No presente estudo, fungos ligninolíticos isolados de ecossistemas brasileiros foram avaliados quanto a capacidade de descolorir corantes reativos e, a linhagem Peniophora cinerea, selecionada, teve seu sistema ligninolítico caracterizado. As lacases deste fungo foram avaliadas para duas aplicações: descoloração de efluentes têxteis e auxílio na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. Lacase foi a única enzima ligninolítica extracelular detectada nos culivos de P. cinerea. A produção de lacase por P. cinerea foi avaliada em meios sintético e complexo, de forma a obter melhores níveis de produção da enzima. Em meio complexo (milhocina 0,5%, sacarose 0,5% e cobre como indutor de lacase) P. cinerea produziu cerca de aproximadamente 1000 U/l de lacase. Em meio sintético, contendo xilidina e tween 80, P. cinerea imobilizado (em esponja de poliuretano) produziu 3505 U/l de lacase em cultivo em Erlenmeyer e somente 150 U/l em reator de tanque com agitação por pás. Lacases produzidas por P. cinerea foram purificadas e caracterizadas. O sobrenadante do meio de cultivo foi aplicado em coluna de troca aniônica, DEAE-Sepharose CL-6B, e três picos com atividade de lacase foram observados e aplicados separadamente em Mono Q (coluna de troca aniônica). Oito isoenzimas de lacase, com massas entre 30 e 70 kDa e ponto isoelétrico (pI) entre 3 e 6 foram reveladas em géis de eletroforese em condições desnaturantes e não desnaturantes e por focalização isoelétrica (IEF). Algumas isoenzimas apresentaram alta termoestabilidade a 50ºC, pH ótimo entre 2,6 e 4,0 e Km para o ABTS entre 12,7 e 20 ?M, dependendo do tipo de lacase. Diferentes mediadores de lacases de P. cinerea foram avaliados (HBT, HBA, 2,3 DHBA, DOPAC, ABTS, siringaldeido, oxalato de sódio e Mn2+). O sistema composto por lacase, siringaldeído, oxalato de sódio e Mn2+ produziu a maior descoloração do Reactive Blue 19. As lacases foram utilizadas para descoloração de um efluente simulado, preparado com 100 mg/l de Reactive Red 271, hidrolisado em NaOH 2 M, e um efluente real, fornecido por uma indústria têxtil. O efluente simulado foi totalmente descolorido, em 24h, pelo extrato enzimático. A partir desta constatação, o efluente real foi tratado com os extratos de P. cinerea e mais de 60% de descoloração foi obtida com o uso de lacase e mediadores. Lacases produzidas por P. cinerea foram também utilizadas para hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. As amostras de bagaços foram obtidas de tratamentos com sulfito ácido, sulfito alcalino, ácido sulfúrico, clorito de sódio ou sem tratamento (in natura). Duas formas de tratamento foram avaliadas: tratamento simultâneo, ou seja, lacases foram adicionadas juntamente com um preparado comercial de celulases; ou num tratamento sequencial, em que a polpa do bagaço foi previamente tratada com lacase para depois ser hidrolisada com celulases. O tratamento simultâneo com lacase e celulase resultou em menor conversão de celulose, devido a possível inativação das celulases pela ação oxidativa de lacase. A aplicação sequencial das enzimas nos bagaços pré-tratados por sulfito ácido ou por sulfito alcalino favoreceu à hidrólise da celulose. Estudos futuros para tratamento sequencial de lacase à hidrólise de bagaço de cana devem considerar aspectos reacionais básicos: maior carga enzimática, temperatura, tempo de reação e mediadores. Lacases são excepcionalmente versáteis para aplicações biotecnológicas e a produção em larga escala integrará o uso da enzima em diferentes processos industriais. / In the present estudy, ligninolytic fungi isolated from Brazilian ecosystems were evaluated for the ability to decolorize reactive dyes and a selected strain of Peniophora cinerea had its ligninolytic system characterized. Laccases from this fungi were evaluated for two biotechnology applications: decolorization of textile effluents and enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse. P. cinerea produced an halotolerant laccase activity, unique feature with the data available in the literature and with potential for biotechnological applications, making it the object of our studies. Laccase was the only ligninolytic enzyme detected in the extracellular extract from P. cinerea. The production of laccase by P. cinerea was evaluated in synthetic and complex media, in order to obtain higher levels of enzyme production. In complex medium (corn steep liquor 0.5%, sucrose 0.5% and copper, as inducer of laccase) P. cinerea produced about 1000 U/l of laccase. In synthetic medium containing tween 80 and xylidine, P. cinerea immobilized in polyurethane foam produced 3505 U/l of laccase in culture in flasks; in STR reactor P. cinerea produced only 150 U/l. Laccases produced by P. cinerea were purified and characterized. The supernatant of the culture medium was loaded on an anion exchange column, DEAE-Sepharose CL-6B, and three peaks with laccase activity were detected and applied separately on a Mono Q column. Eight isoenzymes of laccases with molecular weigh between 30 and 70 kDa and isoelectric point (pI) between 3 and 6 were revealed on electrophoresis gels at denaturing, native conditions and isoelectric foccusing (IEF). Some isoenzymes showed high thermostability at 50°C, optimal pH between 2.6 and 4.0, and Km for the ABTS between 12.7 and 20 ?M., depending on the type of laccase. Different mediators for laccases of P. cinerea were evaluated (HBT, HBA, 2,3 DHBA, DOPAC, ABTS, syringaldehyde, sodium oxalate and Mn2+). The system laccase, syringaldehyde, sodium oxalate and Mn2+ produced the highest decolorization of Reactive Blue 19. Laccases produced by P. cinerea were used for decolorization of a simulated efluent prepared with 100 mg/l of Reactive Red 271 hydrolyzed with NaOH 2 M and a real effluent, provided by a textile industry. The simulated efluent was completely decolorized within 24 hours by the enzymatic extract. In face of that, the real effluent was evaluated for decolorization by the extracts of P. cinerea and more than 60% of decolorization was obtained by laccase-mediator system. Laccases produced by P. cinerea were also used to hydrolize the sugar cane bagasse. Sugarcane bagasse samples were obtained by acid sulfite, alkaline sulfite, sulfuric acid, sodium chlorite or untreated (in natura). Two forms of treatment were evaluated: simultaneous treatment, ie, laccases have been added along with a commercial cellulase complex for hydrolysis of sugarcane bagasse, or a sequential treatment, in witch bagasse was pre-treated with laccase followed by cellulases. Simultaneous treatment with both enzymes resulted in lower conversion of cellulose than sequential treatment due to possible inactivation of cellulases by the oxidative action of laccase. Future studies of sequential treatment with laccase and hydrolysis of sugarcane bagasse should consider additional basic concepts of reactions such as: increase of enzyme load, temperature, reaction time and mediators. Laccases are exceptionally versatile for biotechnological applications and the production in large scale integrate the use of the enzyme in different industrial processes.

Estima-se que o Brasil produza no ano de 2010 cerca de 160 milhões de toneladas de bagaço e palha de cana-de-açúcar. O bagaço é um subproduto decorrente do esmagamento da cana, constituído por fibras, partículas de terra e resíduos de caldo. A palha é o material remanescente encontrado na superfície da área plantada, após a colheita, constituída por frações de folhas, ponteiros, colmos e raízes. Estes subprodutos são utilizados como fonte de energia dentro das próprias usinas e destilarias. Porém, com o interesse mundial voltado para o uso de outras fontes de energia, além do petróleo, a importância do emprego destes substratos na produção de etanol, aumentou. As fibras presentes nestes subprodutos são constituídas principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação destes materiais, resultando na conversão da biomassa em produtos de alto valor agregado, são bastante complexos, necessitando da participação de enzimas lignocelulolíticas produzidas, sobretudo por fungos. Este estudo visou à caracterização enzimática lignocelulósica e a liberação de açúcares redutores por fungos ligninolíticos e celulolíticos, expostos a duas concentrações de nitrogênio e o comportamento destes organismos perante situação de estresse nutricional. Os fungos utilizados foram Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei e Aspergillus niger, selecionados em trabalhos anteriores. Estes organismos foram inoculados em frascos Erlenmeyers, contendo bagaço e palha de cana pré-tratados com H2SO4 (0,5%) e duas concentrações de nitrogênio (0,5% e 1% de extrato de levedura), por 15 dias. Diariamente, foram coletadas amostras e analisadas quanto à concentração de proteínas, atividade específica de Lacase, Peroxidases, Manganês peroxidase, Endoglicanases, atividade celulolítica total, Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e quantificação de açúcares redutores. A enzima SOD foi analisada através de PAGE não desnaturante e o perfil protéico observado em SDS-PAGE. As demais análises foram realizadas em espectrofotômetro. O meio contendo 0,5% de extrato de levedura foi favorável ao crescimento dos fungos P. sajor caju e T. reesei, e o meio com 1% de extrato foi favorável à P. chrysosporium e A. niger. Quanto à produção das enzimas ligninolíticas (µmol.min-1.mg proteína-1), a maior produção de Lacase foi observada em P. sajor caju (2,2; 1%; 13º dia), de Peroxidases também para P. sajor caju (1,5; 1%; 12º dia) e MnP para T. reesei (0,172; 1%; 4º dia). A maior atividade celulolítica total (FPU.mg proteína-1) e de Endoglicanases (CMC.mg proteína-1) foi observada para T. reesei (10,1 e 20,6; 0,5%; 7º dia, respectivamente). Quanto à maior liberação de açúcares redutores, P. chrysosporium (0,757 mgAR.gBS-1; 1%; 9º dia). Foram observadas até quatro isoformas de SOD que variaram entre os fungos, concentrações de nitrogênio e dias. As maiores atividades de CAT (µmol.min-1.mgproteína-1) foram observadas para P. sajor caju (0,811; 5º dia), T. reesei (0,726; 1º dia), P. chrysosporium (0,441; 3º dia) e A. niger (0,194; 10º dia), todos na concentração de 0,5%. As espécies, as concentrações de nitrogênio e o período de incubação influenciaram no crescimento, nas atividades enzimáticas e na liberação de açúcares redutores dos fungos / It is estimated that Brazil will produce in 2010 about 160 million tons of sugarcane bagasse and straw. The bagasse is a byproduct resulting from the crushing of sugarcane, consisting of fibers, particles of dirt and waste broth. The straw is the material found on the surface of the remaining crop, after harvest, consisting of fractions of leaves, pointers, stems and roots. These products are used as an energy source within their own mills and distilleries. However, with the global interest focused on the use of other energy sources instead of petroleum, the importance of using these substrates in ethanol production increased. The fibers in these products are composed primarily of cellulose, hemicellulose and lignin. The mechanisms involved in enzymatic degradation of these materials, resulting in conversion of biomass into high value added products, are quite complex, requiring the participation of lignocellulolytic enzymes produced mainly by fungi. This study aimed to a lignocellulosic enzymatic characterization and the release of reducing sugars by ligninolytic and cellulolytic fungi exposed to two concentrations of nitrogen and the behavior of these organisms against a nutritional stress situation. The fungi used were Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei and Aspergillus niger, selected from previous work. These organisms were inoculated in Erlenmeyer flasks containing sugarcane bagasse and straw pretreated with H2SO4 (0.5%) and two concentrations of nitrogen (0.5% and 1% yeast extract) for 15 days. Daily samples were collected and analyzed for proteins concentration, specific activity of Laccase, Peroxidases, Manganese Peroxidase, Endoglucanases, total cellulolytic activity, Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and quantification of total sugar. The enzyme SOD was analyzed by native PAGE gels and the protein profile observed in SDS-PAGE. Other analyses were performed on a spectrophotometer. The medium containing 0.5% yeast extract was favorable to the growth of fungi P. sajor caju and T. reesei and the medium with 1% extract favored P. chrysosporium and A. niger. Regarding the production of lignilolytic enzymes (mol.min-1.mg protein-1), the highest activity of Laccase was found in P. sajor caju (2.2, 1%, 13 days), for Peroxidases also in P. sajor caju (1.5, 1%, day 12) and MnP in T. reesei (0.172, 1%, day 4). The highest total cellulolytic activity (FPU.mg protein-1) and Endoglucanases (CMC.mg protein-1) was observed for T. reesei (10.1 and 20.6, 0.5%, day 7, respectively). As for the highest release of total sugars, P. chrysosporium (0.757 mgAR.gBS-1, 1%, 9 day). It was observed up to four SOD isoforms that varied from fungi, nitrogen concentrations and days. The highest CAT activities (mol.min-1.mg protein-1) were observed for P. sajor caju (0.811, 5 days), T. reesei (0.726, day 1), P. chrysosporium (0.441, day 3) and A. niger (0.194, 10 days), all at 0.5% concentration. The species, nitrogen concentrations and the period of incubation influenced the growth, the enzymatic activity and the release of total sugars in the fungi

No presente estudo, fungos ligninolíticos isolados de ecossistemas brasileiros foram avaliados quanto a capacidade de descolorir corantes reativos e, a linhagem Peniophora cinerea, selecionada, teve seu sistema ligninolítico caracterizado. As lacases deste fungo foram avaliadas para duas aplicações: descoloração de efluentes têxteis e auxílio na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. Lacase foi a única enzima ligninolítica extracelular detectada nos culivos de P. cinerea. A produção de lacase por P. cinerea foi avaliada em meios sintético e complexo, de forma a obter melhores níveis de produção da enzima. Em meio complexo (milhocina 0,5%, sacarose 0,5% e cobre como indutor de lacase) P. cinerea produziu cerca de aproximadamente 1000 U/l de lacase. Em meio sintético, contendo xilidina e tween 80, P. cinerea imobilizado (em esponja de poliuretano) produziu 3505 U/l de lacase em cultivo em Erlenmeyer e somente 150 U/l em reator de tanque com agitação por pás. Lacases produzidas por P. cinerea foram purificadas e caracterizadas. O sobrenadante do meio de cultivo foi aplicado em coluna de troca aniônica, DEAE-Sepharose CL-6B, e três picos com atividade de lacase foram observados e aplicados separadamente em Mono Q (coluna de troca aniônica). Oito isoenzimas de lacase, com massas entre 30 e 70 kDa e ponto isoelétrico (pI) entre 3 e 6 foram reveladas em géis de eletroforese em condições desnaturantes e não desnaturantes e por focalização isoelétrica (IEF). Algumas isoenzimas apresentaram alta termoestabilidade a 50ºC, pH ótimo entre 2,6 e 4,0 e Km para o ABTS entre 12,7 e 20 ?M, dependendo do tipo de lacase. Diferentes mediadores de lacases de P. cinerea foram avaliados (HBT, HBA, 2,3 DHBA, DOPAC, ABTS, siringaldeido, oxalato de sódio e Mn2+). O sistema composto por lacase, siringaldeído, oxalato de sódio e Mn2+ produziu a maior descoloração do Reactive Blue 19. As lacases foram utilizadas para descoloração de um efluente simulado, preparado com 100 mg/l de Reactive Red 271, hidrolisado em NaOH 2 M, e um efluente real, fornecido por uma indústria têxtil. O efluente simulado foi totalmente descolorido, em 24h, pelo extrato enzimático. A partir desta constatação, o efluente real foi tratado com os extratos de P. cinerea e mais de 60% de descoloração foi obtida com o uso de lacase e mediadores. Lacases produzidas por P. cinerea foram também utilizadas para hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. As amostras de bagaços foram obtidas de tratamentos com sulfito ácido, sulfito alcalino, ácido sulfúrico, clorito de sódio ou sem tratamento (in natura). Duas formas de tratamento foram avaliadas: tratamento simultâneo, ou seja, lacases foram adicionadas juntamente com um preparado comercial de celulases; ou num tratamento sequencial, em que a polpa do bagaço foi previamente tratada com lacase para depois ser hidrolisada com celulases. O tratamento simultâneo com lacase e celulase resultou em menor conversão de celulose, devido a possível inativação das celulases pela ação oxidativa de lacase. A aplicação sequencial das enzimas nos bagaços pré-tratados por sulfito ácido ou por sulfito alcalino favoreceu à hidrólise da celulose. Estudos futuros para tratamento sequencial de lacase à hidrólise de bagaço de cana devem considerar aspectos reacionais básicos: maior carga enzimática, temperatura, tempo de reação e mediadores. Lacases são excepcionalmente versáteis para aplicações biotecnológicas e a produção em larga escala integrará o uso da enzima em diferentes processos industriais. / In the present estudy, ligninolytic fungi isolated from Brazilian ecosystems were evaluated for the ability to decolorize reactive dyes and a selected strain of Peniophora cinerea had its ligninolytic system characterized. Laccases from this fungi were evaluated for two biotechnology applications: decolorization of textile effluents and enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse. P. cinerea produced an halotolerant laccase activity, unique feature with the data available in the literature and with potential for biotechnological applications, making it the object of our studies. Laccase was the only ligninolytic enzyme detected in the extracellular extract from P. cinerea. The production of laccase by P. cinerea was evaluated in synthetic and complex media, in order to obtain higher levels of enzyme production. In complex medium (corn steep liquor 0.5%, sucrose 0.5% and copper, as inducer of laccase) P. cinerea produced about 1000 U/l of laccase. In synthetic medium containing tween 80 and xylidine, P. cinerea immobilized in polyurethane foam produced 3505 U/l of laccase in culture in flasks; in STR reactor P. cinerea produced only 150 U/l. Laccases produced by P. cinerea were purified and characterized. The supernatant of the culture medium was loaded on an anion exchange column, DEAE-Sepharose CL-6B, and three peaks with laccase activity were detected and applied separately on a Mono Q column. Eight isoenzymes of laccases with molecular weigh between 30 and 70 kDa and isoelectric point (pI) between 3 and 6 were revealed on electrophoresis gels at denaturing, native conditions and isoelectric foccusing (IEF). Some isoenzymes showed high thermostability at 50°C, optimal pH between 2.6 and 4.0, and Km for the ABTS between 12.7 and 20 ?M., depending on the type of laccase. Different mediators for laccases of P. cinerea were evaluated (HBT, HBA, 2,3 DHBA, DOPAC, ABTS, syringaldehyde, sodium oxalate and Mn2+). The system laccase, syringaldehyde, sodium oxalate and Mn2+ produced the highest decolorization of Reactive Blue 19. Laccases produced by P. cinerea were used for decolorization of a simulated efluent prepared with 100 mg/l of Reactive Red 271 hydrolyzed with NaOH 2 M and a real effluent, provided by a textile industry. The simulated efluent was completely decolorized within 24 hours by the enzymatic extract. In face of that, the real effluent was evaluated for decolorization by the extracts of P. cinerea and more than 60% of decolorization was obtained by laccase-mediator system. Laccases produced by P. cinerea were also used to hydrolize the sugar cane bagasse. Sugarcane bagasse samples were obtained by acid sulfite, alkaline sulfite, sulfuric acid, sodium chlorite or untreated (in natura). Two forms of treatment were evaluated: simultaneous treatment, ie, laccases have been added along with a commercial cellulase complex for hydrolysis of sugarcane bagasse, or a sequential treatment, in witch bagasse was pre-treated with laccase followed by cellulases. Simultaneous treatment with both enzymes resulted in lower conversion of cellulose than sequential treatment due to possible inactivation of cellulases by the oxidative action of laccase. Future studies of sequential treatment with laccase and hydrolysis of sugarcane bagasse should consider additional basic concepts of reactions such as: increase of enzyme load, temperature, reaction time and mediators. Laccases are exceptionally versatile for biotechnological applications and the production in large scale integrate the use of the enzyme in different industrial processes.

Estima-se que o Brasil produza no ano de 2010 cerca de 160 milhões de toneladas de bagaço e palha de cana-de-açúcar. O bagaço é um subproduto decorrente do esmagamento da cana, constituído por fibras, partículas de terra e resíduos de caldo. A palha é o material remanescente encontrado na superfície da área plantada, após a colheita, constituída por frações de folhas, ponteiros, colmos e raízes. Estes subprodutos são utilizados como fonte de energia dentro das próprias usinas e destilarias. Porém, com o interesse mundial voltado para o uso de outras fontes de energia, além do petróleo, a importância do emprego destes substratos na produção de etanol, aumentou. As fibras presentes nestes subprodutos são constituídas principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação destes materiais, resultando na conversão da biomassa em produtos de alto valor agregado, são bastante complexos, necessitando da participação de enzimas lignocelulolíticas produzidas, sobretudo por fungos. Este estudo visou à caracterização enzimática lignocelulósica e a liberação de açúcares redutores por fungos ligninolíticos e celulolíticos, expostos a duas concentrações de nitrogênio e o comportamento destes organismos perante situação de estresse nutricional. Os fungos utilizados foram Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei e Aspergillus niger, selecionados em trabalhos anteriores. Estes organismos foram inoculados em frascos Erlenmeyers, contendo bagaço e palha de cana pré-tratados com H2SO4 (0,5%) e duas concentrações de nitrogênio (0,5% e 1% de extrato de levedura), por 15 dias. Diariamente, foram coletadas amostras e analisadas quanto à concentração de proteínas, atividade específica de Lacase, Peroxidases, Manganês peroxidase, Endoglicanases, atividade celulolítica total, Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e quantificação de açúcares redutores. A enzima SOD foi analisada através de PAGE não desnaturante e o perfil protéico observado em SDS-PAGE. As demais análises foram realizadas em espectrofotômetro. O meio contendo 0,5% de extrato de levedura foi favorável ao crescimento dos fungos P. sajor caju e T. reesei, e o meio com 1% de extrato foi favorável à P. chrysosporium e A. niger. Quanto à produção das enzimas ligninolíticas (µmol.min-1.mg proteína-1), a maior produção de Lacase foi observada em P. sajor caju (2,2; 1%; 13º dia), de Peroxidases também para P. sajor caju (1,5; 1%; 12º dia) e MnP para T. reesei (0,172; 1%; 4º dia). A maior atividade celulolítica total (FPU.mg proteína-1) e de Endoglicanases (CMC.mg proteína-1) foi observada para T. reesei (10,1 e 20,6; 0,5%; 7º dia, respectivamente). Quanto à maior liberação de açúcares redutores, P. chrysosporium (0,757 mgAR.gBS-1; 1%; 9º dia). Foram observadas até quatro isoformas de SOD que variaram entre os fungos, concentrações de nitrogênio e dias. As maiores atividades de CAT (µmol.min-1.mgproteína-1) foram observadas para P. sajor caju (0,811; 5º dia), T. reesei (0,726; 1º dia), P. chrysosporium (0,441; 3º dia) e A. niger (0,194; 10º dia), todos na concentração de 0,5%. As espécies, as concentrações de nitrogênio e o período de incubação influenciaram no crescimento, nas atividades enzimáticas e na liberação de açúcares redutores dos fungos / It is estimated that Brazil will produce in 2010 about 160 million tons of sugarcane bagasse and straw. The bagasse is a byproduct resulting from the crushing of sugarcane, consisting of fibers, particles of dirt and waste broth. The straw is the material found on the surface of the remaining crop, after harvest, consisting of fractions of leaves, pointers, stems and roots. These products are used as an energy source within their own mills and distilleries. However, with the global interest focused on the use of other energy sources instead of petroleum, the importance of using these substrates in ethanol production increased. The fibers in these products are composed primarily of cellulose, hemicellulose and lignin. The mechanisms involved in enzymatic degradation of these materials, resulting in conversion of biomass into high value added products, are quite complex, requiring the participation of lignocellulolytic enzymes produced mainly by fungi. This study aimed to a lignocellulosic enzymatic characterization and the release of reducing sugars by ligninolytic and cellulolytic fungi exposed to two concentrations of nitrogen and the behavior of these organisms against a nutritional stress situation. The fungi used were Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei and Aspergillus niger, selected from previous work. These organisms were inoculated in Erlenmeyer flasks containing sugarcane bagasse and straw pretreated with H2SO4 (0.5%) and two concentrations of nitrogen (0.5% and 1% yeast extract) for 15 days. Daily samples were collected and analyzed for proteins concentration, specific activity of Laccase, Peroxidases, Manganese Peroxidase, Endoglucanases, total cellulolytic activity, Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and quantification of total sugar. The enzyme SOD was analyzed by native PAGE gels and the protein profile observed in SDS-PAGE. Other analyses were performed on a spectrophotometer. The medium containing 0.5% yeast extract was favorable to the growth of fungi P. sajor caju and T. reesei and the medium with 1% extract favored P. chrysosporium and A. niger. Regarding the production of lignilolytic enzymes (mol.min-1.mg protein-1), the highest activity of Laccase was found in P. sajor caju (2.2, 1%, 13 days), for Peroxidases also in P. sajor caju (1.5, 1%, day 12) and MnP in T. reesei (0.172, 1%, day 4). The highest total cellulolytic activity (FPU.mg protein-1) and Endoglucanases (CMC.mg protein-1) was observed for T. reesei (10.1 and 20.6, 0.5%, day 7, respectively). As for the highest release of total sugars, P. chrysosporium (0.757 mgAR.gBS-1, 1%, 9 day). It was observed up to four SOD isoforms that varied from fungi, nitrogen concentrations and days. The highest CAT activities (mol.min-1.mg protein-1) were observed for P. sajor caju (0.811, 5 days), T. reesei (0.726, day 1), P. chrysosporium (0.441, day 3) and A. niger (0.194, 10 days), all at 0.5% concentration. The species, nitrogen concentrations and the period of incubation influenced the growth, the enzymatic activity and the release of total sugars in the fungi

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:01:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao valeria de Lima Jardim 2010.pdf: 266263 bytes, checksum: 0a24700be4dcac6e853b3f6e041e4a78 (MD5) Previous issue date: 2010-08-23 / Brazil is one of the top pesticides using countries in the world, being the State of Goiás a potential contributor due to its large production of industrial tomatoes. Among the most widely used pesticides is the organophosphate Acephate with toxicological characteristics capable of infecting both living beings and the environment. There are several seeking solution studies to remediate xenobiotic compounds, being microorganisms an important biotechnological tool against them. The aim of this study was to select rot-white fungal that can produce oxidative enzymes under certain conditions, in the presence of Acephate, evaluating their effectiveness in reducing its toxicity. Thus, the study was divided into three parts: testing on solid medium under different nutritional conditions, tests in liquid culture medium under two different conditions (shaking and static) and development of analytical methodology to evaluate the decrease of Acephate toxicity. We defined two levels of Acephate, 10 and 50%, which were treated by the following species: Trametes versicolor, Trametes villosa, Pycnoporus sanguineus, Phanerochaete chrysosporium and Lentinus edodes. In solid medium all species showed mycelial growth and satisfying development in the presence of Acephate under standard nutritional conditions. The concentration of 50% Acephate caused limitation to Trametes villosa in solid and liquid medium cultivation. The opposite occurred to Pycnoporus sanguineus, which had good results in the development and production of enzymes in the presence of Acephate. Lignin Peroxidase in Phanerochaete chrysosporium was present with a 15.77U.mL-1 only in Acephate 50%, suggesting that the pesticide may induce its enzyme complex. The enzyme Laccase excelled in Pycnoporus sanguineus in the two culture conditions, being the largest peak 45.95 U.mL-1 in 50% Acephate in shaking. However, the best value for the production of Laccase from Trametes villosa was in the static condition: 73.55 U.mL-1 in Acephate 10%. The toxicity tests applied, NRU and Cholinesterase Enzyme Inhibition, proved that in these conditions there was no formation of the metabolite Methamidophos. The toxicological methodology developed to assess the toxicity reduction in the treated supernatant was efficient and promising to monitor and investigate environmental contamination. The samples treated by fungi showed 100% increase of Cholinesterase compared to the control group (no treatment) for T. villosa and 91.7% for P. sanguineus. These results showed that the enzyme complex of the fungi studied is capable to reduce Acephate toxicity, proving that well managed rot-white fungal can bring environmental benefits of mitigation. / O Brasil está entre os principais países consumidores de agrotóxicos, sendo o Estado de Goiás um colaborador em potencial devido à grande produção de tomate industrial. Dentre os agrotóxicos mais utilizados, destaca-se o organofosforado Acefato com características toxicológicas capazes de contaminar os seres vivos e o meio ambiente. Várias são as pesquisas que buscam soluções na remediação de compostos xenobióticos, sendo os microrganismos importantes ferramentas biotecnológicas para esse fim. O objetivo deste estudo foi selecionar fungos de decomposição branca capazes de produzir enzimas oxidativas em determinadas condições, na presença de Acefato, avaliando a sua eficiência em reduzir a sua toxicidade. Para tanto o estudo foi dividido em três partes: ensaios em meio de cultura sólido em diferentes condições nutricionais, ensaios em meio de cultura líquido sob duas condições distintas (agitação e estática) e desenvolvimento de metodologia analítica de avaliação da redução de toxicidade do Acefato. Foram definidas duas concentrações de Acefato, 10 e 50%, as quais foram submetidas ao tratamento pelas seguintes espécies: Trametes versicolor, Trametes villosa, Pycnoporus sanguineus, Phanerochaete chrysosporium e Lentinus edodes. Em meio de cultura sólido, todas as espécies apresentaram crescimento micelial e desenvolvimento satisfatórios na presença de Acefato em condição nutricional padrão. A concentração de 50% de Acefato causou limitação para Trametes villosa no cultivo em meio de cultura sólido e líquido. O oposto ocorreu com Pycnoporus sanguineus, que teve bons resultados de desenvolvimento e produção enzimática na presença de Acefato. Lignina Peroxidase esteve presente em Phanerochaete chrysosporium com 15,77U.mL-1 somente em Acefato 50%, sugerindo que o agrotóxico possa induzir seu complexo enzimático. A enzima Lacase se destacou em Pycnoporus sanguineus nas duas condições de cultivo, sendo o maior pico de 45,95 U.mL-1 na presença de 50% de Acefato em agitação. No entanto, o melhor valor para produção de Lacase foi de Trametes villosa na condição estática: 73,55 U.mL-1 em Acefato 10%. Nos testes de toxicidade aplicados, NRU e Inibição da Enzima Colinesterase, comprovou-se que não houve formação do metabólito Metamidofós, nestas condições. A metodologia toxicológica desenvolvida para avaliar a redução de toxicidade do sobrenadante tratado mostrou-se eficaz e promissora no monitoramento e investigação de contaminação ambiental. As amostras tratadas por fungos apresentaram 100% de aumento de Colinesterase em comparação com o Grupo Controle (sem tratamento) para T. villosa e 91,7% para P. sanguineus. Esses resultados mostram que o complexo enzimático dos fungos estudados é capaz de reduzir a toxicidade do Acefato, comprovando que os fungos de decomposição branca, se bem conduzidos, podem trazer benefícios ambientais de mitigação.

Orientador: Lara Durães Sette / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:41:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Passarini_MichelRodrigoZambrano_D.pdf: 6997453 bytes, checksum: 0a905c32bd8d912eb875c88cff54de8e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O oceano representa um habitat promissor na busca por novos micro-organismos, os quais podem apresentar capacidade de produzir enzimas de interesse industrial diferentes das produzidas por seus parceiros terrestres. Neste contexto, duas amostras da esponja marinha Dragmacidon reticulatum foram coletadas no litoral Norte do Estado de São Paulo, objetivando a caracterização da diversidade fúngica por métodos dependentes e independentes de cultivo, bem como a avaliação da produção, expressão da enzima e caracterização do gene da lacase. Com relação à parcela cultivada das amostras, 108 fungos filamentosos foram isolados. Destes, 64 ribotipos distintos foram submetidos aos experimentos de taxonomia polifásica e aos relacionados com a lacase. Análises macro- e microscópicas, moleculares (genes ribossomais ITS/28S) e pela técnica de MALDI TOF ICMS, resultaram na caracterização de 38 isolados distribuídos em 23 gêneros pertencentes ao Filo Ascomycota e um ao Filo Zygomycota. Este foram posteriormente depositados na Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria (CBMAI). Dentre os isolados obtidos, uma potencial espécie nova de Penicillium foi identificada. Os resultados da triagem enzimática permitiram a seleção de dois isolados identificados como Nigrospora sp. CBMAI 1328 (0,30 U L-1) e Arthorpyrenia sp. CBMAI 1330 (0,40 U L-1), os quais foram submetidos à uma nova avaliação da atividade e expressão (RT-PCR) com indução de íons cobre e caracterização do genes da lacase. A adição de íons cobre na concentração de 5 mM, proporcionou aumento das atividades enzimáticas dos isolados CBMAI 1328 e CBMAI 1330 em 3,9X (25,2 U L-1) e 1,2X (9,0 U L-1) após 120 h, respectivamente. Os resultados da expressão dos genes da lacase para o isolado CBMAI 1328 foram os mesmos encontrados pela indução com cobre (maior expressão em 5 mM após 120 h), entretanto para o isolado CBMAI 1330, a maior expressão foi após 96 h sem adição de cobre. Os resultados da caracterização dos genes da lacase revelaram a possivel existência de 3 novos putativos genes de lacases marinhas. Com relação à parcela não cultivada, foi possível a identificação de 7 gêneros e de um fungo não cultivado (uncultured fungi) do Filo Ascomycota bem como 3 gêneros e um fungo não cultivado (uncultured fungi) do Filo Basidiomycota a partir da técnica de DGGE e do sequenciamento direto do gene RNAr ITS e do gene 18S. Em ambas as abordagens utilizadas, a maior diversidade foi encontrada na amostra DR9. Os dados derivados do presente trabalho, ressaltam a importância em se utilizar a taxonomia polifásica, bem como empregar metodologias dependente e independente de cultivo (em paralelo) para um melhor e maior conhecimento da real diversidade em amostras ambientais. Estes resultados ampliam o conhecimento dos fungos filamentosos recuperados de esponjas marinhas e demonstram o potencial biotecnológico destes micro-organismos / Abstract: The ocean represents a promissing habitat in the search for new microorganisms, which may have the ability to produce enzymes of industrial interests different from that produced by their terrestrial counterparts. In this context, two samples of the marine sponge Dragmacidon reticulatum were collected on northern coast of São Paulo State, aiming at the characterization of fungal diversity by cultureddependent and -independent approaches as well as the evaluation of the production, characterization and expression of laccase enzyme gene. Regarding the cultivated portion of the samples, around 108 filamentous fungi were isolated, belonging to 64 different taxonomic groups (ribotypes), which were subjected to enzymatic activity assays. Polyphasic taxonomy approaches (macro- and microscopic, molecular - ITS/28S ribosomal genes - and MALDI TOF ICMS analyses) resulted in the characterization of 38 isolates distributed in 23 genera belonging to the phylum Ascomycota and one to the phylum Zygomycota, which were deposited in the Brazilian Collection of Micro-organisms from Environment and Industry (CBMAI). Among the isolates recovered one possible new species of Penicillium was identified. Enzymatic screening allowed the selection of two isolates identified as Nigrospora sp. CBMAI 1328 (0,30 U L-1) and Arthorpyrenia sp. CBMAI 1330 (0,40 U L-1), which were subjected to a new activity evaluation and expression (RT-PCR) with the induction of copper ions and the laccase genes characterization. The addition of copper ions in a concentration of 5 mM resulted in an increase in the enzymatic activities of CBMAI 1328 and CBMAI 1330 strains in 3,9X (25,2 U L-1) and 1,2X (9,0 U L-1) after 120h, respectively. The results of the expression of the laccase genes for CBMAI 1328 strain were the same found by induction with copper (expression increased in 5 mM after 120 h), however for CBMAI 1330 the higher expression was after 96 h without addition of copper. Results of laccase genes characterization revealed the existence of three possible putative new marine laccase genes. Regarding to the uncultured portion of the samples, from the DGGE and direct sequencing of the ITS rRNA gene and 18S gene approaches, was possible to identify seven species of fungi and one uncultured fungus from phylum Ascomycota and three species and one uncultured fungus from phylum Basidiomycota. For both approaches used the greatest diversity was achieved in the DR9 sample. Data derived from the present work highlight the importance of using polyphasic taxonomy as well as applying culturedependent and culture-independent methodologies (in parallel) in order to have a better and greater knowledge of the real diversity in environmental sample. These results expand the knowledge of fungi recovery from marine sponges and demonstrate the biotechnological potential of these micro-organisms / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

As lacases (EC 1.10.3.2) são fenol-oxidases associadas à habilidade de degradar a lignina e outros compostos recalcitrantes, como xenobióticos e vários tipos de corantes sintéticos. Lacases catalisam a oxidação de vários compostos aromáticos com concomitante redução do oxigênio a água. Neste trabalho são apresentados os resultados de imobilização do extrato de lacases de Pleurotus sajor-caju PS2001 em filmes poliméricos de poliamida 6,6 (PA) e polissulfona (PSU), utilizando glutaraldeído como agente de ligação. A solução enzimática de lacases foi obtida em meio sólido contendo serragem de Pinus spp cultivado com P. sajor-caju. As proteínas da solução enzimática foram imobilizadas em filmes de PA e PSU. O processo de imobilização foi estudado quanto ao pH ótimo, sendo os filmes caracterizados quanto à quantidade de proteínas imobilizadas e atividade de lacases. As membranas de PA apresentaram maior atividade de lacases quando comparadas com as de PSU. Observou-se uma redução do pH ótimo para atividade de lacases imobilizadas, utilizando-se o tampão acetato e um aumento em tampão Mcllvaine. A maior atividade de lacases foi obtida após 6 h de imobilização, em reação a 30°C, com agitação constante, tanto para os filmes de PA quanto para os de PSU. Verificou-se descoloração de aproximadamente 90% da solução 25 mg/L do corante Reactive Blue 220, após 24 horas de reação, utilizando membranas de PA com a enzima imobilizada. Aproximadamente 50% da descoloração obtida deve-se a adsorção do corante pela membrana. Resultados semelhantes foram obtidos com a utilização do corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR), com adição de Reactive Blue 220. Não foi observada descoloração sem adição do Reactive Blue, sugerindo uma ação semelhante a um mediador, proporcionando a descoloração do RBBR. Apesar de serem observadas atividades de lacases imobilizadas nas membranas de PSU, utilizando-se ABTS como substrato, não foi observada descoloração dos corantes analisados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-14T18:02:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Katia Rasera.pdf: 933755 bytes, checksum: fadf6b200d674217ac06cf5b50743776 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-14T18:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Katia Rasera.pdf: 933755 bytes, checksum: fadf6b200d674217ac06cf5b50743776 (MD5) / Laccases (EC 1.10.3.2) are phenol-oxidase enzymes associated to the degradation of lignin and a wide variety of recalcitrant compounds, such as xenobiotics and different types of dyes. Laccases catalyze the oxidation of various aromatic compounds with the concomitant reduction of oxygen to water. In this work, the results of immobilization of Pleurotus sajor-caju PS 2001 laccases in polyamide 6,6 (PA) and polysulfone (PSU) films, using glutaraldehyde as linking agent, are presented. The enzymatic solution containing laccases was obtained from solid medium with Pinus spp sawdust cultivated with P. sajor-caju. The proteins present in this solution were immobilized in PA and PSU films The immobilization process was studied with respect to the optimum pH, and the films were evaluated to determine the protein content and laccase activity. PA membranes showed higher laccase activity than PSU ones. With immobilized enzymes, a reduction of the optimum pH for laccase activity was observed, using acetate buffer and a increase using Mcllvaine buffer. The higher laccase activity was achieved after 6 h of immobilization, at a reaction temperature of 30°C, under agitation, for both PA and PSU films. Discolouration of approximately 90% of solution 25 mg.L-1 of the dye Reactive Blue 220 was verified, after 24 hours of reaction, using membranes of PA with the immobilized enzyme. Approximately 50% of the discolouration would be attributed from the adsortion process of the dye for the PA membrane. Similar results had been gotten with the use of the dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR), with addition of Reactive Blue 220. Discolouration without addition of the Reactive Blue was not observed, suggesting a similar action to a mediator, providing the discolouration of the RBBR. Although to be observed immobilized activities of lacases in the membranes of PSU, using ABTS as substratum, discolouration of the analyzed corantes was not observed.

As lacases (EC 1.10.3.2) são fenol-oxidases associadas à habilidade de degradar a lignina e outros compostos recalcitrantes, como xenobióticos e vários tipos de corantes sintéticos. Lacases catalisam a oxidação de vários compostos aromáticos com concomitante redução do oxigênio a água. Neste trabalho são apresentados os resultados de imobilização do extrato de lacases de Pleurotus sajor-caju PS2001 em filmes poliméricos de poliamida 6,6 (PA) e polissulfona (PSU), utilizando glutaraldeído como agente de ligação. A solução enzimática de lacases foi obtida em meio sólido contendo serragem de Pinus spp cultivado com P. sajor-caju. As proteínas da solução enzimática foram imobilizadas em filmes de PA e PSU. O processo de imobilização foi estudado quanto ao pH ótimo, sendo os filmes caracterizados quanto à quantidade de proteínas imobilizadas e atividade de lacases. As membranas de PA apresentaram maior atividade de lacases quando comparadas com as de PSU. Observou-se uma redução do pH ótimo para atividade de lacases imobilizadas, utilizando-se o tampão acetato e um aumento em tampão Mcllvaine. A maior atividade de lacases foi obtida após 6 h de imobilização, em reação a 30°C, com agitação constante, tanto para os filmes de PA quanto para os de PSU. Verificou-se descoloração de aproximadamente 90% da solução 25 mg/L do corante Reactive Blue 220, após 24 horas de reação, utilizando membranas de PA com a enzima imobilizada. Aproximadamente 50% da descoloração obtida deve-se a adsorção do corante pela membrana. Resultados semelhantes foram obtidos com a utilização do corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR), com adição de Reactive Blue 220. Não foi observada descoloração sem adição do Reactive Blue, sugerindo uma ação semelhante a um mediador, proporcionando a descoloração do RBBR. Apesar de serem observadas atividades de lacases imobilizadas nas membranas de PSU, utilizando-se ABTS como substrato, não foi observada descoloração dos corantes analisados. / Laccases (EC 1.10.3.2) are phenol-oxidase enzymes associated to the degradation of lignin and a wide variety of recalcitrant compounds, such as xenobiotics and different types of dyes. Laccases catalyze the oxidation of various aromatic compounds with the concomitant reduction of oxygen to water. In this work, the results of immobilization of Pleurotus sajor-caju PS 2001 laccases in polyamide 6,6 (PA) and polysulfone (PSU) films, using glutaraldehyde as linking agent, are presented. The enzymatic solution containing laccases was obtained from solid medium with Pinus spp sawdust cultivated with P. sajor-caju. The proteins present in this solution were immobilized in PA and PSU films The immobilization process was studied with respect to the optimum pH, and the films were evaluated to determine the protein content and laccase activity. PA membranes showed higher laccase activity than PSU ones. With immobilized enzymes, a reduction of the optimum pH for laccase activity was observed, using acetate buffer and a increase using Mcllvaine buffer. The higher laccase activity was achieved after 6 h of immobilization, at a reaction temperature of 30°C, under agitation, for both PA and PSU films. Discolouration of approximately 90% of solution 25 mg.L-1 of the dye Reactive Blue 220 was verified, after 24 hours of reaction, using membranes of PA with the immobilized enzyme. Approximately 50% of the discolouration would be attributed from the adsortion process of the dye for the PA membrane. Similar results had been gotten with the use of the dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR), with addition of Reactive Blue 220. Discolouration without addition of the Reactive Blue was not observed, suggesting a similar action to a mediator, providing the discolouration of the RBBR. Although to be observed immobilized activities of lacases in the membranes of PSU, using ABTS as substratum, discolouration of the analyzed corantes was not observed.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-23T12:13:09Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Eli José Miranda Ribeiro Júnior - 2015.pdf: 709119 bytes, checksum: baa5cef4451e6bd53886e3cc249f19df (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-23T12:15:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Eli José Miranda Ribeiro Júnior - 2015.pdf: 709119 bytes, checksum: baa5cef4451e6bd53886e3cc249f19df (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-23T12:15:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Eli José Miranda Ribeiro Júnior - 2015.pdf: 709119 bytes, checksum: baa5cef4451e6bd53886e3cc249f19df (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-01-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Laccase is a poliphenoloxidase enzyme that catalyzes the oxidation of phenolic compounds in the corresponding quinones. The current obtained in this redox process can be used for quantitative analysis. In this work, a carbon paste biosensor modified gluteraldehyde functionalized silica and an enzymatic extract of the “Pycnoporus sanguineus” fungi as a lacase source is proposed for phenol determination. The effect of carbon paste and electrolyte composition, pH from 3,0 to 8,0, start potential from 0,55 to 0,25mV, scan rate from 5 to 25 mV s-1 and potential pulse amplitude from 10 to 60mV on the differential pulse voltammetric response was investigated. A linear correlation of R² = 0,9946 was obtained for the phenol content (catechol) in the concentration range from 50 to 500nMol L-1, with a detection limit of 30nMol L-1. This biosensor was used for the determination of different kinds of phenolic compounds, presenting a better response for catechol. / A lacase é uma enzima poliphenoloxidase que catalisa a oxidação de compostos fenólicos nas correspondentes quinonas. A corrente obtida neste processo redox pode ser usada para a análise quantitativa da concentração dos fenóis na água. Neste trabalho, é proposto o uso de um biossensor modificado para a determinação de fenol. O biossensor de pasta de carbono com sílica funcionalizada foi modificado com glutaraldeído e um extrato enzimático de fungos “Pycnoporus sanguineus” como uma fonte de lacase. O efeito da pasta de carbono e da composição de electrólito, permite trabalhar com pH compreendido entre 3,0 - 8,0, e um potencial inicial entre 0,55 - 0,25mV. A velocidade de varrimento foi de 5 a 25mV s-1 e amplitude de pulso de 10 a 60mV, estudando-se na resposta voltamétrica de pulso diferencial .Uma correlação linear de R2 = 0,9946 foi obtida para o teor de fenol (catecol) na gama de concentrações de 50 a 500nMol L-1, com um limite de detecção de 30nMol L-1. Este biossensor foi utilizado para a determinação de diferentes tipos de compostos fenólicos, apresentando uma melhor resposta para o catecol.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-06-08T18:45:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luane Ferreira Garcia - 2016.pdf: 1247655 bytes, checksum: 7639a387a5a3d1f4157419202b05240e (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-09T11:35:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luane Ferreira Garcia - 2016.pdf: 1247655 bytes, checksum: 7639a387a5a3d1f4157419202b05240e (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-09T11:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luane Ferreira Garcia - 2016.pdf: 1247655 bytes, checksum: 7639a387a5a3d1f4157419202b05240e (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Hormones are released constantly in sewage, originated by of human/animal excreta, or waste of pharmaceutical industries, not treated satisfactorily. The eviction of these pollutants in water resources produces great environmental impact, as disruption in animals’ endocrine system. The 17α-ethinylestradiol (EE2) is the most popular synthetic estrogen, which is found in water and in considerable concentrations. Several strategies are being studied to remedy this pollutant. Enzymes as laccases, which have low specificity, are able to oxidize various pollutants, thus suggesting their potential in the treatment of effluents. Another alternative are the electrochemical processes as electro-oxidation and electrocoagulation. The aim of this study was to evaluate the removal efficiency of the EE2 for biological or/and electrochemical process. The crude extract containing the laccase from Pycnoporus sanguineus was immobilized in Ca/Cu-alginate-chitosan beads. For partial characterization were determined optimum pH and optimum temperature of enzyme activity, for free and immobilized enzyme. Biological remediation was performed in these conditions: shaking (100 rpm); temperature at 28°C (± 2); times of 4, 8 and 24 hours; EE2 solution buffered at pH 4 and 5, and EE2 solution without addition of buffer. For the electrochemical remediation: magnetic stirring; voltage of 2.5, 5 and 7.5 V; times of 10, 20 and 40 minutes; pHs 5 and 7. For bio-electrochemical remediation the best conditions were used. In the remediation assays of the EE2 with immobilized enzyme, the best result was obtained for the support Ca-alginate-chitosan with 89.81% (± 2.71) removal, in sodium acetate buffer pH 5.0 and 24 hours of treatment. Under the same conditions to the free enzyme, 91.81% (± 0.86) of removal was obtained. For electrochemical remediation with titanium electrode, 86.21% (± 9.30) was removed in pH 7 phosphate buffer and 40 minutes. For sequential bio-electrochemical remediation, EE2 concentrations were below the limit of detection of the chromatograph, with the removal by immobilized enzyme acting in unbuffered solution. It can be concluded that the two technologies are very effective for the removal of the EE2. / Hormônios são lançados constantemente em esgotos, sejam oriundos de excretas humanas ou animais, sejam de resíduos provenientes das indústrias farmacêuticas, não tratados de forma eficaz. O despejo destes micropoluentes nos recursos hídricos produz grande impacto ambiental, como desregulação do sistema endócrino em animais. O 17α-etinilestradiol (EE2) é o mais popular estrogênio sintético, sendo encontrado nos recursos hídricos em concentrações consideráveis. Diversas estratégias estão sendo estudadas para remediação deste poluente. Enzimas como as lacases, que possuem baixa especificidade, são capazes de oxidar diversos poluentes, sugerindo assim seu potencial no tratamento de efluentes. Outra alternativa são os processos eletroquímicos, como a eletro-oxidação e eletrocoagulação. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência de remoção do EE2 por processo biológico ou/e eletroquímico. O extrato bruto contendo a lacase de Pycnoporus sanguineus foi imobilizado em beads de quitosana-alginato-Ca/Cu. Para caracterização parcial da enzima livre e imobilizada foram determinados pH e temperatura ótima de atividade enzimática. A remediação biológica foi realizada nas condições: agitação (100 rpm); temperatura em 28°C (± 2); tempos de 4, 8 e 24 horas; solução de EE2 tamponada em pHs 4 e 5, e solução do hormônio sem adição de tampão. A remediação eletroquímica: agitação magnética; tensão de 2,5, 5 e 7,5 V; tempos de 10, 20 e 40 minutos; solução de EE2 tamponada em pHs 5 e 7. Para remediação bio-eletroquímica, de modo sequencial, foram utilizadas as condições mais adequadas para ambas as tecnologias. Nos ensaios de remediação do hormônio EE2 com a enzima imobilizada, o melhor resultado foi obtido para beads de quitosana-alginato-Ca com remoção de 89,81% (± 2,71) em tampão acetato de sódio pH 5 e 24 horas de tratamento. Nas mesmas condições, para a enzima livre foi obtido 91,81% (± 0,86) de remoção. Para remediação eletroquímica, com eletrodo de titânio foi removido 86,21% (± 9,30) do EE2, em tampão fosfato pH 7 e 40 minutos. Para a remediação bio-eletroquímica em modo sequencial, obteve-se remoção do EE2 em concentrações abaixo do limite de detecção do cromatógrafo, com a enzima imobilizada atuando em solução não tamponada. Conclui-se que as duas tecnologias são bastante eficientes para a remoção do EE2, podendo ser utilizadas separadamente ou em conjunto.