A variabilidade na composição e nas atividades biológicas dos venenos de serpentes vem sendo documentada por diversos autores e pode ser observada em diversos níveis. As diferenças na composição dos venenos apresentam relevância na terapêutica dos envenenamentos ofídicos, tornando o estudo da variação dos venenos de extrema importância para a confecção de antivenenos mais específicos e de maior eficácia nos tratamentos de envenenamentos ofídicos em humanos. Os estudos das variações do veneno de serpentes em populações isoladas são raros, sendo no Brasil os casos mais conhecidos os da Bothrops insularis e Bothrops alcatraz. Diversos estudos sugerem que as oscilações do nível marinho, ocorridas há 11.000 anos, teriam isolado populações de serpentes nas ilhas recentemente formadas, resultando em duas diferentes rotas evolutivas que deram origem a estas espécies. Tendo em vista que a formação da Ilha de São Sebastião-SP ocorreu no mesmo período, isolando populações de animais ali existentes, nos propusemos a avaliar a variação nas atividades do veneno de 80 exemplares de serpentes Bothrops jararaca provenientes da ilha e da sua área de distribuição continental, comparando-as com o Veneno Referência Nacional, para as atividades proteolítica sobre caseína, fosfolipásica indireta, hemorrágica e amidolítica, assim como de seus perfis eletroforéticos (SDS-PAGE) e seu reconhecimento pelo soro antibotrópico comercial através da técnica de Western Blot. A análise eletroforética (SDS-PAGE 12,5%) através de densitometria óptica evidenciou, em sua maioria bandas protéicas de baixo peso molecular e a presença de duas áreas majoritárias com grande variação no número, disposição e intensidade das bandas nas faixas de pesos moleculares de 45 kDa e 25 kDa. A variação da disposição das bandas apresentadas nos géis correlacionou-se com a variação nas atividades. Amostras que apresentaram baixa atividade fosfolipásica foram exatamente aquelas que apresentaram poucas e tênues bandas com aproximadamente 14 kDa. A análise das atividades proteolítica sobre caseína, fosfolipásica e esterásica apresentou um padrão de similaridade que nos permitiu estabelecer duas grandes subpopulações de venenos; uma ao norte da distribuição geográfica amostrada, apresentando altas atividades proteolítica sobre caseína, fosfolipásica e amidolítica e outra ao sul apresentando menores valores para tais variedades. Não foi possível estabelecer uma relação direta entre o padrão de distribuição geográfica com a variação nas atividades hemorrágicas dos venenos amostrados. A técnica de Western Blot permitiu concluir que o soro antibotrópico comercial não apresenta um bom reconhecimento para proteínas de baixo peso molecular. A análise das atividades dos venenos dos exemplares insulares apresentou similaridade com as atividades das amostras de veneno de serpentes coletadas próximas à ilha, sugerindo que o intercâmbio gênico não tenha sido de todo interrompido, provavelmente devido à sua proximidade para com o continente. / The variability in composition and biological activities of snake venoms has been documented by several authors and can be observed in different levels. The study of the differences in venom composition is relevant for the therapeutic of snake envenoming, enabling the confection of more specific sera for the treatment of humans. The studies of snake venom variations in isolated population are scarce, and in Brazil, such studies concern mostly Bothrops Alcatraz and Bothrops insularis. Several studies suggest that the oscillations of the sea level which occurred 11,000 years ago might have isolated snake populations on the recently formed islands, resulting in two different evolutive routes which originated these species. Considering that the formation of Island of São Sebastião occurred within the same period, we decided to investigate the variability of 80 individual venom samples collected from specimens from the island and the continent, comparing these samples with the National Reference Venom for their caseinolytic, phospholipase, hemorrhagic and amidolytic activities, as well as electrophoretic profiles and immunoreactivity against the commercial anti-bothropic serum. Optical densitometry of the polyacrylamide gels indicated the presence of low molecular weight components and a molecular weight range with a high degree of variation of band number, migration pattern and intensity between 45 and 25 kDa. The variations in the electrophoretic profiles correlated with the differences observed in the enzymatic activities. Samples that presented low phospholipase activity also showed faint bands in the 14 kDa region. Taken together, the activities profiles enabled us to distinguish two distinct populations, one more to the north with higher activities, and another to the south with lower activities. There was no detectable correlation between geographic origin of the venom and hemorrhagic activity. By western blot we were able to observe the commercial antiserum fails in recognizing the low molecular weight components. These analyses showed that the insular venoms were very similar to the venoms obtained from continental areas close to the island, suggesting that the genic flow might not have been interrupted, probably due to the close vicinity of the island and the continent.

O fibrinogênio é uma glicoproteína presente no plasma composta por duas subunidades idênticas formadas por três pares de cadeias polipeptídicas (Aα Bβ e ϒ), interligadas por pontes dissulfeto. A trombina cliva o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando fibrina e, conseqüentemente, o coágulo. Esse trabalho descreve a purificação e caracterização do fibrinogênio a partir do plasma da serpente Bothrops jararaca (B. jararaca). O fibrinogênio purificado foi obtido através de adsorção com cloreto de bário, precipitações com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração. O fibrinogênio de B. jararaca apresentou massa molecular de 370 kDa em condições não reduzidas e, em condições reduzidas, apresentou massas moleculares de 71, 60 e 55 kDa, similares às cadeias Aα Bβ e ϒ dos fibrinogênio humano e bovino (64, 56 e 47 kDa, respectivamente). Através do seqüenciamento da região amino-terminal das cadeias polipeptídicas por degradação de Edman, foram obtidos os oito primeiros aminoácidos de cada cadeia do fibrinogênio de B. jararaca. As seqüências foram: Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly para a cadeia Aα, Gly-Ser-Asp-His-Asp-Asp-Glu para a cadeia Bβ e Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly para a cadeia ϒ . As seqüências foram então comparadas com a de outros animais já descritos (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov), mas devido ao pequeno número de aminoácidos obtidos não foi possível observar similaridades. Através de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foram observadas algumas seqüências peptídicas, mas não foi possível obter a seqüência completa do fibrinogênio de B. jararaca. Essas seqüências não apresentaram homologia significante com outras seqüências já descritas. O fibrinogênio de B. jararaca foi coagulado pela trombina bovina enquanto que os venenos das serpentes B. jararaca, Crotalus durissus terrificus e Lachesis muta rhombeata não foram capazes de induzir a formação de coágulo. Além disso, os anticorpos anti-fibrinogênio de B. jararaca produzidos em coelho não reconheceram o fibrinogênio humano. Contudo, os anticorpos anti-fibrinogênio humano reconheceram o fibrinogênio de B. jararaca. Assim, mesmo apresentando similaridades entre os fibrinogênios de B. jararaca e de mamíferos, eles possuem comportamentos distintos, podendo sugerir que a B. jararaca apresenta uma molécula de fibrinogênio diferente do humano para evitar um possível auto-envenenamento. / Fibrinogen is a plasma glycoprotein that is composed of two sets of three nonidentical polypeptide chains (Aα Bβ and ϒ ) which are covalently linked by disulfide bonds. Thrombin cleaves fibrinogen to form fibrin and, consequently, the fibrin clot. This work describes the purification and characterization of fibrinogen from Bothrops jararaca (B. jararaca) snake plasma. Purified fibrinogen was obtained by barium chloride adsorption, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. B. jararaca fibrinogen showed a molecular mass of 370 kDa in non-reducing conditions, similar to human and bovine fibrinogen with 340 kDa. Reduced fibrinogen showed three chains of 71, 60 and 55 kDa, which are similar to the molecular masses of human and bovine Aα Bβ and ϒ fibrinogen chains (64, 56 and 47 kDa, respectively). B. jararaca fibrinogen was clotted by bovine thrombin, however, B. jararaca, Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta rhombeata venoms were not able to induce fibrin formation. The N-terminal sequence of B. jararaca fibrinogen chains from PVDF membranes showed only the first eight amino acids residues from each chain. The Nterminal sequence was Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly for Aα chain, Gly-Ser-Asp- His-Asp-Asp-Glu for Bβ chain, and Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly for ϒ chain. The B. jararaca fibrinogen chains N-terminal sequences were compared to other animal Nterminal sequences previously described. However, due to low signal detection during Edman degradation, the sequence results were not sufficient to provide an accurate Blast search identity (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov). Mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis provides some peptide sequences that did not present the complete sequences. Besides, anti-B. jararaca fibrinogen produced in rabbit did not recognize human fibrinogen while anti-human fibrinogen recognized B. jararaca fibrinogen. Thus, despite B. jararaca fibrinogen presents a molecular mass similar to human fibrinogen, the former shows distinctive features, which protect B. jararaca snakes from a fortuitous ingress of snake venom proteins into snake circulation, which could cause a self-envenomation

Neste estudo foram utilizadas 30 serpentes da espécie B. jararaca com três anos de idade, nascidas no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan e divididas em 3 grupos experimentais, cada qual contendo 10 animais. A média do peso e do comprimento rostro cloacal dos machos e das fêmeas, respectivamente, foi de 97 gramas e 75 centímetros, e 281 gramas e 99 centímetros. Os animais do Grupo A não tiveram o seu manejo diário modificado, permanecendo na mesma sala durante todo o experimento. Os animais dos Grupos B e C foram transferidos, no início do experimento, para uma mesma sala de produção de veneno, sendo os animais do Grupo C eram submetidos à rotina de extração de veneno. A cada dois meses, por um período de 1 ano, 2 mL de sangue foram colhidos pela veia caudal, em dois momentos distintos, para a realização de exames hematológicos e dosagens séricas de estradiol, testosterona e corticosterona, pela técnica de radioimunoensaio. A primeira amostra de sangue foi colhida 120 segundo após a primeira contenção física e a segunda amostra 90 minutos após a contenção física e/ou a extração de veneno. As serpentes dos três grupos apresentaram níveis séricos elevados de corticosterona em resposta ao procedimento de contenção e/ou da extração, demonstrando que estes procedimentos podem ser considerados agentes estressantes. Embora não tenha sido observada correlação significante entre os níveis de corticosterona e os de hormônios esteróides sexuais, os níveis de testosterona (nos machos) e os de estradiol (nas fêmeas) diminuíram nos animais que apresentaram maiores valores de corticosterona. A relação heterófilo/linfócito não se mostrou um bom sinalizador para detectar estresse nas jararacas do estudo. / In the present studies, 30 snakes of the species B. jararaca with three years old, born in captivity at the Laboratório de Herpetologia - Instituto Butantan - were divided into 3 experimental groups, each one containing 10 animals. The mean weight and snout vent length of males and females were 97 grams and 75 centimeters and 281 grams and 99 centimeters, respectively. The Group A animals did not have their daily management modified since their birth, staying at the same room through all experiment. The Groups B and C animals were transferred, at the beginning of the studies, to the same venom extraction room, but only snakes of Group C were submitted to milking routine. Each two months for a period of a year 2 ml of blood were collected by ventral caudal venipuncture, at two different moments, for hematological exams and serum measurement of estradiol, testosterone and corticosterone by RIA (radioimmunoassay). The first blood samples were collected 120 seconds after physical restraint and the second blood samples occurred 90 minutes after physical restraint and/or milking routine. Snakes of the three groups showed high serum levels of corticosterone response for the restraint and/or milking procedure, indicating that these procedures can be considered stress agents. Although it has not been observed a significant correlation between levels of corticosterone and sexual steroids hormones, testosterone concentration in males and estradiol concentration in females diminished in animals showing higher levels of corticosterone. The heterophil/limphocyte relation could not be considered a good stress indicator in pitvipers of our studies.

Espécies de serpentes com ampla distribuição geográfica e sujeitas a diferentes condições de temperatura e precipitação ao longo de suas áreas de ocorrência podem apresentar variação geográfica em caracteres morfológicos e ecológicos (e.g. dieta e reprodução). Neste estudo, foi investigado se populações de Bothrops jararaca habitantes de áreas litorâneas e de áreas adjacentes mais elevadas da Serra do Mar e do planalto do estado de São Paulo, apresentavam variação geográfica em caracteres morfológicos e associados à biologia alimentar e reprodutiva. Foram analisados 831 espécimes de imaturos e adultos de ambos os sexos depositados na Coleção Herpetológica do Instituto Butantan (IBSP) e dados adicionais de 42 indivíduos alimentados das áreas supramencionadas obtidos de trabalhos não publicados. Indivíduos jovens da população de altitude consomem presas endotérmicas (mamíferos) em freqüência significativamente maior em relação aos da população litorânea. Isso deve estar relacionado à maior disponibilidade de anuros ao longo do ano nas áreas litorâneas ou ao fato dos jovens das áreas de altitude selecionarem e serem capazes de ingerir presas endotérmicas apesar de seus pequenos tamanhos corporais. Entre os indivíduos sub-adultos e adultos das duas populações, não houve diferenças significativas nos tipos (ectotérmicas e endotérmicas) e nas classes (grupos taxonômicos) de presas consumidas, possivelmente porque esses indivíduos se alimentam de presas endotérmicas assim que possível ao longo da ontogenia, abandonando itens alimentares relativamente pequenos. Apesar das jararacas das áreas de altitude provavelmente estarem menos ativas durante os meses mais frios e secos do ano e se alimentarem com menor freqüência durante esse período, esses indivíduos aparentemente não compensam as menores oportunidades de tomada de alimento consumindo presas em freqüência superior aos coespecíficos das áreas costeiras durante os meses mais quentes e úmidos do ano. Os indivíduos da população de altitude consomem itens alimentares relativamente maiores e possuem, para quase todas as classes de tamanho estabelecidas, maior comprimento rostro-cloacal, maior tamanho relativo de cabeça e maior robustez em relação àqueles das áreas litorâneas. É possível que a sazonalidade climática mais acentuada das áreas de altitude restrinja a extensão do período de atividade e a eficiência alimentar das serpentes habitantes dessas áreas, constituindo um agente seletivo para o consumo de presas maiores. A diferença no tamanho das presas ingeridas deve ser um dos fatores relacionados às diferenças nas dimensões corporais entre as jararacas da costa e aquelas das áreas de maior altitude. Apesar das diferenças climáticas entre as duas áreas, o ciclo reprodutivo de ambos os sexos é sazonal e não difere entre as populações, provavelmente porque esse deve ser um caráter conservativo no gênero Bothrops. Jararacas de áreas de maior altitude da Serra do Mar e do planalto atingem a maturidade sexual com menor tamanho corporal, possuem maior fecundidade relativa e presumivelmente maior massa relativa de ninhada em relação àquelas das áreas litorâneas, o que deve estar associado, ao menos em parte, à dieta mais calórica dessa população. Os neonatos das áreas de altitude aparentemente possuem maiores dimensões corporais em relação aos do litoral, o que deve estar associado a maior freqüência no consumo de presas endotérmicas pelos primeiros. É sugerido que algumas diferenças entre as populações para os caracteres morfológicos e associados à biologia reprodutiva são devido à plasticidade fenotípica da espécie e outras devidas a mudanças evolutivas. / Widely distributed snakes exposed to different conditions of temperature and precipitation throughout their distributions may present geographic variation in morphological and ecological characters (e.g. diet and reproduction). In this study, I investigate whether Bothrops jararaca populations from coastal and adjacent mid-elevation sites of the Serra do Mar and plateau in São Paulo state presented geographic variations in morphological characters and in characters associated to feeding and reproduction. I analyzed 831 specimens among immature and adults of both sexes deposited in the Coleção Herpetológica do Instituto Butantan (IBSP). Data concerning 42 fed individuals from the studied areas taken from unpublished works were also included. Juveniles from the mid-elevation sites feed on endothermic preys (mammals) in higher frequency in relation to that from the coastal sites, which might be due to the higher anuran availability throughout the year at the coastal sites, and/or because the juveniles from the mid-elevation sites select and they are capable of ingest endothermic preys despite their small body size. There were no significant differences among sub-adults and adults from the two populations in the kinds (ectothermic and endothermic) and classes (taxonomic groups) of the prey consumed, which is possibly related to the fact that the individuals from both sites consumes endothermic prey as soon as possible throughout the ontogeny and abandon relatively small items. Although the jararacas from the mid-elevation sites probably are less active during the coldest and driest months of the year and feed less frequently during this period in relation to that of the coastal sites, these individuals did not seem to compensate the fewer opportunities of taking prey by feeding in higher frequency in relation to the coespecifics from the coastal sites during the hottest and warmest months of the year. The specimens from mid-elevation populations consume relatively larger prey and they have larger bodies, relative larger heads, and are stouter for most of the size classes established. It is possible that the more seasonal climate of the mid-elevation sites restricts the extension of the activity period and the feeding efficiency of snakes, which could correspond to a selective agent related to the consumption of larger prey. The difference in diet might be one of the factors that are related to differences in body dimensions between populations from the coast and from mid-elevation sites. Although there are climate differences between the two studied sites, the reproductive cycle of both sexes is seasonal and did not differ between the populations, possibly because this should be a conservative character in the genus Bothrops. The individuals from the higher Serra do Mar and plateau sites become mature with smaller body size, have higher relative fecundity and presumably higher relative clutch mass in relation to those of the coastal sites. These results should be associated, at least partially, to the more caloric preys ingested by the population from the altitude sites. The neonates from the altitude sites seem to have larger body size in relation to those from the coastal sites, what should be associated with the higher frequency of endothermic prey in their diet. It is suggested that some differences between the populations in morphological characters and for the characters associated to the reproductive biology are due to the species phenotypic plasticity and others to evolutionary changes.

Neste estudo foram utilizadas 30 serpentes da espécie B. jararaca com três anos de idade, nascidas no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan e divididas em 3 grupos experimentais, cada qual contendo 10 animais. A média do peso e do comprimento rostro cloacal dos machos e das fêmeas, respectivamente, foi de 97 gramas e 75 centímetros, e 281 gramas e 99 centímetros. Os animais do Grupo A não tiveram o seu manejo diário modificado, permanecendo na mesma sala durante todo o experimento. Os animais dos Grupos B e C foram transferidos, no início do experimento, para uma mesma sala de produção de veneno, sendo os animais do Grupo C eram submetidos à rotina de extração de veneno. A cada dois meses, por um período de 1 ano, 2 mL de sangue foram colhidos pela veia caudal, em dois momentos distintos, para a realização de exames hematológicos e dosagens séricas de estradiol, testosterona e corticosterona, pela técnica de radioimunoensaio. A primeira amostra de sangue foi colhida 120 segundo após a primeira contenção física e a segunda amostra 90 minutos após a contenção física e/ou a extração de veneno. As serpentes dos três grupos apresentaram níveis séricos elevados de corticosterona em resposta ao procedimento de contenção e/ou da extração, demonstrando que estes procedimentos podem ser considerados agentes estressantes. Embora não tenha sido observada correlação significante entre os níveis de corticosterona e os de hormônios esteróides sexuais, os níveis de testosterona (nos machos) e os de estradiol (nas fêmeas) diminuíram nos animais que apresentaram maiores valores de corticosterona. A relação heterófilo/linfócito não se mostrou um bom sinalizador para detectar estresse nas jararacas do estudo. / In the present studies, 30 snakes of the species B. jararaca with three years old, born in captivity at the Laboratório de Herpetologia - Instituto Butantan - were divided into 3 experimental groups, each one containing 10 animals. The mean weight and snout vent length of males and females were 97 grams and 75 centimeters and 281 grams and 99 centimeters, respectively. The Group A animals did not have their daily management modified since their birth, staying at the same room through all experiment. The Groups B and C animals were transferred, at the beginning of the studies, to the same venom extraction room, but only snakes of Group C were submitted to milking routine. Each two months for a period of a year 2 ml of blood were collected by ventral caudal venipuncture, at two different moments, for hematological exams and serum measurement of estradiol, testosterone and corticosterone by RIA (radioimmunoassay). The first blood samples were collected 120 seconds after physical restraint and the second blood samples occurred 90 minutes after physical restraint and/or milking routine. Snakes of the three groups showed high serum levels of corticosterone response for the restraint and/or milking procedure, indicating that these procedures can be considered stress agents. Although it has not been observed a significant correlation between levels of corticosterone and sexual steroids hormones, testosterone concentration in males and estradiol concentration in females diminished in animals showing higher levels of corticosterone. The heterophil/limphocyte relation could not be considered a good stress indicator in pitvipers of our studies.

Escherichia coli enteropatogênica causa uma lesão denominada attaching and effacing, codificadas por genes presentes na região LEE, que está sujeita a regulação por diferentes fatores incluindo por quorum sensing. O veneno de Bothrops jararaca é uma mistura de vários componentes com diferentes efeitos biológicos. Para analisar o efeito de suas frações na interação de EPEC com HEp-2, o veneno foi ultrafiltrado. Testes mostraram que a concentração de 100 ng de fração causou um aumento de adesão bacteriana, sugerindo componente no veneno que potencializa a adesão até certa concentração. Fenótipo das amostras com concentração mais alta foi parecido ao do controle, exceto com 1000 ng da menor fração, onde a adesão foi menor, sugerindo que há componente que afeta negativamente a adesão bacteriana em concentração maior. Estes resultados mostram como diferentes componentes de veneno de serpentes afetam a interação bactéria-célula hospedeira, e apresentam potencial biológico de componentes de baixo peso molecular no veneno. / Enteropathogenic Escherichia coli causes a lesion named attaching and effacing, encoded by genes present in LEE region, which is subject to regulation by different factors including quorum sensing. Bothrops jararaca venom is a mixture of different components with different biological effects. To analyze the effect of its fractions in interactions between EPEC and HEp-2, venom was ultrafiltered. Tests showed that a fraction concentration of 100 ng caused an increase of adherence when compared to the control, suggesting that there is a component in the venom that potentiates the adherence up to a certain concentration. Phenotype of samples with higher concentration were similar to that of the control, except the one with 1000 ng of the lowest fraction, where adherence decreased, indicating that there is a component able to negatively affect adherence when in higher concentration. These results show how different snake venom components can affect a bacteria-host cell interaction, and present biological potential of components of low molecular weight present in venom.

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores α e β, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e β (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both α1- and β-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of α1- and β-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by α1- and β-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of α1- and β-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

Orientador: Ricardo J. Sawaya / Banca: Fausto Erritto Barbo / Banca: Maria Fernanda Calio / Resumo: Um dos objetivos centrais da biogeografia histórica é a reconstrução da história de um determinado táxon ou um grupo baseado em hipóteses filogenéticas. A ideia de que as relações filogenéticas fornecem informações da distribuição geográfica passada é antiga, e apenas se tornou possível com a Sistemática Filogenética de Willi Hennig. Análises de Dispersão e Vicariância (DIVA) e modelos de Dispersão, Extinção e Cladogênese (DEC) são métodos amplamente difundidos para a reconstrução da distribuição geográfica ancestral de espécies. Essas análises incluem eventos anagenéticos e cladogenéticos. Recentemente, esses métodos foram implementados em um pacote do programa R denominado BioGeoBEARS. Além dos eventos anagenéticos e cladogenéticos já implementados nas versões originais de DEC e DIVA, o BioGeoBEARS apresenta a possibilidade de incluir a dispersão em saltos, ou jump dispersal, que tem se mostrado interessante mesmo quando consideradas espécies ou grupos que habitam o continente. O grupo Bothrops alternatus é um clado monofilético recuperado em diferentes filogenias do gênero Bothrops e inclui seis espécies de jararacas que habitam principalmente áreas de vegetação aberta: B. alternatus, B. itapetiningae, B. fonsecai, B. cotiara, B. ammodytoides e B. jonathani. Os objetivos deste trabalho são: 1) inferir a origem do grupo B. alternatus; 2) compreender a diversificação e evolução da distribuição geográfica das espécies atuais e seus ancestrais hipotéticos; 3) analisar se a diversificação ocorreu a partir de áreas abertas ou florestais; e 4) entender como processos geológicos e 14 climáticos podem ter influenciado a distribuição atual do grupo. Revisamos e georreferenciamos 3.265 registros de distribuição geográfica de espécimes depositados em coleções zoológicas e dados da literatura. Utilizamos uma filogenia datada que inclui cinco das seis espécies do grupo, pois... / Abstract: One central aim of historical biogeography is the history reconstruction of a taxon or clade based on phylogenetic hypotheses. The idea that the phylogenetic relationships provide information on past geographical distribution is old, and it was only possible with the Willi Hennig's Cladistic method. Dispersal Vicariance Analysis (DIVA) and Models of Dispersal-Extinction-Cladogenesis (DEC) are among the most popular methods to reconstruct ancestral geographical distributions. Both analysis include anagenetic and cladogenetic processes. Both methods were recently implemented in the R software package BioGeoBEARS. Besides the anagenetic and cladogenetic processes of the original DEC and DIVA, BioGeoBEARS includes a parameter related to jump dispersal, that has been shown interesting even for non-insular species. The Bothrops alternatus group corresponds to a monophyletic clade, recovered in different phylogenies of the genus Bothrops and includes six lancehead snakes species that mainly inhabit open vegetation areas: B. alternatus, B. itapetiningae, B. fonsecai, B. cotiara, B. ammodytoides and B. jonathani. Our aims here are: 1) to infer the area origin of the B. alternatus group; 2) to comprehend the diversification and evolution of the geographic distribution of present species and their hypothetical ancestrals; 3) to analyze if diversification occurred in open vegetation or forested areas; and 4) to understand how geological and climatic processes may have influenced the present distribution of the group. We revised and georeferenced 3,265 records of geographic distributions of species via zoological collection records and 17 literature data. We used a phylogeny including five out six species of the group, because B. jonathani is a rare species lacking molecular data. The biogeographic units in which the species occur were delimited by intersection of geographic distribution of the species and shapefiles of provinces and Brazilian... / Mestre

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-06T10:54:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Pedro F. Gonçalves Bisneto.pdf: 590268 bytes, checksum: 127fb4c1ce5ee0a96122243aa6b75a0a (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-06T10:54:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Pedro F. Gonçalves Bisneto.pdf: 590268 bytes, checksum: 127fb4c1ce5ee0a96122243aa6b75a0a (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-06T10:55:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Pedro F. Gonçalves Bisneto.pdf: 590268 bytes, checksum: 127fb4c1ce5ee0a96122243aa6b75a0a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-06T10:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Pedro F. Gonçalves Bisneto.pdf: 590268 bytes, checksum: 127fb4c1ce5ee0a96122243aa6b75a0a (MD5) Previous issue date: 2016-08-11 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The pit viper Bothrops atrox is a widely distributed and locally abundant snake in Amazonia. Given that the reproductive and feeding biology of snakes varies geographically, we aimed to characterize the natural history of individuals from the central and southwestern portions of the biome. For this, we analyzed museum-preserved specimens collected in the region between the metropolitan areas of the Brazilian cities of Manaus and Porto Velho. We took morphometric measurements and performed the analysis of gonads and digestive tracts of 109 individuals. Females attain sexual maturity with larger body sizes. Adults of the species show a pronounced sexual dimorphism in body size being females, on average, larger. The reproductive cycle seems to be synchronized with regional rainfall, which differs from that found in other portions of the biome. The species has a generalist diet with the consumption of a wide range of prey such as centipedes, frogs, lizards, snakes and mammals. This study first recorded the predation of the snake Imantodes cenchoa (Dipsadidae) by B. atrox. There is an ontogenetic shift in the diet: smaller individuals feed mainly on ectothermic prey (centipedes, frogs, lizards and snakes), and adults tend to incorporate endothermic items (mammals) to their food repertoire. / A jararaca Bothrops atrox é uma serpente de ampla distribuição e localmente abundante na Amazônia. Visto que a biologia reprodutiva e alimentar de serpentes varia geograficamente, objetivamos caracterizar a história natural de indivíduos provenientes das porções central e sudoeste do bioma. Para isso, analisamos espécimes preservados coletados na área compreendida entre as regiões metropolitanas dos municípios brasileiros de Manaus e Porto Velho. Foram aferidas medidas morfométricas e realizadas análises gonadais e do trato digestório de 109 exemplares. Fêmeas atingem a maturação sexual com tamanhos corporais maiores. Adultos da espécie apresentam marcado dimorfismo sexual em tamanho, sendo que fêmeas são, em média, maiores. O ciclo reprodutivo parece estar sincronizado com o regime de chuvas regional, o qual difere daquele encontrado em outras porções do bioma. A espécie possui dieta generalista, com a ingestão de uma ampla gama de presas tais como lacraias, anuros, lagartos, serpentes e mamíferos. Neste estudo foi registrada pela primeira vez a predação da serpente Imantodes cenchoa (Dipsadidae) por B. atrox. Há mudança ontogenética na dieta: indivíduos menores se alimentam principalmente de presas ectotérmicas (lacraias, anuros, lagartos e serpentes) e adultos tendem a incorporar itens endotérmicos (mamíferos) ao repertório alimentar.

O fibrinogênio é uma glicoproteína presente no plasma composta por duas subunidades idênticas formadas por três pares de cadeias polipeptídicas (Aα Bβ e ϒ), interligadas por pontes dissulfeto. A trombina cliva o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando fibrina e, conseqüentemente, o coágulo. Esse trabalho descreve a purificação e caracterização do fibrinogênio a partir do plasma da serpente Bothrops jararaca (B. jararaca). O fibrinogênio purificado foi obtido através de adsorção com cloreto de bário, precipitações com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração. O fibrinogênio de B. jararaca apresentou massa molecular de 370 kDa em condições não reduzidas e, em condições reduzidas, apresentou massas moleculares de 71, 60 e 55 kDa, similares às cadeias Aα Bβ e ϒ dos fibrinogênio humano e bovino (64, 56 e 47 kDa, respectivamente). Através do seqüenciamento da região amino-terminal das cadeias polipeptídicas por degradação de Edman, foram obtidos os oito primeiros aminoácidos de cada cadeia do fibrinogênio de B. jararaca. As seqüências foram: Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly para a cadeia Aα, Gly-Ser-Asp-His-Asp-Asp-Glu para a cadeia Bβ e Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly para a cadeia ϒ . As seqüências foram então comparadas com a de outros animais já descritos (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov), mas devido ao pequeno número de aminoácidos obtidos não foi possível observar similaridades. Através de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foram observadas algumas seqüências peptídicas, mas não foi possível obter a seqüência completa do fibrinogênio de B. jararaca. Essas seqüências não apresentaram homologia significante com outras seqüências já descritas. O fibrinogênio de B. jararaca foi coagulado pela trombina bovina enquanto que os venenos das serpentes B. jararaca, Crotalus durissus terrificus e Lachesis muta rhombeata não foram capazes de induzir a formação de coágulo. Além disso, os anticorpos anti-fibrinogênio de B. jararaca produzidos em coelho não reconheceram o fibrinogênio humano. Contudo, os anticorpos anti-fibrinogênio humano reconheceram o fibrinogênio de B. jararaca. Assim, mesmo apresentando similaridades entre os fibrinogênios de B. jararaca e de mamíferos, eles possuem comportamentos distintos, podendo sugerir que a B. jararaca apresenta uma molécula de fibrinogênio diferente do humano para evitar um possível auto-envenenamento. / Fibrinogen is a plasma glycoprotein that is composed of two sets of three nonidentical polypeptide chains (Aα Bβ and ϒ ) which are covalently linked by disulfide bonds. Thrombin cleaves fibrinogen to form fibrin and, consequently, the fibrin clot. This work describes the purification and characterization of fibrinogen from Bothrops jararaca (B. jararaca) snake plasma. Purified fibrinogen was obtained by barium chloride adsorption, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. B. jararaca fibrinogen showed a molecular mass of 370 kDa in non-reducing conditions, similar to human and bovine fibrinogen with 340 kDa. Reduced fibrinogen showed three chains of 71, 60 and 55 kDa, which are similar to the molecular masses of human and bovine Aα Bβ and ϒ fibrinogen chains (64, 56 and 47 kDa, respectively). B. jararaca fibrinogen was clotted by bovine thrombin, however, B. jararaca, Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta rhombeata venoms were not able to induce fibrin formation. The N-terminal sequence of B. jararaca fibrinogen chains from PVDF membranes showed only the first eight amino acids residues from each chain. The Nterminal sequence was Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly for Aα chain, Gly-Ser-Asp- His-Asp-Asp-Glu for Bβ chain, and Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly for ϒ chain. The B. jararaca fibrinogen chains N-terminal sequences were compared to other animal Nterminal sequences previously described. However, due to low signal detection during Edman degradation, the sequence results were not sufficient to provide an accurate Blast search identity (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov). Mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis provides some peptide sequences that did not present the complete sequences. Besides, anti-B. jararaca fibrinogen produced in rabbit did not recognize human fibrinogen while anti-human fibrinogen recognized B. jararaca fibrinogen. Thus, despite B. jararaca fibrinogen presents a molecular mass similar to human fibrinogen, the former shows distinctive features, which protect B. jararaca snakes from a fortuitous ingress of snake venom proteins into snake circulation, which could cause a self-envenomation