In this study, we evaluated the potential of water-in-oil microemulsions for the separation of beta-galactosidase (lactase) from other proteins. The ability of beta-galactosidase to break down the milk carbohydrate lactose gives the enzyme considerable commercial importance. The extent of solubilization of a commercial Kluyveromyces lactis preparation of beta-galactosidase into microemulsion droplets formed from 200 mM bis (2-ethylhexyl) sodium sulfosuccinate (AOT) in isooctane was measured as a function of buffer type, pH, ionic strength, and protein concentration. Our results showed that, due to the large molecular weight of beta-galactosidase (MW~ 220-240 kDa, dimeric form), the enzyme was taken up by the microemulsion droplets mainly under very low salt conditions. Based on these results, we designed a one-step separation procedure, in which a small volume of aqueous buffer containing the protein mixture is added to an organic surfactant solution. Microemulsion droplets form in the oil and capture protein impurities of smaller molecular weights, while excluding the high molecular weight target protein. This causes the beta-galactosidase to be expelled into a newly formed aqueous phase. The feasibility of this one-step process as a bioseparation tool was demonstrated on a feed consisting of an equal mixture of beta-galactosidase and the test protein beta-lactoglobulin. Recovery and separation of the two proteins was analyzed as function of buffer type, pH, ionic strength, and protein concentration. Results showed that separation was most complete at 100 mM KCl salt concentration, where the droplets were big enough to carry beta-lactoglobulin but too small for lactase. At 100 mM salt concentration, we recovered 92% of the total lactase activity in a virtually pure form. The same separation scheme was then tested on crude extract obtained from a cell culture broth of the yeast Kluyveromyces lactis. Cells of the yeast K. lactis were disrupted by minibeadbeater, forming a crude extract that was used as the feed in our separation process. A 5.4-fold purification factor of the extract was achieved, with 96% activity recovery. The results showed our one-step separation process to be an interesting method for the production of beta-galactosidase as a technical enzyme: it has the potential to achieve a continuous, large-scale partial purification of the enzyme, potentially reducing the number of steps required in downstream process.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-23T11:41:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T11:41:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) Previous issue date: 2001-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A região codificadora do gene LAC4, que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. lactis, foi isolada do plasmídeo pLAC4-12, por meio da técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores, que amplificam um fragmento de aproximadamente 3.000 pb. Com os objetivos de expressar e secretar a β- galactosidase, este fragmento foi clonado em um vetor de expressão e secreção pPIC9 do sistema de expressão de Pichia pastoris. A região codificadora LAC4 intacta e uma versão truncada foram fundidas em fase com a seqüência sinal de secreção do fator-α, sob controle do promotor AOX1. A hidrólise dos DNAs recombinantes obtidos com as enzimas de restrição apropriadas confirmou a clonagem da região codificadora LAC4 intacta nas orientações anti-senso e senso e da versão truncada no vetor pPIC9. Os clones foram linearizados e usados para transformar células eletrocompetentes de Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ). Colônias recombinantes foram isoladas e as inserções da região codificadora LAC4 intacta e truncada no genoma da levedura foram confirmadas por “PCR” com iniciadores específicos. Colônias recombinantes positivas foram cultivadas em glicerol e a expressão dos genes recombinantes foi induzida com metanol. Amostras foram coletadas periodicamente e o meio extracelular e a massa de células analisados quanto à atividade de β -galactosidase. Nenhum aumento na atividade de β - galactosidase foi observado perante o controle. Espera-se que a transformação de linhagens da levedura Mut - com os clones obtidos possa resultar na produção de uma proteína funcional. / The codins Kluyveromyces region marxianus of var. the lactis β-galactosidase was isolated LAC4 from gene, pLAC4-12, from by polimerase chain reaction (PCR) technique with primers that amplify a fragment of approximately 3.000 bp. Expression and secretion vector to expresse and secrete β-galactosidase, the intact and truncated LAC4 coding regions were fused in phase with the factor-α secretion signal sequence in the Pichia pastoris pPIC9. Appropriate restriction enzyme hydrolates confirmed the insertion of the intact LAC4 coding region in sense and antisense orientations, as well as its truncated version in to the pPIC9 vector. The clones were linearized and used to transform electrocompetent Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ) cells. Recombinant cells were isolated and the insertions of intact and truncated LAC4 coding regions in the yeast genome were confirmed by PCR with specific primers. Positive recombinant colonies were grown in glycerol and the expression of the heterologous genes was induced with methanol. Samples were periodically collected and the extracellular medium and cell mass were analyzed for β-galactosidase activity. No increase in β-galactosidase activity was observed over the control. The transformation of Mut - yeast cell lines with the clones is expectial to result in the production of a functional protein. / Dissertação importada do Alexandria

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Neste trabalho, a enzima β-galactosidase, que catalisa a hidrÃlise da lactose em glicose e galactose, foi produzida pelo cultivo do micro-organismo Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 em soro de leite suplementado com extrato de levedura. A enzima à um metabÃlito intracelular, sendo a liberaÃÃo da enzima para o meio uma condiÃÃo essencial, por isso estudaram-se diferentes mÃtodos quÃmicos e mecÃnicos de extraÃÃo como, agitaÃÃo com pÃrolas de vidro, ruptura em ultrassom com pÃrolas de vidro, adiÃÃo de etanol e tolueno, observando tambÃm, seus efeitos na atividade enzimÃtica. Posteriormente, realizaram-se ensaios para estudar a influÃncia da temperatura (30, 34, 37 e 40 ÂC) na produÃÃo da enzima a partir do soro de queijo. Na extraÃÃo da enzima, o uso de esferas de vidro em vÃrtex foi o mÃtodo mais eficiente quando comparado com os outros avaliados. A enzima, nÃo sofreu inibiÃÃo ou desnaturaÃÃo quando incubadas com etanol, tolueno ou etanol-tolueno. A temperatura Ãtima de produÃÃo da enzima por K. lactis NRRL Y1564 foi 30 ÂC, com atividade enzimÃtica de 4418,37 U/g de cÃlulas em 12 h de fermentaÃÃo. A enzima produzida foi imobilizada em quitosana 2,0% m/v. Diferentes protocolos de ativaÃÃo usando glutaraldeÃdo, epicloridrina ou glicidol foram avaliados. Estudou-se tambÃm, o tempo de contato enzima-suporte (3, 5 e 10 horas) a fim de se obter um biocatalisador que apresentasse alto rendimento, atividade recuperada e tempo de meia-vida, visando a hidrÃlise da lactose em reator batelada e leito fixo. A influÃncia da temperatura e do pH na hidrÃlise da lactose foi avaliada, usando como substrato uma soluÃÃo sintÃtica (lactose 5,0% (m/v) e leite desnatado, contendo 4,3% m/v de lactose. O suporte que apresentou melhores resultados nos parÃmetros de imobilizaÃÃo foi a quitosana 2% reticulada com glutaraldeÃdo no tempo de imobilizaÃÃo de 5 horas. O biocatalisador produzido nesse estudo apresentou um fator de estabilidade de 17,37 vezes maior que a enzima solÃvel, com uma estabilidade de armazenamento de 100% quando armazenada a 4 ÂC por 90 dias. A temperatura Ãtima de hidrÃlise da lactose foi de 40 ÂC e o pH Ãtimo foi 7,0 . A conversÃo da lactose a 40 ÂC para este derivado (3,0 U/g) foi em mÃdia 53% em 10 ciclos (bateladas consecutivas). Em reator batelada, a conversÃo em glicose a partir da hidrÃlise da lactose, usando soluÃÃo sintÃtica, foi aproximadamente 86 % para a enzima solÃvel (3,8 U/mL) e 83 % para a enzima imobilizada (3,8 U/g). A conversÃo obtida na hidrÃlise do leite desnatado foi de 17 % para a enzima solÃvel e 20 % para a enzima imobilizada. / In this work, the enzyme β-galactosidase which catalyzes the hydrolysis of lactose to glucose and galactose, was produced by cultivating the micro-organism Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 in whey supplemented with yeast extract. The enzyme is an intracellular metabolite, the release enzyme is very important, therefore were studied various chemical and mechanical methods of extraction and stirring with glass beads, sonication, addition of ethanol and toluene, noting also their effects on enzymatic activity. Subsequently, trials were carried out to study the influence of temperature (30, 34, 37 and 40  C) in the production of the enzyme from the cheese whey. In the enzyme extraction, using glass beads by a vÃrtex was more efficient method compared to others evaluated. The enzyme not presented inhibited or denatured when incubated with ethanol, toluene or ethanol-toluene. The optimum temperature for enzyme production by K. lactis NRRL Y1564 was 30 ÂC with enzymatic activity of 4418.37 U/g of cells at 12 h of fermentation. The enzyme produced was immobilized on chitosan 2.0% w/v. Different activation protocols using glutaraldehyde, epichlorohydrin or glycidol were evaluated. Was also studied, the contact time the enzyme-carrier (3, 5, and 10 hours) to obtain a biocatalyst to produce high yield, recovered activity and half-life in order to hydrolysis of lactose in batch reactor and fixed bed. The influence of temperature and pH on the hydrolysis of lactose was evaluated using as substrate a synthetic solution (lactose 5.0% (w/v) in potassium phosphate buffer 100 mM with 0.1 mM MnCl2) and skimmed milk containing 4.3% w/v lactose. The support shows better results in the parameters of immobilization was chitosan 2% actived with glutaraldehyde and contact time of 5 hours. The biocatalyst produced in this study showed a stability factor of 17.37 and a storage stability of 100% when stored at 4 ÂC for 90 days. Temperature optimum hydrolysis of lactose was 40 ÂC and the optimal pH 7.0. The conversion of lactose to 40 ÂC for this derivative (3.0 U/g) was on average 53% in 10 cycles (consecutive batches). In batch reactor, the conversion to glucose by the hydrolysis of lactose using synthetic solution was approximately 86% for the soluble enzyme (3.8 U/mL) and 83% of the immobilized enzyme (3.8 U/g). The conversion obtained in the hydrolysis of skim milk was 17% for the soluble enzyme and 20% for the immobilized enzyme.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2827_1.pdf: 3255075 bytes, checksum: 22005ee118cfc8ca27010124cd458070 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Leveduras vêm sendo utilizadas como sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse biotecnológico. Dentre as diversas aplicações das proteínas heterólogas, as produzidas com finalidade terapêutica e para diagnóstico clínico vêm recebendo grande destaque, como por exemplo, a lectina frutalina e a oncoproteína E7 do Papilomavírus Humano (HPV). A frutalina, lectina extraída das sementes da fruta-pão, tem sido descrita como importante ferramenta no diagnóstico do câncer devido ao seu tropismo com células tumorais. Enquanto, a oncoproteína viral do HPV, E7, por ser encontrada em células tumorais relacionadas à infecção pelo HPV, torna-se um importante alvo para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra esta infecção. Neste trabalho utilizamos as leveduras Pichia pastoris KM71H e Pichia pastoris GS115 como sistemas de expressão para a produção das proteínas frutalina e E7 do HPV16, respectivamente. A influência da fonte de carbono e do estresse iônico na produção da enzima β-galactosidase pela Kluyveromyces lactis DSM 3795 foi avaliada em diferentes condições de cultivo. Neste trabalho os níveis de frutalina recombinante (13,4 mg.L-1), obtidos pelo processo de batelada alimentada, foi 4 vezes maior que em testes com frascos aerados e a suplementação com elementos traços permitiu o aumento de 2.5 vezes na produção da proteína recombinante. Enquanto, o gene de E7 do HPV16 foi corretamente clonado e integrado ao genoma da P.pastoris GS115, sendo produzido 218,9mg.L-1 da proteína E7 com o peso molecular de 27KDa. A avaliação da influência da fonte de carbono e do estresse iônico na atividade da enzima β-galactosidase pela K. lactis DSM 3795 permitiu selecionar a lactose como a fonte de carbono ideal, pois favoreceu maior atividade específica da enzima (271,0 U.mg-1). Enquanto que, os cátions Na+, K+, Mg2+ potencializaram a atividade da enzima (410,4; 440,1; and 734.71 U.mg-1, respectivamente), o Ca2+ inibiu parcialmente a produção da β-galactosidase. Por fim, apesar da P. pastoris ter se mostrado um sistema eficiente para a produção de proteína heterólogas, ela ainda apresenta algumas limitações. Dessa maneira, o desenvolver estratégias que permitam a otimização de vetores para a produção dessas proteínas, representa um importante alvo no desenvolvimento de produtos para o diagnóstico, prevenção e tratamento do câncer

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-07-30T13:09:39Z No. of bitstreams: 1 Patricia de Oliveira Leite Farias.pdf: 2191536 bytes, checksum: 7dcb59d0b9807994dffa19a1d1a70acb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-30T13:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patricia de Oliveira Leite Farias.pdf: 2191536 bytes, checksum: 7dcb59d0b9807994dffa19a1d1a70acb (MD5) Previous issue date: 2015-08-28 / Cheese whey is the aqueous portion milk rich in lactose, which separates the curd during cheese manufacture which makes it of great importance effluent dairy industries. With the rapid advances in microbial biotechnology, it is considered good alternative to its use, as a substrate inexpensive and available in obtaining β-galactosidase, which is widely used for pharmaceutical and food industries. The sources most widely used for its production are yeasts, as the species Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces marxianus. The objective of this study was to evaluate the feasibility of using the cheese whey, in isolation or in combination with other carbon sources for the production of β-galactosidase enzyme, using Kluyveromyces lactis URM 6684, using the planning simplex centroid mixture. 9 fermentations were carried out using three sources of carbon: cheese whey, lactose and sucrose PA PA. During the study it was determined biomass, pH and after cell disruption, enzymatic activity. With regard to biomass, medium with sucrose had better results E5 (7,8 g / L), E8 (6,8 g / L) and E6 (6,1 g / L). The enzyme activity is presented to best results in medium with cheese whey: E1 (0,65 U / ml), E4 (0,33 U / ml) and E6 (0,40 U / ml). Statistical analysis showed that the enzyme activity showed the best fit to the quadratic and cubic models, which presented the best fit quadratic and cubic models, with coefficients, RA2 = 0.86 and RA2 = 0.93. The results showed that whey was presented as a suitable source of carbon and low cost for production of the enzyme, adding more value to its use, and reduce the costs of production of β-galactosidase enzyme, increasing its availability commerce more affordable and enabling their application in the dairy food industry. / O soro de leite ou de queijo é a porção aquosa do leite, rico em lactose, que se separa do coágulo durante a fabricação de queijos o que o torna efluente de grande relevância das indústrias de laticínios. Com os rápidos avanços em biotecnologia microbiana, considera-se boa alternativa para sua utilização, por ser um substrato barato e disponível, na obtenção de β-galactosidase, que é amplamente utilizada pelas indústrias farmacêutica e de alimentos. As fontes mais utilizadas para sua produção são as leveduras, como as espécies Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces marxianus. O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade do uso do soro de queijo, de forma isolada ou combinada a outras fontes de carbono, para produção da enzima β-galactosidase, utilizando Kluyveromyces lactis URM 6684, empregando o planejamento de mistura simplex centroide. Foram realizadas 9 fermentações utilizando três fontes de carbono: soro de queijo, lactose PA e sacarose PA. Durante o estudo foram determinados valores de biomassa, pH e, após rompimento celular, atividade enzimática. Com relação à biomassa, meios com presença de sacarose obtiveram melhores resultados: E5(7,8 g/L), E8 (6,8 g/L) e E6 (6,1 g/L). A atividade enzimática apresentou-se com melhores resultados em meios com presença de soro de queijo: E1(0,65 U/mL), E4 (0,33 U/mL) e E6 (0,40 U/mL). A análise estatística evidenciou que a atividade enzimática apresentou melhor ajuste aos modelos quadrático e cúbico, a qual apresentou melhor ajuste aos modelos quadrático e cúbico, com coeficientes, RA2, de 0,86 e 0,93. Os resultados encontrados demonstraram que o soro de queijo apresentou-se como uma fonte de carbono adequada e de baixo custo para produção da enzima, agregando maior valor para seu uso, além de reduzir os custos da produção da enzima β-galactosidase, aumentando sua disponibilidade no comércio a preços mais acessíveis e viabilizando sua aplicação na indústria de alimentos derivados de leite.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T09:20:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T09:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) Previous issue date: 2011-04-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Ácido L-ascórbico (L-AA), popularmente conhecido como vitamina C é naturalmente sintetizado pelas plantas a partir de D-glicose por uma via de 10 etapas. L- galactose é o intermediário chave para a biossíntese de L-ascórbico, cuja via de biossíntese foi recentemente elucidada. As leveduras produzem um composto análogo ao L-AA, o ácido D-eritroascórbico, mas em presença de um de seus precursors tais como L-galactose, L galactono-1,4-lactona, ou L-gulono-1 ,4-lactona, as leveduras são capazes de sintetizar o L-AA. Para evitar alimentar a cultura de levedura com o "L" enantiômero, a levedura Kluyveromyces lactis CBS2359 foi engenheirada com genes da via de biossíntese de L-galactose: GDP-manose-3 ,5-epimerase (GME), GDP-L- galactose fosforilase (VTC2) e L-galactose-1-fosfato fosfatase (VTC4) isolados de Arabidopsis thaliana. Com este objetivo plasmídeos foram construídos visando a integração por recombinação homóloga dos cassetes de expressão no Locus LAC4 (beta- galactosidase) Após o processo de transformação, o promotor do gene LAC4 promove a transcrição do gene GME, enquanto que genes VTC2 e VTC4 estão sob o controle dos promotores GPD1 e ADH1 respectivamente provenientes da levedura S. cerevisiae. A expressão dos genes da via de biossíntese de L-galactose em K. lactis foi determinada por RT-PCR e western blot. As leveduras recombinantes foram capazes de produzir cerca de 23 mg.L-1 de ácido L-ascórbico após 48 horas de cultivo, quando cultivados em meio YP suplementado com 2% (p/v) de D-galactose. A biossíntese de L-AA foi também realizada quando as linhagens recombinantes foram cultivadas em meio de soro de queijo, fonte alternativa rica em lactose proveniente da indústria de laticínios. Este trabalho é um dos primeiros relatos de engenharia metabólica na levedura K. lactis visando a biossíntese de ácido L-ascórbico por um processo fermentativo sem a adição de intermediários precursores no meio de cultura. / L-ascorbic acid is naturally synthesized in plants from D-glucose via a ten-step pathway. The branch pathway to synthesize L-galactose, the key intermediate for L- ascorbic biosynthesis, has been recently elucidated. Budding yeast is only able to synthesize L-ascorbic acid if it is cultivated in the presence of one of its precursors: L- galactose, L-galactono-1,4-lactone, or L-gulono-1,4-lactone extracted from plants or animals. To avoid feeding the yeast culture with this “L” enantiomer, we engineered Kluyveromyces lactis with L-galactose biosynthesis pathway genes: GDP-mannose-3,5- epimerase (GME), GDP-L-galactose phosphorylase (VTC2) and L-galactose-1- phosphate phosphatase (VTC4) isolated from Arabidopsis thaliana. Plasmids were constructed to target the cloned plant genes to the K. lactis LAC4 Locus by homologous recombination and the expression was associated to the growth of the cells on D- galactose or lactose. Upon K. lactis transformation, GME was under the control of the native LAC4 promoter while VTC2 and VTC4 genes were transcribed by the S. cerevisiae promoters GPD1 and ADH1 respectively. The expression in K. lactis of the endogenous L-galactose biosynthesis plant genes was determined by RT-PCR and western blotting. The recombinant yeasts were able to produce about 23 mg.L-1 of L- ascorbic acid in 48 hours of cultivation when cultured on rich medium with 2% (w/v) D-galactose. We have also successfully evaluated the L-AA production culturing recombinant strains in cheese whey as an alternative source of lactose and which is a waste product during cheese production. This work is the first attempt to engineering K. lactis cells for L-ascorbic acid biosynthesis through a fermentation process without any trace of “L” isomers precursors in the culture medium.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T13:45:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 600665 bytes, checksum: ee26156d6dc7124f99efde31caf1f198 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T13:45:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 600665 bytes, checksum: ee26156d6dc7124f99efde31caf1f198 (MD5) Previous issue date: 2010-04-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A permease de lactose de Kluyveromyces lactis, Lac12, media o transporte de lactose e o de galactose de baixa afinidade. Aqui é apresentado o estudo do efeito de fontes de carbono na internalização de Lac12 através do uso de linhagens contendo o gene quimérico LAC12-GFP. Quando células de K. lactis pré-cultivadas em galactose ou lactose foram transferidas para um novo meio, Lac12-GFP foi removida da membrana plasmática e localizada intracelularmente. Surpreendentemente, mesmo a presença de galactose ou lactose no novo meio de transferência causou essa internalização, e a resposta celular foi diferente para esse dois açúcares. Os resultados obtidos revelam que o processo de internalização é dependente do tipo de açúcar presente e de sua concentração. A internalização de Lac12-GFP causou redução nas taxas de captação de lactose[C14] e também foi observada em uma linhagem mutante Klsnf1; portanto, esse evento independe da atividade de KlSnf1. Evidências indicam que glicose-6-fosfato é o sinal intracelular, uma vez que a internalização foi induzida por 2-deoxiglicose, e a inibição da atividade da enzima fosfoglimutase por lítio impediu a internalização por galactose, mas não por lactose ou glicose. A internalização não ocorreu em 6-deoxiglicose, e, em ausência de síntese protéica, o evento foi irreversível. / Kluyveromyces lactis Lac12 permease mediates lactose and low-affinity galactose transports. In this study we have investigated the effects of carbon sources on internalization of Lac12 by using a LAC12-GFP fusion construct. When galactose- or lactose-grown cells are shifted to a fresh sugar medium, Lac12-GFP is removed from the plasma membrane and localized intracellularly. Surprisingly, even galactose or lactose in the new media caused the internalization, and cells responded differently to theses two sugars. Our results reveal that this process is dependent of sugar species and also sugar concentration. Lac12-GFP internalization causes reduction on [C14]lactose uptake rates and also occurs in a Klsnf1 mutant strain; thereby, it is independent of KlSnf1 activity. We suggest that glucose-6-phosphate is the intracellular signal, since internalization was induced by 2-deoxyglucose and inhibition of phosphoglucomutase by lithium prevented galactose- but not lactose- or glucose-induced internalization. Lac12-GFP internalization was not triggered by 6-deoxyglucose, and was irreversible in absence of protein synthesis.

The impact of yeasts on food production, quality and safety is closely linked with their ecology and biological activities. Recently, as a consequence of the relationship between diet and health, yeasts are becoming relevant as new probiotics or for the production of bioactive compounds. In dairy products, yeasts play a key role in proteolysis, lipolysis and lactose fermentation during cheese ripening, promoting the development of sensory properties, particularly aroma. This thesis focuses on the yeast diversity in artisanal cheeses produced in the Natural Park Serra d¿Espadà (Castelló) from ewes¿ and goats¿ raw milk. Different molecular techniques have been employed in order to characterize yeast isolates. Moreover, the succession of species along the cheese ripening process was studied. The intraspecific variability of the most abundant identified species Debaryomyces hansenii and Kluyveromyces lactis was also assessed. Additionally, the potential of Kluyveromyces marxianus and K. lactis ß-galactosidases to synthetize prebiotic oligosaccharides from lactose and lactulose was tested. Finally, Kluyveromyces and Debaryomyces isolates were investigated for the production of cheese aromatic compounds. / Padilla López, B. (2014). Yeast diversity in artisanal cheeses: biotechnological applications [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36065 / TESIS

This thesis was dedicated to the investigation of the interplay between signaling pathways governing cell wall biosynthesis, central carbohydrate metabolism and cytokinesis in two different yeast species. The first part of the thesis addressed cell wall biosynthesis, which forms an essential structure and determines both shape and integrity of fungal cells and hyphae. It also serves as a first barrier against changing and adverse environmental conditions. Cell wall synthesis and remodeling is primarily mediated by the cell wall integrity pathway in both the budding yeast Saccharomyces cerevisiae and the milk yeast Kluyveromyces lactis. The latter is a Crabtree-negative yeast with a similar life cycle to that of S. cerevisiae. Yet, K. lactis did not undergo a whole genome duplication, presenting a lower degree of genetic redundancy, which often avoids the need for multiple gene deletions. In this work the SNF1 kinase complex was identified as playing a role in cell wall synthesis. It belongs to the family of AMP-activated protein kinases (AMPKs), whose primary function is thought to be the regulation of energy balance in different organisms. Mutants with defects in this complex have a thinner cell wall than wild type and are hypersensitive to cell wall stress agents such as Caspofungin, Calcofluor white and Congo red. Epistasis analyses with mutants affecting cell wall integrity signaling suggested a parallel action of CWI- and SNF1 signaling in the two yeast species. Further genetic analyses indicated a known downstream effector of the SNF1 kinase complex, the transcriptional repressor Mig1, to mediate the signaling function in cell wall synthesis, too. Further epistasis analyses indicated that the hypersensitivity of the SNF1 complex mutants to the stress agents can be suppressed by an additional defect in the upper part of glycolysis. This has been attributed to the accumulation of the glycolytic intermediates glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate, which serve as precursors of cell wall polysaccharides. A function of the SNF1 complex in yeast cell wall synthesis has not been described, until now. In order to study the relation to cytokinesis, i.e. the last step of cell division, first some tools to follow this process in K. lactis had to be established in the second part of the thesis. Cytokinesis is also an essential feature of life since it ensures cell proliferation. In yeast and mammalian cells the concluding abscission of the plasma membrane is initiated by the construction of an actomyosin ring (AMR), accompanied by the formation of a primary septum, and followed by the deposition of secondary septa from both mother and daughter cells. Cytokinesis is a highly coordinated process and regulation is not yet fully explained. Proteins important for cytokinesis in S. cerevisiae were identified in K. lactis by in silico analyses and then genetically investigated. In contrast to S. cerevisiae, analysis of deletion mutants showed that deletion of the gene encoding K. lactis myosin II (KlMYO1) as a key component of the AMR is viable but temperature-sensitives and therefore dispensable for cytokinesis in K. lactis under normal growth conditions. Also different from its S. cerevisiae ortholog, a Klcyk3 deletion is lethal, while inn1 deletions are not viable in either yeast species. In contrast to the other genes studied, expression of INN1 does not cross-complement between the two yeast species, which could be narrowed down to a species specificity of the C2 domain in the Inn1 protein, which activates the chitin synthase II in S. cerevisiae. Deletions lacking the K. lactis chitin synthase II gene (KlCHS2) are also not viable. Fluorescently tagged versions of all proteins show a similar spatiotemporal localization at the bud neck as their counterparts in S. cerevisiae. The second part of this work thus provides insights into the regulation of cytokinesis in K. lactis and indicates that AMR constriction and its regulation could be more important in K. lactis than in S. cerevisiae, while the overall sequence of morphological events in cytokinesis is quite similar.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A imobilizaÃÃo de β-galactosidase para hidrÃlise de lactose à uma proposta para agregar valor ao soro de leite com conseqÃente produÃÃo de galactose e glicose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver biocatalisadores a partir de diferentes suportes orgÃnicos e protocolos de ativaÃÃo visando à hidrÃlise de lactose proveniente do soro de leite. Inicialmente, prepararam-se os suportes a serem aplicados no estudo como quitosana 2,5% (m/v) (sem e com prÃ-tratamento com dimetilformamida) e 2,0% (m/v), quitosana-alginato-epoxilado (QAE), bagaÃo de caju (BC) e fibra de casca de coco verde (CV), os quais foram ativados de diferentes formas, com glutaraldeÃdo, epicloridrina ou glicidol. Na primeira etapa, determinaram-se o rendimento de imobilizaÃÃo, atividade recuperada e atividade aparente dos diferentes derivados obtidos para assim determinar os seis melhores â quitosana 2,5% (m/v) ativada com glutaraldeÃdo (QUITGLU1), quitosana 2,0% (m/v) coagulada com KOH a 50ÂC ativada com glutaraldeÃdo (QUITGLU2) ou epicloridrina (QUITEPI) ou glicidol (QUITGLI), quitosana 2,5% (m/v) tratada com dimetilformamida ativada com epicloridrina (QUIT-DMFEPI) ou glicidol (QUIT-DMFGLI). Para segunda fase, os catalisadores (QUITGLU1, QUITGLU2, QUITEPI, QUITGLI) foram estudados quanto à estabilidade operacional com o uso de reator contÃnuo, assim como ensaios de carga mÃxima e efetividade. Baseado nestes ensaios determinou-se QUITGLU2 como melhor biocatalisador e realizaram-se os seguintes estudos: variaÃÃo do tempo de imobilizaÃÃo, determinaÃÃo da melhor temperatura e pH para atividade enzimÃtica, determinaÃÃo de parÃmetros cinÃticos, estocagem sob 10ÂC e estabilidade operacional com o uso de alta carga enzimÃtica usando soro de leite como substrato. Suportes como CV e BC nÃo apresentaram boa adequaÃÃo para imobilizaÃÃo de β-galactosidase de Kluyveromyces lactis, assim como o suporte QAE. Suportes com tratamento com dimetilformamida apresentaram baixos rendimentos de imobilizaÃÃo. Os resultados para o derivado QUITGLU2 apresentaram carga mÃxima de 75 mgProteÃna.g-1 de suporte e efetividade superiores aos demais. A estabilidade operacional para este derivado apresentou-se estÃvel, visto sua produÃÃo de glicose constante por 10 h de reaÃÃo. O tempo 3 h mostrou-se suficiente para imobilizaÃÃo. Os valores de Km e VmÃx tanto para enzima solÃvel (46,79 mM e 7.142,86 μmol.(mL.min)-1) quanto para o derivado (69,56 mM e 113,25 μmol.(g.min)-1). Durante os 120 dias de armazenamento sob 10ÂC, nÃo houve decrÃscimo da atividade hidrolÃtica do derivado, demonstrando Ãtima estabilidade à estocagem. Por fim, o biocatalisador mostrou bons resultados de estabilidade operacional quando utilizado em alta carga oferecida (255,9 mgProteÃna.g-1 de quitosana de carga teoricamente imobilizada) para hidrÃlise de soro de leite / β-galactosidase immobilization was studied seeking to add value to cheese whey trough lactose hydrolyze producing galactose and glucose. This work aimed to develop biocatalysts using different organic supports and activation protocols. Firstly, some supports were prepared as chitosan 2.5% (w/v) (with and without pretreatment with dimethylformamide) and 2.0% (w/v), chitosan-alginate-epoxide (QAE), cashew bagasse (BC) and coconut shell fiber (CV), which were activated in different ways with glutaraldehyde, epichlorohydrin or glycidol. Initially, it was determined the immobilization yield, couple yield and apparent activity from obtained catalysts, being chosen six derivatives according to better results parameters: 2.5% chitosan (w/v) glutaraldehyde activated (QUITGLU1), 2.0% chitosan (w/v) KOH coagulated at 50ÂC glutaraldehyde activated (QUITGLU2) and epichlorohydrin (QUITEPI) or glycidol (QUITGLI), chitosan 2.5% (w/v) dimethylformamide treated with epichlorohydrin (QUIT-DMFEPI) or glycidol (QUIT-DMFGLI). Thus, catalysts (QUITGLU1, QUITGLU2, QUITEPI, QUITGLI) were studied as operational stability by using a continuous reactor, as well as, maximum enzyme loading and effectiveness assays. Then, it was determined QUITGLU2 as the best biocatalyst and following studies were carried out: immobilization time, enzyme optimum temperature and pH, kinetic parameters using lactose as substrate at 37ÂC, storage at 10ÂC and operational stability using high load enzyme and cheese whey as substrate. CV and BC supports did not present good results for β-Kluyveromyces lactis galactosidase immobilization, as well as, QAE support. Supports treated with dimethylformamide presented low immobilization yields. The results for QUITGLU2 derivative presented maximum loading of 75 mgProtein.g-1support and higher effectiveness than others. The operational stability for this derivative remained stable, with constant glucose production for 10 h of reaction. Immobilization time of 3h proved enough for the process. The Km and VmÃx values were respectively: free enzyme (46.79 mM and 7,142.86 μmol.(mL.min)-1) and catalyst (69.56 mM and 113.25 μmol.(g.min)-1). During 120 days of storage at 10ÂC, no decrease derivative hydrolitic activity was noted, demonstrating satisfactory storage stability. Finally, the biocatalyst showed good results as operational stability when used high offered enzyme load (theoretically immobilized load 255.9 mgProtein.g-1chitosan) for cheese whey hydrolysis