Made available in DSpace on 2016-05-11T12:03:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478505-Texto+Completo-0.pdf: 2728715 bytes, checksum: 93bb3d4fcee10a1e8abba33e2e0e8996 (MD5) Previous issue date: 2016 / Introduction: Cutaneous leishmaniasis is caused by Leishmania protozoan and transmitted through the female of Lutzomyia sandflies. The disease can manifest itself in different clinical forms: localized cutaneous leishmaniasis, disseminated cutaneous leishmaniasis, recidivans and diffuse cutaneous leishmaniasis. The North and Northeast (Brazil) are the most affected area by the disease. Pentavalent antimonials and amphotericin B have been the most used drugs for the treatment of this disease but may cause many side effects, which leads the patients to discontinue treatment. Control or progression of the disease has been related to the immune response triggered by the individual. PNP (purine nucleoside phosphorylase) is the key enzyme in the purine salvage route catalyzing the reversible phosphorolysis of purine nucleosides such as deoxyinosine or deoxyguanosine producing their respective bases and deoxyrribose-1-phosphate. The PNP inhibitors can be used for treating diseases caused by disorder mediated by T cells. Immucillin - DI4G (4th generation Immucillin ; 7-((bis(2-hydroxyiethyl)amine)methyl)-1,5-dihydro-4H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-one) is considered as a potent inhibitor of PNP. Objective: development of pre-formulation and formulation studies of a pharmaceutical form for topical use containing Immucillin-DI4G as drug candidate for Cutaneous Leishmaniasis treatment. Material and Methods: Characterization of the compound was performed by NMR, FTIR-ATR and HRMS. The stability of the amorphous powder was evaluated over 90 days using a HPLC method for quantification. Formulations have been developed for stability, rheological and spreadability studies over 30 and 90 days. A method for the quantification of Immucillin-DI4G in the formulation was developed and validated using the HPLC. Results and discussion: The Immucillin - DI4G (amorphous powder) was stable up to 30 days when stored at 4 °C and 25 °C. Formulation 1 (Immucillin - DI4G 1. 1% Carboxyvinylpolymer gel 2%) was stable only when stored at 4 °C for a period of 60 days. Formulation 1 was considered as a non-Newtonian fluid with pseudoplastic behavior and no alterations in viscosity was observed over 90 days. On the other hand, significant changes in spreadability was observed when topical formulation was stored at 45 °C. The formulation containing additives (formulation 2) showed an improvement in stability when stored at 45 °C for a period of 30 days, but there was a significant decrease in drug content when stored at 4 °C and 25 °C. Formulations 3 (Immucillin-DI4G a 1,1% Gel-Cream) and 4 (Immucillin-DI4G 1. 1% in Hydroxypropylcellulose polymer at 2%) presented significant loss in the drug content in 30 days when stored at 45 °C. The results shows that further studies should be conducted in order to analyze the possible degradation products looking for design of novel formulations. / Introdução: A Leishmaniose Cutânea é causada por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas através das fêmeas dos mosquitos do gênero Lutzomyia. A Leishmaniose cutânea pode se manifestar de diferentes formas clínicas: cutânea localizada, cutânea disseminada, recidiva cútis e cutânea difusa. A região Norte e Nordeste são as mais acometidas pela doença. Os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B são os medicamentos mais utilizados para o tratamento desta doença, porém podem causar vários efeitos adversos fazendo com que muitos pacientes abandonem o tratamento. O controle ou a progressão da doença estão diretamente relacionados com a resposta imunológica desencadeada pelo indivíduo. A PNP é a enzima chave na rota de salvamento de purinas, catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos purínicos como deoxinosina e deoxiguanosina formando suas respectivas bases e deoxirribose-1-fosfato. Os inibidores da PNP podem ser utilizados para tratamento de doenças causadas por desordem mediada pelas células T, através da inibição segura e seletiva da proliferação da célula T. O Immucillin-DI4G (Immucillin de 4ª geração; 7-((bis(2-hidroxietil)amino)metil)-1,5-diidro-4H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-4-ona) é considerado como um potente inibidor da PNP. Objetivo: desenvolver estudos de pré-formulação e formulação de uma forma farmacêutica de uso tópico contendo o Immucillin-DI4G como candidato a fármaco para tratamento da Leishmaniose Cutânea. Materiais e Métodos: Foi realizada a caracterização do composto através do RMN, EMS e FTIR-ATR. A estabilidade do pó amorfo foi avaliada durante 90 dias, o doseamento foi realizado através do CLAE. Formulações foram desenvolvidas para o estudo de estabilidade, estudos reológicos e espalhabilidade durante 30 e 90 dias. Um método para o doseamento do fármaco nas formulações foi desenvolvido e validado empregando o método de CLAE. Resultados e discussão: O Immucillin-DI4G (pó amorfo) mostrou-se estável até 30 dias quando armazenado a 4 °C e 25 °C. A formulação 1(Immucillin-DI4G a 1,1% em Gel polímero Carboxivinílico a 2% ) mostrou-se estável apenas quando armazenada a 4 °C por um período de 60 dias; é considerada como um Fluído Não-Newtoniano de comportamento pseudoplástico, sem alterações na viscosidade durante 90 dias, porém com alterações significativas na espalhabilidade quando armazenada a 45 °C. A formulação que continha aditivos (formulação 2) apresentou uma melhora na estabilidade quando armazenada a 45 °C num período de 30 dias, porém apresentou queda significativa no teor do fármaco quando armazenada a 4 °C e 25 °C. As formulações 3 (Immucillin-DI4G a 1,1% em Creme-Gel) e 4 (Immucillin-DI4G a 1,1% em Gel Polímero Hidroxipropilcelulose a 2%) apresentaram perdas significativas no teor do fármaco em 30 dias quando armazenadas a 45 °C. Os resultados demonstram que novos estudos devem ser realizados para a análise de possíveis produtos de degradação, para possíveis ajustes nas formulações.

Orientador: Márcia Rita Fernandes Machado / Banca: Leucio Camara Alves / Banca: Maria Cecília Rui Luvizzoto / Banca: Fábio Luiz da Cunha Brito / Banca: Áureo Evangelista Santana / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma zoonose causada pelo agente Leishmania infantum. O cão se destaca por seu importante papel na cadeia epidemiológica da doença, porquanto é o principal reservatório urbano da infecção, cuja transmissão é dependente de populações de Lutzomyia longipalpis. A enfermidade é multissistêmica e de patogenia complexa, envolvendo diferentes mecanismos imunológicos. A despeito do grande número de estudos sobre a patogenia e lesões que ocorrem na leishmaniose visceral canina, a fisiopatologia da lesão ocular ainda permanece obscura. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de células inflamatórias e de formas amastigotas de L. Infantum pela imuno-histoquímica em olhos de cães experimentalmente infectados via ocular tópica. Constituiu-se um grupo inoculado (GI) composto por sete cães, que receberam a instilação de cultura de Leishmania infantum por via conjuntival, e um grupo controle (GC) composto por três cães, nos quais a instilação tópica foi realizada com solução salina. Após 60 dias, os tecidos oculares foram analisados utilizando-se as técnicas de coloração em Hematoxilina e Eosina (HE) e a reação de imuno-histoquímica pela streptoavidina-peroxidase. A análise histopatológica revelou uma resposta inflamatória com predomínio de plasmócitos e linfócitos, perivasculite, congestão vascular e hiperplasia das células caliciformes em conjuntiva. As glândulas lacrimais da terceira pálpebra apresentaram infiltrado inflamatório com atrofia focal e desorganização do estroma. Formas amastigotas de L. infantum foram observadas através da detecção imuno-histoquímica em 100% das amostras do grupo infectado / Abstract: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is an infection caused by Leishmania infantum agent. The dog stands out for its important role in the epidemiology of the disease, since it is the main urban reservoir of infection, whose transmission is dependent on populations of Lutzomyia longipalpis. The disease is multisystemic and complex pathogenesis, involving different immunological mechanisms. Despite the large number of studies regarding the pathogenesis and lesions that occur in canine leishmaniasis, the pathophysiology of a ocular lesion still remains obscure. The goal of this study was to evaluate the inflammatory cells and immunohistochemical detection of L. infantum in eyes from dogs experimentally infected by topical ocular infection. Constituted an inoculated group (IG), composed of seven dogs that received instillation of culture of Leishmania infantum by conjunctival route, and a control group (CG) composed of three dogs, in which the topical instillation was performed with saline. After 60 days, the ocular tissues were analyzed using the techniques of staining in hematoxylin and eosin (HE) and immunohistochemical reaction for streptoavidin-peroxidase. Histopathological analysis revealed an inflammatory response characterized by the presence of plasma cells, lymphocytes, congestion, perivasculitis and hyperplasia of the goblet cells in conjuctiva. In the lachrymal gland of the third eyelid were observed inflammatory response with focal atrophy and stromal disorganization. Amastigotes forms of L. infantum were observed by immunohistochemical detection in 100% of samples from infected group / Doutor

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Cáris Maronis Nunes / Banca: Vânia Luiza Deperon Bonato Martins / Resumo: O presente estudo investiga in vitro a ação leishmanicida do imunomodulador fosfolinoleato-palmitoleato de magnésio e amônio proteico (PMAPA) e sua ação citotóxica em células mononucleares, e in vivo seu efeito imunomodulador em cães naturalmente infectados por Leishmania spp. Para avaliar a viabilidade celular após a ação do P-MAPA utilizou-se o ensaio colorimétrico com (3 - (4,5-dimetil-2-il) -2,5-difenil tetrazolium brometo (MTT), onde células mononucleares derivadas de sangue periférico foram cultivadas com diferentes concentrações de P- MAPA; 0, 50, 100 e 200 μg/mL em ambiente úmido a 37°C, com 5% de CO2 por 72 horas. A ação leishmanicida do imunomodulador foi avaliada pelo mesmo método utilizando-se a forma promastigosta de Leishmania (L.) chagasi. Para avaliar a ação terapêutica do PMAPA, vinte cães sem raça definida, com sintomas clínicos compatíveis com leishmaniose e positivos na detecção de anticorpos anti-leishmania pelo método ELISA, foram tratados. Dez cães receberam 15 doses do imunomodulador (2,0 mg/kg), por via intramuscular, e dez receberam solução fisiológica como placebo. Os grupos foram acompanhados para observação da remissão de sinais clínicos, no grupo tratado e controle foram colhidas amostras de pele antes e após a administração do imunomodulador para quantificação da carga parasitária, ao final do tratamento amostras de sangue periférico foram utilizadas para o isolamento de mononucleares e investigação do perfil linfocitário do tipo T e produção das citocinas IL-10, IFN-gama e IL-2 em sobrenadante de cultura celular. A quantificação da carga parasitária nas amostras de pele foi realizada pelo método da PCR em tempo real. O perfil linfocitário do tipo T foi realizado por citometria de fluxo, e a quantificação das citocinas em sobrenadante de cultura... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study investigates the in vitro leishmanicidal action of the immunomodulator-phospholinoleate palmitoleato magnesium and ammonium protein (P-MAPA) together with its cytotoxic action in mononuclear cells. It also investigates, in vivo, its immunomodulatory effect in dogs naturally infected by Leishmania spp. To assess cell viability after the action of P-MAPA, the colorimetric assay with (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) was used. There mononuclear cells derived from peripheral blood and were cultured with different concentrations of P-MAPA, 0, 50, 100 and 200 μg/mL in a humid environment at 37 ° C with 5% CO2 for 72 hours. The leishmanicidal action of immunomodulators was evaluated using the same method to form promastigosta of Leishmania (L.) chagasi. To assess the therapeutic action of P-MAPA, twenty mongrel dogs, with clinical symptoms compatible with leishmaniasis and positive detection of anti-leishmania antibodies by ELISA assay were treated. Ten dogs received 15 doses of the immunomodulator (2.0 mg / kg) intramuscularly, and ten received saline solution as placebo. The groups were followed for observation of clinical signs of remission; in the both groups, skin samples were collected before and after administration of the immunomodulator to quantify the parasite load. At the end of treatment, peripheral blood samples were used for the isolation of mononuclears, the profile investigation of type T lymphocytes, together with the production of IL-10, IFN-gamma and IL-2 cytokines in cell culture supernatant. The quantification of parasite load in the samples was performed by PCR in real time. The profile of type T lymphocytes was performed by flow cytometry, and quantification of cytokines in culture supernatants by ELISA capture... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Sônia Regina Verde da Silva / Resumo: A leishmaniose visceral canina é uma zoonose considerada endêmica em algumas regiões do estado de São Paulo e outras localidades do país. Apesar de ser uma enfermidade sistêmica, no cão, os principais sinais clínicos são dermatológicos. Foram avaliados trinta cães com diagnóstico de leishmaniose pelos exames parasitológico e sorológico, divididos em dois grupos: grupo A com descamação cutânea e grupo B com ulceração cutânea. Os padrões histopatológicos encontrados nos animais pertencentes ao grupo A foram de dermatite perianexial (33,3%), perivascular superficial (6,6%), nodular (6,6%), e as mistas (53,3%), sendo, intersticial/perianexial (12,5%), liquenóide/perivascular superficial e profunda (12,5%), perivascular superficial e profunda/perianexial (12,5%) e perivascular superficial/perianexial (62,5%). Os cães do grupo B apresentaram quadros histopatológicos compatíveis com dermatite perivascular superficial e profunda (33,3%), difusa (20%), perianexial (13,3%), nodular (6,6%), e as mistas (26,6%), representadas por intersticial/perivascular superficial e profunda (25%), nodular/perianexial (25%), fibrosante/perianexial (25%) e perivascular superficial e profunda/perianexial (25%). A presença de formas amastigotas foi observada em 8 (53%) cães com descamação e 7 (47%) com ulceração. A presença de linfócitos T CD3+ foi maior em relação aos linfócitos B CD79a +, tanto nas lesões descamativas como nas ulcerativas (69,5/8,8 e 66,1/14,5, respectivamente). Houve diferença estatística entre a população de células CD3+ e CD79a+ dentro do mesmo padrão dermatológico, o mesmo ocorreu quando se comparou a população de células CD79a+ entre os padrões descamativos e ulcerativos (p<0,05). / Abstract: Canine leishmaniasis is an endemic zoonoses, in some São Paulo state regions and other Brazilian cities. Even though it is a systemic disease, in the dog, the main clinical sign is dermatological. Thirty dogs with positive results in serology and parasitological exam for leishmaniasis, were evaluated. They were divided in two groups, one with exfoliative lesions and other with cutaneous ulcers. Histopathological patterns in the first group were: periadnexial dermatitis (33.3%), superficial perivascular (6.6%), nodular (6.6%) and mixeds (53.3%), intersticial/periadnexial (12.5%), lichenoid/perivascular superficial and deep (12.5%), perivascular superficial and deep/periadnexial (12.5%) and superficial perivascular/periadnexial (62.5%). In the ulcerative pattern, the histopathological patterns were: perivascular superficial and deep dermatitis (33.3%), diffuse dermatitis (20%), periadnexial dermatitis (13.3%), nodular dermatitis (6.6%) and mixed dermatitis (26.6%), including intersticial/ perivascular superficial and deep (25%), nodular/periadnexial (25%), fibrosing/perianexial (25%) and perivascular superficial and deep/periadnexial. Parasites were found in 8 dogs (53%) with exfoliative pattern and 7 dogs (47%) with ulcerative pattern. CD3 positive cells (T lymphocytes) were predominant than CD79a positive cells (B lymphocytes), in both dermatological patterns of lesions (69,5/8,8 e 66,1/14,5, respectively). There was no statistical difference between CD3 positive and CD79a cell population concerning exfoliative and ulcerative patterns. There was statistical difference between CD3+ cells and CD79a+ cells, when the same dermatological pattern was considered. The same was observed when compared CD79a+ cells in exfoliative and ulcerative patterns (p<0,05). / Mestre

Orientador: Sonia R. V. da Silva Franco / Resumo:A identificação do agente etiológico da leishmaniose visceral canina (LVC) em tecido cutâneo é importante ferramenta para o controle desta enfermidade. Foram colhidas amostras da cútis, clinicamente sem lesão, de 30 cães pertencentes à área endêmica e com diagnóstico positivo para leishmaniose visceral, com o objetivo de determinar se há uma região preferencial para a realização da biópsia cutânea para o diagnóstico da doença, relacionando esses achados aos aspectos clínicos. Fragmentos cutâneos foram colhidos de seis regiões distintas: plano nasal, pavilhão auricular, toráx, abdome, membro anterior e transição mucocutânea. Foi realizada a técnica de imunoistoquímica em todas as amostras cutâneas e posteriormente, empregou-se a técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) somente nas amostras que apresentaram resultados negativos à primeira técnica. Os sinais clínicos mais freqüentemente observados nos cães foram emagrecimento (95%), seguido de linfoadenomegalia (55%) e mucosas pálidas (30%). As alterações dermatológicas mais freqüentes foram alopecia e descamação cutânea (90%), seguidas de dermatite ulcerativa (60%), onicogrifose (50%) e hiperpigmentação (40%). A imunoistoquímica revelou resultado positivo em 100% das amostras cutâneas, independente da região dos cães sintomáticos que apresentaram quadro dermatológico. Já nos cães que não apresentaram manifestações dermatológicas, a porcentagem de positividade foi menor, 40% e 30%, dependendo da região e nos animais assintomáticos a positividade foi de 30% e 20%. Todas as regiões avaliadas nos cães com diagnóstico negativo apresentaram resultado negativo a imunoistoquímica. A PCR apresentou maior positividade quando comparada com a imunoistoquímica (P< 0,05) para a região de membro anterior dos cães sintomáticos sem alterações cutâneas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The identification of Leishmania spp. in the skin is an important tool for the canine visceral leishmaniasis (CVL) control. The aim of this study was to investigate which would be a better clinically normal skin region to perform skin biopsies for the diagnosis of the naturally Leishmania-infected dogs and to associate this finds to clinical signs. Thirty dogs from an endemic visceral leishmaniasis area and positive diagnose for CVL were selected for the study. Five asymptomatics dogs, negative for Leishmania were included as a fourth group. Clinically normal skin samples were collected from the six different sites by punch biopsy: upper part of the muzzle, ear, thorax, abdomen, forelimb and mucocutaneous junction. Immunohistochemistry detection of Leishmania was performed in all skin biopsy specimens and polymerase chain reaction (PCR) was performed in samples that were Leishmania-negative by immunohistochemistry. Weight loss (95%), lymphadenomegaly (55%) and pale mucous membrane (30%) were the main clinical signs observed. The most frequent skin abnormalities were alopecia and desquamation (90%), ulcerative dermatitis (60%), onychogryphosis (50%) and hyperpigmentation (40%). The immunohistochemistry demonstrated 100% of positivity in all skin samples of symptomatics dogs with skin lesions, independing on the region. Symptomatics dogs without skin lesions showed a lower positivity percentage, 40% and 30% depending on the region and asymptomatics dogs showed 30% and 20%. All regions from group 4 showed negative results. PCR showed positivity rates higher when compared to immunohistochemistry (P< 0,05) for the forelimb region from symptomatics dogs without skin lesions. These findings demonstrated that clinically normal skin of dogs from endemic area have parasites independently of clinical signs. / Mestre

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: Helio Langoni / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Antonio Carlos Paes / Resumo: Devido à proximidade filogenética entre Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi (T. cruzi), podem ocorrer reações cruzadas e resultados falso-positivos à sorologia. O objetivo do presente estudo foi contribuir com o diagnóstico elucidativo da leishmaniose e da tripanossomíase caninas, utilizando a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), o exame parasitológico direto e a pesquisa de DNA, tanto de Leishmania spp., quanto de T.cruzi, pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em amostras de fígado e baço. Para tanto, foram utilizados 100 cães eutanasiados no Centro de Controle de Zoonoses da cidade de Bauru-SP, onde a leishmaniose visceral é endêmica, e 100 cães eutanasiados no canil municipal da cidade de Botucatu-SP, área indene. Sessenta e cinco amostras de soros dos cães de Bauru foram positivas pela RIFI para Leishmania spp. e 40 foram positivas para T.cruzi, enquanto que todas as 100 amostras de cães de Botucatu foram negativas pela RIFI para leishmaniose e somente quatro amostras foram positivas para T. cruzi. Do total de 200 soros testados, 33 (16,5%) apresentaram resultado positivo à sorologia para ambos parasitos. Em 30 amostras de fígado e/ou de baço dos 33 cães que apresentavam anticorpos contra Leishmania spp. e T.cruzi, tanto o exame parasitológico direto como a PCR para Leishmania spp. resultaram positivos, indicando a verdadeira infecção por este parasito. Nenhuma amostra de fígado e baço dos 200 cães de Bauru e Botucatu foi positiva pela PCR para T. cruzi. Estes resultados reforçam a ocorrência de reações cruzadas entre Leishmania spp. e T. cruzi pela RIFI, bem como a necessidade da realização do exame parasitológico direto e/ou da PCR para o diagnóstico elucidativo da leishmaniose e das tripanossomíases caninas. / Abstract: Due Leishmania spp. and Trypanosoma cruzi (T. cruzi) phylogenetical closely, some serological cross-reactions and false-positives results can occur. The objective of this study was to contribute with the elucidative canine leishmaniasis and trypanossomiasis' diagnosis, using Indirect Immunofluorescence (IIF) serologic test, direct parasitological exam and Leishmania spp. and T.cruzi DNA investigation by Polimerase Chain Reaction (PCR) in liver and spleen samples. For this purpose, it were used 100 culled dogs of Zoonosis Control Center in Bauru-SP where Visceral Leishmaniasis (VL) is endemic, and 100 culled dogs of the municipality kennel in Botucatu-SP where VL is non-endemic. Sixty-five (65%) serum samples of dogs from Bauru were positive by IFI for Leishmania spp. and 40 (40%) were positive for T. cruzi. All serum samples (100%) of dogs from Botucatu were negative by IFI for leishmaniasis and only 4 samples were positive for T. cruzi. Of a total of 200 tested serum samples, 33 (16.5%) showed serologic positive results for both parasites. In 30 liver and/or spleen samples of 33 dogs that presented antibodies anti-Leishmania spp. and anti-T.cruzi, both direct parasitological exam and PCR for Leishmania spp. resulted positive, indicating the true dog's infection by this parasite. No liver and spleen samples of 200 dogs from Bauru and Botucatu were positive by PCR for T. cruzi. These results reinforce the occurrence of antibodies cross reactions for Leishmania spp. and T. cruzi by IFI, and also confirm the necessity of a parasitological exam and/or a PCR test for the canine leishmaniasis and trypanosomiasis elucidative diagnosis. / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2011. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-17T14:52:27Z No. of bitstreams: 1 2012_AdaAmaliaAyalaUrdapilleta_Parcial.pdf: 577695 bytes, checksum: da6d65d141a3fe1334cdfd1c715bf6ab (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-17T14:53:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AdaAmaliaAyalaUrdapilleta_Parcial.pdf: 577695 bytes, checksum: da6d65d141a3fe1334cdfd1c715bf6ab (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-17T14:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AdaAmaliaAyalaUrdapilleta_Parcial.pdf: 577695 bytes, checksum: da6d65d141a3fe1334cdfd1c715bf6ab (MD5) / No Brasil, a Leishmaniose Tegumentar Americana constitui um importante problema de saúde pública. É uma doença de difícil controle com aumento de casos que não respondem ao tratamento. Até o momento, não existe terapêutica ideal para as leishmanioses, contudo os antimoniais pentavalentes têm representado a droga de escolha com cura de 60 a 90%, nos últimos anos. A não resposta ao tratamento é complexa com vários fatores envolvidos tais como, a falha terapêutica vinculada à resposta do hospedeiro e a resistência do parasito as drogas. O objetivo deste estudo foi analisar isolados de L.(L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis obtidos de lesão cutânea de portador de Leishmaniose Cutânea Difusa e Leishmaniose Cutânea Mucosa respectivamente com sucessivas falhas terapêuticas, comparados com Leishmanias controles. Os isolados dos pacientes foram estudados em relação a manifestação clínica, a ação de drogas in vitro e a identificação de proteínas. Os testes in vitro foram realizados com formas promastigotas e amatigotas axênicas testadas com antimônio pentavalente, miltefosina, anfotericina B lipossomal, pentoxifilina, itraconazol e alopurinol. As drogas foram distribuídas em placas Elisa de 96 poços em concentrações de 0 até 3000 μg/mL para formas promastigotas e de 0 a 50 μg/mL para formas amastigotas axênicas. A suspensão utilizada foi de 106 para formas promastigotas incubadas por 48 h e de 107 amastigotas/mL incubadas por 24 horas a 37ºC e 5% de CO2 para as formas amastigotas axênicas. Em ambas as formas foi empregado o método colorimétrico, com o Methyl Thiazolyl Blue e a leitura dos testes foi realizada em leitor de placas Elisa (Molecular Devices-Spectra Max, 385 plus - USA) no comprimento de onda de 570nm. As drogas alopurinol e miltefosina apresentaram maior eficácia (p<0,05) frente às formas promastigotas de L.(L.) amazonensis comparadas com o controle. E para as formas amastigotas axênicas da mesma espécie, as drogas anfotericina B lipossomal e miltefosina mostraram redução significativa (p<0,05) do número de parasitos em relação ao controle. Na identificação de proteínas pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência associada a espectrometria de massa, foram identificadas em maior quantidade as proteínas malate dehydrogenase no isolado de L.(L.) amazonensis e as proteínas XIX ATPase alpha subunit Leishmania braziliensis e putative heat shock protein hsp70 Leishmania braziliensis no isolado de L.(V.) braziliensis, indicando possível relação destas proteínas no comportamento da doença. Acredita-se que seja necessária, além da identificação e elevação dos níveis das proteínas, a constatação da super-expressão das mesmas nas populações sensíveis e resistentes das espécies de L.(L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis estudadas para explicar melhor a falha terapêutica dos isolados dos pacientes. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, American cutaneous leishmaniasis is an important public health problem. It is a difficult disease to control with an increase in cases no-response to treatment. At the moment, no exist ideal therapy for leishmaniasis, but the pentavalent antimonials have represented the drug of choice to cure 60-90% in recent years. The non-responsiveness to treatment is complex with many factors involved such as therapeutic failure linked to the host response and parasite resistance to drugs. The objective of this study was analyze isolated from L.(L.) amazonensis and L.(V.) braziliensis obtained from patients with diffuse cutaneous leishmaniasis and cutaneous mucosa leishmaniasis respectively with successive therapeutic failures, compared with controls Leishmanias. The isolates of patients were studied in relation to clinical manifestation, the action of drugs in vitro and identification of proteins. The in vitro tests were performed with promastigotes and axenic amatigotas with pentavalent antimony, miltefosine, liposomal amphotericin B, pentoxifylline, itraconazole and allopurinol. The drugs were distributed in 96-well ELISA plates in concentrations ranging from 0 to 3000 mg/mL for promastigotes and 0-50 mg/mL for axenic amastigotes. The suspension used was 106 to forms promastigotes/mL incubated for 48 h and 107 forms amastigotes/mL incubated for 24 hours at 37°C and 5% CO2. In both forms was used the colorimetric method, with Methyl Thiazolyl Blue and reading test was performed in Elisa plate reader (Molecular Devices, Spectra Max 385 plus - USA) at a wavelength of 570nm. The drug allopurinol and miltefosine showed greater efficacy (p <0.05) compared to the promastigotes of L.(L.) amazonensis compared with control. And for the axenic amastigotes of the same species, the drug miltefosine and liposomal amphotericin B showed a significant reduction (p <0.05) of the parasites number when compared to the control. The identification of proteins by the technique of high performance liquid chromatography combined with mass spectrometry identified in higher quantities the proteins malate dehydrogenase isolated from L.(L.) amazonensis and ATPase alpha subunit Leishmania braziliensis and putative heat shock protein hsp70 in Leishmania braziliensis isolated from L.(V.) braziliensis, indicating a possible relationship of these proteins in disease behavior. It is XXI believed that besides the identification and increased levels of proteins, it is necessary the realization of over-expression of the same in sensitive and resistant populations of the species of L.(L.) amazonensis and L.(V.) braziliensis studied to explain better the treatment failure from patients isolates.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-25T15:49:45Z No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-02T11:12:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-02T11:12:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / A leishmaniose é endêmica em várias partes do mundo, e ainda nos dias atuais a doença permanece um sério problema de saúde pública. A doença tem diferentes formas clínicas, afeta cerca de 12 milhões de pessoas no mundo com um aumento de 1,5 a 2 milhões de novos casos ao ano. A Leishmania amazonensis é uma das espécies causadora da leishmaniose tegumentar americana que pode manifestar a forma cutânea ou difusa dependendo do estado imunológico do indivíduo. A imunidade inata participa da defesa inicial contra o parasita e pode determinar a evolução da doença. Camundongos da linhagem BALB/c são suscetíveis à infecção pela leishmânia desenvolvendo uma forma disseminada que evolui para morte, enquanto que camundongos C57BL/6 possuem características de resistência parcial, desenvolvem lesão, porém exercem controle sobre o crescimento do parasito, evoluindo para a cura. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imune inata dos macrófagos de camundongos suscetíveis e resistentes nas primeiras 24 h de contato do parasita com o fagócito. De 14 camundongos BALB/c e C57BL/6 foram obtidos macrófagos peritoneias para análise do índice de infecção, da capacidade microbicida dos macrófagos dos dois modelos e capacidade de produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio na presença ou ausência da Leishmania amazonensis. Não houve diferença no índice de infecção dos macrófagos dos camundongos dos dois modelos estudados. A capacidade microbicida dos macrófagos obtidos dos camundongos resistentes foi mais efetiva do que a dos macrófagos dos camundongos suscetíveis, sendo que observamos um retardo e um menor crescimento em cultura dos parasitos recuperados dos macrófagos dos animais resistentes, que foram estatisticamente significantes a partir do quarto dia de acompanhamento. Ocorreu produção inicial de óxido nítrico pelos macrófagos peritoneais dos camundongos suscetíveis à infecção na presença de L. amazonensis, entretanto, estes animais não conseguiram manter a produção deste radical após 24 h em cultura, ocorrendo uma modulação negativa da produção deste radical na presença da leishmânia. Enquanto a produção do NO pelos macrófagos dos animais resistentes aumentou progressivamente e manteve-se 24 horas após. A produção do peróxido de hidrogênio pelos macrófagos peritoneais dos camundongos C57BL/6 foi maior do que o dos camundongos BALB/c mesmo quando infectados com L. amazonensis. Concluímos que a interação da Leishmania amazonensis com os macrófagos modulou negativamente a produção de óxido nítrico em camundongos suscetíveis, mas não nos camundongos resistentes. Os macrófagos dos camundongos C57BL/6, resistentes à leishmânia, foram capazes de eliminar o parasito mais eficientemente do que os macrófagos da linhagem suscetível BALB/c. A produção precoce mais elevada de H2O2 e a capacidade de manter a resposta de NO por tempo mais prolongado parecem ter sido fatores importantes para a resposta de suscetibilidade ou resistência a Leishmania amazonensis. Nossos dados, portanto, contribuíram para esclarecer alguns mecanismos iniciais envolvidos nas respostas de suscetibilidade ou resistência à infecção pela Leishmania amazonensis. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is endemic in several parts of the world and still remains an important healthy problem. The disease affects about 12 million people worldwide, with an increase of 1.5 to 2 million new cases by year. There are different clinical forms of the disease depending on the host, parasite species, and immunological response to infection. The innate immunity response is responsible by the initial defense against the parasite and may determine the evolution of the disease. BALB/c mice are susceptible to Leishmania infection and show disseminated disease that progress to death, whereas C57BL/6 mice show partial resistance to the disease, develop lesions, but control the growth of the parasite evolving to healing. This work aimed to evaluate the innate immune response of macrophages from susceptible or resistant mice during the first 24h in culture. The macrophage infection rate, the microbicidal activity of macrophages, and the nitric oxide and hydrogen peroxide production by macrophages of 14 BALB/c and 14 C57BL/6 mice were in vitro assessed in presence or absence of Leishmania amazonensis. There was no difference in macrophage infection rate by Leishmania between both models evaluated. The microbicidal capacity of macrophages from resistant mice was more effective than that of macrophages from susceptible animals, which showed statistical difference in the fourth day. Enhanced nitric oxide production by peritoneal macrophages from BALB/c susceptible mice stimulated with L. amazonensis occurred at the beginning of the incubation, but there was a decrease in production after that, showing a downmodulation of nitric oxide production by Leishmania in this mouse model. However, differently, the nitric oxide production by C57BL/6 resistant mice gradually increased until 24 h. The hydrogen peroxide production by peritoneal macrophages from C57BL/6 mice was higher than that of BALB/c mice when infected with L. amazonensis. We conclude that the interaction of macrophages with Leishmania amazonensis dowmodulates nitric oxide production in susceptible but not in resistant mice. Furthermore, macrophages from C57BL6 mice resistant to Leishmania were able to eliminate the parasite more efficiently than macrophages from the susceptible strain BALB/c. The higher early production of H2O2 and the capacity to maintain NO production for a longer period appear to be important factors in the response of susceptibility or resistance to Leishmania amazonensis. Our data therefore may clarify some mechanisms involved in the initial responses of susceptibility or resistance to Leishmania amazonensis infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by mariana castro (nanacastro0107@hotmail.com) on 2009-09-27T22:28:30Z No. of bitstreams: 1 2006_Jorgeth de Oliveira Carneiro da Motta.pdf: 1951933 bytes, checksum: 31efc58a983df0ee9e1fa963950916e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-12T18:24:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Jorgeth de Oliveira Carneiro da Motta.pdf: 1951933 bytes, checksum: 31efc58a983df0ee9e1fa963950916e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-12T18:24:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Jorgeth de Oliveira Carneiro da Motta.pdf: 1951933 bytes, checksum: 31efc58a983df0ee9e1fa963950916e4 (MD5) Previous issue date: 2006 / A leishmaniose tegumentar americana é uma doença infecciosa, não contagiosa, de pele e mucosas, cujo agente etiológico é um protozoário do gênero Leishmania. Esta doença representa um importante problema de saúde pública, com mais de 12 milhões de pessoas acometidas no Mundo. Tem aumentado em incidência, sendo a prevalência no Brasil a mais alta em todo o Novo Mundo. Dentre as cinco regiões brasileiras, o Centro- Oeste figura como a terceira em incidência e a primeira em crescimento da doença. No Distrito Federal, os casos de leishmaniose têm aumentado nos últimos anos, havendo fortes indícios de autoctonia da doença. Apesar do N-metil glucamina já estar sendo usado na leishmaniose por mais de 60 anos e serem bem conhecidos seus efeitos hepato, nefro e cardiotóxicos, ele permanece como a primeira linha de tratamento para esta doença. Este estudo foi realizado com o objetivo de testar uma outra medicação, a anfotericina B lipossomal, num esquema terapêutico curto e com menor risco de toxicidade. Comparou-se a resposta clínica e imunológica, nos pacientes portadores de leishmaniose tegumentar americana, forma localizada, tratados com anfotericina B lipossomal, na dose de 1,5mg/kg/dia, por via endovenosa, durante 5 dias (grupo de estudo) com os pacientes tratados com N-metil glucamina, na dose de 20 mg SbV/kg/dia, por via endovenosa, durante 20 dias (grupo controle). Foram incluídos 35 pacientes sem tratamento prévio ou doenças como diabetes, hepato, nefro ou cardiopatias, alocados de forma randomizada para os dois grupos. Os dois grupos foram considerados homogêneos em relação aos aspectos epidemiológicos e clínicos. O diagnóstico foi confirmado pela positividade de dois ou mais exames parasitológicos e imunológicos em todos os pacientes. Identificou-se as espécies e subgêneros de Leishmania em vinte e uma amostras provenientes de pacientes, havendo predominância da Leishmania (Viannia) braziliensis. Quanto á resposta terapêutica, no grupo tratado com a anfotericina B lipossomal, a taxa de cura foi mais baixa (50%) do que a encontrada no grupo controle. Entretanto, a mesma induziu uma resposta clínica em cerca de 81% dos pacientes em até 90 dias após o tratamento. Além disto, no período de acompanhamento de um ano, nenhum dos pacientes curados com esta medicação apresentou recidiva, mostrando que a mesma é eficaz, mas foi usada, provavelmente, em dose baixa. Sendo segura, com baixa incidência de eventos adversos e alterações laboratoriais. Porém, são necessários estudos usando doses mais altas da anfotericina B lipossomal. Já no grupo tratado com N-metil glucamina, todos tiveram suas lesões cicatrizadas, mas a maioria apresentou eventos adversos e/ou alterações laboratoriais, demonstrando sua elevada toxicidade. Em relação à resposta imunológica, houve diminuição ou negativação dos títulos da imunofluorescência indireta após o tratamento nos dois grupos, indicando uma diminuição dos parasitos com as duas medicações, com conseqüente diminuição ou não produção de anticorpos. Por meio da imunohistoquímica, observou-se aumento do número de células T e macrófagos ativados, número inalterado de linfócitos B e diminuição dos parasitos nas lesões. Houve negativação dos parasitos com o N-metilglucamina em alguns casos, mas isto, não ocorreu com a anfotericina B lipossomal. Sugerindo que ambas as medicações induziram uma resposta no sentido da cicatrização, mas aparentemente o N-metil glucamina foi mais eficaz. Entretanto, mais estudos, com número maior de casos, são necessários para uma conclusão definitiva sobre a resposta clínica e imunológica induzida pela anfotericina B lipossomal em pacientes portadores de LTA forma cutânea localizada. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / American Cutaneous Leishmaniasis is a non-contagious, infectious disease of skin and mucosa, whose aetiologic agent is a protozoa of the genus Leishmania. This disease represents an important public health problem, affecting more than 12 million people worldwide. It has increased in incidence, with the highest prevalence occurring in Brazil around the New World. The Center-West region, one of the five regions of Brazil, is the third in incidence and first in growing of the disease. Cases of Leishmaniasis have increased in the last years at Distrito Federal, with strong suspicion of autoctony of the disease. Despite of the usage of N-metil glucamine for Leishmaniasis for more than 60 years and its liver, nephron and cardiotoxicity has been already well known it still remains as the first line drug for the treatment of this disease. This study was performed with the aim at testing a new medication, Liposomal Amphotericin B, at a short therapeutic scheme with low risk of toxicity. The clinical and immunological response was compared in patients with a localized form of American Cutaneous Leishmaniasis treated with Liposomal Amphotericin B in a dose of 1,5 mg/kg/day by endovenous via for 5 days (study group) with those treated with N-metil glucamine in a dose of 20 mg SbV/mg/day by endovenous via for 20 days (control group). Thirty-five patients were included without previous treatment or diseases such as diabetes, liver, nephron or heart pathologies that were randomily assigned to the two groups. The two groups were considered homogeneous in relation to epidemiological and clinical features. The diagnosis was confirmed by positivity of two or more parasitological and immunological tests in all patients. It was identified species and subgenus of Leishmania in twenty-one samples from patients, with predominance of Leishmania (Viannia) braziliensis. As to therapeutic response, the rate of cure in the group treated with Liposomal Amphotericin B was lower (50%) than that one in the control group. However, it induced a clinical response in approximately 81% of the patients in 90 days after the treatment. Moreover, none of the patients who had cured presented recurrence in one year of following up, showing that this drug is effective, but it was used in a low dose. And, it showed to be safe due to low incidence of side effects and laboratorial alterations. But, studies using higher doses of Liposomal Amphotericin B are necessary. In the group treated with N-metil glucamine, all patients had their lesions healed, but the majority of them presented side effects and/or laboratorial alterations, demonstrating its high toxicity. In relation to immunological response, there was decreasing or negativation of titles of indirect immunofluorescency after treatment in the two groups, showing that there was a decreasing of parasites with both medications, with consequently decreasing or no production of antibodies. Through immunohystochemic test after treatment, it was observed that activated T cells and macrophages increased in number, but the number of B lymphocytes remained the same. Moreover, there was reduction of parasites in the lesions with negativation in a few cases treated with N-metil Glucamine but not with Liposomal Amphotericin B. Suggesting, that both medications caused a healing response but it seems that N-metil Glucamine was more effective. Moreover, other studies, with higher number of cases, are necessary to reach a definite conclusion about clinical and immunological response induced by Liposomal Amphotericin B in patients with localized cutaneous form of American Cutaneous Leishmaniasis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-12-10T16:07:08Z No. of bitstreams: 1 2007_MariannaCarminattiMartinsPapa.PDF: 316803 bytes, checksum: d82df5e83e6990e312f5a5e758fafa82 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-08T00:02:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_MariannaCarminattiMartinsPapa.PDF: 316803 bytes, checksum: d82df5e83e6990e312f5a5e758fafa82 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-08T00:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_MariannaCarminattiMartinsPapa.PDF: 316803 bytes, checksum: d82df5e83e6990e312f5a5e758fafa82 (MD5) Previous issue date: 2007 / A leishmaniose é endêmica em 88 paises e é estimado que mais de 12 milhões de indivíduos são infectados pelas várias espécies do parasita, ocorrendo aproximadamente 1,5 a 2 milhões de casos clínicos por ano da doença no mundo. Os macrófagos são importantes na defesa contra a doença, pela fagocitose e os mecanismos microbicidas intracelulares. Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade fagocitária, a capacidade de produção de peróxido de hidrogênio e a capacidade de produção de fator de necrose tumoral- pelos monócitos de indivíduos com leishmaniose tegumentar americana. A capacidade fagocitária foi avaliada em 18 indivíduos com leishmaniose e 15 indivíduos controles normais utilizando-se Saccharomyces cerevisiae, pelos receptores que reconhecem padrões moleculares de patógenos e pelos receptores que reconhecem opsoninas. A produção de peróxido de hidrogênio foi avaliada pela técnica de oxidação do vermelho fenol na presença de peroxidase, e a avaliação da produção de fator de necrose tumoral- foi realizada pela técnica de ELISA no sobrenadante das culturas dos monócitos. A capacidade fagocitária dos monócitos dos indivíduos com leishmaniose tegumentar americana foi menor do que a dos indivíduos normais, tanto pelos receptores que reconhecem padrões moleculares de patógenos quanto pelos receptores para opsoninas. A menor capacidade fagocitária deveu-se ao menor envolvimento de macrófagos na fagocitose, não havendo alteração no número médio de leveduras fagocitadas, para a fagocitose testada por ambos os tipos de receptores. A produção de peróxido de hidrogênio pelos monócitos dos indivíduos com LTA foi maior do que a do grupo controle, tanto basal quanto após estímulo com LPS e PMA. A produção de fator de necrose tumoral- também foi maior nos indivíduos com leishmaniose. Nossos dados mostraram pela primeira vez que a capacidade fagocitária dos monócitos de indivíduos com LTA é menor do que a dos indivíduos normais, embora a produção de substâncias microbicidas, como radicais de oxigênio e FNT- foi maior do que os valores dos indivíduos normais. É possível que estas alterações das funções dos fagócitos tenham repercussões tanto nos mecanismos de defesa antiparasitária quanto nos mecanismos de imunopatogenia da doença. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis threatens 350 million people in 88 countries and remains a serious public health problem in several parts of the world with more than 12 million infected individuals by some species of the parasite, and about 1,5 million clinical cases by year. Macrophages are important in defense against parasite through phagocytosis and microbicidal mechanisms. This work aimed to evaluate the phagocytosis, hydrogen peroxide and TNF- production by monocytes from leishmaniasis individuals. Phagocytosis was assessed in 18 infected individuals and 15 normal control using Saccharomyces cerevisiae, through pattern recognition receptors and opsonin receptors. The hydrogen peroxide production was assessed by the phenol red oxidation technique. Tumor necrosis factor-a was assessed in the supernatant of monocyte cultures by an immunoassay test. Phagocytosis was decreased in leishmaniasis individuals, through pattern recognition receptors and opsonin receptors. However, hydrogen peroxide and TNF-a production were increased in leishmaniasis individuals. Our data showed for the first time that phagocytic index of monocytes were decreased in leishmaniasis individuals. However, TNF-a production and the microbicidal hydrogen peroxide were increased in these individuals. These data suggest these alterations in monocytes might play a role both in defense against parasites as in pathogenesis of the disease.