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Diagnóstico da leishmaniose visceral canina pelas técnicas de imunoistoquímica e PCR em tecidos cutâneos em associação com a Rifi e Elisa-teste /Queiroz, Nina Marí Gual Pimenta de. January 2008 (has links)
Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC) é causada pelo protozoário Leishmania (L.) chagasi e a presença deste parasita na pele dos cães reforça a importância destes animais no ciclo de vida da L. (L..) chagasi e na infecção humana. O objetivo deste trabalho foi avaliar o teste imunoistoquímico (IMIQ) e a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) em tecidos cutâneos caninos para o diagnóstico da LVC e compará-los com os exames histoquímico (HE) e sorológicos (ELISA e RIFI). Dos 34 cães naturalmente infectados, classificados em assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos, foram colhidas amostras de pele sadia ou com lesão para a realização da IMIQ, HE e PCR. Não somente peles lesionadas (56,5%), mas também peles sadias (31,8%) encontravam-se positivas pela IMIQ, confirmadas posteriormente pela PCR em 97,8% das amostras. No grupo assintomático, 87,5% estavam negativos pelos testes sorológicos, mas positivos em 50% dos casos pela IMIQ e 100% pela PCR. Entre os oligossintomáticos, 100%, 85,7% e 28,6% encontravam-se positivos, respectivamente pela PCR, sorologia e IMIQ. 91,7% dos polissintomáticos eram soro positivos e tinham parasitas intactos na pele. A PCR apresentou maior positividade, detectando amastigotas na pele de 100% dos cães independente do quadro clínico, do resultado dos exames sorológicos e do teste HE. A eficiência de cada teste variou de acordo com a evolução da doença, demonstrando a necessidade da associação de técnicas, usando IMIQ para confirmação da sorologia e a PCR apenas nos casos ainda suspeitos após a IMIQ, podendo assim aumentar os níveis de positividade e contribuir para o controle desta zoonose. / Abstract: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is caused by a protozoa of the specie Leishmania (L.) chagasi and the presence of parasite in the skin reinforces the importance of dogs in the L. (L.). chagasi life cycle and for human infection. The purpose of the present study was to evaluate the immunohistichemistry (IMHC) and PCR (Polymerase Chain Reaction) tests for CVL diagnosis and compared the results with serological tests such as the indirect fluorescence antibody test (IFAT), ELISA and a parasitalogical test (microscopic direct examination of the parasite stained with haematoxylin and eosin - HE). For this study, samples of healthy or lesion skin tissues were obtained from 34 CVL naturally infected dogs classified in three groups: asymptomatic, oligosymptomatic and polisymptomatic. Not only lesion (56.5%) but also healthy skins (31.8%) were positives by IMHC and confirmed by PCR in 97.8% of skin samples. In asymptomatic group, 87.5% dogs were negatives by serological tests, but positives by IMHC in 50% and by PCR in 100%. In oligosymptomatic group, 100%, 85.7% and 28.6% of dogs were positives, respectively by PCR, serological and IMHC tests. In addition, 91.7% of polisymptomatic dogs were serum positives and had intact parasites in the skin. PCR showed higher positivity, detecting amastigotes in skins of 100% dogs regardless their clinical status or the serological or IMHC or HE test results. The efficiency of each test varied in agreement with the evolution of the disease. IMHC may be used to confirm the results of the serology and PCR only in suspicious cases after IMHC. The association of techniques proposed in this study may increase the positivity and contributed to the control of this zoonoses. / Orientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Coorientador: Caris Maroni Nunes / Banca: Caris Maroni Nunes / Banca: Mary Marcondes / Mestre
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Estudo da Potencialidade da Lignana Iangambina e da Quitosana no Tratamento da Leishmaniose Experimental em Camundongos SuiçosPenha, Antônia Rosangela Soares 10 March 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-03-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis are a group of parasitic diseases caused by different species of
the genus Leishmania and affect over 12 million people throughout the world.
Clinical manifestations may vary from simple cutaneous lesions to visceral
leishmaniasis, which may be fatal. Conventional chemotherapy is based on
several parenteral injections of pentavalent antimonials, drugs that are
considerably toxic and prone to induce parasite resistance. Yangambin is a
furofuranic lignan, isolated from the leaves of Ocotea duckei, which presents
several pharmacological potentialities. Chitosan, a natural polysaccharide
composed of glucosamine and n-acetyl-d-glucosamine, has been
demonstrating pharmaceutical properties related to controlled drug release.
Taking into account that the search for more effective drugs against Leismania
has become necessary, this study aimed to evaluate the antileishmanial activity
of yangambin and chitosan, as well as the association of yangambin and
chitosan on in vitro and in vivo experimental models. The molecules were tested
on: promastigote forms of L. amazonensis and L. chagasi; murine macrophages
and epithelial cells of canine kidney (MDCK cells); macrophages infected with L.
chagasi; and Swiss mice infected with L. amazonensis. Yangambin presented
antipromastigote activity against both Leishmania species, and chitosan against
L. chagasi. The association yangambin-chitosan did not interfere with the
antipromastigote activity of yangambin. Concerning cytotoxicity on mammalian
cells, no cytotoxic activity of yangambin was registered on murine macrophages
nor MDCK cells at a 24-hour exposure time. Chitosan was not cytotoxic for
macrophages exposed to it for 24 hours, however, it presented significant
cytotoxic activity for macrophages at a 48-hour exposure time. Yangambin and
chitosan presented antiamastigote activity on murine macrophages infected
with L. chagasi at a 48 and 72-hour incubation time. Such activity was
independent of nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor-a (TNF-a)
production. On the model of Swiss mice infected on the footpad with L.
amazonensis, the group treated with the association yangambin-chitosan and
the group treated with chitosan presented a significant reduction of the paw
lesion size at the eighth week of treatment, as well as a reduced parasite load
at the footpad and linfonode. Although the group of animals treated with
yangambin did not present reduction of the footpad lesion size, a reduced
parasite load was observed at the footpad and linfonode. Thus, it can be
concluded that yangambin and chitosan present a potentiality in the
therapeutics of leishmaniasis, characterized by antileishmanial activity both in
vitro and in vivo. / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por diferentes espécies
do gênero Leishmania que afetam mais de 12 milhões de pessoas em todo o
mundo. As manifestações clínicas podem variar desde simples lesões cutâneas
à leishmaniose visceral que pode ser fatal. A quimioterapia convencional
baseia-se em múltiplas injeções parenterais com antimoniais pentavalentes que
são consideravelmente tóxicos e propensos a induzir resistência nos parasitas.
A iangambina é uma lignana furofurânica isolada das folhas da Ocotea duckei
que apresenta várias potencialidades farmacológicas. A quitosana, um
polissacarídeo natural composto de glicosamina e N-acetil-D glicosamina, tem
demonstrado propriedades farmacêuticas relacionadas à liberação controlada
de drogas. Considerando que a busca de drogas mais eficazes contra
Leishmania tornou-se extremamente necessária, este trabalho teve como
objetivo avaliar a atividade antileishmania da iangambina e da quitosana assim
como a associação da iangambina com a quitosana em modelos experimentais
in vitro e in vivo. Estas substancias foram testadas sobre formas promastigotas
de L. amazonensis e L. chagasi, sobre macrófagos murinos e células epiteliais
de rim canino (MDCK), sobre a infecção de macrófagos murinos com L.
chagasi e em camundongos suíços infectados com L. amazonensis. A
iangambina apresentou atividade antipromastigota sobre as duas espécies e a
quitosana apresentou atividade antipromastigota para a espécie L. chagasi. A
associação da iangambina com a quitosana não interferiu com a atividade
antipromastigota da iangambina. Quanto a citotoxicidade para as células de
mamíferos, não houve atividade citotóxica da iangambina sobre macrófagos e
células MDCK no tempo de exposição de 24h; a quitosana não apresentou um
efeito citotóxico para os macrófagos quando estes foram expostos por 24h, no
entanto para o tempo de exposição de 48h, esse carboidrato apresentou uma
citotoxicidade significativa para macrófagos. A iangambina e a quitosana
apresentaram atividade anti-amastigota em macrófagos murinos infectados
com L. chagasi nos tempos de 48h e 72h de incubação. Esta redução não foi
dependente da produção de óxido nítrico (NO) e nem do fator de necrose
tumoral- (TNF- ). No modelo de camundongos suíços infectados na pata
com L. amazonensis o grupo de animais que recebeu tratamento da
associação da iangambina com a quitosana e o grupo que recebeu quitosana
apresentaram uma redução significativa no tamanho das lesões da pata na
oitava semana de tratamento e uma diminuição na carga parasitária da pata e
linfonodo poplíteo. O grupo de animais tratados com a iangambina, embora não
tenha apresentado diminuição de lesão, também teve uma redução da carga
parasitária da pata e linfonodo. Dessa forma, pode-se concluir que a
iangambina e a quitosana apresentam uma potencialidade na terapêutica das
leishmanioses, caracterizada por uma atividade antileishmania tanto in vitro
como in vivo
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Identificação de um gene que confere resistência a tubercidina em Leishmania (Leishmania) major / Identification of a gene related with tubercidin resistance in Leishmania (Leishmania) majorJuliana Ide Aoki 29 November 2013 (has links)
A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de compostos antileishmania. Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação do análogo de purina tubercidina (TUB) em Leishmania. Utilizando a estratégia de superexpressão após transfecção gênica, isolamos um locus de Leishmania (Leishmania) major, de 31 kb, capaz de conferir níveis de resistência quatro vezes maior que o parasita selvagem. Várias deleções desse locus foram geradas e a construção de 3 kb (pSNBR/3kbClaI-EcoRI) também conferiu níveis de resistência quando comparado ao parasita elvagem. Através de análises no genoma de L. (L.) major, localizamos esse locus no cromossomo 31 e, no fragmento de 3 kb, um gene que codifica para uma proteína com função desconhecida até o momento (LmjF.31.2010). Esta proteína foi relacionada com resistência a TUB em todas as linhagens transfectadas analisadas (cosTUB2 e pSNBR/3kbClaI-EcoRI), assim denominamos LmjF.31.2010, de proteína relacionada com resistência a TUB (PRRT). A quantificação relativa de transcritos de mRNA na construção pSNBR/3kbClaI-EcoRI apresentou níveis altos de transcritos da PRRT. Foram gerados ainda mutantes de L. (L.) major e L. (L.) amazonensis resistentes a TUB e estes se apresentaram bem adaptados a concentrações altas de TUB, apresentando razão de resistência maior que 200 vezes, quando comparado com os respectivos parasitas selvagens. A PRRT também foi relacionada na resistência a TUB nos mutantes gerados, pois houve amplificação gênica de prrt. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados para inferir a importância da PRRT no mecanismo relacionado com resistência a TUB. / The identification of genes associated with resistance to antiparasitic compounds has contributed to a better understanding of the mechanism of action of compounds against Leishmania. Little is known about the mechanism of action of purine analog tubercidin (TUB) in Leishmania. Using a strategy of gene overexpression after transfection, we isolated a locus of Leishmania (Leishmania) major, 31 kb, capable of conferring fold resistance four times greater than the wild type parasite. A set of deletions of this locus were generated and a 3 kb construction (pSNBR/3kbClaI-EcoRI) conferred fold resistance twice than the wild type. Analysis of L. (L.) major genome, located this locus on chromosome 31 and on 3 kb fragment we identified a gene encoding a protein with unknown function (LmjF.31.2010). This protein has been related to TUB resistance in all strains analyzed (cosTUB2 and pSNBR/3kbClaI-EcoRI), so we named mjF.31.2010 of protein related with resistance to TUB (PRRT). Relative quantification of mRNA transcripts in the construction pSNBR/3kbClaI-EcoRI showed high levels of PRRT transcripts.Mutants of L. (L.) major and L. (L.) amazonensis resistant to TUB were also generated and these were well adapted to high TUB concentrations, presenting fol resistance greater than 200 times when compared with their respective wild type. The PRRT was also related to TUB resistance mutants generated by PRRT gene amplification. Despite the high fold resistance presented by TUB resistant mutants, the ratio of expression of these mutant PRRT transfected and wild was similar to the wild type.
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Identificação de genes que codificam translocadores de fosfolipídios em Leishmania / Identifications of phospholipid translocators in LeishmaniaCarolina de Lima Jorge 04 December 2017 (has links)
Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. / Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.
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Desenvolvimento de um sistema induzível de expressão mediado pela Cre-recombinase para a caracterização do domínio C-terminal da proteína RAD9 de Leishmania major / Development of an inducible system for the expression of proteins mediated by Cre-recombinase for the characterization of the C-terminal domain of Rad9 protein from Leishmania majorRenato Elias Rodrigues de Souza Santos 17 April 2017 (has links)
O desenvolvimento de novas ferramentas para manipulação genética é necessário para um melhor entendimento da biologia de protozoários que causam doenças sérias e negligenciadas. Neste contexto, apresentamos uma nova aplicação do sistema Cre recombinase em Leishmania major, utilizado para a expressão condicional de genes de interesse. Como prova de conceito demonstramos por ensaios de PCR, western blotting e imunofluorescência que o gene da Proteína Fluorescente Verde (Green Fluorescent Protein, GFP) é condicionalmente expresso em função do tempo e dose de rapamicina necessários para a ativação da recombinase. A aplicação do sistema diCre em L. major é feita com o estudo da proteína Rad9, que participa na sinalização e resposta a danos ao DNA. A Rad9 de L. major possui um domínio C-terminal desestruturado, que no homólogo humano não é essencial para a formação do complexo 911 (Rad9-Hus1-Rad1), mas possui sítios de fosforilação importantes para a cascata de sinalização que mantém a integridade do DNA. Usando predições da estrutura de Rad9, a proteína foi dividida em domínios e foram geradas linhagens que expressam, condicionalmente, versões truncadas de Rad9. Por análises de PCR, western blotting, citometria de fluxo e imunofluorescência, acessamos alguns dos papeis que o domínio C-terminal de Rad9 pode desempenhar em L. major. / The development of new tools for genetic manipulation is necessary for a better understanding of the biology of protozoa that cause severe and neglected diseases. In this context, we present a new application of the Cre recombinase system in Leishmania major, using it for the conditional expression of genes of interest. As proof of concept we show by PCR, western blotting and immunofluorescence assays that the Green Fluorescent Protein (GFP) gene can be conditionally expressed depending on the time and dose of the rapamycin treatment required for the recombinase activation. The application of the diCre system in L. major was tested with the study of the Rad9 protein, which participates in the parasite\'s DNA damage response. Rad9 from L. major presents an unstructured C-terminal domain, which in the human homolog is not essential for the 911 (Rad9-Hus1-Rad1) complex formation, but has phosphorylation sites that are important in the signaling cascade that maintains the DNA integrity. Using structure predictions of Rad9, the protein was divided into specific domains and cell lines were generated conditionally expressing truncated versions of Rad9. By PCR, western blotting, flow cytometry and immunofluorescence assays, we assessed some of the roles that the C-terminal domain of Rad9 can perform in L. major.
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O sensor intracelular AIM2 participa da resposta imune inata e adaptativa durante a infecção por Leishmania amazonensis / The intracelular sensor AIM2 participates of the innate and adaptive immune responses during the infection with Leishmania amazonensisLeonardo Lima dos Santos 05 July 2017 (has links)
Leishmania amazonensis é um parasito endêmico no Brasil, que ao infectar humanos, pode causar a leishmaniose cutânea. Cerca de 12 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Leishmania em 98 países, e anualmente, 350 milhões de indivíduos estão em risco de contrair esta doença. Enquanto o papel da imunidade adaptativa já foi extensivamente investigado, em modelos de infecção com Leishmania spp., os mecanismos de alguns receptores da imunidade inata, e principalmente dos citosólicos, como é o caso do AIM2, permanecem obscuros. Recentemente, o nosso grupo descreveu a importância do inflamassoma de NLRP3 no controle da infecção por L. amazonensis, o qual é mediado pela produção de óxido nítrico dependente da sinalização de IL-1R. Neste trabalho, foi demonstrado que a deficiência para IL-1R confere uma maior susceptibilidade a este parasito do que a deficiência para NLRP3. Sugerindo que outros inflamassomas, que operam via IL- 1R, possam estar envolvidos na resposta contra este patógeno. Dentre estes, o AIM2 destacase como sendo um receptor de DNA citosólico que mediante a sua ativação promove a secreção de citocinas pro-inflamatórias e piroptose. Neste contexto, nós demonstramos que o AIM2 promove o controle da infecção in vitro por L. amazonensis em macrófagos, e que estas células requerem este sensor de DNA para a secreção de IL-1?, expressão da enzima NOS2 e produção de óxido nítrico. Adicionalmente, também observamos que AIM2 promove resistência à infecção por L. amazonensis in vivo, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1. Por fim, também demonstramos que o inflamassoma de AIM2 atua na produção de IL-1? e IL-1?, por células dendríticas, assim como na expressão de CD86 e CD40 e na secreção de IL-12 por estas células. Desta forma, foi demonstrado neste trabalho que o AIM2, ao ativar células da imunidade inata e adaptativa, promove o controle direto ou indireto da infecção por L. amazonensis. / Leishmania amazonensis is an endemic parasite in Brazil that can cause the cutaneous leishmaniasis in humans. Annually, around 12 million people are infected with Leishmania spp. parasites, in 98 countries. In addition, 350 million of individuals are on risk to develop this disease. While the role of the adaptive immune response was already extensively evaluated, on models of infection with Leishmania spp., the mechanisms of some innate immune receptors, and mainly the cytosolic ones, such as AIM2, remain unclear. Recently, our group described the importance of the NLRP3 inflammasome to the control of L. amazonensis mediated by NO, which is dependent of the IL-1R signaling. In this work, it was also reported that the Il-1r deficiency displayed a higher susceptibility to L. amazonensis infection in comparison to Nlrp3-deficient mice. Suggesting that other inflammasomes, which may operate through IL-1R, might be involved in the response to this pathogen. Among these, the AIM2 highlights as a cytosolic DNA sensor, which, after its activation, promotes the secretion of proinflammatory cytokines and pyroptosis. On this context, we demonstrated that AIM2 promotes the in vitro control of L. amazonensis in macrophages, and that these cells require this DNA sensor for the IL-1? secretion, NOS2 expression and NO production. In addition, we also observed that AIM2 promotes the in vivo resistance to L. amazonensis infection, contributing for the development of a Th1 response. Finally, we also demonstrated that AIM2 acts on the production of IL-1? and IL-1?, by dendritic cells, as well as on the CD86 and CD40 expression and IL-12 secretion by these cells. Therefore, in this work, we showed that the AIM2, leading to the activation of innate and adaptive immune cells, promotes the direct or indirect control of L. amazonensis infection.
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Estatinas como coadjuvantes nos tratamentos da doença de Chagas e leishmanioses / Statins as coadjuvant to treatment of Chagas disease and LeishmaniasisKelly Cristina Rodrigues 31 January 2014 (has links)
As doenças denominadas como negligenciadas têm causado nos últimos anos uma preocupação muito acentuada na comunidade científica e para as autoridades de saúde, relacionada às suas terapêuticas, no sentido de que os medicamentos existentes não se apresentam totalmente eficazes, além de determinarem efeitos colaterais extremamente elevados. Nesse perfil se encaixam a doença de Chagas e as Leishmanioses, etiologias determinadas respectivamente por Trypanosoma cruzi e parasitas do gênero Leishmania. Como proposta de encontrarmos uma alternativa para o tratamento dessas parasitoses, avaliamos o potencial terapêutico de três estatinas (sinvastatina, pravastatina e mevastatina), comercialmente encontradas para o tratamento de níveis elevados de colesterol e triglicérides, baseado no princípio de que a rota bioquímica para a formação de colesterol é semelhante à do ergosterol, componente da membrana plasmática desses protozoários. Foram realizadas avaliações in vitro e in vivo das estatinas puras e de suas associações com o benzonidazol, medicamento de referência no tratamento da doença de Chagas e com a anfotericina B, medicamento de referência no tratamento das leishmanioses, partindo do pressuposto que a substituição do benzonidazol / anfotericina B ou a diminuição de suas doses em combinação com as estatinas, atuando como coadjuvantes, pudessem auxiliar no tratamento e diminuir os efeitos colaterais provocados pela medicação. Observou-se nos ensaios com T. cruzi in vitro boa atividade antiparasitária, com valores de porcentagem de lise celular mais altos ou comparados aos encontrados para o benzonidazol, já in vivo, apenas a mevastatina apresentou redução da parasitemia em relação ao controle positivo e às outras estatinas testadas. Nos ensaios com L. braziliensis e L. major não foi observado resultado significante, tanto in vitro como in vivo, apesar de em algumas situações encontrarmos resultados próximos ao controle positivo. / Over recent years, neglected diseases has been a problem to the scientific community and health associations due the absence of total efficacy of drugs, and by their potential side effects. Chagas\' disease and Leishmaniasis - both caused respectively by Trypanosoma cruzi and by parasites the genus Leishmania fit on this profile. Aiming to find an alternative treatment of these parasitosis we evaluated the potential therapeutic of three statins (simvastatin, pravatatin, and mevastatin) which are commercially employed for treatment of high levels of cholesterol and triglycerides, based on the similarity of the biochemical route of cholesterol and ergosterol formation, being the ergosterol a component of plasmatic membrane of these protozoa. In vitro and in vivo evaluation were made by the association of these statins with benznidazole and amphotericin B used for Chagas\' disease and Leishmaniasis treatment respectively, hypothesizing that the replacement of benznidazole/amphotericin B or the reduction of the doses in combination with statins as coadjuvants could provide better treatment and side effects reduction caused by the commercial drugs. In vitro assays under T. cruzi showed significant antiparasitic activity when compared with benzonidazole to all statins. On the other hand in vivo assays showed parasitic reduction only by mevastatin when it was compared with positive control. L. braziliensis and L. major in in vivo assay didn´t show significant results despite the results have been similar to the positive control.
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Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4 / Biochemical preparation for molecular and structural characterization of the RNA virus LRV1-4Érika Chang de Azevedo 26 February 2015 (has links)
O vírus de Leishmania 1-4 ( do inglês Leishmania RNA virus 1-4 ou LRV1-4) é um vírus da família Totiviridae, e que possui capsídeo icosaédrico e RNA dupla-fita que codifica duas proteínas (proteína capsidial e RNA polimerase). Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Há relatos sobre a purificação do vírus a partir do seu hospedeiro natural (Leishmania guyanensis) e a partir de sistemas de expressão heteróloga. Este trabalho tem por objetivo estabelecer os métodos de purificação para posteriores estudos estruturais por Microscopia Eletrônica de Transmissão por Contraste Negativo (NS-TEM) e por Crio-Microscopia Eletrônica (Cryo-EM). Os estudos aqui propostos irão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e sua identificação correta dentre os totivírus. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsídeo viral realizada no Brasil, e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais. Foram realizadas ultracentrifugações biológicas, utilizando gradientes de sacarose, para a purificação do vírus a partir do extrato celular de L. guyanensis. As frações que apresentaram RNA viral foram analisadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (Campinas LNNano CNPEM). Além disso, foram realizadas tentativas de expressar a proteína do capsídeo (ORF2) em Leishmania tarentolae e Escherichia coli. Foram também realizados esforços para a obtenção de anticorpos a partir de peptídeos sintetizados após análise computacional da sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo. As amostras obtidas a partir do hospedeiro natural do vírus se apresentaram heterogêneas quando analisadas por NS-TEM, de modo que não foi possível a realização de uma análise estrutural. Porém, a presença de partículas do tamanho esperado para o vírus em amostras em que foi detectado o RNA viral indicam que são necessários esforços para obtenção de uma amostra de maior pureza e homogênea. Além disso, não foi possível obter a proteína do capsídeo nos sistemas de expressão heteróloga. A presença de 25 resíduos de cisteína pode estar levando a proteína à degradação rápida em bactéria. Os experimentos de expressão em células de Leishmania ainda não foram conclusivos. Foi obtido um anticorpo anti-peptídeo que reconhece a proteína do capsídeo, tornando possíveis experimentos como imunolocalização e imunoprecipitação do vírus. / The Leishmania RNA virus 1-4 (LRV1-4) belongs to the Totiviridae family. It has an icosahedral capsid and a double-strand RNA encoding two proteins (capsid protein and RNA polymerase). Recent data indicate the involvement of LRV1-4 in the pathogenesis of Leishmania in the human host, making their study of fundamental importance for the understanding of this disease and its role in host-parasite relationship. There are reports on the purification of the virus from its natural host (Leishmania guyanensis) and from the same heterologous expression systems such as Escherichia coli.This work aims to stablish purification methods for further structural studies by Negative Stain Transmission Microscopy (NS-TEM) and Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM). The studies proposed here will allow the construction of a structural model of the coat protein of LRV1-4 and their correct identification amongst the Totiviridae. In addition to the contributions to the knowledge of the biology and pathogenesis of LRV1-4, this study represents the first structural characterization of a viral capsid held in Brazil and thus an important step forward for the field of virology and structural biology in the country. Sucrose for virus purification gradients were performed from the cell extract of L. guyanensis. Fractions that showed viral RNA were analised by Transmission Electron Microscopy (Campinas LNNano - CNPEM). Furthermore, attempts have been made to express the capsid protein (ORF2) in Leishmania tarentolae and Escherichia coli. There has also been made efforts to obtain antibodies from peptides synthesized accordingly to the computer analysis of the amino acid sequence of the capsid protein. The samples obtained from the natural host of the virus showed a heterogeneous distribution of particles when examined by NS-TEM so that it was not possible to perform a structural analysis. However, the presence of particles of the size expected for the virus particles in samples where the viral RNA was detected indicate that efforts are necessary to obtain a more homogeneous and pure sample. Moreover, it was not possible to obtain the capsid protein in heterologous expression systems. The presence of 25 cysteine residues could have led to the protein rapid degradation in the bacteria host. The expression experiments in Leishmania cells were not yet conclusive. It was also possible to obtain an anti-peptide antibody recognizing the capsid protein, enabling immunoprecipitation and immunolocalization experiments.
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Expressão, purificação e caracterização das proteínas Rvb1 e Rvb2 do complexo R2TP de Leishmania major / Expression, purification and characterization of Rvb1 and Rvb2 proteins of R2TP complex in Leishmania majorPeres, Bárbara Ramalho, 1988- 09 December 2014 (has links)
Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:59:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Resumo: As proteínas Rvb1 e Rvb2 são DNA helicases dependentes de ATP pertencentes à família AAA+ ATPases (ATPases associadas com diversos processos celulares) que estão envolvidas na remodelação da cromatina, montagem da telomerase, mitose e biogênese de snoRNP ("small nucleolar ribonucleoprotein") e interagem com as co-chaperonas Tah1 (contém um domínio TPR associado com Hsp90) e Pih1 formando um complexo funcional, denominado R2TP. Este complexo já foi identificado em levedura e seres humanos, e desempenha um papel essencial na montagem de complexos multi-proteicos com DNA e RNA. Nosso grupo de pesquisa tem por objetivo identificar e caracterizar o complexo R2TP em Leishmania major pela importância deste parasita para medicina. Apresentamos o estudo das proteínas Rvb1 e Rvb2 de L. major. Os genes foram clonados e as proteínas recombinantes foram purificadas e caracterizadas quanto à conformação pelas técnicas de dicroísmo circular, gel filtração analítica e fluorescência intrínseca, mostrando que as proteínas foram purificadas enoveladas. Foram feitos ensaios funcionais de atividade ATPásica mostrando que estas possuem atividade ATPásica a qual é aumentada quando as proteínas foram incubadas com DNA. Espera-se que os resultados deste trabalho possam contribuir para o objetivo de compreensão do sistema R2TP e da regulação da homeostase do genoma de L. major. O conjunto destas pesquisas pode contribuir também para o desenvolvimento de possíveis estratégias para intervir no parasita causador de uma doença negligenciada / Abstract: Rvb1 and Rvb2 proteins are ATP-dependent DNA helicases belonging to the AAA + ATPases family (ATPases associated with diverse cellular processes) that are involved in chromatin remodeling, telomerase assembly, mitosis and snoRNP biogenesis ("small nucleolar ribonucleoprotein") and interact with co-chaperones Tah1 (wich contains a TPR domain associated with Hsp90) and Pih1 into a functional complex, named R2TP. The R2TP complex has been identified in yeast and humans, and has an essential role in the assembly of multi-protein complexes with DNA and RNA. Due to the medical importance of Leishmania major our research group has becoming interested in the identification and characterization of the R2TP complex of this parasite. We studied the Rvb1 and Rvb2 proteins of L. major. The genes were cloned, the recombinant proteins were purified and their conformation were characterized by circular dichroism, analytical gel filtration and intrinsic fluorescence techniques, indicating that the proteins were folded. Functional assays showed that Rvb1 and Rvb2 have ATPase activity and this activity increased when incubated with DNA. Hopefully, the results of this study may contribute to the goal of understanding the R2TP system and homeostasis of the L. major genome and together, may contribute to the development of possible strategies to intervene with a parasite that causes a neglected disease / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular
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Estudos das propriedades biológicas de bioterápicos homeopáticos obtidos por diferentes metodologias farmacotécnicas sobre Leishmania (Viannia) braziliensis / Studies of the biologic properties of homeophatic biotherapics obtained from different phamacotecnical methodologies over Leishmania (Viannia) braziliensisMamede, Karina Pontin, 1977- 05 September 2012 (has links)
Orientador: Sérgio de Albuquerque / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T09:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2012 / Resumo: Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde, a prevalência das diferentes formas de leishmaniose (tegumentar e visceral) ultrapassou 12 milhões de casos. A leishmaniose constitui um importante problema de saúde pública especialmente na América Latina e Central, África e esporadicamente na Europa e América do Norte. No Brasil, a leishmaniose cutânea é causada principalmente por Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis, a mucocutânea por Leishmania (Viannia) braziliensis e a visceral por Leishmania (Leishmania) chagasi. O principal tratamento das infecções causadas por esse parasito é baseado principalmente no uso de antimoniais pentavalentes que, apesar da relativa eficácia, essas drogas são altamente tóxicas, provocando efeitos colaterais graves, além de determinar certa resistência parasitária. Diante disso, faz-se necessário o estudo de novas drogas eficazes para o tratamento da leishmaniose com menos efeitos colaterais. Objetivou-se com o presente trabalho avaliar a eficácia de diversos tipos de Bioterápicos homeopáticos nas escalas Centesimal (CH) e Decimal (DH), utilizando diferentes processos de preparação, com o intuito de proporcionar uma melhor eficácia no tratamento a leishmaniose, com menores taxas de efeitos colaterais. Para tal, foram utilizados Mus musculus, machos, infectados experimentalmente com 2,0x 104 formas promastigotas de L. (V) braziliensis. Os animais foram divididos em: grupo controle positivo, tratados com Glucantime; controle negativo, tratados com solução fisiológica; grupos infectados e não infectados tratados com o Bioterápico 1 (obtidos por formas promastigotas inativados pelo método do ultra-som), Bioterápico 2 (obtidos de formas amastigotas inativados por álcool 70%), Bioterápico 3 (obtidos por formas promastigotas inativados por álcool 70%), Bioterápico 4 (obtidos de formas amastigotas mais sangue de camundongos infectados) e Bioterápico 5 (obtidos de formas amastigotas mais sangue de animais infectados e mix homeopático. Os Bioterápicos 2, 3 e 4 foram preparados nas escalas centesimal e decimal. O tratamento ocorreu por um período de 60 dias, com exceção do controle positivo que foi administrado conforme o padrão terapêutico do medicamento. Após o tratamento, realizou-se provas hematológicas em todos os animais, a fim de verificar possíveis efeitos dos Bioterápicos em relação ao desenvolvimento de suas células sanguíneas. Os resultados demonstraram que os animais tratados com o Bioterápico 2 na escala decimal (DH) apresentaram uma maior redução na lesão leishmaniótica em relação aos outros grupos, porém não o suficiente para alcançar a cura parasitológica. Em relação às provas hematológicas, os resultados mais significativos observados foram aumento de monócitos nos grupos infectados e tratados com os Bioterápicos, aumento do número de macrófagos, principalmente para os grupos tratados com os Bioterápicos 2 e 3 na escala decimal, o que leva a pensar em uma possível estimulação do sistema imunológico pelos Bioterápicos utilizados / Abstract: According to the last estimative of the Wold Health Organization, the prevalence of the distinct forms of leishmaniosis (tegumentar and visceral) exceeded 12 million people. Leishmaniosis is considered an important health problem in Central and south America, Africa ·., and seldom in Europe and North America. In Brazil, cutaneous leishmaniosis is caused mainly by Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonens1s, the mucocutaneous by Leishmania (Viannia) braziliensis and the visceral by Leishmania (Leishmania) chagasi. The main clinical treatment for these infections is based in the use of pentavalente antimonials, which presents a partial efficacy, being extremely toxic and triggering serious side effects, besides the fact of causing parasitic resistance to drug. So the use of alternative drugs with less collateral side effects for the treatment of leishmaniosis has been the goal of several researchers. This work has as objectives to evaluate the effectiveness of homeopathic biotherapics in the Centesimal (CH) and Decimal (DH) scales, using different processes of manufacturing in the attempt to induce a better efficiency for leishmaniosis. For this purpose it was used male Mus musculus experimentally infected with 2,0 x 104 promastigote forms of L. braziliensis. Animals were divided in groups: positive control group, Glucantine treated animals, negative control, treated with saline solution; infected and uninfected animals treated with Biotherapic 1 (manufactured using promastigote forms inactivated by ultra-sound). Biotherapic 2 (manufactured using promastigote forms inactivated by ultra-sound), Biotherapic 2 (manufactured using amastigote forms inactivate with alcohol 70%), Biotherapic 3 (manufactured using promastigote forms inactivated with alcohol 70%), Biotherapic 4 (manufactured from amastigote forms added with blood of infected mice) and Biothepapic 5 (manufactured from amastigote forms added with blood infected animals and homeopathic mix). The biotherapics 2, 3 e 4 were prepared in the centesimal and decimal scales. Treatment was applied for a period of 60 days, with exception of the positive control, which was administered according to the directions of the drug. After fmished the therapeutic treatment, hemogram of all animals was done in order to verify possible harmfull effects on the blood red and white cells. Our data revealed that treated with biotherapic 2 in the decimal (DH) scale displayed a more effective reduction in the leishmaniotic lesion as compared to other groups, although not sufficient to induce the parasitological cure. Concerning to the hemogram, a monocytosis was observed for infected animals treated with distinct biothepapics. It was also found enhanced number of macrophages mainly for groups treated with Biotherapics 2 and 3 in the decimal scale. These data points in the direction of a possible stimulation of the host's immune response, triggered by these biotherapics / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia
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