Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T12:18:31Z No. of bitstreams: 1 sarah_falcao. Avaliação...2013.pdf: 3048010 bytes, checksum: 6d0d112498f296909639914a28ec6b23 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T12:18:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sarah_falcao. Avaliação...2013.pdf: 3048010 bytes, checksum: 6d0d112498f296909639914a28ec6b23 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) tem como principal agente etiológico a L. braziliensis e é uma das afecções dermatológicas que merece mais atenção, por seu alto coeficiente de detecção e sua capacidade de produzir deformidades. O neutrófilo é considerado a primeira linha de defesa contra agentes infecciosos ou substâncias estranhas e o seu rápido recrutamento para os tecidos é fundamental para o sistema imune inato. No modelo murino de infecção por L. braziliensis, mostramos um constante recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção. Baseados nesses resultados, nós formulamos uma hipótese que os neutrófilos desempenham um papel importante durante os estágios iniciais de infecção com L. braziliensis. Assim, conduzimos experimentos com neutrófilos recrutados com tioglicolato e neutrófilos derivados de medula óssea. Inicialmente, observamos que os neutrófilos são prontamente infectados com parasitas opsonizados com soro fresco. O contato entre neutrófilos e L. braziliensis ativou os neutrófilos, aumentando a expressão de CD18 e diminuindo a expressão de CD62L. Essa ativação levou à produção de superóxido, secreção de elastase e liberação de TNF-a. O contato com L. braziliensis não impediu a apoptose dos neutrófilos e a destruição dos parasitas internalizados. Utilizando anticorpos específicos para neutrófilos, observamos o aumento significativo no número de parasitas em animais depletados de neutrófilos. Em paralelo, o contato dos neutrófilos com L. braziliensis levou à secreção de quimiocinas, capazes de induzir o recrutamento de células dendríticas. Os neutrófilos, portanto, desempenham um papel importante no combate ao parasita no período inicial da infecção por L. braziliensis. / L. braziliensis is the main etiological agent of American Cutaneous Leishmaniasis, a disease that deserves further attention due to the high detection rate and ability to produce deformities. The neutrophil is considered the first line of defense against infectious agents or foreign substances and their rapid recruitment into tissues is critical for the innate immune system. In a murine model of infection with L. braziliensis, we showed a constant recruitment of neutrophils to the site of infection. Based on this finding, we hypothesized that neutrophil may a play an important role during the initial stages of L. braziliensis infection. Experiments were conducted used thyoglycolate-recruited and bone marrow-derived neutrophils. We initially observed that neutrophils are readily infected by fresh serum-opsonized parasites. Neutrophil upon L. braziliensis interaction, neutrophil became activated, increasing the expression of CD18 and decreasing the expression of CD62L. This activation led to the production of superoxide, neutrophil elastase secretion and release of TNF-a. Neutrophil infection with L. braziliensis did not prevented neutrophil apoptosis or destruction of internalized parasites. Using a neutrophil depleting antibody, we detected a significant increase in parasites numbers in neutrophil-depleted mice. In parallel, the contact of neutrophils with L. braziliensis led to secretion of chemokines, able to induce the recruitment of dendritic cells. Therefore, we can conclude that neutrophils play an important role in combating parasite during initial infection by L. braziliensis

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-07T17:54:24Z No. of bitstreams: 1 Romulo Carvalho Santiago A relação arginase-óxido nítrico na infecção experimental...pdf: 2942021 bytes, checksum: 81ffaf4770b56567bb2217f9add6a63b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-07T17:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Romulo Carvalho Santiago A relação arginase-óxido nítrico na infecção experimental...pdf: 2942021 bytes, checksum: 81ffaf4770b56567bb2217f9add6a63b (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A arginase é uma importante enzima envolvida no processo de desintoxicação, eliminando amônia via ciclo da ureia, hidrolisando a L-arginina à L-ornitina e ureia. L-ornitina pode ser metabolizada pela ornitina descarboxilase (ODC), dando origem a poliaminas, que são importantes para divisão e proliferação celular. A L. major usa esta via metabólica para proliferar dentro do macrófago durante a infecção. Por outro lado, a óxido nítrico sintase (NOS) oxida a L-arginina à citrulina e óxido nítrico, participando, desta forma, da eliminação do parasita. Estas enzimas podem ser moduladas na presença de citocinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre arginase e óxido nítrico durante a infecção experimental causada por L. braziliensis. No modelo cutâneo de infecção por L. braziliensis, camundongos BALB/c desenvolvem uma lesão que cura espontaneamente na décima semana após infecção. Os parasitas, no entanto, persistem no linfonodo de drenagem (LNd) até 6 meses após a infecção. Camundongos BALB/c foram infectados com L. braziliensis, na derme da orelha, e o desenvolvimento da lesão, a carga parasitária, a atividade da arginase e a produção de óxido nítrico (NO) foram avaliados, assim como a produção de citocinas. A atividade da arginase na orelha aumenta com o desenvolvimento da lesão e diminui com a cura da mesma. No LNd, a atividade da arginase foi detectada junto com a persistência do parasita. A presença de NO na orelha foi maior no pico de desenvolvimento da lesão, acompanhando a presença de IFN-g, no LNd. Com a cura da clínica, houve redução dos níveis de NO na orelha, acompanhado de aumento na produção de TGF-b no LNd. A inibição da arginase, utilizando Nor-NOHA, reduziu significativamente o tamanho da lesão e a carga parasitária na orelha e no LNd. Curiosamente, este efeito foi associado a uma maior produção de IL-4 e IL-10. Por outro lado, a suplementação com L-arginina, o substrato comum para as enzimas iNOS e arginase exacerbou o tamanho da lesão e elevou a carga parasitária. Nossos dados sugerem que a arginase está envolvida com a multiplicação de L. braziliensis, causando a lesão na orelha e, posteriormente, está envolvida com a persistência do parasita no LNd. / Arginase is an important enzyme involved in the detoxification process, eliminating ammonia via the urea cycle, hydrolyzing L-arginine to L-ornithine and urea. L-ornithine can be metabolized by ornithine decarboxylase (ODC) to give polyamines, which are important for cellular division and proliferation. It has been demonstrated that L. major uses this pathway to proliferate within macrophages during infection. On the other hand, nitric oxide synthase (iNOS) oxidizes L-arginine to citrulline and nitric oxide, participating in the elimination of parasites. These enzymes can be modulated in presence of cytokines. The aim of this work was to study the relationship between arginase and nitric oxide during the experimental infection caused by L. braziliensis. In the cutaneous model of infection with L. braziliensis, there is a development of a lesion that heals spontaneously in the second month of infection. The parasites, however, persist in draining lymph nodes (dLN) until 6 months after infection. BALB/c mice were infected with L. braziliensis in the ear dermis and the lesion development, parasite load, arginase activity and the nitric oxide (NO) production were evaluated, as well as cytokine production. Arginase activity in the ear increased with lesion development and decreased at the time of lesion healing. In dLNs, arginase activity was detected in parallel to the persisting parasites. The presence of NO in the ear was higher at the peak of lesion development, accompanying the presence of IFN-g in dLNs. With clinical cure, decreased NO levels were detected in the ear parallaled by an increase in the production of TGF-b in the dLNs. The competitive inhibition of arginase, using Nor-NOHA, significantly reduced lesion size and parasite load in the ear and in dLNs. Interestingly, this effect was associated with increased production of IL-4 and IL-10. Furthermore, supplementation with L-arginine, the common substrate for both enzymes, iNOS and arginase, exacerbated lesion size and the parasite load. Our data suggest that arginase is involved with the multiplication of L. braziliensis, causing injury in the ear and it is involved with the persistence of the parasite in the dLN.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-γ. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-α há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago. / The members of the genus Leishmania are responsible for a group of parasitic diseases that vary from self-limited lesions to severe tissue injury. These parasites are obligatory intracellular protozoa that use human macrophages as hosts. Their entry into macrophages occurs through phagocytosis that involves the cytoskeleton, comprised of actin and myosin, to form the phagosomes. Actin and myosin are also involved in other cellular processes including cytokinesis, intracellular trafficking of organelles and vesicles, which may interfere with parasite entry. Previous studies have analyzed the expression, localization and role of both actin and myosin in Leishmania. Their participation in various processes vital to the biology of the parasite suggests new targets for therapeutic intervention. Since myosin is required for intracellular transport, attempts have been made to examine the intracellular localization and expression of Leishmania myosin. Studies have shown the presence of kinase activity of CK2 in various trypanosomes linked to cell growth, morphology and infectivity of macrophages by promastigotes. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the role of myosin, actin and CK2 for infectivity of Leishmania brasiliensis. In addition, the influence of these proteins in cytokine production and microbiocidal activity in human macrophages was investigated. Drug-based inhibition using lipoxin, latrunculin, nocodozole and TBB caused at least a 50% decrease in growth of L. brasiliensis. The CK2 secreted by the parasite was purified from the supernatant of cultures by HPLC and fraction 44 was determined to correspond to this protein. Lipoxin and TBB were shown to inhibit CK2 activity, contrary to latrunculin that increased its activity. Pretreatment of parasites or macrophages with either lipoxin, latrunculin, nocodozole or TBB lead to a ~50% decrease in the association index between L. brasiliensis and macrphages, with or without preactivation with LPS and INF-γ. Latrunculin and TBB increased the NO in non-activated macrophages and parasites did not infect activated macrophages treated with latrunculin. The other drugs all decreased the production of NO. The release of IL-10 was decreased after treatment with all drugs in non-activated macrophages in the presence of parasites and in activated macrophages in the presence of parasites. For the production of TNF-α, there was a significant decrease in activated macrophages by latrunculin, nocodozole and TBB. When macrophages were activated and infected, treatment with lipoxin showed an increase in the production of this cytokine, opposite to the reduction observed with TBB. When evaluating the integrity of actin, all compounds were determined to influence the organization of actin leading to a decrease in the association index. The transfection of the tail of myosin Va fused to eGFP into macrophages was observed to decrease the association index by 94%. The data confirm the importance of CK2, actin and myosin Va in the process of interactions between parasites and macrophages.

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-&#945;. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco. / The leishmaniases are among the most important endemic diseases in Brazil and are among the most neglected diseases in the world. The therapeutic tools available is restricted, toxic, expensive and ineffective in some situations, due to the emergence of resistant strains of the parasite. Are reported annually in Brazil more than 20.000 cases of cutaneous leishmaniasis and Leishmania braziliensis is the main species causing clinical forms of skin and mucosa. Therefore become important studies that lead to the development of new therapies. The aim of this study was to evaluate the activity of pterocarpanoquinona LQB118 called on Leishmania braziliensis in vitro and in vivo using hamsters as an experimental model. The antiparasitic effect was evaluated on the in vitro growth of promastigotes and on intracellular amastigotes in mouse peritoneal macrophages. To assess the mode of action in vitro was investigated using the induction of apoptosis by TUNEL labeling and Annexin V-FITC. The effect on the modulation of murine macrophage activation was assessed by measuring levels of nitric oxide (Griess reagent) and IL-12, TNF-alpha and IL-10 (ELISA) in supernatants of macrophages. In vivo therapeutic activity of LQB 118 was studied in groups of hamsters infected with L.braziliensis the paw treated with intralesional routes by LQB118 (100M/3x/semana) or oral (0.5 mg/5x/semana) after 7 days after infection for eight weeks. The therapeutic action was analyzed using the size of the lesion. The immune response was evaluated during treatment, the response of delayed hypersensitivity (DTH) to the total antigen of L. braziliensis. The action of LQB118 in vitro was dose-dependent manner in both the promastigote inhibiting 45%, 64.7% and 99.95%, and intracellular amastigotes in 22%, 72% and 81% at concentrations of 5M, 10M and 20M, respectively for both forms evolving. The LQB118 was able to induce the externalization of phosphatidylserine in promastigotes (18.57% of the cells incubated for 24 h in 25.79% of cells treated for 48h) as well promoted the increase of fluorescence in the two evolutive forms of Leishmania compared to controls, demonstrating the induction of DNA fragmentation of the parasite. This substance was also able to modulate the response of macrophages infected for 24 h increased in a dose-dependent IL-12 and NO, TNF-&#945; was kept constant. In vivo, in the seventh week of treatment, we observed a significant reduction in lesion size in animals treated with intralesional LQB 118 (p <0, 001) and in those treated orally (p <0.05) compared with control. These results demonstrate that the activity of anti-Leishmania LQB118 is directly on the parasite by inducing apoptosis, also presenting to modulate the response of macrophages contributes to antileishmanial without changing the morphology of host cells and that the 118 has LQB therapeutic activity in a hamster model and could be an important molecule for the development of a new drug.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-&#947;. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-&#945; há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago. / The members of the genus Leishmania are responsible for a group of parasitic diseases that vary from self-limited lesions to severe tissue injury. These parasites are obligatory intracellular protozoa that use human macrophages as hosts. Their entry into macrophages occurs through phagocytosis that involves the cytoskeleton, comprised of actin and myosin, to form the phagosomes. Actin and myosin are also involved in other cellular processes including cytokinesis, intracellular trafficking of organelles and vesicles, which may interfere with parasite entry. Previous studies have analyzed the expression, localization and role of both actin and myosin in Leishmania. Their participation in various processes vital to the biology of the parasite suggests new targets for therapeutic intervention. Since myosin is required for intracellular transport, attempts have been made to examine the intracellular localization and expression of Leishmania myosin. Studies have shown the presence of kinase activity of CK2 in various trypanosomes linked to cell growth, morphology and infectivity of macrophages by promastigotes. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the role of myosin, actin and CK2 for infectivity of Leishmania brasiliensis. In addition, the influence of these proteins in cytokine production and microbiocidal activity in human macrophages was investigated. Drug-based inhibition using lipoxin, latrunculin, nocodozole and TBB caused at least a 50% decrease in growth of L. brasiliensis. The CK2 secreted by the parasite was purified from the supernatant of cultures by HPLC and fraction 44 was determined to correspond to this protein. Lipoxin and TBB were shown to inhibit CK2 activity, contrary to latrunculin that increased its activity. Pretreatment of parasites or macrophages with either lipoxin, latrunculin, nocodozole or TBB lead to a ~50% decrease in the association index between L. brasiliensis and macrphages, with or without preactivation with LPS and INF-&#947;. Latrunculin and TBB increased the NO in non-activated macrophages and parasites did not infect activated macrophages treated with latrunculin. The other drugs all decreased the production of NO. The release of IL-10 was decreased after treatment with all drugs in non-activated macrophages in the presence of parasites and in activated macrophages in the presence of parasites. For the production of TNF-&#945;, there was a significant decrease in activated macrophages by latrunculin, nocodozole and TBB. When macrophages were activated and infected, treatment with lipoxin showed an increase in the production of this cytokine, opposite to the reduction observed with TBB. When evaluating the integrity of actin, all compounds were determined to influence the organization of actin leading to a decrease in the association index. The transfection of the tail of myosin Va fused to eGFP into macrophages was observed to decrease the association index by 94%. The data confirm the importance of CK2, actin and myosin Va in the process of interactions between parasites and macrophages.

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-&#945;. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco. / The leishmaniases are among the most important endemic diseases in Brazil and are among the most neglected diseases in the world. The therapeutic tools available is restricted, toxic, expensive and ineffective in some situations, due to the emergence of resistant strains of the parasite. Are reported annually in Brazil more than 20.000 cases of cutaneous leishmaniasis and Leishmania braziliensis is the main species causing clinical forms of skin and mucosa. Therefore become important studies that lead to the development of new therapies. The aim of this study was to evaluate the activity of pterocarpanoquinona LQB118 called on Leishmania braziliensis in vitro and in vivo using hamsters as an experimental model. The antiparasitic effect was evaluated on the in vitro growth of promastigotes and on intracellular amastigotes in mouse peritoneal macrophages. To assess the mode of action in vitro was investigated using the induction of apoptosis by TUNEL labeling and Annexin V-FITC. The effect on the modulation of murine macrophage activation was assessed by measuring levels of nitric oxide (Griess reagent) and IL-12, TNF-alpha and IL-10 (ELISA) in supernatants of macrophages. In vivo therapeutic activity of LQB 118 was studied in groups of hamsters infected with L.braziliensis the paw treated with intralesional routes by LQB118 (100M/3x/semana) or oral (0.5 mg/5x/semana) after 7 days after infection for eight weeks. The therapeutic action was analyzed using the size of the lesion. The immune response was evaluated during treatment, the response of delayed hypersensitivity (DTH) to the total antigen of L. braziliensis. The action of LQB118 in vitro was dose-dependent manner in both the promastigote inhibiting 45%, 64.7% and 99.95%, and intracellular amastigotes in 22%, 72% and 81% at concentrations of 5M, 10M and 20M, respectively for both forms evolving. The LQB118 was able to induce the externalization of phosphatidylserine in promastigotes (18.57% of the cells incubated for 24 h in 25.79% of cells treated for 48h) as well promoted the increase of fluorescence in the two evolutive forms of Leishmania compared to controls, demonstrating the induction of DNA fragmentation of the parasite. This substance was also able to modulate the response of macrophages infected for 24 h increased in a dose-dependent IL-12 and NO, TNF-&#945; was kept constant. In vivo, in the seventh week of treatment, we observed a significant reduction in lesion size in animals treated with intralesional LQB 118 (p <0, 001) and in those treated orally (p <0.05) compared with control. These results demonstrate that the activity of anti-Leishmania LQB118 is directly on the parasite by inducing apoptosis, also presenting to modulate the response of macrophages contributes to antileishmanial without changing the morphology of host cells and that the 118 has LQB therapeutic activity in a hamster model and could be an important molecule for the development of a new drug.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Estudos prévios mostraram que o flavonóide quercetina tem ação terapêutica pela via oral em camundongos infectados com L. amazonensis. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do flavonóide quercetina sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário da quercetina foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos e hamsters. O efeito da quercetina sobre macrófagos foi avaliado pela dosagem de óxido nítrico pelo método de Griess nos sobrenadantes das culturas e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular através do H2DCFDA. In vivo a atividade terapêutica da quercetina foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com quercetina pela via oral (2mg/ 5X / semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas.A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A quercetina não apresentou atividade sobre o crescimento de promastigotas em cultura em nenhuma das concentrações testadas. Em amastigotas intracelulares quercetina apresentou ação dose dependente em macrófagos de camundongos e hamsters inibindo 45% e 54% e 25% e 48 %, respectivamente nas concentrações de 50 e 100g/ml após 48h de tratamento. O pré - tratamento dos macrófagos de camundongos e hamsters com quercetina foi capaz de inibir o crescimento de amastigotas intracelulares em 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58% respectivamente, nas concentrações de 25, 50 e 100 g/ml, apresentado ação inibitória significativa em todas as concentrações testadas. Não houve alteração na produção de NO pelos macrófagos, entretanto macrófagos pré tratados com a quercetina por 24 horas antes da infecção apresentaram um aumento significativo na produção de EROs, quando comparados aos controles. Macrófagos tratados antes e depois da infecção, apresentaram diminuição da produção de EROs. In vivo, a quercetina foi capaz de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado ( P< 0,05). Os animais tratados com quercetina apresentaram maior resposta intradérmica aos antígenos de L. braziliensis. Esses dados mostram que a quercetina tem atividade sobre L. braziliensis, inibindo amastigotas intracelulares in vitro e sendo capaz de controlar o tamanho das lesões em hamsters infectados quando administrada pela via oral. / Leishmaniasis are among the most important endemic diseases in Brazil and are among the most neglected diseases in the world. The therapeutic tools available is restricted, toxic, expensive and ineffective in some situations, due to the emergence of resistant strains of the parasite are reported annually in Brazil more than 20.000 cases of cutaneous leishmaniasis. a Leishmania braziliensis is the main species causing clinical forms of skin and mucosa. Previous studies demonstrated therapeutic effect of quercetin flavonoid by oral route in mice infected with L. amazonensis. The aim of this study was to evaluate the activity of quercetina in Leishmania braziliensis in vitro and in vivo using hamsters as experimental model. The antiparasitic effect was evaluated in vitro on the growth of promastigotes and on intracellular amastigotes in mouse and hamsters peritoneal macrophages. The effect on the modulation of murine macrophage activation was assessed by measuring levels of nitric oxide(Griess reagent) and ROS by H2DCFDA. In vivo therapeutic activity of quercetin was studied in groups of hamsters infected with L.braziliensis in the paw, treated with oral routes by quercetin (2mg/ 5X / week) after 7 days of infection for eight weeks. The therapeutic action was analyzed using the size of the lesion. The immune response was evaluated during treatment by the response of delayed hypersensitivity (DTH) to the total antigen of L. braziliensis. Quercetin showed no activity in promastigotes forms in none of the concentration tested. The antiamastigote action is a dose dependent manner, in mice and hamsters macrophages treated for 48 hours inhibiting 45% e 54% and 25% e 48 %, respectively, at concentrations of 50 and 100 g/ml. No inibihition was observed at concentration of 25 g/ml. The pre- treatment of mice and hamsters macrophages inibihited 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58%, respectively at the concentrations of 25, 50 and 100 g/ml the growth of intracellular amastigotes, showing inhibitory effects on all concentrations tested. No production of nitric oxide was observed in macrophages. Pre treated macrophages before infection, shows an increase of ROS, when compared to controls, while macrophages treated before and after infection showed an decrease of ROS production. In vivo, quercetin was able to control de size of lesion since the third week of of treatment, when compared to untreated controls (P< 0,05). These dates show quercetin activity on L. braziliensis, inhibiting amastigote growth in vitro and being able to control lesion size in infected hamster when administred by oral route.

Leishmania braziliensis é o agente responsável pela maior parte dos casos de leishmaniose tegumentar e mucocutânea no Brasil. Entre as espécies incriminadas como vetoras, na região Sudeste encontram-se Nyssomyia intermedia e Nyssomyia neivai. A comprovação destas espécies como responsáveis pela transmissão de Leishmania sp. depende de vários fatores, entre estes, a competência vetorial, definida como a capacidade da espécie se infectar e repassar a infecção para um hospedeiro vertebrado. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo avaliar experimentalmente a competência vetorial de Ny. intermedia e Ny. neivai para transmitir L. braziliensis. Métodos: Fêmeas de primeira geração de ambas as espécies foram alimentadas em hamster infectado com L. braziliensis e após a oviposição, desafiados a um segundo repasto sanguíneo em hamsters susceptíveis (limpos). Adicionalmente, foram obtidos dados do desenvolvimento imaturo das duas espécies. Resultados: em relação ao ciclo imaturo, observou-se que a maior mortalidade ocorreu no primeiro instar larval para ambas as espécies, 27,6% para Ny. intermedia e 53,9% para Ny. neivai. O quarto instar larval teve a maior duração, com mediana de 8 a 12 dias. Quanto à susceptibilidade à infecção das fêmeas colonizadas de ambas as espécies 0,89% das fêmeas de Ny. intermedia e 8,33 % das fêmeas de Ny. neivai apresentaram infecção por L. braziliensis. Nenhuma fêmea de Ny. intermedia realizou um segundo repasto sanguíneo, enquanto que 3 fêmeas de Ny. neivai realizaram. Destas, duas estavam infectadas e o hamster potencialmente infectado ficou em observação por dois meses. Amostras de tecido do hamster exposto demostraram, por meio de PCR, a presença de L. braziliensis. Conclusão: Nyssomyia intermedia apresentou desenvolvimento de formas flageladas porém não repassou a infecção a um hospedeiro suscetível. Nyssomyia neivai, além de se infectar com a L. braziliensis, também repassou a infecção a um hospedeiro suscetível, demostrando assim sua competência vetora. / Leishmania braziliensis is the agent related to cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Brazil. Among the sandflies involved in the Leishmania sp transmission in the Southeast Region, Ny. intermedia and Ny. neivai are suspected vectors. However, the incrimination of these species as vectors in the transmission of Leishmania sp. depends of several factors, including vector competence, defined as the ability of the species to develop the agent and transmit it to a vertebrate host. Objective: The present study aimed to demonstrate the vector competence to Ny. intermedia and Ny. neivai for L. braziliensis. Methods: To develop the experiments,specimens of both species were reared under laboratory conditions and the adults obtained were used to evaluate the vector competence. Thefemales were fed in infected hamsters and after oviposition, challenged to take a bloodmeal in suscetible hamsters (without infection). All females fed on infected hamster were dissected. The hamster bitted in the exposition were follow up for two months, after that, were euthanatized to evaluate the infection by PCR. Result: The highest immature mortality occurred in the first instar larval for both species, 27.6% for Ny. intermedia and 53.9% for Ny. neivai. The fourth larval instar had the longest duration, with a median varying between 8 to 12 days. About the females of Ny intermedia, only 0.89% of them develop the flagellates. For Ny. neivai, among 36 females feed on infected hamster, 2 were infected. None female of Ny intermedia take a second blood meal and 3 of Ny. neivai have had. The hamsters bitted by the infected females were follow up for 60 days. After that the hamster were euthanatized and the infection was observed. Conclusion: The vector competence of Ny. neivai to transmit Leishmania braziiensis was demonstrated. The susceptibility of Ny. intermedia to develop this leishmania was corroborated.

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As chaperonas moleculares da família Hsp70 desempenham funções cruciais nas células de todos os organismos vivos, de procariotos a eucariotos. Nestes, estão presentes em todos os compartimentos celulares e nas mitocôndrias é expressa uma isoforma própria (mtHsp70), que participa dos processos enovelamento e maturação de proteínas bem como de sua importação para a matriz mitocondrial. Diante da crescente demanda de pesquisa sobre doenças tropicais negligenciadas, foi tomado como objeto de estudo neste trabalho uma Hsp70 mitocondrial de Leishmania braziliensis (LbmtHsp70) com o intuito de caracterizá-la estrutural e funcionalmente em comparação à ortóloga humana com maior identidade: a mtHsp70 também chamada de mortalina, GRP75, HspA9 ou PBP74. A LbmtHsp70 foi purificada em sua forma enovelada, em sistema monodisperso apresentando dados hidrodinâmicos condizentes com a forma monomérica, foi testada sua estabilidade quanto à influência de nucleotídeos de adenosina (ATP e ADP) à sua estrutura e, por fim, foram feitos ensaios para avaliar sua atividade ATPásica e de energia de interação com nucleotídeos. De forma geral, a LbmtHsp70 é bastante similar à mortalina, como pode ser evidenciado pelos resultados obtidos com algumas particularidades. / The molecular chaperones from the Hsp70 family perform critical cell roles in all organisms, from prokaryotes to eukaryotes. In the last ones, they are found in all cell compartments and a particular isoform is expressed in the mitochondria, where it carries out folding and maturation processes as well as the import of proteins to the mitochondrial matrix. In face of the growing demand for research about neglected tropical diseases, in this study a Hsp70 from Leishmania braziliensis\'s mitochondria was taken as object of study for further structural and functional characterization in comparison to the human orthologous which presents the highest identity to LbmtHsp70: the mtHsp70 also known as mortalin, GRP75, HspA9 or PB74. LbmtHsp70 was obtained in folded state in monodisperse system with hydrodynamic data consistent to monomeric conformer, stability and adenosine nucleotides influence to its structure were analyzed, and were performed assays for ATPase activity and nucleotide interaction energy. In a general way LbmtHsp70 is very similar to mortalin as can be shown through the results, but with some peculiarities.