Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697140 bytes, checksum: a673ff7affad18149751f45b84127b29 (MD5) Previous issue date: 2009-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work is a contribution to the studies about the role of KlRox1p in fermentative metabolism of Kluyveromyces lactis. Rox1p is known in Saccharomyces cerevisiae by repressing in aerobic conditions genes that are expressed when oxygen is limited. The kinetics growth of lineages of Kluyveromyces lactis MW270-7B and its derivative mutant K. lactis MW270- 7B rox1Δ was carry out on YNB media (Yeast Nitrogen Base) containing fermentative carbon sources (glucose and lactose) or non fermentative carbon sources (glycerol and ethanol) to determine the growth profile on this sources. Besides both yeasts had its fermentative capacity researched in the presence of an inhibitor of electron chain carrier, antimicin A on YPD (yeast extract, peptone and glucose). The results indicated that the absence of KlROX1 didn't favor the growth in fermentative carbon sources, but it favored in non fermentative carbon sources. The more fermentative capacity of K. lactis rox1Δ was confirmed for the higher ethanol yield for biomass detected in the absence and presence of antimicin A (10 and 20 µM). The lineages rox1 mutant and control were also cultivated on YNB plus glucose under aerobic continuous culture (D = 0,01 h-1) and later they were submitted to a hypoxic condition for 9 hours. Samples were collected every 3 hours for analysis of the expression of putative target genes of KlRox1p as well as analysis of ethanol and of the enzymatic activity of the alcohol desidrogenase (ADH). For the analysis of gene expression, recognition sequences for KlRox1p were researched in silico in the promoters of the genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 and KlADH1 and they were found diverging of two nucleotide of the consensus sequence YYYATTGTTCTC. KlRox1p showed to have negative effect on expression of KlAAC3 and KlHEM13, but it didn't seem to act on KlCOX5B. The ethanol concentration, the activity of ADH and the expression of KlADH1 evidenced the metabolism more fermentative of K. lactis rox1Δ on aerobic and hypoxic conditions. And in a way not known, KlRox1p acts on expression of KlHAP1 and KlRAG1. The influence of KlRox1p on expression of KlADH1, KlRAG1 and KlHAP1 suggests the participation of KlRox1p in the control of key points of the fermentative metabolism: entrance of the glucose that determine the flow for the maintenance of fermentative way, as well as in the reductive reaction end that culminates with the ethanol production. The existence of genes that showed to be regulated negatively by KlRox1p in aerobic condition, like KlAAC3 and KlHEM13, indicates the existence in K. lactis of mechanism of transcriptional regulation for oxygen that intends to better use the oxygen in a limit condition, similar to the function of Rox1p in Saccharomyces cerevisiae. However that mechanism seems not just to be related with the concentrations of oxygen, but also with the carbon sources used, fermentative sources or non fermentative sources. / Esse trabalho é uma contribuição aos estudos sobre a função de KlRox1p no metabolismo fermentativo de Kluyveromyces lactis. Rox1p é conhecida em Saccharomyces cerevisiae por reprimir, em aerobiose, genes que são expressos em condição limitante de oxigênio. A cinética de crescimento de linhagens de Kluyveromyces lactis MW270-7B e sua mutante derivativa K. lactis MW270-7B rox1Δ foi realizada em meio YNB (Yeast Nitrogen Base) contendo fontes de carbono fermentáveis (glicose e lactose) ou não fermentáveis (glicerol e etanol) para determinar o perfil de crescimento nessas fontes. Além disso, ambas as linhagens tiveram sua capacidade fermentativa avaliada na presença de um inibidor da cadeia transportadora de elétrons, antimicina A, em meio YPD (extrato de levedura, peptona e glicose). Os resultados indicaram que a ausência de KlROX1 não favoreceu o crescimento em fontes de carbono fermentáveis, mas favoreceu em fontes de carbono não fermentáveis. A maior capacidade fermentativa de K. lactis rox1Δ foi confirmada pelo maior rendimento de etanol por biomassa detectada, na ausência e presença de antimicina A (10 e 20 µM). As linhagens mutante rox1 e controle também foram cultivadas em YNB e glicose em regime contínuo (D= 0,1h-1) sob aerobiose e, em seguida, submetidas à hipoxia por 9 horas. Amostras foram coletadas a cada 3 horas para análise da expressão de possíveis genes alvos de KlRox1p, bem como de etanol e da atividade da álcool desidrogenase (ADH). Para análise da expressão gênica, sequências de reconhecimento por KlRox1p foram pesquisadas in silico nos promotores dos genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 e KlADH1 e foram encontradas divergindo de dois nucleotídeos da sequência consenso YYYATTGTTCTC. KlRox1p mostrou ter efeito negativo sobre as expressões de KlAAC3 e KlHEM13 em aerobiose, mas não pareceu atuar sobre KlCOX5B. A concentração de etanol, a atividade da ADH e a expressão de KlADH1 evidenciaram o metabolismo mais fermentativo de K. lactis rox1Δ tanto em aerobiose quanto em hipoxia. E, por um mecanismo ainda desconhecido, KlRox1p atuou sobre as expressões de KlHAP1 e KlRAG1. A influência de KlRox1p na expressão de KlADH1, KlRAG1 e KlHAP1, sugere a participação de KlRox1p no controle de pontos chaves do metabolismo fermentativo: entrada da glicose, que determina o fluxo para a manutenção de uma via fermentativa, bem como na reação redutiva final, que culmina com a formação de etanol. A existência de genes que mostraram ser regulados negativamente por KlRox1p em aerobiose, como KlAAC3 e KlHEM13, indica a existência em K. lactis de mecanismo de regulação transcricional por oxigênio que visa melhor utilizar o oxigênio numa condição limitante, semelhante à função de Rox1p em Saccharomyces cerevisiae. Esse mecanismo, entretanto, parece não estar relacionado apenas com as concentrações de oxigênio, mas também com metabolismo de carbono fermentável ou não fermentável.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1544318 bytes, checksum: 458a87e82a4f75c2f8b02abcdb7d9ed9 (MD5) Previous issue date: 2009-08-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The yeast Kluyveromyces lactis has a potential applicability as a host in biotechnological production of heterologous recombinant proteins of biotechnological interest. In this context the objective of this work was to express the protein of Leishmania major GDPase for biotechnology applied to human and canine leishmaniasis. The GDPase of L. major belongs to the family of E-NTPDases or apirases, proteins involved in infectivity and virulence of parasites. For a system of expression and secretion of heterologous proteins in K. lactis, the technique of polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify a sequence of 2073 bp covering the complete coding region of the GDPase "of L. major, which is inserted into the amplicon plasmid pKLAC1 sites in Sal I and Bgl II.The construction pKLAC1- GDPase was confirmed by PCR, linearized by the enzyme Ahd I and used for transformation of wild strain CBS 2359. The transformants were selected in YCB medium containing 5 mM acetamide induced in batch and in YPGal. Extract and supernatant of these cultures were analyzed by SDS-PAGE and Western blot using a polyclonal antiserum anti-GDPase of L. major. The analysis revealed a single protein of approximately 120 kDa in the wild strains and transformants of K. lactis. Perform a search in GenBank are two homologous genes in the genome of yeast: KlGDA1 and KlYND1que may explain the cross-reactivity. The results point to the failure to obtain transformants producing GDPase of L. major, probably due not to reconstitute the promoter PLAC4 that would direct the expression of the gene of GDPase. But that raises the chances of a wild strain to be tested as to induce the production of antibodies against species of the genus Leishmania and signal that the system contains flaws that compromise its use due to the dependence of reconstitution of the promoter PLAC4. / A levedura Kluyveromyces lactis apresenta potencial aplicabilidade biotecnológica como hospedeira na produção heteróloga de proteínas recombinantes de interesse biotecnológico. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína GDPase de Leishmania major em K. lactis para fins biotecnológicos aplicados às leishmanioses humana e canina. A GDPase de L. major pertence à família das E-NTPDases ou apirases, proteínas envolvidas na infectividade e virulência de parasitos. A técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) foi utilizada para amplificar uma seqüência de 2073 pb referente a região codificante completa da GDPase de L. major, sendo este amplicon inserido no plasmídeo pKLAC1 nos sítios Sal I e Bgl II. A construção pKLAC1-GDPase foi confirmada por PCR, linearizada pela enzima Ahd I e utilizada para transformação da cepa selvagem de K. lactis CBS 2359. Os transformantes foram selecionados em meio YCB contendo 5 mM de acetamida e cultivados sob condições de indução em batelada em meio YPGal. Extrato e sobrenadante destas culturas foram analisados por SDS-PAGE e Western Blot utilizando um anti-soro policlonal anti-GDPase de L. major. As análises revelaram uma única proteína de cerca de 120 kDa nas cepas selvagem e transformantes de K. lactis. Pesquisa no Genbank revelou a presença de dois genes homólogos a GDPase no genoma da levedura: KlGDA1 e KlYND1que podem explicar a reatividade cruzada. Os resultados demonstram que os transformantes obtidos não produzem a GDPase de L. major, provavelmente devido a não reconstituição do promotor PLAC4 que dirigiria a expressão do gene da GDPase. Porém levanta as hipóteses de que a cepa selvagem possa ser testada quanto à indução da produção de anticorpos contra espécies do gênero Leishmania e de sinalizar que o sistema utilizado contém falhas que comprometem seu uso, devido à dependência de reconstituição do promotor PLAC4.

A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e de uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e no segundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1722 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial. Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos. / In spite of the advantageous physiological properties of the yeast Kluyveromyces marxianus to produce heterologous proteins, this species has not been widely explored for the synthesis of these biomolecules. On the other hand, more than 40 heterologous expression systems, including commercial ones, were developed for Kluyveromyces lactis. Moreover, there is no available literature concerning heterologous protein glycosylation in K. marxianus. Taking these facts into account, this work aimed at developing systems for the heterologous production of Aspergillus niger glucose oxidase (GOX) and of a thermophilic esterase (EST) from Thermus thermophilus in K. marxianus. The strain K. lactis CBS 2359 was utilized as a reference throughout the whole work. First, a physiological study was carried out in order to select one K. marxianus strain, out of three which had been chosen based on literature information, that exhibited the best physiological traits to be a heterologous expression host. The chosen strain was CBS 6556, based on a combination of the following properties: specific growth rate, metabolites formation, biomass yield on substrate, and secretion of the homologous enzyme inulinase. Subsequently, two episomal systems were constructed. In one of them, the heterologous gene was expressed under control of the S. cerevisiae PGK promoter, whereas in the other system, heterologous gene expression occurred under control of the K. marxianus INU1 promoter. An integrative expression system was also constructed, in which the KmINU1 promoter drove foreign gene expression. Both heterologous enzymes were characterized biochemically and also with respect to their glycosylation. The results attained with GOX led to an expression level of 1722 U/g DW (unit per gram of dry cell weight) in K. marxianus transformed with the episomal INU1-based system. The biochemical studies showed that the enzyme was very similar to the A. niger GOX. Furthermore, analysis of the glycosylation pattern showed a lower tendency of K. marxianus to hypermannosylate proteins, when compared to K. lactis. Higher levels of esterase (294 U/gDW) were obtained in K. lactis than in K. marxianus. However, the enzyme produced in the latter host presented a higher temperature for maximal activity ((50 °C), when compared to the former organism (45 °C). Both values are lower than the temperature for maximal activity of the homologous enzyme (65 °C), which can be explained by the glycans added by both yeast species to the peptide, resulting in a glycosylated protein, in contrast to the homologous esterase. Moreover, the yeast products presented three glycosylation patterns. In conclusion, the work presented in this thesis reached its aims, which were to develop these expression systems and to characterize biochemically the heterologous enzymes expressed, which included an analysis of the glycosylation pattern. The results presented here will certainly be of interest and aid the scientific community working on the expression of heterologous proteins in microorganisms.

Chez les levures, organismes eucaryotes unicellulaires, le glucose est la source d'énergie préférée. La levure modèle Kluyveromyces lactis possède deux perméases au glucose. L'expression d'une de ces deux perméases, codée par le gène RAG1, est induite par la présence de glucose extracellulaire et cette régulation transcriptionnelle dépend de la détection du glucose par un senseur membranaire spécifique, Rag4. Cependant, la régulation de l'expression de RAG1 dépend également de la capacité des cellules à métaboliser le glucose via la glycolyse. En effet, l'expression de RAG1 est fortement affectée dans des mutants glycolytiques malgré la présence de glucose extracellulaire. Au cours de cette thèse, nous nous sommes attachés à déterminer les mécanismes via lesquels la glycolyse contrôle l'expression de RAG1. Grâce à l'utilisation de mutants glycolytiques ou d'inhibiteurs chimiques de la glycolyse chez K. lactis, nous avons démontré que la glycolyse régule la stabilité du senseur Rag4 à la membrane plasmique et contrôle ainsi la voie de signalisation du glucose et l'expression de RAG1. De plus, ce mécanisme de contrôle est conservé chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiae. L'étude plus approfondie de Rag4 nous a permis de déterminer que la transmission du signal glucose requiert la queue C-terminale cytoplasmique de Rag4, qui sert de plateforme d'interaction protéique. La caractérisation fonctionnelle de Rag4 nous a permis de mettre en évidence que la protéine contient plusieurs domaines impliqués dans le contrôle de sa stabilité en fonction du type de signal induisant la déstabilisation: signal glycolytique ou changement de source de carbone. Enfin, la nature du signal issu de la glycolyse qui cible le senseur membranaire Rag4 a été étudiée en testant deux hypothèses : le signal est protéique (enzyme de la glycolyse) ou métabolique (métabolite intermédiaire de la glycolyse). Ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un rôle inédit de la glycolyse dans le contrôle de la stabilité des senseurs membranaires du glucose chez les levures K. lactis et S. cerevisiae / Yeasts are unicellular eukaryotic organisms which prefer glucose as energy source. The yeast model Kluyveromyces lactis has two glucose permeases. The expression of one of its permeases, RAG1, is induced by extracellular glucose. The glucose signaling pathway responsible for RAG1 expression regulation is dependent upon glucose sensing through a specific membrane glucose sensor, Rag4. However, RAG1 expression is also dependent upon glucose metabolism by glycolysis. Indeed, in glycolytic mutants RAG1 expression is strongly affected even when glucose is present. During these doctoral studies, we characterized mechanisms involved in glycolytic control on glucose signaling. Using glycolytic mutant or glycolysis chemical inhibitors, we have demonstrated that, in K. lactis, glycolysis targets the stability of the glucose sensor Rag4, controlling glucose signaling and RAG1 expression. This glycolytic control appears to be conserved in the yeast model Saccharomyces cerevisiae. We have shown that the C-terminal cytoplasmic tail of glucose sensor Rag4 is necessary for glucose signaling and forms a protein interaction platform. Rag4 protein contains several domains controlling Rag4 stability in response to different destabilization signals: glycolytic signal or carbon source signal. Finally, the nature of the glycolytic signal was studied considering two hypotheses: protein nature (e.g. glycolytic enzyme) or metabolic nature (e.g. glycolysis metabolic intermediate). This doctoral thesis underlines a new role of glycolysis in controlling membrane glucose sensor stability in K. lactis and S. cerevisiae

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 800491 bytes, checksum: 274cc18672a32ed45926e416e0de5305 (MD5) Previous issue date: 2011-02-15 / The homologue recombination in Kluyveromyces lactis is not the preferential way used as repair mechanism of DNA double strand, desirable in proteins expression construction dependent on gene-specific integration. In order to obtain K. lactis strains to recombinant protein expression efficient in homologue recombination way, KU80 gene was interrupted. The perfect running of non-homologue ends junctions (NHEJ) way depends on that gene and is responsible by exogenous DNA random integration in the host genome. KU80 gene deletion was made by Split-Marker. Two fragments were generated by PCR fusion, each one with a flanker sequence of KU80 coding region (5 and 3 ends) and part of geneticin resistance gene (KanMX). Deletion cassette resulting from in vivo recombination of two fragments had KanMX gene flanked by KU80 coding regions end sand was used for KU80 deletion by homologue recombination in the genome in two K. lactis strains, JA6 and HP108. The 3.7 Kb fragment obtained by PCR amplification with external primers to KU80 coding region confirmed deletion cassette integration in the target gene. Integration efficiency with Split-Marker resulting fragments was 100 %. pKLAC1 and pKLAC1/cStp vectors with streptavidin affinity domain by biotin were used to determine homologue recombination efficiency of KU80 (JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80) mutant strains. Pectin lyase coding gene (plg1) from Penicillium griseoroseum was cloned in those vectors to evaluate the capacity of K. lactis strains to produce and secrete the recombinant protein. The transformation efficiency (transformants/μg of DNA) of mutants JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80 with pKLAC1/Plg1 and pKLAC1/cStp-Plg1 vectors was higher than to parental strains JA6 and HP108. Target gene integration efficiency was 100 % in most strains, except to strains JA6/Plg1and HP108ΔKU80/Plg1 that showed an integration efficiency of 80 and 70 %, respectively. Although the high efficiency of specific-gene integration there was no pectin lyase (PL) or cStp-Plg1 secretion as expected for pKLAC1 vector. PL intracellular activity was significant when compared with parental strain HP108/Plg1, that presented specific activity of 9,525 U.mg-1 protein. / A recombinação homóloga em Kluyveromyces lactis não é a via preferencial usada como mecanismo de reparo de quebra de fita dupla de DNA, o que pode ser indesejado em construções de expressão de proteínas dependentes de integração gene-específico. Para obter linhagens de K. lactis hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes eficientes na via de recombinação homóloga realizou-se a mutação do gene KU80. Este gene é essencial para perfeito funcionamento da via de junções de extremidades não-homólogas (NHEJ), responsável pela integração aleatória do DNA exógeno no genoma hospedeiro. A deleção do gene KU80 foi feita utilizando a técnica Split-Marker. Dois fragmentos foram obtidos por fusão por PCR, cada um contendo uma sequência flanqueadora da região codificante do gene KU80 (extremidades 5 e 3 ) e uma parte do gene de resistência a geneticina (KanMX). O cassete de deleção resultante da recombinação in vivo dos dois fragmentos gerados continha o gene KanMX flanqueado pelas extremidades da região codificante do gene KU80, e foi utilizado para deleção do gene KU80 por recombinação homóloga no genoma de duas linhagens de K. lactis, JA6 e HP108. O fragmento de 3,7 Kb obtido por amplificação por PCR com oligonucleotídeos externos à região codificante do gene KU80 confirmou a integração do cassete de deleção no gene alvo. A eficiência de integração com os fragmentos resultantes do Split-Marker foi de 100 %. Os vetores pKLAC1, e pKLAC1/cStp contendo o domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina, foram usados para determinar a eficiência de recombinação homóloga das linhagens mutantes KU80 (JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80). O gene da pectina liase (plg1) de Penicillium griseoroseum foi clonado nesses vetores para avaliar a capacidade de linhagens de K. lactis em produzir e secretar a proteína recombinante. A eficiência de transformação (transformantes/μg de DNA) dos mutantes JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80 com os vetores pKLAC1/Plg1 e pKLAC1/cStp-Plg1, foi superior à das linhagens parentais JA6 e HP108. A eficiência de integração no gene alvo foi de 100% para maioria das linhagens, com exceção das linhagens JA6/Plg1e HP108ΔKU80/Plg1 que apresentaram, respectivamente, eficiência de 80 e 70 % de integração geneespecífico. Apesar da eficiência de integração por recombinação homóloga, não houve secreção de PL e da fusão cStp-Plg1 como esperado ao se utilizar o vetor pKLAC1. A atividade intracelular de pectina liase (PL) só foi significativa em relação à parental para a cepa HP108/Plg1, que demonstrou atividade específica de 9,525 U.mg-1 proteína.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 996773 bytes, checksum: 7322b4697c096a6f17a4388ca498fede (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The L-ascorbic acid (ALA) is produced naturally by plants from D-glucose. Yeasts synthesize a similar metabolite, D-eritroascorbic acid (ADEA). Although this compound does not show activity against scurvy, it contains an antioxidant function, but it is produced in low concentrations by the microorganism. Recently, in order to make yeasts are capable of converting D-galactose D-lactose from cheese whey into ALA, the wild strain Kluyveromyces lactis CBS2359 has been transformed with genes that integrate the L-galactose biosynthesis pathway, isolated from Arabidopsis thaliana. In the presence of intermediate L-galactose, ALA can be synthesized by yeast with enzymes responsible for ADEA production. It has been demonstrated that the engineered strain JVC 1-56 was able to synthesize ALA compared to the wild type, but the yield was still low. In this regard, studies to assist the increased of ALA production are relevant. Once the engineered ALA pathway and native cell wall formation pathway of K. lactis have a common intermediate, GDP-D-mannose, we need to evaluate the effect of uncoupling of vitamin C synthesis route of the growth that requires constant wall synthesis. Moreover, considering the antioxidant properties of ALA, the expectation is that the production of this metabolite increase when JVC 1-56 is exposed to a oxidative stress condition by menadione. In this context, this study investigated the both physiological conditions, using the media Yeast Galactose Base (YGB) and ultrafiltered cheese whey (SQU - byproduct of cheese industry that predominates lactose as carbon source). It was analyzed that Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produces higher yields of ALA when it is grown for 96 hours in batch culture in the middle YPGal. Cultivation at low growth rates (0.04 h-1) predisposes the cells to synthesize more ALA per unit cell mass (0.80 mg/mg). However, the yield of continuous culture operated as quimostato, limiting the substrate nitrogen, still proved to be lower than expected in the batch (1.94 mg/mg). Oxidative stress by 12.5 mM menadione on K. lactis JVC1 -56, in the conditions applied, was not effective in the increasing the ALA production (1.47 mg/mg). Still, ADEA yield was higher than ALA in two strategies: 1.37 mg/mg at 0.21 h-1 in culture under steady state, 8.52 mg/mg in batch under oxidative stress and 10.33 mg/mg in the batch in the absence of oxidizing agent, indicating that ADEA may be in a more stable configuration than vitamin C. Finally, the permeate cheese whey remains a prospect for the conversion of lactose into a biotechnological product of higher value aggregate. / O ácido L-ascórbico (ALA) é produzido naturalmente por plantas a partir de D-glicose. Leveduras sintetizam um metabólito semelhante, o ácido D-eritroascórbico (ADEA). Embora este composto não mostre atividade contra o escorbuto, ele contém uma função antioxidante, mas é produzido pelo micro-organismo em baixas concentrações. Recentemente, com a finalidade de fazer as leveduras serem capazes de converter o componente D-galactose da D-lactose do soro de queijo em ALA, a linhagem selvagem de Kluyveromyces lactis CBS2359 foi transformada com genes, que integram a via de biossíntese de L-galactose, isolados de Arabidopsis thaliana. Na presença do intermediário L-galactose, ALA pode então ser sintetizado pela levedura com as enzimas responsáveis pela produção de ADEA. Foi demonstrado que a linhagem engenheirada JVC 1-56 foi capaz de sintetizar ALA em comparação com a selvagem, mas com baixo rendimento. Neste sentido, estudos que auxiliem o aumento da produção de ALA são relevantes. Uma vez que a via engenheirada da síntese de ALA e a via nativa da formação da parede celular de K. lactis possuem um intermediário comum, GDP-D-manose, faz-se necessário avaliar o efeito do desacoplamento da produção de ALA do crescimento que requer constante síntese da parede. Além disso, considerando a propriedade antioxidante do ALA, a expectativa é de que a produção deste metabólito aumentasse quando JVC 1-56 fosse exposta a uma condição de estresse oxidativo por menadiona. Neste contexto, este trabalho investigou as condições fisiológicas mencionadas utilizando os meios Yeast Galactose Base (YGB) e soro de queijo ultrafiltrado (SQU - subproduto de indústrias de queijo em que predomina lactose como fonte de carbono). Foi averiguado que Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produz ALA com rendimentos maiores quando cultivada por 96 horas em batelada no meio YPGal. O cultivo em baixas velocidades de crescimento (0,04 h -1) predispõe as células a sintetizar mais ALA por unidade de massa celular (0,80 mg/mg). Entretanto, o rendimento da cultura contínua operada como quimostato, tendo nitrogênio como substrato limitante, ainda mostrou ser inferior ao previsto na batelada (1,94 mg/mg). Já o estresse oxidativo por 12,5 μM de menadiona sobre K. lactis JVC1- 56, nas condições aplicadas, não foi eficaz no aumento da produção de ALA (1,47 mg/mg). Ainda, o rendimento de ADEA foi superior ao de ALA nas duas estratégias: 1,37 mg/mg a 0,21 h-1 na cultura sob regime permanente, 8,52 mg/mg na batelada sob estresse oxidativo e 10,33 mg/mg na batelada na ausência do agente oxidante, indicando que ele pode estar em uma configuração mais estável do que a vitamina C. Finalmente, o permeado do soro de queijo continua sendo uma perspectiva para a conversão da lactose em um produto biotecnológico de maior valor agregado.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 587076 bytes, checksum: d1ad8af5f243dc621caec98155378354 (MD5) Previous issue date: 2008-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this work we have created an in silico system to address secretion of a desired protein among the genome data of Kluyveromyces lactis. The completed K. lactis genome sequencing has provided a tool to construct such a system. In order to explore a potential K. lactis extracellular secretome, four computational prediction algorithms have been applied: SignalP (presence or absence of an N-terminal signal peptide and clivage site), Phobius (transmembrane topology), big-PI Predictor (GPI modification site) and WolfPsort (subcellular addressing, including extracellular prediction). These algorithms have correctly predicted 95 yeast secreted proteins sought in public databases (NCBI, UNIProt and MIPS). They have also predicted as intracellular the same number (i.e. 95) of random sequences found in K. lactis database. The K. lactis database consists of 5327 sequences (http://cbi.labri.fr/Genolevures). When analyzed by SignalP 3.0, it has pointed out 698 putative proteins with N-terminal signal peptides. In this group, 260 were predicted by Phobius to have no transmembrane domains and 236 were found by the big-PI Predictor to have no GPI modifications site. Finally, the predicted K. lactis secretome was estimated to consist of up to 101 sequences by WolfPSORT which eliminates proteins with subcellular targeting. In order to validate theses analysis, both groups of predicted and annotated extracellular proteins were compared by Hotelling s T2 test. The analysis has shown no differences between the mean values of these two groups. The physiological significance of those potential extracellular proteins was similarly investigated by analyzing the relationship between the S. cerevisiae transcriptional regulators ortologues in K. lactis and the putative promoters (i.e. 1 KB upstream) of those extracellular proteins. It was applied the methodology proposed by Yeastract which search for elements such as binding sites that indicates associations between transcriptional factor and target genes. The physiological condition favoring protein expression in extracellular medium was obtained by searching Gene Ontology (http://www.geneontology.org). It has been shown that most of the transcriptional regulators of K. lactis extracellular proteins are related to stress response, especially presence of drugs into the medium. Also pH stress and limiting nitrogen can induce the extracellular proteins. / O banco de dados da Kluyveromyces lactis constituído de 5327 seqüências de proteínas (http://cbi.labri.fr/Genolevures) foi submetido a quatro algoritmos de predição para identificar o potencial secretome extracelular. O primeiro,SignalP v3 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0), que identifica a presença de peptideo sinal na porção N-terminal e o sítio de clivagem da peptidase sinalagrupou 698 proteínas.Deste grupo, o Phobius(http://phobius.sbc.su.se), que prevê a topologia de domínios transmembranas a partir das sequencias primárias, indicou 260 sem domínios transmembranas.Outros dois algoritmos, big-PI predictor(http://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html),capaz reconhecer marcas de de ancoras GPI (Glicosilfosfatidilinositol) e WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)capaz de identificar assinaturas para a localização em compartimentos subcelulares apontaram 236 proteínas sem ancoras GPI e 101 endereçadas ao meio extracelular. Como controle positivo, os mesmos algoritmos foram testados e predisseram corretamente 95 proteínas de leveduras Saccharomycetes encontradas nos bancos de dados públicos (NCBI e UNIProt) e anotadas como extracelulares. Como controle negativo foram preditas como intracelular 95 seqüências aleatórias do banco de dados da K. lactis. O grupo controle positivo e o grupo predito foram comparados pelo teste estatístico T2 de Hotelling. Não foram evidenciadas diferenças significativas entre os valores das médias dos grupos.A condição fisiológicana qual estas proteínas extracelulares são expressas foi analisada relacionando suas seqüências promotoras com os fatores transcricionais ortólogos da Saccharomyces cerevisiae. A metodologia aplicada foi o "Yeastract" (http://www.yeastract.com) que localiza sítios de ligação ao DNA dos fatores transcricionais de S. cerevisiaenas seqüências promotoras dos ORFs das proteínas preditas como extracelulares. A condição fisiológica que favorece a expressão para o meio extracelular foi obtida pela pesquisa dos termos descritos pelo "Gene Ontology"(http://www.geneontology.org). Os fatores transcricionais que mais se relacionam com as seqüências preditas foram aqueles associados com resposta a estresse. Também foi indicado que o estresse ácido e limitação de nitrogênio (aminoácidos) exercem influência na expressão das proteínas extracelulares.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 445645 bytes, checksum: f448d5a3c851f1c181e95a80994ffb89 (MD5) Previous issue date: 2007-03-16 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / In order to investigate the stress condition imposed by nitrogen limitation on kinetic of growth and aging of Kluyveromyces lactis, the kinetics constants of K. lactis culture as function of ammonium sulfate concentration were determined. The effect of aging of the culture on its specific initial growth rate was evaluated. Signals of aging such as cell wall chitin concentration and apoptosis markers were analyzed as function of growth rate on continuous culture. K. lactis was cultured in buffered YCB medium supplemented with ammonium sulfate at concentrations of 0.02 to 38.0 mmol.L-1. The growth kinetic followed the model proposed by Monod. The maximum specific growth rate (µmax) and saturation constant (Ks) were 0.44 h-1 and 0.15 mmol.L-1, respectively. The initial specific growth rates decrease as the aging of the culture increases. The cell wall chitin concentration increased with the ammonium concentrate and the aging of the cultures. The cell dimensions raised with aging in all the ammonium sulfate concentration analyzed. Apoptosis markers were only observed in the older cultures, after five days of recycling of the culture on the concentrations of 0.57 mmol.L-1, 3.80 mmol.L-1 and 7.60 mmol.L-1 and after eight days on the concentrations 38.0 mmol.L-1 of ammonium sulfate. Aging signals were investigated at K. lactis cells growing in nitrogen limiting continuous culture at growth rate 0.01, 0.06, 0.18 and 0.35 h-1. Chitin concentration of cell wall of cells growing at 0.01 h-1 and 0.06 h-1 was higher (27µg.mL-1 N-acetylglucosamine and 20µg.mL-1 N-acetylglucosamine) than of cells growing at 0.18 h-1 and 0.35 h-1 (6µg.mL-1 and 5µg.mL-1, respectively). The dimensions of K. lactis cells were largest on the growth rate of 0.01 h-1. It was detected apoptosis markers on the continuous culture under the nitrogen limiting growth rate of 0.01 h-1. The results demonstrate that nitrogen limitation and aging affect growth kinetic and suggest that nitrogen limiteted continuous culture conducted at growth rate 0.01 h-1 can still proven useful to investigate aging response of Kluyveromyces lactis. / Para investigar o estresse imposto por condições limitantes de nitrogênio na cinética de crescimento e na longevidade de culturas de Kluyveromyces lactis, determinaram-se as constantes cinéticas do crescimento de culturas de K. lactis em função da concentração de sulfato de amônio, avaliou-se o efeito da idade das culturas na velocidade específica inicial de crescimento e averiguaram-se os sinais de envelhecimento celular em função de diferentes velocidades de crescimento de culturas conduzidas em regime contínuo sob limitação por nitrogênio. Culturas de K. lactis foram cultivadas em meio YCB tamponado acrescido de sulfato de amônio, nas concentrações 0,02 a 38,0 mmol.L-1. A cinética de crescimento de K. lactis em função da concentração de sulfato de amônio, obedeceu o modelo cinético proposto por Monod. A velocidade específica máxima de crescimento (μmáx.) e a constante de saturação (Ks) foram de 0,44 h-1 e 0,15 mmol.L-1, respectivamente. A velocidade específica inicial de crescimento reduziu com a idade da cultura. Concentrações de quitina na parede celular aumentaram com a idade da cultura e com a concentração de sulfato de amônio. Dimensões celulares aumentaram com a idade independente da concentração de sulfato de amônio. A presença de características morfológicas de apoptose foi verificada a partir do quinto dia de transferência da cultura para meio novo nas concentrações de 0,57 mmol.L-1, 3,80 mmol.L-1, 7,60 mmol.L-1 e a partir do oitavo dia de repicagem na concentração de 38,0 mmol.L-1 de [NH4]2SO4. Culturas contínuas sob estresse por nitrogênio foram conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,01, 0,06; 0,18 e 0,35 h-1. Culturas com velocidades de crescimento de 0,18 e 0,35 h-1 produziram maior rendimento em etanol e menor rendimento em glicerol. A concentração de quitina na parede celular de culturas de K. lactis conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,01 h-1 e 0,06 h-1 foi maior (27 mg.mL-1 e 20 mg.mL-1 de N-acetilglicosamina) comparada com as culturas conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,18 h-1 e 0,35 h-1, que apresentaram 6 μg.mL-1 e 5 μg.mL-1 de N-acetilglicosamina, respectivamente. As dimensões das células de K. lactis foram maiores na cultura conduzida com velocidade de crescimento de 0,01 h-1, se comparada com as demais velocidades de crescimento avaliadas: 0,06; 0,18 e 0,35 h-1. Apesar desses sinais de envelhecimento terem sido detectados, características morfológicas de apoptose só foram identificadas nas culturas de K. lactis conduzidas na velocidade de crescimento de 0,01 h-1. Os resultados mostraram que o estresse por nitrogênio e a idade afetam a cinética de crescimento de culturas de K. lactis e sugerem que culturas contínuas de Kluyveromyces lactis sob condições nitrogênio limitantes conduzidas com velocidade de crescimento correspondente a 0,01 h-1 podem ser úteis em estudos sobre sinais de envelhecimento celular.

Transfer RNAs (tRNA) function as adaptor molecules in the translation of mRNA into protein. These adaptor molecules require modifications of a subset of their nucleosides for optimal function. The most frequently modified nucleoside in tRNA is position 34 (wobble position), and especially uridines present at this position. Modified nucleosides at the wobble position are important in the decoding process of mRNA, i.e., restriction or improvement of codon-anticodon interactions. This thesis addresses the functional aspects of the wobble uridine modifications. The Saccharomyces cerevisiae Elongator complex consisting of the six Elp1-Elp6 proteins has been proposed to participate in three distinct cellular processes; elongation of RNA polymerase II transcription, regulation of polarized exocytosis, and formation of modified wobble nucleosides in tRNA. In Paper I, we show that the phenotypes of Elongator deficient cells linking the complex to transcription and exocytosis are counteracted by increased level of and . These tRNAs requires the Elongator complex for formation of the 5-methoxycarbonylmethyl (mcmlnGUUGsmcm25tRNALysUUUsmcm25tRNA5) group of their modified wobble nucleoside 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine (mcm5s2U). Our results therefore indicate that the relevant function of the Elongator complex is in formation of modified nucleosides in tRNAs and the defects observed in exocytosis and transcription are indirectly caused by inefficient translation of mRNAs encoding gene products important for these processes. The lack of defined mutants in eukaryotes has led to limited understanding about the role of the wobble uridine modifications in this domain of life. In Paper II, we utilized recently characterized mutants lacking the 2-thio (s2) or 5-carbamoylmethyl (ncm5) and mcm5 groups to address the in vivo function of eukaryotic wobble uridine modifications. We show that ncm5 and mcm5 side-chains promote reading of G-ending codons, and that presence of a mcm5 and an s2 group cooperatively improves reading of both A- and G-ending codons. Previous studies revealed that a S. cerevisiae strain deleted for any of the six Elongator subunit genes shows resistance towards a toxin (zymocin) secreted by the dairy yeast Kluyveromyces lactis. In Paper III, we show that the cytotoxic γ subunit of zymocin is a tRNA endonuclease that target the anticodon of mcm5s2U34 containing tRNAs and that the wobble mcm5 modification is required for efficient cleavage. This explains the γ-toxin resistant phenotype of Elongator mutants which are defective in the synthesis of the mcm5 group.

The aim of this research was the production of beta-galactosidase from thermophilic fungi for use in low lactose milk production or other possible applications. For this purpose, three thermophilic fungi Humicola insolens, Torula thermophila and Thermomyces lanuginosus were screened for lactase production. Highest lactase activity was observed in Thermomyces lanuginosus. The carbon source inducing highest extracellular lactase production in Thermomyces lanuginosus was determined as arabinose. When grown on arabinose T. lanuginosus produced two major lactase activity peaks, one being at day 4 (beta-galactosidase-A) and second starting following the initiation of biomass degradation at day 3 suggesting the existence of a cell wall-bound beta-galactosidase (beta-galactosidase-B). Maximum activity of the second enzyme was at day 10. Crude enzyme stored at 4&ordm / C and -20&ordm / C was stable over a period of one month. Optimum pH and temperature of crude enzyme were found as pH 6.8 and 65&ordm / C. For concentration of extracellular enzyme, fractional ammonium sulfate precipitation with 60-85% salt was applied. Comparisons with commercial lactase obtained from Kluyveromyces lactis revealed that partially purified lactase from Thermomyces lanuginosus was 1.3 times more efficient in hydrolysis of lactose even at 30&ordm / C which is optimum for Kluyveromyces lactis. Lactose hydrolysis was enhanced at higher temperatures and reached maximum at 50-60&ordm / C giving 4.7 fold higher hydrolysis than Kluyveromyces lactis beta-galactosidase. Molecular weight of the second enzyme was determined as 156 kDa by gel filtration. Being an extracellular enzyme with optimum pH suitable for dairy processes, high thermotolerance and stability, this enzyme has a potential for commercial use.