O veneno da Bothrops jararaca (VBj) causa inflamação aguda local. Os mastócitos secretam mediadores que desencadeiam a inflamação por sua ação direta ou pelo recrutamento de células. Este trabalho avalia o papel dos mastócitos na inflamação induzida por VBj em camundongos geneticamente selecionados para alta (AIRmax) ou baixa (AIRmin) resposta inflamatória aguda. Os animais foram tratados com o inibidor de mastócito Cromoglicato de Sódio (CROM) e receberam o VBj, e apresentaram formação de edema similar em resposta ao veneno. Os animais AIRmax apresentaram maior dor que os AIRmin, sendo esta inibida por CROM. O VBj aumentou o número de células peritoneais em AIRmax, bem como o número de macrófagos, e diminuiu o número de mastócitos. O VBj também aumentou neutrófilos e a produção de ROS em AIRmax, efeito inibido por CROM. Os resultados mostram, portanto, que os animais AIRmax apresentam maior dor, migração de neutrófilos e macrófagos e produção de ROS que os AIRmin, e que essas reações são reduzidas quando os mastócitos são inibidos. / Bothrops jararaca venom (BjV) causes acute local inflammation. Mast cells acts secreting mediators that trigger inflammatory events through their direct action or the recruitment of other cells. This study aims to evaluate the role of mast cells in inflammation induced by BjV in mice genetically selected for maximum (AIRmax) or minimum (AIRmin) acute inflammatory response. Animals were treated with mast cell degranulation inhibitor cromolyn (CROM) and received BjV, and showed similar edema formation in response to BjV. AIRmax mice exhibited greatest pain than AIRmin, which was inhibited by CROM. BjV increased peritoneal cells number in AIRmax, as well as the number of macrophages, and diminished the number of mast cells. BjV also increased neutrophils and ROS production in AIRmax, which was inhibited by CROM. These results shows, therefore, that AIRmax mice exhibit more pain, macrophage and neutrophil migration, and ROS production than AIRmin mice, being all these reactions reduced when mast cells are inhibited.

No Brasil, ocorrem anualmente mais de 20.000 acidentes ofídicos, sendo mais de 80 por cento por espécies do gênero Bothrops. Envenenamentos por serpentes desse gênero raramente causam óbito mas, muitas vezes, levam a necrose e infecção secundária, que podem determinar a perda de um membro acometido ou de segmento desse. A dose de soro antibotrópico utilizada para o seu tratamento é baseada na gravidade do envenenamento ao exame inicial. Vários fatores têm sido associados a essa gravidade, mas poucos são os dados científicos e nenhuma avaliação foi feita para acidentes comprovadamente causados por B. jararaca. O presente estudo teve como objetivo identificar: as variáveis associadas à ocorrência de necrose; as variáveis asociadas à ocorrência de abscesso; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de necrose; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de abscesso. Foram analisados no presente estudo 779 casos de acidentes por B. jararaca atendidos no Hospital Vital Brazil do Instituto Butantan, no período de 1982 a 1990. Os dados foram levantados a partir de prontuários médicos arquivados nesse hospital. Os casos que apresentaram necrose e os que evoluiram para abscesso, foram comparados no que se refere a uma série de variáveis, respectivamente, com aqueles que não apresentaram necrose e não evoluiram para abscesso. Correlacionaram-se estatisticamente à análise bivariada com necrose e abscesso (p < 0,05) o acidente por serpentes de grande porte (> 60cm), a picada em perna, o uso de torniquete, a presença de dor, edema, equimose, bolha, choque, sangramento fora da região da picada. Acidentes em determinados meses do ano, picadas nos dedos da mão e alteração da coagulação sanguínea só se correlacionaram com necrose (p < 0,05). Mostraram-se fatores prognósticos independentes para necrose à análise multivariada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento, 60 - 80cm, 80 - lOOcm, 100 - 140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picadas no dedo da mão, e na perna; uso de torniquete; ocorrência de sangramento. Mostraram-se fatores prognósticos independentes para abscesso, à análise multi variada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento 60-80cm, 80- lOOcm, 100-140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picada na perna; alteração da coagulação sanguínea; ocorrência de sangramento. Conclui-se que, as variáveis relacionadas com necrose e aquelas relacionadas com abscesso, os fatores prognósticos independentes para necrose e aqueles para abscesso, são os apresentados acima e que o porte de B. jararaca é o fator prognóstico independente mais importante para necrose e, principalmente, para abscesso, que são tanto mais freqüentes quanto maior o comprimento da serpente. / There is an annual incidence of over 20 000 snakebite cases in Brazil; of these over 80 per cent are caused by Bothrops species. Bothropic envenoming commonly causes necrosis and secondary infection which may lead to loss of part or of all the bitten limb. Fortunately fatalities are rare. During treatment, the dose of antivenom administered is based on the clinical severity of the envenoming. Several factors have been shown to be associated with the severity of the envenoming, however data are scarce and no such studies on Bothrops jararaca exist. The objective of this study was to identify the following: the variables associated with necrosis; the variables associated with abscess formation; the independent prognostic factors of necrosis; the independent prognostic factors of abscess formation. The study analysed 779 B. jararaca envenoming cases admitted from the Hospital Vital Brazil of the Instituto Butanatan in the period from 1982 to 1990. Data were taken from medical records in this hospital. Occurrence of necrosis or of abscesses was independently compared, in the light of a series of specific variables, with cases in which, necrosis or abscesses did not occur. Occurrence of necrosis and of abscess (p<0,05) was correlated by bivariable statistical analysis with the following: bites caused by large-sized snakes (>60cm in length); bites on the leg; use of tourniquet; presence of pain, oedema, equimosis, blisters, shock; and systemic bleeding. Occurrence of necrosis (p<0.05) was only correlated with bites on the fingers, impaired blood coagulability, and with accidents grouped according to the month of the year. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic factors for necrosis: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80- l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on fingers and legs; use of tourniquet; and the presence of haemmorrhage. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic indicators for abscess formation: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80-l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on the leg; impaired blood coagulability; and the presence of haemmorrhage. It is concluded that the forementioned are: associated factors of necrosis and abscess formation; and the independent prognostic factors of necrosis; and independent prognostic factors of abscess. The size of B. jararaca responsible for the bite was shown to be the most important independent prognostic factor of necrosis and, even more so, of abscess.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-04-03T16:56:41Z No. of bitstreams: 1 Oliveira, Eduardo Coriolano de [Dissertação, 2011].pdf: 1135569 bytes, checksum: 8920e224ba454e60a5daa5d299a3e9bb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-03T16:56:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira, Eduardo Coriolano de [Dissertação, 2011].pdf: 1135569 bytes, checksum: 8920e224ba454e60a5daa5d299a3e9bb (MD5) / O envenenamento ofídico, dentre os acidentes com animais peçonhentos é o mais importante deles, pela sua frequência e gravidade. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90 % dos acidentes ofídicos. Os extratos vegetais apresentam uma diversidade de moléculas com diversas ações farmacológicas. As espécies de Clusia são de grande interesse paisagístico, porém duas espécies deste gênero, C. torresii Standl. e C. palmana Standl. apresentam propriedades antiofídicas contra o veneno de B. asper. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar as propriedades antiofídicas da espécie Clusia fluminensis Planch & Triana, utilizando diferentes partes vegetais e solventes de diferentes polaridades para o preparo dos extratos, assim como uma benzofenona isolada do extrato hexânico da flor, frente atividades biológicas do veneno de B. jararaca. Ensaios in vitro mostraram que os extratos hexânicos e metanólicos das folhas e frutos, na proporção de 1:50 (veneno:extrato) foram capazes de inibir 100 % a atividade proteolítica do veneno de B. jararaca (9 μg/mL), usando-se azocaseína como substrato; com exceção do extrato hexânico do caule e da benzofenona que inibiram cerca de 50 %. Na atividade hemolítica do veneno de B. jararaca (88 μg/mL), a inibição foi de 40 %, nas proporções de 1:10 e 1:20. Por outro lado, os extratos nestas mesmas proporções não foram capazes de neutralizar a coagulação do plasma induzida pelo veneno de B. jararaca (22 μg/mL), de forma significativa. Em ensaios in vivo (atividade hemorrágica) apenas o extrato acetônico do fruto, na proporção de 1:20, foi capaz de reverter totalmente a hemorragia causada pelo veneno de B. jararaca (16,7 μg/g). Sendo assim, nossos resultados mostram que a planta C. fluminensis pode ser uma fonte de moléculas com propriedades antiofídicas, especificamente contra o veneno de B. jararaca, e que este efeito neutralizante está diretamente relacionado a parte do vegetal e a polaridade do solvente utilizado na extração, Além disso podemos concluir que a benzofenona não é responsável, isoladamente, pelos resultados obtidos / Snake venom poisoning, among accidents with venomous animals is the most important of them, by their frequency and severity. In Brazil, Bothrops are responsible for 90 % of snake bites. The plant extracts have a variety of molecules with several pharmacological actions. Clusia species are of great landscape interest, but two species of this genus, C. torresii Standl. and C. palmana Standl. have properties against snake venom B. asper. The aim of our study was to evaluate the antivenom properties the species Clusia fluminensis Triana & Planch, using different plant parts and solvents of different polarities for the preparation of extracts, as well as a benzophenone isolated from the hexane extract of the flower, against biological activity of the venom of B. jararaca. In vitro assays showed that the hexane and methanolic extracts of leaves and fruits at a ratio of 1:50 (venom: extract) were able to inhibit 100 % proteolytic activity of the venom of B.jararaca (9μg/mL), using azocaseíne as substrate, with the exception of hexanic extract from stem and benzophenone which inhibited about 50 %. In the hemolytic activity of the venom of B. jararaca (88 μg/mL), inhibition was 40 %, the proportions of 1:10 and 1:20. On the other hand, the same proportions in these extracts were not able to neutralize the plasma coagulation induced by the venom of B. jararaca (22 μg/mL) significantly. In vivo assays (hemorrhagic activity) only the acetone extract of the fruit was able to totally reverse bleeding caused by the venom of B. jararaca (16,7 μg/g). Thus, our results show that the plant C. fluminensis can be a source of molecules with neutralizing properties of snake venom, specifically against the venom of B. jararaca, and that the neutralizing effect is directly related to part of the plant and the polarity of the solvent used in extraction, we can also conclude that benzophenone is not responsible alone for the results

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores &alpha; e &beta;, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores &alpha; e &beta; (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores &alpha; e &beta;. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores &alpha; e &beta; e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both &alpha;1- and &beta;-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of &alpha;1- and &beta;-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by &alpha;1- and &beta;-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of &alpha;1- and &beta;-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

O objetivo deste trabalho foi analisar a relação entre estrutura e função dos domínios não catalíticos do HF3, uma metaloproteínase da classe P-III do veneno da Bothrops jararaca com atividades hemorrágica e pró-inflamatória. Mostramos que proteínas recombinantes contendo o domínio rico em cisteínas (domínios tipo-disintegrina/rico em cisteínas, DC, e domínio rico em cisteínas, C) são capazes de aumentar o rolamento de leucócitos na microcirculação e de inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. Por outro lado, a proteína D e a proteína DC contendo a mutação Asp/Ala no motif Glu-Cys-Asp não apresentaram estas atividades. Peptídeos derivados da região hiper variável (HVR) do domínio rico em cisteínas também promoveram o rolamento de leucócitos, sendo esta atividade foi inibida por anticorpos anti-aMb2, e ainda inibiram a agregação plaquetária. Em conjunto, estes resultados sugerem que o domínio rico em cisteínas do HF3 e sua HVR desempenham um papel em sua atividade pró-inflamatória mediada pela integrina aMb2, e na inibição da agregação plaquetária. / This aim of this study was analyze the relationship between structure and function of the non-catalytic domains of HF3, a hemorrhagic and pro-inflammatory metalloproteinase of the P-III class, from Bothrops jararaca venom. Here we show that recombinant proteins of HF3 containing the cysteine-rich domain (disintegrin-like/cysteine rich and cysteine-rich proteins) but not the disintegrin-like protein and a disintegrin-like/cysteine rich protein carrying the mutation Asp/Ala in the Glu-Cys-Asp motif were able to significantly increase leukocyte rolling in the microcirculation and to inhibit collagen-induced platelet aggregation. Peptides from the hyper variable region (HVR) of the cysteine-rich domain also promoted leukocyte rolling and this activity was inhibited by anti-aMb2 antibodies. HVR peptides also inhibited platelet-aggregation. Taken together, these results suggest that the cysteine- rich domain of HF3 and its HVR play a role in triggering pro-inflammatory effects mediated by integrin aM/b2 and in the inhibition of platelet-aggregation.

As Fosfolipases A2 (PLA2) são enzimas que atuam desconstruindo membranas celulares, resultando em ácidos graxos e lisofosfolipidios, causando inflamação tecidual. Evidências indicam que serpentes possuem uma resistência natural devido a propriedades presentes no sangue, que inibem ações de proteínas presentes no veneno. Portanto, no presente trabalho foi isolado e caracterizado bioquimicamente e biologicamente o primeiro inibidor de PLA2 do tipo gama (&#947;PLI) do soro da serpente B. jararaca, denominado PLI_BJ. O inibidor de PLA2 foi isolado utilizando dois passos cromatográficos. O PLI_BJ mostrou, por SDS-PAGE, uma massa molecular aparente de 25 000 e 20 000 em condições redutoras e não redutoras, respectivamente. A sequência de aminoácidos parcial de PLI_BJ foi determinada por espectrometria de massa e corresponde a 72% e 68% de cobertura da sequência de aminoácidos de duas proteínas já descritas como PLI. O PLI_BJ mostrou também atividade inibitória satisfatória nos três testes realizados sugerindo um papel deste inibidor nos efeitos de envenenamento da serpente. / Phospholipases A2 (PLA2) are enzymes that act on cell membrane phospholipids resulting in fatty acids and lysophospholipids, deconstructing the cell wall causing tissue inflammation. Evidence indicates that snakes have natural resistance due to protective properties of blood that inhibits the action of proteins present in the venom. This study aimed to purify and characterize PLA2 inhibitors (PLI) from serum of the Bothrops jararaca snakes. PLA2 inhibitor was isolated using two chromatographic steps, and was named PLI_BJ. The purity of the PLI_BJ was confirmed by HPLC and SEC. The PLI_BJ showed, by SDS-PAGE, an molecular mass of 25,000 and 20,000 under reducing and non-reducing conditions, respectively. The partial amino acid sequence of PLI_BJ was determined by mass spectrometry and it corresponds to 72% and 68% of coverage of the amino acid sequence of two proteins already described as PLI. The PLI_BJ also showed satisfactory inhibitory activity in the three tests performed suggesting a role of this inhibitor in snake envenomation effects.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-27T13:21:42Z No. of bitstreams: 1 Ana Tereza Barufi Franco.pdf: 4866107 bytes, checksum: ed3e675a1fc6ca76bcd7853ae5fb75d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T13:21:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Tereza Barufi Franco.pdf: 4866107 bytes, checksum: ed3e675a1fc6ca76bcd7853ae5fb75d2 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / The Bothropoides and Bothrops gender are responsible for the largest number of snakebites in Brazil, presenting serious systemic effects that induce pathophysiological alterations characterized by local reactions such as edema , myonecrosis, pain and hemohrrage. The antivenom is used to neutralize the greatest possible amount of circulating venom, minimizing its systemic effects. But its action does not extend to local manifestations. The low level laser therapy is an alternative treatment in situations of local lesions due to its biological effects, and is considered a biostimulate resource to the tissues . The aim of this study was to analyze the effect of low power laser -red wavelength of 660 nm, and the infrared laser- wavelength 780 nm, in endothelial cells submitted to injury by Bothropoides jararaca venom. The results showed that the snake venom affected the integrity of endothelial, in all concentrations (1, 5, 10, 12,5, 25 and 50 µg/mL); and affected the viability of endothelial cell in 10 µg/ mL at all time periods analyzed . To evaluate the protective effect of the laser, the dose of 4 J/cm2 reduced the detachment of endothelial cells by improving cellular integrity . This effect was observed in a wavelength of 660 nm at 60 and 120 minutes. The same effect was not observed with the wavelength of 780 nm. So, the present study allowed us to better understand the pathophysiological effects of Bothropoides venom, and contributed to a better understanding of the effects of low power laser and eventually facilitate therapeutic measures more efficient and / or complementary. / As serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são as responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos no Brasil, apresentando efeitos sistêmicos graves, além de induzirem um quadro fisiopatológico caracterizado por reações locais como edema, mionecrose, dor e hemorragia. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende as manifestações locais. A laserterapia de baixa potência é uma alternativa de tratamento em situações de lesão local, devido a seus efeitos biológicos, sendo considerado um recurso bioestimulante em tecidos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do laser de baixa potência vermelho- comprimento de onda de 660 nm; e o laser infravermelho- comprimento de onda 780 nm, em monocamada de células endoteliais submetidos à lesão por veneno de Bothropoides jararaca. Os resultados obtidos mostraram que o veneno, afetou a integridade das monocamadas de células endoteliais em todas as concentrações analisada (5, 10, 12,5, 25 e 50L/mL) em todos os períodos de tempo analisados. Para avaliação do efeito protetor do laser, a dose usada de 4 J/cm2 reduziu o descolamento de células endoteliais melhorando assim a integridade celular. Esse efeito foi observado nos comprimentos de onda de 660 nm nos tempos de 60 e 120 min, o mesmo efeito não foi observado com o comprimento de onda 780 nm. Desta forma, este estudo permitiu entender melhor os efeitos fisiopatológicos do envenenamento botrópico, bem como contribuiu para a melhor compreensão dos efeitos do laser de baixa potência e, eventualmente, favorecer medidas terapêuticas mais eficientes e/ou complementares.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:16Z : No. of bitstreams: 1 salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf: 205572 bytes, checksum: ea2da7983b8e624b8fb6f242a2874147 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-03-16T11:30:15Z: salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-03-16T11:31:00Z : No. of bitstreams: 1 000709624.pdf: 1507151 bytes, checksum: e7624c11b3bf8ce0e311b5d40988f595 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... / Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Roberto Morato Fernandez / Banca: Antonio Sérgio Kimus Braz / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O envenenamento ofídico é considerado uma condição tropical negligenciada pela OMS, e no Brasil, o gênero Bothrops está envolvido na maioria dos casos. Primeiramente, estudamos a atividade hidrolítica do veneno de B. jararaca sobre peptídeos biologicamente ativos que podem estar relacionadas com o envenenamento. A hidrólise dos peptídeos que foram substratos para as serinopeptidases não foi eficientemente bloqueada pelo soro antibotrópico produzido pelo Instituto Butantan e, portanto, as causas dessas falhas foram investigadas. Para isso, purificamos quatro serinopeptidases não bloqueadas pelo soro e, por estudos imunoquímicos, observamos que apesar deste não bloquear as atividades destas enzimas, o mesmo é capaz de reconhecê-las. Portanto, decidimos obter soros experimentais contra estas moléculas utilizando camundongos, a fim de compará-los com o soro comercial. Os soros experimentais contra as serinopeptidases mostraram capacidade de reconhecimento e alta afinidade contra elas, e mais importante, capacidade de neutralizar suas atividades in vitro. / Snakebite is considered a neglected tropical condition by WHO, and in Brazil, the Bothrops genus is involved in most of the cases. Initially, we have studied the B. jararaca venom activity over bioactive peptides which could be related with the envenomation. The hydrolysis of the peptides substrate for serinepeptidases were not efficiently blocked by the Butantan Institute bothropic antivenom, therefore, the causes of this flaw were investigated. Thereafter, we purified four serinepeptidases not blocked by the antivenom and, by immunochemistry analysis, we observed that although it could not neutralize the activity, it could well recognize these proteins. Thus, we decided to obtain experimental sera against these serinepeptidases in mice, in order to compare it with the commercial antivenom. The experimental sera against these enzymes demonstrated recognition capability and high affinity, and most important, the ability to neutralize their activity in vitro.