Le but du projet est le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour le diagnostic et le traitement du cancer du rein. Nous avons évalué différentes techniques comprenant la tomographie en cohérence optique et l’imagerie moléculaire. Nous avons évalué différents marqueurs potentiels pour l’imagerie moléculaire en étudiant l’expression de différents marqueurs dans le cancer du rein et leur association avec le pronostic de la maladie. Enfin, nous avons évalué deux techniques d’imagerie moléculaire sur des modèles précliniques : l’Imagerie par Résonnance Magnétique moléculaire et l’échographie moléculaire. / The aim of this project is the development of new imaging techniques for renal cancer diagnostic and treatment.We have assessed several techniques including optical coherence tomography and molecular imaging. We assessed a series of potential markers for molecular imaging by measuring some pre-defined markers expressions by immunohistochemistry in renal cell carcinoma and their association with disease’s prognostic. Finally, we assessed two molecular imaging techniques in pre-clinical models: Molecular Magnetic Resonance Imaging and Molecular Ultrasound Imaging.

Le cancer du rein compte parmi les 10 types de cancers les plus fréquents chez l’Homme. Il n’existe aujourd’hui aucun marqueur biomoléculaire dans ce type de cancer, et dans le cas d’un cancer métastatique, l’arsenal thérapeutique aujourd’hui disponible manque d’efficacité. Les différents processus mis en jeu lors de la progression tumorale sont encore mal connus. La connaissance de ces processus pourrait permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques, ainsi que des marqueurs biomoléculaires pronostiques ou diagnostiques de la maladie. Dans un premier projet, et afin de mieux comprendre les mécanismes de la progression tumorale et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles et de nouveaux marqueurs biomoléculaires dans le cancer du rein, un nouveau modèle innovant a été généré à partir d’une lignée tumorale de RCC murine. Ce modèle de réimplantations successives de cellules tumorales issues de tumeur primaire ou de métastases a permis de générer différentes lignées cellulaires montrant une agressivité accrue au cours des passages. En utilisant une stratégie de biologie des systèmes, ce modèle pourra permettre de mettre en évidence des cibles d’études prometteuses qui pourraient être de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouveaux marqueurs biomoléculaires dans le RCC. L’interleukine-34 est l’exemple d’une cible d’étude d’ores et déjà été sélectionnée, mettant en évidence la puissance du modèle généré. Dans un second projet, les rôles de certains membres de la matrice extracellulaire tumorale ont été évalués en utilisant cette même lignée de RCC murine (collagène de type I, fibronectine, matrigel). Cette étude a permis de mettre en évidence le potentiel pro-invasif et pro-métastatique du dépôt de collagène de type I dans les tumeurs. Des récepteurs activés par le collagène sont proposés comme potentiellement impliqués dans les effets induits par le collagène de type I dans le modèle. Ces deux projets permettent et permettront de mieux comprendre certains mécanismes de la progression tumorale, ainsi que de mettre en évidence des marqueurs biomoléculaires et de nouvelles cibles thérapeutiques. / Kidney cancer is one of the 10 commonest human cancers. To date, no biomolecular markers are available in this type of cancer, and in the case of metastatic cancer, the therapeutic arsenal is still inefficient. The different processes involved in cancer progression are still poorly understood. Understanding those processes could highlight new therapeutic targets, and new prognostic or diagnostic biomolecular markers of this disease. For a first project, a new innovative model has been generated from a murine RCC cell line as a tool to understand cancer progression mechanisms and to identify new therapeutic target and new biomolecular markers in kidney cancer. This model of sequential reimplantation of cancer cells isolated from primary tumours or metastases allowed us to generate different cell lines showing increased aggressiveness after passages. Using a systems biology strategy, this model will allow us to identify new potential therapeutic targets and new biomolecular markers in RCC. Interleukin-34 is an example of an already selected target, showing the power of the model generated. For a second project, the role of some members of extracellular matrix (collagen type I, fibronectin, matrigel).was studied using this same murine RCC cell line. This study demonstrated the potential pro-invasive and pro-metastatic roles of collagen type I deposition in tumors. Collagen-activated receptors are proposed as mediators of the effect induced by collagen type I in this model. Those two projects have and will continue to contribute to a better understanding of cancer progression mechanisms, and will bring out new biomolecular markers and new therapeutic targets.

Renal Cell Carcinoma (RCC) has low 5 year survival rate and is resistant to radiation and chemotherapy. Phenethyl Isothiocyanate (PEITC) is a naturally occurring phytochemical that has a variety of anti-cancer properties. Here we explore two anti-cancer properties of PEITC: induction of apoptosis and induction of cell cycle arrest in RCC cells and the underlying mechanisms. We used two human RCC cell lines Caki-1 and Caki-2. Survival and cell proliferation was assayed using Calcein AM. Annexin V staining was used to measure apoptosis. Caspase-3/7 induction was measured using a fluorescent substrate. Cell cycle was studied using Propidium Iodide staining. DNA damage was determined using phospho [gamma]-H2AX antibody. Protein expression and phosphorylation was determined using immunoblotting. PEITC significantly reduced survival of Caki-1 and Caki-2 cells and inhibited their proliferation as determined by Calcein AM. 15 and 20 [mu]M PEITC induced apoptosis in both cell lines and induced caspase-3/7 activity. Western blot analysis revealed caspase-8, caspase-9 and Bid cleavage as well as upregulation of the death receptors Fas and DR5. Lower doses (up to 10 [mu]M) arrested Caki-1 cells in G2/M phase, and this was associated with increased p38 and MK2 (Thr334) phosphorylation. The p38 inhibitor SB203850 inhibited this G2 arrest induced by PEITC. 15 and 20 [mu]M PEITC treatment resulted in increased [gamma]-H2AX phosphorylation suggesting DNA damage, but this was completely blocked by caspase inhibitor. In summary, our study shows that PEITC induces apoptosis in Caki-1 and Caki-2 cells by upregulating Fas and DR5 and activating the downstream apoptosis cascade. PEITC does not cause direct DNA damage to the cells; the observed DNA damage is a result of the apoptotic process and is blocked by caspase inhibitor. PEITC induces G2/M arrest in Caki-1 cells and the mechanism involves p38 phosphorylation which activates MK2. Inducing cell cycle arrest and apoptosis may play an important role in the anti-cancer properties of PEITC. Fully understanding the mechanism by which PEITC induces apoptosis and cell cycle arrest in RCC cells may lead to development of novel chemotherapeutic drugs against RCC. / text

La relation entre le risque de décès par cancer du poumon et l’exposition au radon est aujourd’hui établie, notamment à partir des études conduites chez les mineurs d’uranium. Mais de nombreuses interrogations persistent sur les risques de cancers extra-pulmonaires et de maladies non-cancéreuses, et sur l'impact sur la santé des autres expositions radiologiques professionnelles. L’objectif général de cette thèse est de contribuer à l’estimation des risques radio-induits aux faibles débits de dose au travers de l'analyse des risques de décès par cancer du rein et par Maladie de l'Appareil Circulatoire (MAC) chez les mineurs d’uranium.Les analyses du risque de décès par cancer du rein ont été réalisées au sein de la cohorte française des mineurs d'uranium (n=5 086 ; période de suivi : 1946-2007), la cohorte post-55 (n=3 377 ; période de suivi : 1957-2007) et la cohorte allemande de la Wismut (n=58 986; période de suivi : 1946-2003) au sein desquelles sont respectivement répertoriés 24, 11 et 174 décès par cancer du rein. L’exposition au radon et à ses descendants à vie courte (exprimée en Working Level Month WLM), aux poussières d’uranium (kBqh.m-3) et aux rayonnements gamma (mSv) a été estimée individuellement et la dose absorbée au rein a été calculée. La relation dose-réponse a été affinée par rapport à l'analyse classique en considérant deux types de réponse : le risque instantané de décès par cancer du rein (analyse classique, Cause-specific Hazard Ratio (CSHR) estimé avec le modèle de Cox) et sa probabilité d'occurrence au cours du suivi (Subdistribution Hazard Ratio (SHR) estimé avec le modèle de Fine & Gray). Un excès de mortalité par cancer du rein était observé dans la cohorte française (SMR = 1,62 IC95%[1,04; 2,41]), mais pas dans la cohorte post-55. Dans la cohorte de la Wismut, un déficit de mortalité par cancer du rein était observé (0,89 [0,78; 0,99]). Pour ces trois populations, aucune relation n'a pu être mise en évidence entre les expositions radiologiques (ou la dose au rein) et le risque de décès par cancer du rein (ex : CSHRWismut_radon/100WLM=1,023 [0,993; 1,053]), ni avec sa probabilité d'occurrence au cours du suivi (ex : SHRWismut_radon /100WLM=1,012 [0,983; 1,042]).L’étude du risque de décès par MAC dans la cohorte française a montré une augmentation significative du risque de décès par MAC (n=442, CSHR/100WLM=1,11 [1,01; 1,22]) et par Maladie CérébroVasculaire (MCeV, n=105, CSHR/100WLM=1,25 [1,09; 1,43]) avec l’exposition au radon. Une enquête cas-témoins nichée au sein de la cohorte a été mise en place pour recueillir dans les dossiers médicaux les facteurs de risque classiques de MAC (surpoids, hypertension, diabète...) pour 313 mineurs (76 décès par MAC (dont 26 par Cardiopathie Ischémique (CI) et 16 par MCeV) et 237 témoins). Pour les trois expositions radiologiques, la relation exposition-risque a été analysée au sein d'une pseudo-cohorte (obtenue en pondérant les observations par l'inverse de la probabilité de sélection, n=1 644 pseudo-individus) avec le modèle de Cox, en ajustant sur les différents facteurs de risque. L’association entre les expositions radiologiques et le risque de décès par MAC, CI ou MCeV n'était pas significative (ex : CSHRMAC_radon/100WLM=1,43 [0,71; 2,87]). La prise en compte des facteurs de risque ne modifiait pas sensiblement cette association.L'absence de relation dose-réponse significative suggère que l'excès de mortalité par cancer du rein chez les mineurs français serait induit par d'autres facteurs, non-disponibles pour cette analyse. La faible variation des coefficients avec l'ajustement sur les facteurs de risque de MAC dans l'enquête cas-témoins nichée soutient l'hypothèse de l'existence d'une augmentation du risque de MCeV dans la cohorte française associée à l’exposition au radon. La poursuite du suivi de la cohorte permettra d'affiner ces résultats. / The relation between lung cancer risk and radon exposure has been clearly established, especially from the studies on uranium miner cohorts. But the association between radon exposure and extrapulmonary cancers and non-cancer diseases remains not well known. Moreover, the health risks associated with the other mining-related ionizing radiation exposures are still under consideration. The aim of this thesis is to contribute to the estimation of the radio-induced health risks at low-doses through the analysis of the kidney cancer and Circulatory System Disease (CSD) mortality risks among uranium miners.Kidney cancer mortality risk analyses were performed from the French cohort of uranium miners (n=5086; follow-up period: 1946-2007), the post-55 cohort (n=3,377; follow-up period: 1957-2007) and the German cohort of the Wismut (n=58,986; follow-up period: 1946-2003) which included 24, 11 and 174 deaths from kidney cancer, respectively. The exposures to radon and its short-lived progeny (expressed in Working Level Month WLM), to uranium ore dust (kBqh.m-3) and to external gamma rays (mSv) were estimated for each miners and the equivalent kidney dose was calculated. The dose-response relation was refined considering two responses: the instantaneous risk of kidney cancer mortality (corresponding to the classical analysis, Cause-specific Hazard Ratio (CSHR) estimated with the Cox model) and its occurrence probability during the follow-up (Subdistribution Hazard Ratio (SHR) estimated with the Fine & Gray model). An excess of kidney cancer mortality was observed only in the French cohort (SMR = 1.62 CI95%[1.04; 2.41]). In the Wismut cohort, a decrease of the kidney cancer mortality was observed (0.89 [0.78; 0.99]). For these three cohorts, the occupational radiological exposures (or the equivalent kidney dose) were significantly associated neither with the risk of kidney cancer mortality (e.g. CSHRWismut_radon/100WLM=1.023 [0.993; 1.053]), nor with its occurrence probability during the follow-up (e.g. SHRWismut_radon /100WLM=1.012 [0.983; 1.042]).CSD mortality risk analyses in the French cohort showed a significant increase of the risks of mortality from CSD (n=442, CSHR/100WLM=1.11 [1.01; 1.22]) and from CerebroVascular Disease (MCeV, n=105, CSHR/100WLM=1.25 [1.09; 1.43]) with radon exposure. A case-control study nested in the French cohort was set up to collect the information related to CSD risk factors (overweight, hypertension, diabetes...) from the medical records of 313 miners (76 deaths from CSD (including 26 from Ischemic Heart Disease (IHD) and 16 from MCeV) and 237 controls). For the three radiological exposures, the exposure-risk relation was analyzed in a pseudo-cohort (n=1,644 pseudo-individuals, obtained from the weighting of the observations by their inverse selection probability) with the Cox model, adjusted for the CSD risk factors. The association between the radiological exposure and the risk of mortality from CSD, IHD or MCeV was not significant (e.g. CSHRCSD_radon/100WLM=1.43 [0.71; 2.87]). The adjustment for CSD risk factors did not substantially change the exposure-risk relation.The lack of a significant dose-response relation suggests that the excess of kidney cancer mortality among the French uranium miners may be induced by other risk factors, unavailable for this study. The small change of the coefficients observed after adjustment for CSD risk factors in the nested case-control study supports the assumption of the existence of the MCeV mortality risk increase associated with radon exposure in the French cohort of uranium miners. Future analyses based on further follow-up updates should allow to confirm or not these results.

Trotz der breiten Anwendung zielgerichteter Therapien und Immuncheckpoint-Inhibitoren, liegt die 5-Jahres-Überlebensrate beim metastasierten klarzelligen Nierenkarzinom (ccRCC) unter 15%. Um den Therapieerfolg für Patienten zu verbessern, werden neue Modelle benötigt, die die Tumorheterogenität rekapitulieren und eine personalisierte Therapieentwicklung ermöglichen. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit habe ich Organoidkulturen direkt aus Patiententumoren und sortierten Krebsstammzellen (CSCs) etabliert und diese Organoide im Detail charakterisiert. Die Rolle von WNT und NOTCH, die zuvor in ccRCC CSCs bestimmt wurde, wurde in Organoiden bestätigt und konnte mit Hilfe von molekularen Inhibitoren als therapeutische Schwachstelle ausgenutzt werden. Diese Ergebnisse heben das Potenzial von Patienten-abgeleiteten Organoiden (PDOs) für die personalisierte Medizin und das Potenzial von WNT und NOTCH Inhibierung in der ccRCC Behandlung hervor. PDOs stellen Werkzeuge für die personalisierte Medizin dar, geben jedoch wenig Einblick in die frühen Stufen der Tumorentstehung. Deshalb habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation VHL, PBRM1 und SETD2 – die drei am häufigsten mutierten Gene in ccRCC – mit einer induzierbaren CRISPR-Cas9 Strategie in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Nierenorganoiden targetiert. Ich differenzierte iPSCs in nierenspezifische Zelltypen aus sowohl metanephrischem Mesenchym als auch Ureterknospen-Epithelium. Knockout von VHL, PBRM1 und SETD2 führte zur Hochregulation von Hypoxie-induzierbaren Genen in Organoiden und Knockout Effekte konnten durch längere Kultivierungszeiten und Zellselektion via FACS verstärkt werden. Obwohl ccRCC-spezifische Signalwege aktiviert wurden, wurde kein Wachstumsvorteil der transformierten Zellen beobachtet. Dennoch stellen diese Organoide ein einzigartiges Modell dar, das auf andere Nephropathien angewendet werden könnte, um die Nieren- und Nierenkrebsforschung weiter voranzutreiben. / Despite the widespread application of targeted therapies and immune checkpoint inhibitors, the five-year survival rate for metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is below 15%, as unpredictable progression, therapy resistance, and tumor relapse occur. In order to improve patient outcome, novel models are needed that recapitulate tumor heterogeneity and allow for a more personalized therapy development. In the first part of my PhD thesis, I established organoid cultures directly from patient tumors and sorted cancer stem cells (CSCs) and I characterized these organoids thoroughly. The roles of WNT and NOTCH, which were previously determined in ccRCC CSCs, were confirmed in organoid cultures and could be exploited as a therapeutic weakness via small molecule inhibition. These results highlight the potential of patient-derived organoids (PDOs) for personalized therapy and further the potential of WNT and NOTCH inhibition for ccRCC treatment. PDOs present suitable tools for personalized medicine, but provide little insight into early stages of tumorigenesis. Therefore, in the second part of my thesis, I targeted VHL, PBRM1, and SETD2 – the three most frequently mutated genes in ccRCC – using an inducible CRISPR-Cas9 genome editing strategy in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived kidney organoids. I used a previously published protocol to differentiate iPSCs into kidney-specific cells originating from both metanephric mesenchyme and ureteric bud epithelium. Knockout of VHL, PBRM1, and SETD2 led to the upregulation of hypoxia-inducible genes in organoids and knockout effects could be enhanced by longer cultivation times and cell selection through FACS. Although ccRCC-specific signaling pathways were activated, a growth advantage of transformed cells was not observed. Nevertheless, these organoids present a unique model that could be applied to other nephropathies to further advance kidney and kidney cancer research.

Le système immunitaire se doit d’être étroitement régulé afin d’éviter que des réponses immunologiques inappropriées ou de trop forte intensité ne surviennent. Ainsi, différents mécanismes permettent de maintenir une tolérance périphérique, mais aussi d’atténuer la réponse lorsque celle-ci n’est plus nécessaire. De tels mécanismes sont cependant aussi exploités par les tumeurs, qui peuvent ainsi échapper à une attaque par le système immunitaire et donc poursuivre leur progression. Ces mécanismes immunosuppresseurs nuisent non seulement à la réponse naturelle contre les cellules tumorales, mais font aussi obstacle aux tentatives de manipulation clinique de l’immunité visant à générer une réponse anti-tumorale par l’immunothérapie. L’un des mécanismes par lesquels les tumeurs s’évadent du système immunitaire est l’expression d’enzymes responsables du métabolisme des acides aminés dont l’une des principales est l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO). Cette dernière dégrade le tryptophane et diminue ainsi sa disponibilité dans le microenvironnement tumoral, ce qui engendre des effets négatifs sur la prolifération, les fonctions et la survie des lymphocytes T qui y sont présents. Bien que la régulation de l’expression de cette enzyme ait été largement étudiée chez certaines cellules présentatrices d’antigènes, dont les macrophages et les cellules dendritiques, peu est encore connu sur sa régulation dans les cellules tumorales humaines. Nous avons posé l’hypothèse que différents facteurs produits par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIIC) régulent l’expression de l’IDO dans les cellules tumorales. Nous avons effectivement démontré qu’une expression de l’IDO est induite chez les cellules tumorales humaines, suite à une interaction avec des TIIC. Cette induction indépendante du contact cellulaire résulte principalement de l’interféron-gamma (IFN-g) produit par les lymphocytes T activés, mais est régulée à la baisse par l’interleukine (IL)-13. De plus, la fludarabine utilisée comme agent chimiothérapeutique inhibe l’induction de l’IDO chez les cellules tumorales en réponse aux lymphocytes T activés. Cette observation pourrait avoir des conséquences importantes en clinique sachant qu’une forte proportion d’échantillons cliniques provenant de tumeurs humaines exprime l’IDO. Enfin, les lymphocytes B, qui sont retrouvés également dans certaines tumeurs et qui interagissent étroitement avec les lymphocytes T, sont aussi susceptibles à une induction transcriptionnelle et traductionnelle de l’IDO. Cette enzyme est cependant produite sous une forme inactive dans les lymphocytes B, ce qui rend peu probable l’utilisation de l’IDO par les lymphocytes B comme mécanisme pour freiner la réponse immunitaire. Nos travaux apportent des informations importantes quant à la régulation de l’expression de la molécule immunosuppressive IDO dans les cellules cancéreuses. Ils démontrent que l’expression de l’IDO est influencée par la nature des cytokines présentes dans le microenvironnement tumoral. De plus son expression est inhibée par la fludarabine, un agent utilisé pour le traitement de certains cancers. Ces données devraient être prises en considération dans la planification de futurs essais immunothérapeutiques, et pourraient avoir un impact sur les réponses cliniques anti-tumorales. / The immune system is under tight control to avoid inappropriate and excessive immunological responses. Many mechanisms allow the maintenance of peripheral tolerance and mediate attenuation of the immune response after pathogen clearance. Such mechanisms are also exploited by tumors, thereby favoring their escape from assault by the immune system. These immunosuppressive mechanisms hamper host natural immune responses against tumor cells, but also represent an obstacle to the successful clinical manipulation of the immune system in attempts to generate an anti-tumor response through immunotherapy. One immune escape mechanism used by tumors is the production of enzymes responsible for amino acid metabolism, amongst which indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is of major importance. IDO degrades tryptophan, thus leading to its depletion from intracellular pools and local microenvironments. This culminates in multi-pronged negative effects on T lymphocytes neighboring IDO-expressing cells, notably on proliferation, function and survival. The regulation of IDO expression has been largely studied in antigen-presenting cells such as macrophages and dendritic cells, but its regulation in human tumor cells must still be characterized. We hypothesized that different factors produced by tumor-infiltrating immune cells (TIIC) regulate IDO expression in tumor cells. Accordingly, we have demonstrated that IDO expression is induced in human tumor cells upon interaction with TIIC. This induction is cell contact-independent, and results mainly from interferon-gamma (IFN-g) produced by activated T lymphocytes, while being antagonised by interleukin (IL)-13. Moreover, the chemotherapeutic agent fludarabine inhibits activated T lymphocyte-dependent IDO induction in tumor cells. This observation could have major clinical consequences, considering the large proportion of human cancer clinical samples expressing IDO. Finally, B lymphocytes, which interact closely with T lymphocytes and are found infiltrating human tumors, are also susceptible to transcriptional and translational IDO induction. This enzyme is however produced in an inactive form, suggesting that B lymphocytes do not exploit this mechanism to impede the immune response. In conclusion, our work brings crucial information on the regulation of the immunosuppressive molecule IDO in human tumor cells. We demonstrate that IDO expression is dependent on the nature of cytokines present in the tumor microenvironment. Furthermore, its expression is inhibited by fludarabine, a compound used to treat some types of cancer. These data should be taken into consideration in planning future immunotherapy trials and could impact anti-tumor clinical responses.

Le système immunitaire se doit d’être étroitement régulé afin d’éviter que des réponses immunologiques inappropriées ou de trop forte intensité ne surviennent. Ainsi, différents mécanismes permettent de maintenir une tolérance périphérique, mais aussi d’atténuer la réponse lorsque celle-ci n’est plus nécessaire. De tels mécanismes sont cependant aussi exploités par les tumeurs, qui peuvent ainsi échapper à une attaque par le système immunitaire et donc poursuivre leur progression. Ces mécanismes immunosuppresseurs nuisent non seulement à la réponse naturelle contre les cellules tumorales, mais font aussi obstacle aux tentatives de manipulation clinique de l’immunité visant à générer une réponse anti-tumorale par l’immunothérapie. L’un des mécanismes par lesquels les tumeurs s’évadent du système immunitaire est l’expression d’enzymes responsables du métabolisme des acides aminés dont l’une des principales est l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO). Cette dernière dégrade le tryptophane et diminue ainsi sa disponibilité dans le microenvironnement tumoral, ce qui engendre des effets négatifs sur la prolifération, les fonctions et la survie des lymphocytes T qui y sont présents. Bien que la régulation de l’expression de cette enzyme ait été largement étudiée chez certaines cellules présentatrices d’antigènes, dont les macrophages et les cellules dendritiques, peu est encore connu sur sa régulation dans les cellules tumorales humaines. Nous avons posé l’hypothèse que différents facteurs produits par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIIC) régulent l’expression de l’IDO dans les cellules tumorales. Nous avons effectivement démontré qu’une expression de l’IDO est induite chez les cellules tumorales humaines, suite à une interaction avec des TIIC. Cette induction indépendante du contact cellulaire résulte principalement de l’interféron-gamma (IFN-g) produit par les lymphocytes T activés, mais est régulée à la baisse par l’interleukine (IL)-13. De plus, la fludarabine utilisée comme agent chimiothérapeutique inhibe l’induction de l’IDO chez les cellules tumorales en réponse aux lymphocytes T activés. Cette observation pourrait avoir des conséquences importantes en clinique sachant qu’une forte proportion d’échantillons cliniques provenant de tumeurs humaines exprime l’IDO. Enfin, les lymphocytes B, qui sont retrouvés également dans certaines tumeurs et qui interagissent étroitement avec les lymphocytes T, sont aussi susceptibles à une induction transcriptionnelle et traductionnelle de l’IDO. Cette enzyme est cependant produite sous une forme inactive dans les lymphocytes B, ce qui rend peu probable l’utilisation de l’IDO par les lymphocytes B comme mécanisme pour freiner la réponse immunitaire. Nos travaux apportent des informations importantes quant à la régulation de l’expression de la molécule immunosuppressive IDO dans les cellules cancéreuses. Ils démontrent que l’expression de l’IDO est influencée par la nature des cytokines présentes dans le microenvironnement tumoral. De plus son expression est inhibée par la fludarabine, un agent utilisé pour le traitement de certains cancers. Ces données devraient être prises en considération dans la planification de futurs essais immunothérapeutiques, et pourraient avoir un impact sur les réponses cliniques anti-tumorales. / The immune system is under tight control to avoid inappropriate and excessive immunological responses. Many mechanisms allow the maintenance of peripheral tolerance and mediate attenuation of the immune response after pathogen clearance. Such mechanisms are also exploited by tumors, thereby favoring their escape from assault by the immune system. These immunosuppressive mechanisms hamper host natural immune responses against tumor cells, but also represent an obstacle to the successful clinical manipulation of the immune system in attempts to generate an anti-tumor response through immunotherapy. One immune escape mechanism used by tumors is the production of enzymes responsible for amino acid metabolism, amongst which indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is of major importance. IDO degrades tryptophan, thus leading to its depletion from intracellular pools and local microenvironments. This culminates in multi-pronged negative effects on T lymphocytes neighboring IDO-expressing cells, notably on proliferation, function and survival. The regulation of IDO expression has been largely studied in antigen-presenting cells such as macrophages and dendritic cells, but its regulation in human tumor cells must still be characterized. We hypothesized that different factors produced by tumor-infiltrating immune cells (TIIC) regulate IDO expression in tumor cells. Accordingly, we have demonstrated that IDO expression is induced in human tumor cells upon interaction with TIIC. This induction is cell contact-independent, and results mainly from interferon-gamma (IFN-g) produced by activated T lymphocytes, while being antagonised by interleukin (IL)-13. Moreover, the chemotherapeutic agent fludarabine inhibits activated T lymphocyte-dependent IDO induction in tumor cells. This observation could have major clinical consequences, considering the large proportion of human cancer clinical samples expressing IDO. Finally, B lymphocytes, which interact closely with T lymphocytes and are found infiltrating human tumors, are also susceptible to transcriptional and translational IDO induction. This enzyme is however produced in an inactive form, suggesting that B lymphocytes do not exploit this mechanism to impede the immune response. In conclusion, our work brings crucial information on the regulation of the immunosuppressive molecule IDO in human tumor cells. We demonstrate that IDO expression is dependent on the nature of cytokines present in the tumor microenvironment. Furthermore, its expression is inhibited by fludarabine, a compound used to treat some types of cancer. These data should be taken into consideration in planning future immunotherapy trials and could impact anti-tumor clinical responses.

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Organoide aus adulten Mäusen sind vielversprechende Modelle für die Nierenforschung. Ihre Charakterisierung wurde jedoch nicht auf ein zufriedenstellendes Niveau gebracht. Hier habe ich ein langfristiges 3D-Maus-Organoid (Tubuloid)-Modell etabliert und charakterisiert, das die Erneuerung und die Reparatur sowie die Architektur und die Funktionalität der adulten tubulären Epithelien rekapituliert. In der Zukunft wird das Modell detaillierte Untersuchungen der Trajektorien selbsterneuernder Zellen sowohl zur teilweisen Wiederherstellung der Niere als auch zur malignen Transformation der Niere ermöglichen. Das klarzellige Nierenzellkarzinom (ccRCC) ist der häufigste und aggressivste Nierenkrebs. Die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens Von Hippel-Lindau (VHL) ist der Haupttreiber des ccRCCs. Zuvor hatten wir die Hochregulation der Wnt- und Notch-Signalübertragung in den CXCR4+MET+CD44+-Krebsstammzellen (CSC) aus primären humanen ccRCC-Tumoren identifiziert. Das Blockieren von Wnt und Notch in von Patienten stammenden Xenotransplantaten, Organoiden und nicht-anhaftenden Sphären unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren beeinträchtigte die Selbsterneuerung der CSC und das Tumorwachstum. Um CSC-gesteuertes humanes ccRCC in genetischen Mausmodellen nachzuahmen, begann ich mit der Erzeugung von zwei Doppelmausmutanten; β-Catenin-GOF; Notch-GOF und Vhl-LOF; β-Catenin-GOF. Sowohl die β-Catenin-GOF; Notch-GOF Mausmutante als auch die Vhl-LOF; β-Catenin-GOF Mausmutante entwickelten innerhalb einiger Monate schwere Krankheitssymptome. Überraschenderweise beobachtete ich weder Tumore oder Tumorvorläuferläsionen noch höhere Zellproliferationsraten in den mutierten Nieren. Weitere Analysen ergaben, dass die Mausmutanten Merkmale chronischer Nierenerkrankung (CKD) aufwiesen. / Adult mouse organoids are promising models for kidney research. However, their characterization has not been pushed forward to a satisfying level. Here, I have generated and characterized a long-term 3D mouse organoid (tubuloid) model, which recapitulates renewal and repair, and the architecture and functionality of the adult tubular epithelia. In the future, the model will allow detailed investigations of trajectories of self-renewing cells towards both the partial recreation and malignant transformation of the kidney. Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common and aggressive kidney cancer. Inactivation of the Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene is the major driver of ccRCC. Earlier, we identified the upregulation of Wnt and Notch signaling in CXCR4+MET+CD44+ cancer stem cells (CSCs) from primary human ccRCCs. Blocking Wnt and Notch in patient-derived xenografts, organoids and non-adherent spheres using small-molecule inhibitors impaired self-renewal of CSCs and tumor growth. To mimic CSC-governed human ccRCC in genetic mouse models, I started from the generation of two double mouse mutants; β-catenin-GOF; Notch-GOF and Vhl-LOF; β-catenin-GOF. Surprizingly, I observed neither tumors or tumor precursor lesions nor higher cell proliferation rates in the mutant kidneys. Further analyses revealed that the mutant mice displayed features of chronic kidney disease (CKD). Thus, β-catenin-GOF; Notch-GOF and Vhl-LOF; β-catenin-GOF mouse mutants did not develop kidney tumors under the given experimental conditions.

<p>Urine-based biomarkers offer numerous advantages for clinical analysis, including non-invasive collection, a suitable sample source for longitudinal disease monitoring, a better screenshot of disease heterogeneity, higher sample volumes, faster processing times, and lower rejection rates and costs. They will be extremely useful in a clinical trial context, which can be applied alone or in combination with other methods as long as they demonstrate clear reproducibility across cohorts. While biofluids such as urine present enormous challenges with a wide dynamic range and extreme complex typically dominated by a few highly abundant proteins, we have demonstrated that the analytical issue can be efficiently addressed by focusing on extracellular vesicles (EVs), tiny packages released by all kinds of cells. These tiny packages contain different kinds of molecules from inside the cells. Here, we established a robust EV isolation and characterization platform to screen and validate Parkinson’s Disease (PD) and Renal Cell Carcinoma (RCC) biomarkers from urine. PD is a progressive neurological disorder affecting body movement because some brain cells stop producing dopamine. PD is often not diagnosed until it has advanced, making early detection crucial. We investigated urinary EVs from 138 individuals to enable early detection and found several proteins involved in PD development that could be biological indicators for early disease detection. Several biochemical techniques were applied to verify our findings. In the second project, we attempted to develop a novel diagnostic technique for early intervention of RCC. Here, we made our efforts to develop a quantitative method based on data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry to analyze urinary EV phosphoproteomics for non-invasive RCC biomarker screening. Combined with our in-house EVtrap method for EV isolation and PolyMAC enrichment of phosphopeptides, we quantified 2,584 unique phosphosites. We observed unique upregulated phosphosites and pathways differentiating healthy control (HC), chronic kidney disease (CKD), low-grade, and high-grade clear cell RCC. These applications have a significant promise for early PD and RCC diagnosis and monitoring based on actual functional proteins with urine as the source. These studies might provide a viable path to developing urinary EV-based disease diagnosis.</p>