Die Ursachen für genetisch bedingte neurologische Entwicklungsstörungen sind sehr vielfältig. Aufgrund der heterogenen und unspezifischen klinischen Präsentation ist eine eindeutige Diagnosestellung durch eine rein klinische Beschreibung selten möglich. Eine frühzeitige und effiziente Diagnosestellung erspart den Betroffenen und auch dem Gesundheitssystem unnötige Untersuchungen und Krankenhausaufenthalte und verbessert die prognostischen und therapeutischen Möglichkeiten. Mit Hilfe der massiven Parallelsequenzierung, der Next-Generation-Sequencing Technologie, sind in den letzten Jahren bereits über tausend krankheitsassoziierte Gene für NDD identifiziert worden. Weltweit werden mittels der Sequenzierung und Auswertung von tausenden Exomen betroffener Menschen große Studien zur Identifizierung neuer valider Kandidatengene durchgeführt. Die Zahl valider Kandidatengene bleibt, im Vergleich zum Aufwand, jedoch hinter den Erwartungen zurück. Am Institut für Humangenetik Leipzig wird daher von jedem Fall einer neurologischen Entwicklungsstörung, soweit Material und Einwilligung der Betroffenen vorhanden sind, ein Trio-Exom sequenziert. Das bedeutet, dass die Exome der Eltern oder der Geschwister mit dem Exom des betroffenen Menschen verglichen werden. Somit ist es möglich, Varianten in bereits bekannten krankheitsassoziierten Genen zu finden und folgend eine genetische Diagnose zu stellen. Wenn in dieser Routinediagnostik keine Diagnosestellung möglich war, analysierte ich die Trio-Exome erneut auf Forschungsbasis, um mögliche, bisher noch nicht bekannte neue Kandidatengene zu finden, welche die Erkrankungen der Betroffenen erklären können. Um die Masse an Kandidatengenvarianten einzugrenzen, eine Vergleichbarkeit von verschiedenen Kandidatengenvarianten zu schaffen und die wissenschaftlichen Ressourcen bestmöglich zu nutzen, entwickelte ich einen Kandidatengenscore zur Priorisierung jeder einzelnen Variante. Dieser Score besteht aus 4 Übergruppen zusammengesetzt aus 12 verschiedenen Parametern, welche die Eigenschaften des konkreten Vererbungsmodus, des einzelnen Gens, der spezifischen Variante und Aspekte der Literaturrecherche widerspiegeln. Aus der untersuchten Kohorte von 198 Betroffenen mit neurologischen Entwicklungsstörungen konnten 63 Fälle in der Routinediagnostik mit einer klaren genetischen Diagnose geklärt und in den restlichen ungeklärten Fällen insgesamt 158 Kandidatengenvarianten identifiziert werden. Allein aus den Top 15% (21 Kandidatengene) der gescorten Kandidatengene, wurden bisher bereits 10 Gene als krankheitsverursachend durch Publikationen validiert. Diese Gene sind TANC2, GLS, ACTL6B, GRIN3B, CUX1, UNC13A, GRIA4, MAPK8IP3, CACNB4 und WDFY3. An den Publikationen von TANC2 und WDFY3 arbeitete ich im Zuge meiner Doktorarbeit aktiv als Co-Autor mit. Als Erstautor und als Grundlage dieser publikationsbasierten Dissertation konnte ich ein neues rezessiv-vererbtes Krankheitsbild ausgelöst durch Varianten im GLS-Gen beschreiben: Im Rahmen der wissenschaftlichen Auswertung der Trio-Exome und während der Entwicklung des Kandidatengenscores fielen zwei Fälle mit gleichem Kandidatengen und ähnlicher klinischer Symptomatik auf. Zwei nicht verwandte Kinder von gesunden Eltern besaßen rezessive Varianten im GLS-Gen, welches das Enzym Glutaminase kodiert. Beide Betroffenen verstarben innerhalb des ersten Lebensmonats an einer sich rasch entwickelnden epileptischen Enzephalopathie. Des Weiteren wurden in beiden Fällen verstorbene Geschwisterkinder beschrieben, welche an vergleichbaren Symptomen kurz nach der Geburt verstarben. Da das Enzym Glutaminase ein wichtiger Bestandteil der Glutamin/Glutamat-Homöostase ist und Glutamat einen wichtigen Neurotransmitter des Menschen darstellt, lag die Vermutung nahe, dass eine Störung des Glutamat-Stoffwechsels zu neurologischen Entwicklungsstörungen führen kann. In Zusammenarbeit mit der niederländischen Arbeitsgruppe um Prof. van Hasselt konnten erhöhte Glutaminkonzentrationen in den Trockenblutkarten des Neugeborenenscreenings der beiden verstorbenen Geschwister einer Familie nachgewiesen werden. Ebenfalls war es möglich, die von jeweils einem Elternteil vererbten compound heterozygoten Varianten in beiden Erbanlagen der verstorbenen Geschwister nachzuweisen und das gemeinsame Auftreten beider Varianten im genetischen Code der gesunden Geschwister auszuschließen. Somit konnte durch die Entwicklung des Kandidatengenscores mit Priorisierung der verschiedenen Kandidatengene und Fokussierung auf die vielversprechendsten Gene mit folgender intensiver wissenschaftlicher Evaluation ein neues autosomal rezessives Krankheitsbild beschrieben werden, welches aufgrund von Varianten im GLS-Gen zu einer neonatalen, tödlich verlaufenden Enzephalopathie führt. Mit Hilfe des Kandidatengenscores ist es gelungen, sich auf die überzeugendsten neuen Kandidatengene zu fokussieren, neue wissenschaftliche Kooperationen zu knüpfen und hierdurch die Liste an validen krankheitsassoziierten Genen, wie zum Beispiel des GLS-Gens, zu erweitern. Der Kandidatengenscore wird weiterhin am Institut für Humangenetik Leipzig erfolgreich eingesetzt.

Das Hauptziel der Untersuchung der Artenvielfalt syrischer Araber war die Identifizierung der Populationsstruktur in einer Reihe von syrischen Araberpferden, die die drei Hauptstämme Saglawi, Kahlawi und Hamdani repräsentieren. Für die Studie wurden molekulare Marker der Sequenzdaten der 353 bp der hypervariablen Region der mitochondrialen D-Schleife, sowie der Daten von 12 Pferde-Mikrosatelliten und 38.671 genomweite SNPs verwendet. Kenntnisse über die Variabilität der Ausdauer sowie über morphologische Eigenschaften sind in Zuchtprogrammen von Vorteil. Wir haben in einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) getestet, ob es einen kausalen Zusammenhang zwischen morphologischen Merkmalen und Variabilität der Ausdauer mit genetischen Polymorphismen gibt.Darüber hinaus haben wir Kandidatengene näher charakterisiert, welche zu dem komplexen Merkmal der Ausdauerleistung beitragen könnten. / The major objective of studying the biodiversity of Syrian Arabian horses was to identify the population structure in a set of Syrian Arabian horses representing the three major strains Saglawi, Kahlawi, and Hamdani. For the study, we used different genetic markers. The variability of endurance and morphological traits are beneficial in breeding programs. We tested genome-wide associations (GWAS) to find a causal relationship between morphological traits and genetic variants. Furthermore, we used the candidate gene approach to investigate the variability of genes contributing to endurance performance.

Ziel unserer molekulargenetischen Studien ist es, Gene der genetisch komplexen idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE) im Genom des Menschen zu lokalisieren und die verantwortlichen Genstörungen durch die Mutationsanalyse von positionell und funktionell plausiblen Kandidatengenen zu identifizieren. Unsere Kopplungsanalysen konnten einen IGE-Locus (Locus-Symbol: EJM1) in der chromosomalen Region 6p21.3 bestätigen und die Kandidatengenregion auf ein chromosomales Segment von 10 centiMorgan (cM) eingrenzen. Ein positionell und funktionell plausibles Kandidatengen ist das Gen einer Untereinheit des heterodimeren GABAB Rezeptors (Gen-Symbol: GABA-BR1). Die systematische Mutationsanalyse des GABA-BR1 Gens und eine Assoziationsstudie mit drei Sequenzpolymorphismen in den Exonen 1a1, 7 und 11 ergaben keinen Anhalt für eine Beteiligung des GABA-BR1 Gens bei der Epileptogenese der IGE. Kopplungshinweise in den chromosomalen Regionen 20q13, 8q24 und 15q14 konnten wir in unserem Familienkollektiv nicht bestätigen. Die Mutationsanalyse der Kandidatengene CHRNA4 und KCNQ2 in der Kandidatengenregion 20q13 und von zwei Kalziumkanal-Genen (CACNA1A, CACNB4) ergaben keinen Hinweis auf disponierende Sequenzvarianten bei IGE-Patienten. Unsere systematische Genomanalyse bei 130 Familien mit mehreren IGE-Angehörigen zielte auf die positionelle Eingrenzung von Genstörungen, die an der Disposition eines breiten IGE-Spektrums beteiligt sind. Bei 360 der 694 Familienangehörigen lag ein IGE-Phänotyp vor. Bei 617 Familienangehörigen wurden für die systematische Genomanalyse insgesamt 416 Mikrosatelliten-Polymorphismen mit einem durchschnittlichen Abstand von 10 cM genotypisiert. Die parameter-freien Kopplungsanalysen ergaben einen signifikanten Kopplungsbefund in der chromosomalen Region 3q26 (P = 1,7 x 10-5 bei D3S3725) sowie zwei Kopplungshinweise in den chromosomalen Regionen 2q36.1 (P = 5,4 x 10-4 bei D2S1371) und 14q23 (P = 5,6 x 10-4 bei D14S63). Positionell und funktionell plausible Kandidatengene sind die Gene des Kalium-Kanals KCNA1B und des Chlorid-Kanals CLCN2 in der Region 3q26, das Gen des Chlorid-Bikarbonat Austauschers SLC4A3 in der Region 2q36, und das Gen des Natrium-Kalzium Austauschers SLC8A3 in der Region 14q23. Der molekulargenetische Nachweis von Genmutationen für die IGE wird konkrete Einblicke in die molekularen Mechanismen der Epileptogenese eröffnen und die Voraussetzungen dafür schaffen, rational begründete Therapieansätze zu entwickeln. / The aim of our molecular genetic studies is to map genes of the genetically complex idiopathic generalized epilepsies on the human genome and to identify the causative gene variants by mutation analyses of positional and functional plausible candidate genes. Our linkage studies confirmed an IGE-locus (locus symbol: EJM1) in the chromosomal region 6p21.3 and to refine the candidate region to a chromosomal segment of 10 centiMorgan (cM). A positional and functional candidate gene is the gene encoding a subunit of the heterodimeric GABAB receptor (gene symbol: GABA-BR1). The systematic mutation screening of the GABA-BR1 gene and an association analysis with three sequence polymorphisms in exons 1a1, 7 and 11 provided no evidence that the GABA-BR1 gene confers susceptibility to the epileptogenesis of IGE. We failed to replicate previous linkage findings in the chromosomal regions 20q13, 8q24 and 15q14 in our family sample. Mutation analysis of the candidate genes CHRNA4 and KCNQ2 and two genes encoding calcium channel subunits (CACNA1A, CACNB4) did not detect common susceptibility alleles in IGE patients. Our systematic genome scan was designed to identify susceptibility loci that predispose to a broad spectrum of common IGE syndromes. Our study included 130 families with two or more siblings affected by an IGE. In total, 360 out of 694 family members were affected by an IGE-trait. 617 family members were genotyped for 416 microsatellite polymorphisms with an average distance of 10 cM. Non-parametric linkage analysis provided significant evidence for a novel IGE susceptibility locus on chromosome 3q26 (ZNPL = 4.19 at D3S3725; P = 0.000017) and suggestive evidence for two IGE loci on chromosome 14q23 (ZNPL = 3.28 at D14S63; P = 0.000566), and chromosome 2q36 (ZNPL = 2.98 at D2S1371; P = 0.000535). Positional and functional candidate genes include the potassium channel gene KCNA1B and the chloride channel gene CLCN2 in the region 3q26, the chloride-bicarbonate anion exchanger gene SLC4A3 in the region 2q36, and the sodium-calcium exchanger gene SLC8A3 in the region 14q23. The molecular genetic detection of susceptibility genes for IGE will provide clues to elucidate the complex molecular pathways of epileptogenesis, and, finally, will help to develop rational treatment strategies.

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Einleitung: In der Tiermedizin sind nahezu 800 erblich bedingte Erkrankungen bekannt. Praktisch alle Hunderassen leiden unter solch einer Erkrankung. Für die Ausprägung der Brachyzephalie gibt es derzeit keinen eindeutigen Hinweis auf eine zugrundeliegende Genveränderung. In der Humanmedizin ist die kongenitale Brachyzephalie Folge einer Kraniosynostose (vorzeitigen Verknöcherung einer oder mehrerer Schädelnähte). Für die verschiedenen syndromalen Kraniosynostosen sind die verantwortlichen Gendefekte bereits definiert. In der Tiermedizin können in Analogie entsprechende Kandidatengene postuliert werden. Ob Veränderungen in diesen Kandidatengenen tatsächlich zu einer vergleichbaren klinischen Ausprägung der kaninen Brachyzephalie führen, wurde für das FGFR2-Gen in dieser Arbeit untersucht. Ziel: Ziel dieser Arbeit war es die Hypothese zu prüfen, dass Veränderungen in Genen, die bekannterweise bereits in der Humanmedizin in Zusammenhang mit genetisch bedingter Brachyzephalie stehen, auch für die kanine Brachyzephalie als Kandidatengene fungieren können. Tiere und Methoden: Für die Untersuchungen wurden EDTA-Blutproben und Maulschleimhautabstriche verwendet. Insgesamt wurde eine Gruppe von 106 Tieren untersucht, davon waren 51 Tiere vom Phänotyp normozephal und umfassten 33 verschiedene Rassen. 55 Tiere entsprachen dem brachyzephalen Phänotyp, gehörten zu den Rassen FB, Mops, EB, BT und OEB und wurden in der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig zur Behandlung eines BAS vorstellig. Die Proben wurden am Institut für angewandte Humangenetik und Onkogenetik durch die Autorin weiterverarbeitet. Die Auswahl eines geeigneten Kandidatengens erfolgte durch den Vergleich des humanen und kaninen Phänotyps und der klinischen Merkmale von an Kraniosynostose-Syndromen erkrankten Menschen mit brachyzephalen Hunden sowie anhand von Literaturrecherche. Die DNA wurde isoliert, amplifiziert und nach Erstellung der für das Kandidatengen spezifischen Primer, sequenziert und analysiert. Ergebnisse: Sowohl der phänotypisch-klinische Vergleich zwischen humaner und kaniner Brachyzephalie als auch die Literaturrecherche ergaben, dass das FGFR2-Gen ein ideales Kandidatengen darstellt. Die Erstellung spezifischer Primer für den proteincodierenden Bereich dieses Gens war erfolgreich. Die Sequenzanalyse identifizierte 3 Lokalisationen auf 2 der 17 sequenzierten Exon-Abschnitte des kaninen FGFR2-Gens, die eine Sequenzabweichung aufwiesen. Sie wurden im Folgenden als Varianten VarE2, VarE7 und VarE7AB bezeichnet. Es gab einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem Auftreten aller 3 Varianten und der Gruppe „Rasse Brachyzephal“ (Chi2-Wert > 3,841, p-Wert < 0,05), jedoch keinen Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Varianten und der Normozephalen-Gruppe. Ein Zusammenhang der VarE2 und der Patientengruppe (Normo-/Brachyzephal) konnte ebenfalls ausgeschlossen werden, somit auch der Zusammenhang dieser Variante mit dem Auftreten des brachyzephalen Phänotyps. Die VarE7 trat bei 53 % (29/55) der Brachyzephalen-Gruppe auf. Innerhalb der Gruppe wies die FB mit 90 % (19/21) den höchsten Wert auf, diesem stand der Mops mit einem Auftreten der Variante von nur 22 % (4/18) gegenüber. Die Normozephalen-Gruppe wies, bezogen auf VarE7, lediglich einen Anteil von 28 % (14/50) auf, wobei innerhalb der Gruppe das Auftreten von 40 % nicht überschritten wurde. Die VarE7AB trat bei 47 % der Brachyzephalen-Gruppe auf, dabei hielt die Rasse Mops den höchsten Anteil von 78 % (14/18). Im Vergleich dazu tauchte diese Variante innerhalb der Normozephalen-Gruppe mit einem vergleichsweise hohen Anteil von 74 % (37/50) auf, wobei das Auftreten innerhalb dieser Gruppe einen relativ gleichmäßig hohen Anteil von 60 - 88% aufwies. Schlussfolgerungen: Ein klinisch-morphologischer Vergleich zwischen humanen und kaninen Kraniosynostose-Syndromen ist möglich. Ob Mutationen in Kandidatengenen (z.B. FGFR2) des Menschen auch in den analogen Genen beim Hund nachgewiesen werden können, wurde in dieser Arbeit geprüft. Erstmals wurde die Sequenz des kaninen FGFR2-Gens auf Sequenzabweichungen hin analysiert. Die dabei detektierte Variante VarE7 zeigte einen statistisch signifikanten Zusammenhang mit dem Auftreten des Phänotyps 'Brachyzephalie' bei der Französischen Bulldogge. Eine weitere Variante, Var7AB, konnte als statistisch signifikant im Zusammenhang mit dem Auftreten des Phänotyps 'Brachyzephalie' bei der Rasse Mops identifiziert werden. Dieser Zusammenhang war allerdings nicht eindeutig verifizierbar. Weitere Studien, insbesondere Funktionsstudien, sind notwendig, um die Auswirkungen der Varianten im FGFR2-Gen auf den Phänotyp zu prüfen.

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