Office; NHS Greater Glasgow and Clyde Research Endowment Fund; Chest, Heart and Stroke Scotland

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences