Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Subcapítulos 5.3 e 6.3. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-12T19:00:07Z No. of bitstreams: 1 2017_TamaraOliveiraMachado_PARCIAL.pdf: 7203052 bytes, checksum: 6786c9c953d5af025014b7721f8ac98d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-20T21:31:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_TamaraOliveiraMachado_PARCIAL.pdf: 7203052 bytes, checksum: 6786c9c953d5af025014b7721f8ac98d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-20T21:31:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_TamaraOliveiraMachado_PARCIAL.pdf: 7203052 bytes, checksum: 6786c9c953d5af025014b7721f8ac98d (MD5) Previous issue date: 2018-04-20 / Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS). / O conhecimento das espécies de flebotomíneos e de seus níveis de infecção natural por Leishmania é necessário para a identificação do risco de ocorrência das leishmanioses. Considerando o pouco conhecimento da fauna flebotomínica em Palmas, Tocantins, e a inexistência de dados de ocorrência de espécies de Leishmania em flebotomíneos nesse município, o presente trabalho objetivou: investigar a fauna flebotomínica em fragmentos de matas de galeria e em unidades domiciliares (UDs) bem como a infecção natural por tripanosomatídeos nas fêmeas de flebotomíneos capturados em dois períodos distintos, seco e chuvoso. Quatro fragmentos de matas de galeria e quatro áreas domiciliares adjacentes foram amostradas utilizando armadilhas luminosas HP e Shannon. Após a identificação, 752 fêmeas foram agrupadas em 154 pools para a extração do DNA. A qualidade do DNA foi verificada por PCR do gene cacophany da região IVS6 de flebotomíneos. A detecção de tripanossomatídeos nas fêmeas de flebotomíneos foi realizada a partir da amplificação da região SSU rDNA e as amostras positivas foram submetidas a PCR ITS-1. A identificação das espécies de tripanossomatídeos foi realizada por sequenciamento. A caracterização ambiental das 40 casas amostradas foi realizada a partir de questionários. Variáveis estruturais do intra, do peridomicílio e da circunvizinhança foram obtidas. Foram capturados 949 (28 spp.) e 578 (22 spp.) espécimes em julho e novembro, respectivamente. Nyssomyia whitmani foi a mais abundante (n = 743). Em julho, a maioria dos espécimes foram capturados nas matas de galeria (n = 762, 80%) e em novembro, a maioria dos espécimes foi encontrada nas UDs (n = 551, 95%) com predominância de Ny. whitmani. Lu. longipalpis foi a mais frequente em áreas domiciliares e Bi. flaviscutellata em matas de galeria. A PCR SSU rDNA identificou L. amazonensis, L. infantum e Crithidia fasciculata em Ny. whitmani. A PCR SSU rDNA identificou Leishmania amazonensis, L. infantum e Crithidia fasciculata em Ny. whitmani; L. amazonensis em Lu. longipalpis; Trypanosoma sp. e L. amazonensis em Pintomyia christenseni; L. amazonensis em Psathyromyia hermanlenti e Evandromyia walkeri. Determinadas UDs de Palmas (no centro de Palmas e no distrito de Taquaruçu) apresentaram características que permitem a manutenção da população de flebotomíneos no peridomicílio, tais como a presença de árvores frutíferas, matéria orgânica e animais, como cães e galinhas. As matas de galeria são importantes para manter os flebotomíneos vetores de Leishmania em Palmas e as UDs são receptivas à manutenção da população de flebotomíneos no peridomicílio. Dessa forma, recomenda-se uma vigilância mais ativa principalmente nas UDs próximas a matas de galeria. / Knowledge on phlebotomine species and levels of natural infection by Leishmania are necessary to identify potential areas of risk of leishmaniasis. Given the limited knowledge on phlebotomine fauna in the city of Palmas, State of Tocantins, Brazil and the lack of data on the occurrence of Leishmania species in phlebotomines in this municipality, this study aimed to: to investigate the phlebotomine fauna in fragments of gallery forests and in household units (HUs) as well as the natural infection by trypanosomatids in females of sandflies captured in two different periods, dry and rainy. Four fragments of gallery forests and four adjacent HUs were sampled using HP light traps and Shannon traps. After their identification, 752 females were grouped into 154 pools for DNA extraction. The quality of the DNA was determined by PCR of the cacophany gene of the IVS6 region in Phlebotominae. Trypanosomatids were detected in Phlebotominae females through the amplification of the SSU rDNA region, and the positive samples were tested using ITS1-PCR. Trypanosomatids species were identified using sequencing. The environmental status of the 40 houses sampled was characterized using questionnaires. Structural variables within the HUs, around the HUs, and in the surrounding neighborhood were obtained. A total of 949 specimens (28 spp.) and 578 specimens (22 spp.) were captured in July and November, respectively. Nyssomyia whitmani was the most frequent species (n=743). In July, the majority of specimens were captured in the gallery forests (n=762; 80%), while in November, most of the specimens were found in the HUs (n=551; 95%). The specimens found were predominantly Ny. whitmani. Lutzomyia longipalpis was most frequent in domestic areas (84/86), while Bichromomyia flaviscutellata in gallery forests. The SSU rDNA PCR identified Leishmania amazonensis, L. infantum and Crithidia fasciculata in Ny. whitmani, as well as L. amazonensis in Lu. longipalpis; Trypanosoma sp. and L. amazonensis in Pintomyia christenseni; and L. amazonensis in Psathyromyia hermanlenti and Evandromyia walkeri. Certain HUs in Palmas (some in downtown Palmas and others in the Taquaruçu district) exhibited characteristics that allow the maintaining of Phlebotominae population in the peridomestic environment, such as the presence of fruit trees, organic matter, and animals such as dogs and chickens. The gallery forests are important to maintain the phlebotomine vectors of Leishmania in the city and the HUs are receptive to maintain Phlebotomine populations in peridomestic environments. Therefore, more active surveillance is recommended, particularly in the HUs close to gallery forests.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 5. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-07T17:47:39Z No. of bitstreams: 1 2017_AlineMachadoRapellodoNascimento_PARCIAL.pdf: 3540132 bytes, checksum: 95b353b0a1a8566776e09d59fb639f73 (MD5) / Rejected by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br), reason: Boa tarde, O corte do arquivo está incorreto. Atenciosamente on 2018-02-08T20:46:24Z (GMT) / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-02-21T19:29:56Z No. of bitstreams: 1 2017_AlineMachadoRapellodoNascimento_PARCIAL.pdf: 2432611 bytes, checksum: e46911a877d6666ecb27b881da5577da (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-28T20:49:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AlineMachadoRapellodoNascimento_PARCIAL.pdf: 2432611 bytes, checksum: e46911a877d6666ecb27b881da5577da (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-28T20:49:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AlineMachadoRapellodoNascimento_PARCIAL.pdf: 2432611 bytes, checksum: e46911a877d6666ecb27b881da5577da (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O conhecimento relacionado à transmissão enzoótica de espécies de Leishmania no Distrito Federal ainda é escasso e a participação de flebotomíneos e mamíferos silvestres no ciclo de transmissão desses protozoários é objeto do presente estudo. As áreas estudadas foram as matas de galeria da Fazenda Água Limpa da Universidade de Brasília, Reserva Biológica da Contagem, Parque Nacional de Brasília e Jardim Botânico de Brasília em maio e setembro de 2014. O Capítulo 1 traz a atualização da lista de espécies de flebotomíneos no DF. Com esforço de captura de 1.280 armadilhas HP e 16 armadilhas do tipo Shannon, foram capturados 1.209 flebotomíneos pertencentes a 16 espécies. Bichromomyia flaviscutellata (n=668) foi a espécie mais capturada. Psathyromyia pradobarrientosi, Brumptomyia guimaraesi, Br. brumpti, Micropygomyia ferreirana e Evandromyia bourrouli foram registradas pela primeira vez no DF, ampliando a distribuição geográfica das mesmas e elevando para 35 o número de espécies registradas nessa unidade da federação. O Capítulo 2 analisou a infecção natural dos flebotomíneos capturados por Leishmania. DNA foi extraído de 569 fêmeas agrupadas em 87 “pools”. A integridade das amostras foi conferida por uma PCR designada à amplificação do gene cacophony da região IVS6. A detecção dos tripanossomatídeos foi feita pela amplificação das regiões SSU rRNA e ITS-1. Nenhuma amostra mostrou-se positiva para Leishmania spp., entretanto, os resultados do presente estudo não implicam na inexistência de vetores infectados nestas matas de galeria. O Capítulo 3 analisou a ocorrência e infecção em pequenos mamíferos (Rodentia e Didelphimorphia) por Leishmania spp. nas mesmas áreas dos flebotomíneos e nos mesmos períodos. Amostras de tecido (fragmentos de orelhas) foram obtidas dos mamíferos capturados e utilizadas para a detecção molecular dos parasitos a partir de Nested PCR SSU rRNA e PCR com alvo na região ITS em 153 amostras. Com um total de 5.120 armadilhas-noite, 172 pequenos mamíferos foram capturados, pertencentes à três espécies de marsupiais (Didelphis albiventris, Gracilinanus agilis e Monodephis americana) e seis espécies de roedores (Rhipidomys macrurus, Oecomys bicolor, Calomys expulsus, Hyleaemys megacephalus, Nectomys rattus e Necromys lasiurus). Vinte amostras (13,07%) foram positivas, considerando ambos os marcadores moleculares, quatro somente para SSU e quatro somente para ITS. As espécies infectadas por Leishmania spp. foram Rhipidomys macrurus, Gracilinanus agilis e Didelphis albiventris. Estas espécies devem participar da transmissão enzoótica de Leishmania na REBIO, FAL e JBB sendo este o primeiro relato de mamíferos silvestres infectados por este parasito nestas duas últimas áreas. Ao considerar todos os resultados obtidos conclui-se que as matas de galeria do DF abrigam hospedeiros e espécies incriminadas vetoras de Leishmania e teriam um papel importante na manutenção da transmissão enzoótica desses tripanossomatídeos. / Knowledge about the enzootic transmission of Leishmania in the FD is still scarce and the participation of wild mammals and sandflies in the leishmaniasis transmission cycle is the subject of this study. All samples were captured in gallery forests of four areas, Água Limpa Farm, Biological Reserve of Contagem, Brasilia’s National Park and Botanic Garden of Brasília, on May and September, 2014. Chapter 1 provides the updated list of sand fly species in the Federal District. The entire capture effort entailed 1.280 HP light traps and 16 Shannon traps, 16 species were identified. Bichromomyia flaviscutellata (n=668) was the most captured species. Psathyromyia pradobarrientosi, Brumptomyia guimaraesi, Br. brumpti, Micropygomyia ferreirana and Evandromyia bourrouli were registered for the first time in the Federal District, elevating to 35 the number of reported species at this federation unit. Chapter 2 follows up the study of Chapter 1 by detecting natural Leishmania infection in those captured sandflies. DNA was extracted from 569 females grouped into 87 pools. Fragments that corresponded to cacophony gene were amplified in all of the samples, demonstrating the quality of the extracted DNA. Trypanosomatids detection was performed by amplifying the SSU rRNA and ITS-1 regions. All samples tested negative for Leishmania spp. Therefore negative results in the present study do not implicate in the inexistence of infected vectors in these gallery forests and surroundings. Chapter 3 addresses occurrence and natural infection data of small mammals (Rodentia and Didelphimorphia) captured in the same areas of sandflies and during the same periods. Tissue samples (ear tips) were obtained from captured mammals and used to molecular parasite detection from Nested PCR SSU rRNA and PCR targeting the region ITS in 153 samples. The entire capture effort entailed 5.120 night-traps and 172 small mammals from three marsupials species (Didelphis albiventris, Gracilinanus agilis and Monodephis americana) and six rodents species (Rhipidomys macrurus, Oecomys bicolor, Calomys expulsus, Hyleaemys megacephalus, Nectomys rattus and Necromys lasiurus) were captured. Twenty samples (13,07%) were positive, considering both molecular markers, four samples only for SSU and four sampes only for ITS. Leishmania spp. infected species were: Rhipidomys macrurus, Gracilinanus agilis and Didelphis albiventris. These species might participate in the enzootic transmition of Leishmania at REBIO, FAL and JBB. This is the first report of Leishmania infected wild mammals in the last two cited areas. Considering all results obtained it is concluded that gallery forests of FD host hosts and species from possible Leishmania vectors and they might have an important role in the maintenance of enzootic transmission of these trypanosomatids.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-22T16:37:38Z No. of bitstreams: 1 2016_IgorMeloZimovski.pdf: 2384759 bytes, checksum: 7028c9dbda127c85f0eb4f8cb61eadfb (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T12:25:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IgorMeloZimovski.pdf: 2384759 bytes, checksum: 7028c9dbda127c85f0eb4f8cb61eadfb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T12:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IgorMeloZimovski.pdf: 2384759 bytes, checksum: 7028c9dbda127c85f0eb4f8cb61eadfb (MD5) / A leishmaniose visceral é uma doença negligenciada que apresenta cerca de 0,2 a 0,4 milhões de novos casos por ano em todo o mundo, sendo o Brasil um dos seis países com maior número de casos. O cão domestico é considerado o principal reservatório urbano do agente Leishmania infantum que é transmitido principalmente pelo vetor flebotomíneo Lutzomya longipalpis. A leishmaniose visceral canina tem caráter crônico e cães infectados em área endêmica podem não apresentar sinais clínicos aparentes, dificultando detecção e o controle da doença. Os casos caninos podem estar associados aos casos humanos, pela proximidade entre homem e o cão doméstico. O Ministério da Saúde preconiza o uso de testes sorológicos para a detecção de cães positivos para a doença e eutanásia dos mesmos, porém estes apresentam limitações quanto à sensibilidade e a especificidade. Testes moleculares como a PCR-RFLP têm mostrado grandes vantagens em relação aos testes convencionais no diagnóstico e identificação da espécie do parasito. Assim, o presente estudo avaliou a detecção do DNA da região ITS1 do rDNA e da região 3’-UTR do gene HSP70 de Leishmania em amostras de medula óssea de cães de um hospital veterinário particular no DF, seguidas de PCR-RFLP para identificar a espécie do parasito. Além disso, estudamos a associação do diagnóstico molecular com exames parasitológicos e sorológicos, bem como com perfil clínico, hematológico e de alguns parâmetros bioquímicos dos animais estudados. As reações de PCR do ITS1 e 3’-UTR do gene HSP70 apresentaram 78,69% e 52,46% de positividade respectivamente. Os testes parasitológicos detectaram apenas 40,98% das amostras positivas, sendo a L. infantum a única espécie identificada pelo RFLP. Os sintomas incluíram perda de peso, alterações gastrointestinais, fraqueza, epistáxe e uveíte. Cães de orelhas caídas, pelagem curta e de grande porte estavam em maior proporção entre os positivos. Observou-se também anemia, trombocitopenia e alterações dos valores normais do número de leucócitos nesses animais. No perfil bioquímico, apenas a ALT (alanina amino transferase) foi significativamente mais alta nos cães com detecção molecular positiva. Assim conclui-se que as ferramentas moleculares são potentes para a detecção e identificação de Leishmania em amostras de cães nas áreas endêmicas, permitindo também o diagnóstico em cães assintomáticos. Assim, tornam-se essenciais para a conclusão do diagnóstico na clínica veterinária, permitindo a decisão correta das medidas para o controle da doença. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Visceral leishmaniasis is a neglected disease with about 0.2 to 0.4 million of new cases per year worldwide, and Brazil is one of the six countries with the highest number of cases. The domestic dog is considered the main urban reservoir of the agent Leishmania infantum which is mainly transmitted by the sand fly vector Lutzomya longipalpis. Canine visceral leishmaniasis has chronic character and infected dogs in endemic areas can not show overt clinical signs, hindering detection and control of the disease. The canine cases may be associated with human cases, because of the proximity between man and the domestic dog. The Ministry of Health recommends the use of serological tests for the detection of positive dogs for the disease and their euthanasia, but these tests have limitations in terms of sensitivity and specificity. Molecular tests such as PCR-RFLP have shown great advantages over conventional assays in diagnosis and species identification of the parasite. In this way, the present report evaluate Leishmania DNA detection of ITS1 ribosomal DNA or 3’-UTR of the HSP70 gene in bone marrow samples from dogs attended in a veterinary hospital in the Federal District (DF-Brazil). Parasite detection was followed by species identification through PCR-RFLP. Furthermore we compared the molecular testing with some parasitological, serological, clinical and biochemical characteristics of these animals. The ITS1 PCR reactions and 3'-UTR of HSP70 gene showed 78.69% and 52.46% of positivity respectively. Parasitological tests detected only 40.98% of the positive samples, and L. infantum was the only species identified by RFLP. Symptoms include weight loss, gastrointestinal disorders, weakness, epistaxis and uveitis. Dog-eared, short hair and large were in greater proportion of the positive dogs. It was also observed anemia, thrombocytopenia and alterations of the normal values of the number of leukocytes in these animals. In biochemical profile, only ALT (alanine transaminase) was significantly higher in dogs with positive molecular detection. It was concluded that the molecular tools are potent for the Leishmania detection and identification of positive dogs in endemic areas, and allow diagnosis in asymptomatic dogs. Thus the molecular test becomes essential for the completion of diagnosis in veterinary clinic, allowing the correct actions to control this disease.

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Coorientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Ana Lúcia Abreu Silva / Banca: Hélio José Montassier / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose de distribuição mundial. No Brasil foi descrita em várias regiões, mas na região sudeste vem ocorrendo de forma significativa desde 1998, na região de Araçatuba, SP. O cão é o principal reservatório doméstico do protozoário Leishmania chagasi e a principal fonte de contaminação para o homem. A resposta imune do hospedeiro canino frente ao parasito é variável e por este fato, os cães apresentam sinais clínicos acentuados ou ausência destes. Os animais que apresentam maior carga parasitária e sinais clínicos mais severos são considerados susceptíveis à infecção pelo parasito. Este padrão está associado ao perfil de citocinas produzidas, ou seja, na predominância de citocinas Th1 são resistentes ou Th2 susceptíveis. No entanto existem muitas variações neste padrão de resposta, ou seja, muitos animais apresentam a produção de citocinas Th1 e Th2, sugerindo um desequilíbrio na proporção de citocinas pró e antiinflamatórias, que favorecem a multiplicação e sobrevivência dos parasitos. Este desequilíbrio tem influência direta sobre a ativação de macrófagos e sobre sua capacidade microbicida e de apresentação antigênica, levando a uma anergia de linfócitos T e a manutenção e cronicidade da infecção. As quimiocinas são citocinas com potente atividade quimiotática sobre leucócitos. Na LV existem estudos no homem e em modelos experimentais, mas no cão apenas um estudo avalia o seu papel no baço. Existe muita controvérsia sobre o seu verdadeiro papel na LV, pois descreve-se tanto a sua ação próinflamatória quanto a sua ação deletéria, que favorece o parasito. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel das quimiocinas MIP-1a e MCP-1 no baço e fígado de 30 cães... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis of worldwide distribution. In Brazil has been described in several regions, but has been occurring in the Southeast significantly since 1998 in Araçatuba, SP. The dog is the main domestic reservoir of Leishmania chagasi and the main source of contamination for humans. The canine host immune response against the parasite is variable. Dogs have severe intensity or absence of clinical symptoms. Animals that have a higher parasite load and clinical signs are considered more susceptible to infection by the parasite. This pattern is associated with the profile of cytokines produced, in the predominance of Th1 they are resistant or in the predominance of Th2 they are susceptible. However there are many variations on this response pattern, many animals have the production of Th1 and Th2 cytokines, suggesting an imbalance in the proportion of pro and anti-inflammatory cytokines, which favor the multiplication and survival of parasites. This imbalance has a direct influence on the activation of macrophages and their microbicidal activity and antigen presentation, leading to anergy of T lymphocytes and the maintenance and chronicity of infection. Chemokines are cytokines with potent chemotactic activity on leukocytes. In the VL are studies in humans and experimental models, but the dog only one study assessing its role in the spleen. There is much controversy over its true role in VL, because it describes both its pro-inflammatory action and its deleterious effects, which favors the parasite. Therefore, the aim of this study was to evaluate the role of chemokines MIP-1α and MCP-1 in the spleen and liver of 30 dogs naturally infected with Leishmania spp. and compare the findings with the parasite load of each organ. For this purpose, samples of liver and spleen were analyzed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Coorientador: Paulo César Ciarlini / Banca:Luiz Daniel de Barros / Banca:Flavia Lombardi Lopes / Banca:Suely Regina Mogami Bomfim / Banca; Rosimeri de Oliveira Vasconcelos / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença crônica que causa imunossupressão nos animais doentes, principalmente por prejudicar a resposta imunológica celular, diminuindo a proliferação linfocitária e a capacidade fagocítica das células de defesa. Recentemente, a enzima heme oxigenase-1 (HO-1) vem ganhando destaque por estar envolvida na regulação da resposta imune celular em algumas condições patológicas, sendo uma enzima induzível por condições de estresse, como o estresse oxidativo que sabidamente ocorre na LVC. Nesse contexto, esse trabalho teve por objetivo determinar o papel da HO-1 na LVC, determinando sua concentração e expressão em cães infectados e saudáveis, correlacionando-a com o estresse oxidativo, carga parasitária e IL-10. Objetivou-se também avaliar o efeito da indução e inibição da enzima sobre a resposta linfoproliferativa de células de linfonodo de cães doentes e sobre a taxa de infecção macrofágica por promastigotas de Leishmania infantum, determinando as citocinas envolvidas. Os cães com LVC apresentaram marcante estresse oxidativo e aumento da concentração e expressão de HO-1, obtendo-se correlação positiva entre HO-1e estresse oxidativo e IL-10 de acordo com o tecido analisado. A inibição de HO-1 aumentou a taxa de proliferação celular na presença de antígeno solúvel de L. infantum, enquanto a indução de HO-1 diminuiu a taxa de proliferação antígeno-específica e aumentou a taxa de infecção macrofágica e o número de amastigotas por macrófago. Con... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a chronic disease that causes immunosuppression by reducing the cellular response of infected animals, impairing the cell proliferation and the phagocytic ability of defense cells. Recently, heme oxygenase-1 (HO-1) has been highlighted for being involved in regulation of cell response in certain pathological conditions, and for being an enzyme that can be induced by stress conditions, such as oxidative stress, that is known to occur in CVL. In this context, this study aimed to determine the role of HO-1 in CVL, determining its levels and expression in infected and healthy dogs, correlating these findings with oxidative stress, parasite load and IL-10. The effect of induction and inhibition of HO-1 on lymphoproliferative response by lymph node cells of infected dogs and macrophage infection rate by promastigotes of Leishmania infantum were also evaluated. Dogs with CVL showed marked oxidative stress and increased levels and expression of HO-1, obtaining a positive correlation between HO-1 and oxidative stress and IL-10 in a tissue-dependent way. Inhibition of HO-1 increased proliferation rate in the presence of L. infantum soluble antigen, while induction of HO-1 decreased antigen-specific proliferation and increased macrophage infection rate and number of amastigotes per macrophage. The increase in HO-1 metabolism observed in CVL is associated to oxidative stress present in these dogs and could be one of the mechanisms involved in the in... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Hiro Goto / Banca: Jayme Augusto de Souza Neto / Banca: Cassiano Victória / Banca: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença tropical negligenciada em expansão no Brasil, ocorrendo em áreas onde antes não havia registro. Seu agente etiológico e a Leishmania chagasi um protozoário pertencente à classe Kinetoplastida caracterizada por uma organela denominada cinetoplasto a qual possui um DNA organizado em uma rede contendo maxicírculos, responsáveis pelas funções respiratórias e minicírculos, envolvidos na pordução de RNAs-guia, os quais possuem um papel importante na edição dos RNAs dos maxicírculos. Os minicírculos são divididos em uma região convervada de aproximadamente 120 p.b. e uma região variável de aproximadamente 600 p.b. O foco desse estudo está na análise das seqüências da região variável a fim de entender sua distribuição nos diferentes estágios de vida da L. chagasi. As amostras foram coletadas de cães e pacientes sintomáticos por aspiração dos linfonodos e, em alguns casos, foram obtidas culturas primárias. A extração do DNA foi realizada com o kit comercial Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) seguindo as instruções do protocolo. O kDNA foi amplificado por PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos LIN R4 - forward (5'-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) e LIN 19 - reverse (5'-GAA CGC CCC TAC CCG-3'), produzindo um fragmento de aproximadamente 720 p.b. Os produtos da PCR foram clonados no vetor pTZ57R/T de acordo com o protocolo do InsTAclone PCR cloning kit. As seqüências (aproximadamente 182) foram individualmente comparadas com as depositadas no GenBank, alinhadas com o software Clustal X2 e tiveram uma árvore filogenética construída utilizando o software MEGA 4.0 adotando o algoritmo UPGMA e escolhendo um bootstrap com 1000 replicatas. A distribuição entre os diferentes hospedeiros foi homogênea. A princípio, um lato polimorfismo é observado, mas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: American Visceral Leishmaniasis (AVL) is a neglected tropical disease in expansion in Brazil currently occurring in areas where there has never been reports. Its etiologic agent is Leishmania chagasi, a protozoan belonging to the order Kinetoplastida characterized by an organelle named kinetoplast wich has a DNA organized in a network containing maxicircles, responsible for respiratory functions and minicircles, involved in the production of guide RNAs, which play a role in the RNA editing of maxicircles. The minicircles are divided into an approximately 120 b.p. conserved region and an approximately 600 b.p. variable region. The focus of this study is on the sequence analysis of the minicircles variable region in order to understand its distribution on different life stages of L. chagasi. Samples were collected from dogs and symptomatic patients by lymphonod aspiration and, in some cases, primary cultures were obtained. DNA extraction was carried out with the commercial kit Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) following its protocol. kDNA was amplified by PCR, using a pair of oligonucleotides LIN R4 - forward (5'-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) and LIN 19 - reverse (5'-GAA CGC CCC TAC CCG-3'), producing a fragment of 720 b.p. PCR products were cloned in pTZ57R/T vector according to the InsTAclone PCR cloning kit protocol. Sequences (182) were individually compared with the ones deposited at the GENBANK, aligned with Clustal X2 software and had a phylogenetic tree constructed utilizing MEGA 4.0 software adopting UPGMA algorithm and choosing bootstrap with 1000 replicates. Sequences distribution among different hosts was homogeneous. At first, high polymorphism is observed but, when analyzed in more detail, i.e. by branch, sequences proved to be conserved and minimal SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was found... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Gisele Fabrino Machado / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença crônica, invariavelmente progressiva, de alta variabilidade clínica, incluindo desordens neurológicas. Para investigar as alterações neurológicas desencadeadas pela LVC, a expressão de genes envolvidos na resposta imune inata e adaptativa em cérebros de cães naturalmente infectados para Leishmania infantum foi realizada. Cães machos/fêmeas, 1 a 5 anos de idade, sem raça definida, com prévia avaliação clínica e laboratorial, avaliação histopatológica cerebral, e ausência das principais co-infecções foram organizados em dois grupos, grupo (Infectados) com 11 cães e grupo (Controle) com 04 cães. A avaliação da expressão gênica foi realizada por PCR Profiler com kit comercial RT² Profiler™ PCR Array Dog Innate & Adaptive Immune Responses (Qiagen®). O p-valor estipulado foi em ≤ 0,05 por Teste-t de Student. Infiltrados inflamatórios, de variação discreta a moderada, foram verificados nos cães infectados. Houve o aumento da expressão de 24 genes de diferentes subclasses comparados ao grupo controle (IRF6, CD4, CD40LG, TLR6, CCR4, TLR5, CCR8, CCL3, IFNG, IFNB1, TNF, IL13, IRF3, CD14, CD209, CD80, TLR4, CD86, CCR6, TRAF6, TLR7, RORC, NOD1, STAT3). Esta informação indica a participação da resposta imune inata e adaptativa no cérebro de cães com LVC, e a alta expressão destes pode ser considerada fator chave para o início, manutenção e persistência da inflamação. / Abstract: Visceral canine leishmaniasis (LVC) is a chronic, invariably progressive disease of high clinical variability including neurological disorders. To investigate the neurological changes triggered by LVC, the expression of genes involved in the innate and adaptive immune response in brains of naturally infected dogs to Leishmania infantum was performed. Male and female dogs, 1 to 5 years of age, with no previous breed, previous clinical and laboratory evaluation, histopathological evaluation, and absence of major coinfections were organized into two groups (Infected) with 11 dogs and group Control) with 04 dogs. The evaluation of gene expression was performed by PCR Profiler with commercial Kit RT² Profiler ™ PCR Array Dog Innate & Adaptive Immune Responses (Qiagen®). The p-value stipulated was ≤ 0.05 per Student's t-Test. Inflammatory infiltrates, mild to moderate, were found in infected dogs. There was an increase in expression of 24 genes of different subclasses compared to the control group (IRF6, CD4, CD40LG, TLR6, CCR4, TLR5, CCR8, CCL3, IFNG, IFNB1, TNF, IL13, IRF3, CD14, CD209, CD80, TLR4, CD86, CCR6, TRAF6, TLR7, RORC, NOD1, STAT3). This information indicates the involvement of the innate and adaptive immune response in the brain of dogs with LVC, and the high expression of these can be considered a key factor for the onset, maintenance and persistence of inflammation. / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-07T13:04:23Z No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / A infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis tem um amplo espectro de manifestações clínicas e imunológicas. Uma variedade de células estão envolvidas na defesa do hospedeiro contra o parasito. Entre elas, as células dendríticas (DCs) são elementos chaves para o sistema imune, pois atuam como sentinelas na periferia e alertam os linfócitos T do tipo do antígeno invasor, direcionando sua polarização e inicializando uma resposta imune. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a interação de células dendríticas humanas com L. braziliensis, já que, esse contato desencadeia estímulos para a produção de citocinas e moléculas co-estimulatórias envolvidas na resposta inflamatória, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. Assim, monócitos humanos foram isolados a partir de células mononucleares de sangue periférico, purificados por separação magnética e colocados em cultura com IL-4 e GM-CSF para gerar DCs imaturas, as quais foram infectadas com promastigotas de L. braziliensis durante 12 e 24 h. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo, usando os marcadores de superfície CD1a, HLA-DR, CD86 (B7-2)e DC-SIGN (CD209). Foi observada uma taxa de infecção de 46±3.5% com 7,2±0.6 amastigotas/DCs e 52.5± 2.4% com 6,1±1.6 amastigotas/DCs após 12 e 24 h de cultura, respectivamente. Os marcadores de superfície revelaram uma porcentagem de expressão de 70,5% (CD1a), 87,9% (HLA-DR), 94% (CD86) e 97,5% (DC-SIGN) nas células não infectadas; e 71% (CD1a), 89,9% (HLA-DR), 98,3% (CD86) e 97% (DC-SIGN) para células infectadas após 24 h. Após 12 h de infecção não detectamos alterações no padrão de expressão de moléculas de superfície. A inibição da apoptose pode tanto favorecer a apresentação dos antígenos quanto a disseminação do parasito. Além disso, foram encontradas principalmente as citocinas IL-12p40 e TNF-α nos sobrenadantes das culturas, enquanto não detectamos as citocinas IL-10, IL-6, IL-1β e TGF-β. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmania (Viannia) braziliensis infection leads to a broad spectrum of clinical and immunological manifestations. A great variety of cells is involved in host defense against the parasite. Among those, dendritic cells (DCs) are key elements of the immune system, which acts as sentinels in the periphery and alert T lymphocytes about the type of invading antigen, addressing their polarization and initiating an early immune response. The aim of this work was study the interaction of human dendritic cells with L. braziliensis, this contact triggers stimuli for the production of cytokine and co-stimulatory molecules involved in the inflammatory response, contributing to the development of protective adaptive immune response. Thereby, monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells, subsequently purified by magnetic separation, and cultured with IL-4 and GM-CSF to generate immature DCs, which were infected with L. braziliensis promastigotes during 12 e 24 h. The cells where characterized by flow cytometry using surface markers CD1a, HLA-DR, CD86 and DC-SIGN. It was observed an infection rate of 46±3.5% with 7,140±0.6 amastigotes/DC and 52.50± 2.4% with 6,1±1.6 amastigotes/DC 12 and 24 h post infection, respectively. The surface markers showed a percentage of expression of 70.5% (CD1a), 87.9% (HLA-DR), 94% (CD86) and 97.5% (DC-SIGN) in non-infected cells; and 71% (CD1a), 89.9% (HLA-DR), 98.3% (CD86) and 97% (DC-SIGN) in infected cells after 24 h infection. After 12 h of infection, we not detected differences of surface molecules expression. Moreover, cell death delay can either stimulate antigen- presentation or favor parasite dissemination. Additionally, the cytokines IL-12p40 and TNF- α were detected in the culture supernatants, whereas IL-10, IL-6, IL-1β and TGF-β were not detected.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-19T16:36:59Z No. of bitstreams: 1 2014_ Aurilene Gomes Monteiro.pdf: 1120017 bytes, checksum: 1181ffcd849a4f54466fcf6b6659445b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-20T14:19:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ Aurilene Gomes Monteiro.pdf: 1120017 bytes, checksum: 1181ffcd849a4f54466fcf6b6659445b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-20T14:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ Aurilene Gomes Monteiro.pdf: 1120017 bytes, checksum: 1181ffcd849a4f54466fcf6b6659445b (MD5) / A leishmaniose é uma das doenças parasitárias mais relevantes, estando em expansão em áreas urbanas e periurbanas no Centro-Oeste do Brasil. Na verdade, o diagnóstico sorológico é empregado no Brasil para determinar a eutanásia de cães positivos. No presente estudo examinamos a relevância do diagnóstico molecular no controle da leishmaniose visceral canina. Por outro lado, a sorologia positiva não está diretamente relacionada a uma doença ativa. Desta forma, avaliamos cinquenta e oito (58) cães de diferentes regiões do Distrito Federal a partir de abril de 2012 a dezembro 2013 relativa à infecção por Leishmania. Para tanto, os animais foram fornecidos pelo Centro de Controle de Zoonoses, após investigação epidemiológica. Analisamos biópsias de fígado, baço, nódulos linfáticos e medula óssea através de exames parasitológicos (HE imprints e cultura dos parasitas isolados) e moleculares (PCR da região ITS1 do rDNA e da região 3’ UTR do gene da HSP70). A amostra teve mais de 62% dos cães machos e a maioria destes animais tinha pelos curtos e as orelhas caídas. Análise por PCR das biópsias apresentou resultados positivos em 47 (81%) dos animais. As amostras positivas foram de 35 cães sintomáticos (83%) e 12 (75%) de cães assintomáticos. A reação de PCR-RFLP revelou a espécie L. infantum em 47 (100%) das amostras positivas para a PCR. Deste modo, concluiu-se que o diagnóstico molecular é mais sensível e específico para identificar a leishmaniose visceral em cães. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is one of the most relevant parasitic diseases, being in expansion on urban and periurban areas in Brazil´s Center East. Actually, serological diagnostic is employed in Brazil determining euthanasia of positive dogs. In this study we examined the relevance of the molecular diagnostic in the control of canine visceral leishmaniasis. On the other hand, a positive serology is not directly correlated to an active disease. In this way, we evaluated fifty-eight (58) dogs from different regions of the Federal District from April 2012 to December 2013 concerning Leishmania infection. For this purpose, animals were provided by the Center for Control of Zoonoses, after epidemiological investigation. We analyzed biopsies from liver, spleen, lymph nodes and bone marrow through parasitological (HE imprints and culture parasite isolation) and molecular tests (PCR of ITS1 region of the rDNA and 3’ UTR region of the HSP70 gene). Our sample had more than 62% of male dogs and most of these animals had short hair and dropping ears. PCR analysis of the biopsies showed positive results in 47 (81%) animals. Positive samples were from 35 (83%) symptomatic and 12 (75%) asymptomatic dogs. PCR-RFLP revealed L. infantum in 47 animals (100% of the PCR positive samples). In this way, we concluded that the molecular diagnosis is more sensible and specific to identify visceral leishmaniasis in dogs.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-24T18:36:17Z No. of bitstreams: 1 2014_MauroMacieldeArruda.pdf: 5466854 bytes, checksum: d70b31aa614ceb8e0f6566c97c4cb41c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-25T13:03:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MauroMacieldeArruda.pdf: 5466854 bytes, checksum: d70b31aa614ceb8e0f6566c97c4cb41c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T13:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MauroMacieldeArruda.pdf: 5466854 bytes, checksum: d70b31aa614ceb8e0f6566c97c4cb41c (MD5) / Introdução: A leishmaniose visceral é uma enfermidade parasitária, provocada pelo protozoário Leishmania (Leishmania) infantum (sin. Leishmania (Leishmania) chagasi). A limitada acurácia dos testes empregados para o diagnóstico dos cães pode contribuir com o baixo impacto de uma das medidas de controle preconizadas pelo Ministério da Saúde brasileiro, a eutanásia de cães sororreagentes para leishmaniose. Os objetivos deste trabalho buscam estimar a acurácia e a confiabilidade de dois testes imunoenzimáticos que utilizam antígenos de L.(L.) major ou de L.(L.) infantum em laboratórios de diferentes níveis de complexidade e estimar a acurácia dos testes de ELISA e IFI aplicados em combinação sequencial ou de forma paralela, analisando os valores preditivos positivos e negativos destas abordagens em prevalências variáveis de infecção canina. Método e principais resultados: Foi utilizado um painel de 1.425 amostras de soros caninos, coletados em estudo multicêntrico. As amostras foram analisadas por meio de técnicas de visualização direta de parasitos, por estudo histopatológico corado com hematoxilina-eosina, pela técnica de imunohistoquímica e pelo isolamento do parasito em cultura. Estas técnicas constituíram o padrão de referência, sendo um caso positivo para a infecção por L. infantum o animal que apresentasse positividade em pelo menos um dos testes. Os resultados da acurácia do teste de ELISA com antígenos de L. major e L. infantum realizados em condições ideais no Laboratório de Referencia Nacional foi de 91,84% (IC95% 86,3 - 97,3) e 89,80% (IC95% 83,8 - 95,7) para sensibilidade e de 83,57% (IC95% 81,7 - 85,7) e 82,69% (IC95% 80,6 - 84,7) para especificidade, respectivamente. A AUC (área abaixo da curva ROC) foi de 0,920 para antígeno de L. major e de 0,898 para L. infantum. Os coeficientes de correlação intraclasse médios dos testes com antígenos de L. major, variaram entre 0,890 (0,876-0,902 IC95%) e 0,948 (0,942-0,953 IC95%) e com os antígenos de L. infantum entre 0,818 (0,792-0,841IC95%) e 0,879 (0,865-0,8910 IC95%). A sensibilidade e a especificidade do teste de imunofluorescência indireta (IFI) foi 90,8% (IC95% 84,2 - 97,5) e 53,4% (IC95% 51,6 - 55,1), respectivamente. Utilizados de forma combinada o teste de ELISA com antígeno de L. major e o teste de IFI mostraram que em paralelo o desempenho da sensibilidade global subiu para 99,2%, porém a especificidade diminuiu para 44,8%. Na utilização dos testes em série (ELISA seguido de IFI) observou-se uma diminuição na sensibilidade (83,3%) e melhora na especificidade (92,5%). Conclusões: A acurácia dos dois testes avaliados é semelhante, com um desempenho discretamente melhor do antígeno de L. major. A reprodutibilidade dos testes foi quase que perfeita (>0,81) com desempenho pouco melhor para o antígeno de L. major. Conclui-se, portanto, que não se justifica a mudança do antígeno no teste de ELISA atualmente constituído por L. major para diagnóstico de leishmaniose visceral canina no Brasil. Finalmente, a combinação dos testes de ELISA com antígeno de L. major seguido do teste de IFI melhorou a especificidade da abordagem diagnóstica, sem perda substancial da sensibilidade. A combinação em série destes testes pode satisfazer os anseios, tanto da saúde pública como dos proprietários de cães residentes em áreas endêmicas, por uma abordagem diagnóstica mais acurada da leishmaniose visceral canina. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Background Visceral leishmaniasis is a parasitic disease caused by the protozoan Leishmania (Leishmania) infantum (syn. Leishmania (Leishmania) chagasi). The limited accuracy of diagnostic tests for canine leishmaniasis may contribute to the lack of impact of the control measures recommended by the Brazilian Ministry of Health, i.e., euthanasia of seroreactive dogs. The objective of this study was to estimate the accuracy and reliability of two ELISA tests employing L. (L.) major or L.(L.) infantum antigen used by laboratories of different levels of complexity and estimate the accuracy of the ELISA tests and IFI applied in sequential or parallel combination , analyzing the positive and negative predictive values of these variables approaches prevalence of canine infection. Methods and principal findings A series of 1,425 serum samples collected from dogs in a multicenter study was used. The samples were analyzed by direct visualization of the parasite in hematoxylin/eosin-stained sections, immune histochemistry, and isolation of the parasite in culture. These techniques represented the reference standard and an animal that was positive in at least one of the tests was defined as infected with L. infantum. The results of the accuracy of the ELISA test with antigens of L. major and L. infantum played in ideal conditions at the National Reference Laboratory was 91.84% (CI 95% CI 86.3 - 97.3 ) and 89.80% ( CI95% 83.8 - 95.7 ) for sensitivity and 83.57% (CI95% 81.7 - 85.7 ) and 82.59 ( CI95% 80.6 - 84.7 ) specificity%, respectively. The AUC (area under the ROC curve) was 0.920 for the L. major and L. infantum 0.898 to. The mean intraclass correlation coefficients of the tests ranged from 0.890 (CI95% 0.876-0.902) to 0.948 (CI95% 0.942-0.953) when L. major was used as antigen, and from 0.818 (CI95% 0.792-0.841) to 0.879 (CI95% 0.865-0.8910) when L. infantum was used. The sensitivity and specificity of indirect immunofluorescence assay (IFA ) was 90.8 % ( 95% CI 84.2 to 97.5 ) and 53.4 % ( 95% CI 51.6 to 55.1 ) , respectively. Used in combination with the ELISA antigen of L. major and the IFA test showed that parallel the performance of the overall sensitivity increased to 99.2 % , but the specificity decreased to 44.8 % . The use of serial testing ( ELISA followed by IFI ) observed a 15 decrease in sensitivity ( 83.3 % ) and improved specificity ( 92.5 % ). Conclusions The accuracy of the two assays was similar with a slightly better performance of the L. major. Reliability of the test was almost perfect (> 0.81) with slightly better performance for the L. major. These results do not support a change in the antigen composition of ELISA tests (L. major) currently used for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in Brazil. Finally, the combination of ELISA tests with L. major antigen followed by the IFA test improved the specificity of the diagnostic approach without substantial loss of sensitivity. Serial combination of these tests can satisfy the desires of both the public health and dog owners living in endemic areas for a more accurate diagnostic approach of canine visceral leishmaniasis.