O Arroio Dilúvio é um dos principais cursos d’água de Porto Alegre possuindo 17.605m de extensão com a sua nascente localizada na cidade de Viamão e o seu deságue junto ao Lago Guaíba. Ao longo do seu percurso o Arroio Dilúvio recebe diversos dejetos oriundos de esgoto pluvial, doméstico e hospitalar, favorecendo o crescimento de uma população microbiana diversificada, com a possível presença de microrganismos resistentes a antimicrobianos que podem comprometer a qualidade de vida da população. O objetivo do presente estudo foi avaliar a presença de leveduras oportunistas em amostras de água coletadas próximo a hospitais localizados ao longo do Arroio Dilúvio, buscando verificar a presença de fatores de virulência e resistência aos antifúngicos comumente utilizados nos tratamentos de micoses. As coletas ocorreram em três pontos em duas estações do ano. As amostras coletadas foram isoladas e semeadas em diferentes meios de cultura seletivos para leveduras. Para a verificação dos fatores de virulência foram realizados métodos de crescimento a 37C e meios de cultura para atividade de fosfolipase e proteinase. Para a caracterização de resistência, foram realizados métodos de fungigrama e concentração inibitória mínima (CIM) utilizando diferentes antifúngicos. Após os ensaios preliminares foi observado a predominância de leveduras pertencente ao filo Ascomycota. Aproximadamente 25% dos isolados inicialmente selecionados apresentaram um potencial de leveduras oportunista. No ensaio de fungigrama foi observado resistência dos isolados ao fluconazol e voriconazol, enquanto que no CIM ao fluconazol e itraconazol. Somente três isolados apresentaram resistência ao fluconazol em ambos os ensaios. / The Dilúvio Stream is one of the main watercourses in Porto Alegre, with 17.605m large with its headwaters located in the Viamão city and the outlet in the Guaíba lake. Throughout its course the Dilúvio Stream receives a high concentration of waste that comes with the rain, household and hospital sewage, promoting in this way the microbial growth of a diverse population, with the possible presence of microorganisms resistant that can compromise the quality of population life. The aim of this study was to evaluate the presence of opportunistic yeast in water samples collected near hospitals located along the Dilúvio Stream, to verify the presence of virulence factors and resistance to antifungal drugs commonly used in the treatment of fungal infections. Sampling occurred at three points in winter and summer time. The samples were isolated on different selective culture media for yeasts. To verify the virulence factors, the growth at 37°C and activity for phospholipase and proteinase were performed. To characterize the resistance, two methods were performed, the fungigrama and minimum inhibitory concentration (MIC) for different antifungal agents. After preliminary tests the prevalence of yeasts belonging to the phylum Ascomycota was observed. Approximately 25% of the initially selected isolates presented a potential to be opportunistic yeasts. In the fungigrama test was observed a resistance to fluconazole and voriconazole, while in the MIC against fluconazole and itraconazole. Only tree isolates were resistant to fluconazole in both trials.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-06-21T22:17:56Z No. of bitstreams: 1 2012_EugenioMirandaSperandio.pdf: 2322636 bytes, checksum: 95951d212ae63bd9160f3c78dd0440b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-22T11:56:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_EugenioMirandaSperandio.pdf: 2322636 bytes, checksum: 95951d212ae63bd9160f3c78dd0440b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-22T11:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_EugenioMirandaSperandio.pdf: 2322636 bytes, checksum: 95951d212ae63bd9160f3c78dd0440b0 (MD5) / O Cerrado é considerado um patrimônio natural e genético do país tanto pela sua extensão e diversidade como pela variedade de fitofisionomias. No entanto, o conhecimento sobre a distribuição e organização da biodiversidade, principalmente nas comunidades microbianas do Cerrado, é ainda reduzido. Leveduras em plantas do Cerrado são pouco estudadas, sendo estas, nichos em potencial para o desenvolvimento destes microrganismos. O objetivo do presente trabalho foi estudar ocorrência, densidade e diversidade de leveduras associadas a plantas do Cerrado, bem como sua aplicação no controle de doenças de pós-colheita em laranja e pêssego. Foram coletadas folhas e frutos de cinco espécies de plantas nativas do Cerrado em áreas de preservação no Distrito Federal: Anacardium humile, Byrsonima crassifolia, Eugenia dysenterica, Psidium pohlianum e Sabicea brasiliensis. Para isolar leveduras endofíticas, as amostras de folha e fruto foram submetidas à desinfecção superficial, maceradas e a solução obtida foi então pipetada, plaqueada e incubada em meio MYGP a 25 ºC por 4 dias. A mesma metodologia foi empregada para o isolamento de leveduras totais, exceto a etapa de desinfecção superficial. A densidade de leveduras endofíticas e totais foi bastante variável entre as plantas amostradas, variando de 1,4x101 UFC.g-1 a 2,2x102 UFC.g-1. Foram obtidos 322 isolados de leveduras, sendo 39 endofíticos e 283 totais. Os representantes de morfotipos diferentes foram purificados e identificados utilizando metodologia convencional e molecular. Por meio do padrão de bandas obtidos no MSP-PCR, foram agrupados utilizando o programa Bionumerics®. Um representante de cada cluster foi selecionado para teste de antagonismo in vitro e in vivo contra patógenos de pós-colheita. Os isolados de levedura foram pareados com Alternaria sp., Aspergillus niger, A. flavus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Penicillium digitatum, P. italicum, Penicillium sp., Monilinia sp., Rhyzopus sp. Três isolados de leveduras identificados como A. pullulans demonstraram efeito inibitório e foram selecionados para os testes in vivo em pêssegos inoculados com Monilinia sp. e Penicillium sp. e laranjas inoculadas com P. digitatum. O isolado 276 mostrou-se efetiva no controle do bolor verde dos citros, reduziu significativamente a severidade da doença, diferindo estatisticamente da testemunha. Os resultados confirmaram a eficácia de A. pullulans contra P. digitatum e evidencia o potencial dessa levedura no controle do bolor verde dos citros. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Cerrado is considered a natural and genetic heritage of the country both for its size and diversity as the variety of biomes. However, knowledge about the distribution and organization of biodiversity, especially in the microbial communities of the Cerrado is still low. Yeasts in Cerrado plants are little studied, these being potential niches for the development of these microorganisms. The aim of this study was to investigate the occurrence, density and diversity of yeasts associated with plants of the Cerrado, as well as their application in disease control post-harvest orange and peach. We collected leaves and fruits of five species of native plants in Cerrado conservation areas in Distrito Federal: Anacardium humile, Byrsonima crassifolia, Eugenia dysenterica, Psidium pohlianum and Sabicea brasiliensis. To isolate endophytic yeast, fruits and leaves samples were submitted for surface disinfection, macerated and the obtained solution was then pipetted, incubated and plated through MYGP at 25 ° C for 4 days. The same methodology was used for isolation of total yeast, except the step of surface disinfection. The density and total yeast endophytic varied considerably among the sampled plants, ranging from 1.4x101 CFU.g-1 to 2.2x102 CFU g-1. Was obtained 322 yeast isolates, being 39 endophytes and 283 total. The representatives of different morphotypes were purified and identified using conventional and molecular methods. By means of the band pattern obtained in the MSP-PCR, yeasts were grouped using the program Bionumerics®. A representative of each cluster was selected for antagonism test in vitro and in vivo against postharvest pathogens. The yeast isolates were paired with Alternaria sp., Aspergillus niger, A. flavus, Bortytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Penicillium digitatum, P. italicum, Penicillium sp., Monilinia sp., Rhyzopus sp. Three yeast isolates identified as Aureobasidium pullulans that showed inhibitory effect were selected for in vitro and in vivo tests on peaches inoculated with Monilinia sp. and Penicillium sp. and oranges inoculated with P. digitatum. This yeast showed to be effective in controlling green mold of citrus, significantly reduced disease severity, differing from the control. The results confirm the effectiveness of A. pullulans against P. digitatum and showed the potential of this yeast in the control of green mold of citrus.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós–Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-03-11T15:16:39Z No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-03-18T13:36:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-18T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / O fungo dimórfico Paracoccidioides é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma doença adquirida pela inalação de conídios ou fragmentos de micélio que transitam para a fase patogênica, leveduriforme, nos pulmões do hospedeiro. Após a infecção, a sobrevivência do fungo depende da evasão do sistema imune e adaptação ao ambiente hostil do hospedeiro. Macrófagos alveolares são a primeira linha de defesa contra Paracoccidioides e para conter a infecção essas células produzem várias substâncias nocivas como o peróxido de hidrogênio (H2O2) que desencadeia o estresse oxidativo. Para investigar os efeitos que H2O2 causa no proteoma de Paracoccidiodes, foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional (2-DE) para analisar as proteínas diferencialmente expressas durante a resposta inicial (2 h) e tardia (6 h) ao H2O2. A análise 2-DE revelou um total de 179 proteínas/spots diferencialmente expressos (116 spots com expressão aumentada e 63 com expressão diminuída). As proteínas/spots diferencialmente expressas foram submetidas à identificação por meio da espectrometria de massas e submissão da massa monoisotópica dos peptídeos ao banco de dados do NCBI. Todos os spots/proteínas foram identificados com sucesso e agrupados de acordo com a categoria funcional - FunCat2. Resgate, defesa e virulência celular, metabolismo e energia foram as categorias com as maiores freqüências de proteínas/isoformas. Várias enzimas antioxidantes, como catalase, superóxido dismutase, peroxidases e tioredoxinas foram identificadas, bem como outras oxidoredutases que estão provavelmente envolvidas na resposta contra o estresse oxidativo. O perfil metabólico foi caracterizado, verificando-se ativação da via das pentoses fosfato, uma importante fonte geradora de NADPH celular. No intuito de confirmar os dados proteômicos, ensaios confirmatórios de atividade enzimática, citometria de fluxo e análises dos níveis transcricionais e de NADPH foram realizados e se mostraram concordantes com os dados obtidos na análise proteômica. Os resultados sugerem que Paracoccidioides possui um amplo repertório antioxidante, composto por diferentes proteínas que atuam de maneira complementar, que foram capazes de detoxificar as EROs e de minimizar os efeitos causados pelo estresse oxidativo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis, a disease acquired by inhalation of infective airborne conidia or mycelia fragments that transit to the pathogenic yeast phase in the host lungs. Upon infection, fungal survival depends on evasion from the immune system and adaptation to the host environment. Alveolar macrophages are the first defense cells line against Paracoccidioides and aiming to restrict the fungal infection, macrophages produce several harmful substances, such as hydrogen peroxide (H2O2) that triggers oxidative stress. To investigate the effect of H2O2 on the proteome of Paracoccidiodes, we used a large scale 2-DE protein gel electrophoresis approach to analyze differentially expressed proteins that were detected in early (2 h) and in late (6 h) H2O2-treatments. The 2-DE analysis revealed a total 179 spots differentially expressed (116 proteins spots with increased expression and 63 with decreased expression). Differentially expressed proteins were subjected to identification by mass spectrometry and by submi tting the monoisotopic mass of the peptides to the NCBI non reduntand database. All spots were successfully identified and they were grouped according the functional category - FunCat2. Cell rescue, defense and virulence, metabolism and energy were the categories that showed the most number of occurrences of the proteins/isoforms. Several antioxidant enzymes, such as catalase, superoxide dismutase, peroxidases and thioredoxins were identified, as well as others oxidoreductases putatively involved with defense against oxidative stress. A view of the metabolic cell profile depicted an activation of the pentose phosphate pathway, a great source of cellular reducing power in the form of NADPH. Confirmatory assays of enzymatic activity, flow cytometry, transcript levels and NADPH measurements, produced data in agreement with proteomic analysis. The results indicated that Paracoccidioides has several antioxidant systems, including various proteins that complementarlly were able to detoxified ROS and minimized the damage triggered by oxidative stress.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-30T13:31:01Z No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23950574 bytes, checksum: ada26d8276116b5222dad832b831254c (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: on 2013-05-10T13:18:44Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-05-10T13:32:25Z No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23952407 bytes, checksum: 83c151a080c3915cba63eff313a6648b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-16T14:30:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23952407 bytes, checksum: 83c151a080c3915cba63eff313a6648b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-16T14:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23952407 bytes, checksum: 83c151a080c3915cba63eff313a6648b (MD5) / Para a produção economicamente viável de etanol de segunda geração a partir de bagaço de cana são necessários vários avanços tecnológicos em diferentes etapas deste bioprocesso incluindo o melhoramento genético de microrganismos fermentadores. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais usado para tal por ser uma excelente fermentadora e tolerante aos estresses dos grandes processos fermentativos industriais. Dentre os principais açúcares que compõem o bagaço de cana, destaca-se a xilose, uma pentose que pertence à fração hemicelulósica. Todavia, S. cerevisiae só utiliza hexoses na fermentação, não sendo capaz de metabolizar pentoses. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma levedura capaz de fermentar xilose. Inicialmente, foi feito um estudo das características genéticas da linhagem industrial de S. cerevisiae JP1 – microrganismo hospedeiro selecionado como alvo das modificações desejadas (Capítulo 1). Pode-se verificar que a linhagem JP1 é diploide e heterotálica. Mostrou-se também sensível às principais drogas usadas em processo de seleção de recombinantes assim com uma boa eficiência de transformação. Além disso, foi construída uma linhagem auxotrófica para uracila com a dupla deleção do gene URA3. Posteriormente, a linhagem JP1 foi modificada geneticamente para se tornar capaz de fermentar xilose a etanol (Capítulo 2). Foram construídos cassetes de expressão para duas enzimas da via metabólica de xilose - xilose isomerase e xiluloquinase – clonados em vetor epissomal. A linhagem recombinante obtida foi submetida à adaptação metabólica por 48 dias em meio contendo apenas xilose como fonte de carbono, levando a um aumento na taxa de crescimento de 0,008 h-1para 0,13 h-1. Estudos preliminares de fermentação em meio sintético mostrou um acúmulo de xilitol (YX/S = 0,29 g g-1) e baixa produção de etanol (YE/S = 0,27 g g-1). Para incrementar a produção de etanol, um cassete de deleção para o gene GRE3 (aldose redutase) foi desenvolvido. Além disso, consideramos a introdução de um gene codificador para um transportador com afinidade por xilose, visando aumentar o influxo de xilose para a célula. Para tanto, foi iniciada uma análise transcricional da levedura Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 adaptada ao hidrolisado de bagaço de cana a fim de compreender a regulação em diferentes concentraçõesde xilose e glicose, além de selecionar um possível transportador de xilose para ser expresso em S. cerevisiae (Capítulo 3). Dados preliminares indicam que o gene com maior expressão em xilose foi XYL3 e, dentre os transportadores putativos de xilose, XUT1. Esse trabalho representou uma das primeiras iniciativas no País no emprego de abordagens de engenharia metabólica para o desenvolvimento de um bioprocesso em linhagem industrial de S. cerevisiae. No seu conjunto, nossos resultados preliminares mostram que o desenvolvimento da tecnologia nacional para a produção de álcool lignocelulósico utilizando microrganismos modificados geneticamente é plenamente viável. Embora a linhagem obtida nesse estudo não tenha apresentado rendimentos de etanol desejáveis a partir de xilose, foi demonstrada a eficácia das ferramentas moleculares desenvolvidas que poderão ser empregada em futuros estudos. Além disso, comprovamos que as características genéticas da linhagem industrial JP1 a tornam uma interessante plataforma para futuras modificações relacionadas a outros bioprocessos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In order to achieve cost-effective, second-generation ethanol production from sugarcane bagasse, several stages of this bioprocess need to be technologically upgraded, which includes the genetic improvement of fermenting microorganisms. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most employed microbe to this purpose due to its excellent fermentative properties and high tolerance to the stressing conditions of large-scale industrial fermentation. Among the sugars that constitute sugarcane bagasse, xylose, a pentose abundant in the hemicellulosic fraction, is one of the most important. However, S. cerevisiae only uses hexoses in fermentation and is incapable of catabolising pentoses. The main goal of this project was to develop a xylose-fermenting yeast strain. Initially, we made genetic profiled the industrial S. cerevisiae strain JP1, which was to be subjected to the genetic manipulations in the pursuit of our goal (Chapter 1). We assessed that JP1 is diploid and heterothallic. It was also shown to be susceptible to the main drugs used in recombinant derivative selection and to be transformable with good efficiency. Next, we created an uracyl-auxotroph derivative by double-deleting the URA3 gene. Later, the JP1 strain was genetically modified to become able to ferment xylose to ethanol (Chapter 2). We created expression cassettes for two enzymes of the xylose catabolic pathway – xylose isomerase and xylulokinase – cloned into an episomal vector. The recombinant strain was submitted to metabolic adaptation for 48 days in medium with xylose as the sole carbon source, which led to an increase in the growth rate from 0.008 h-1 to 0.13 h-1. Preliminary studies of fermentation in synthetic medium revealed a buildup of xylitol (YX/S= 0,29 g g-1) and low ethanol production (YE/S= 0,27 g g-1) by this strain. In order to increase ethanol production, a deletion cassette for the GRE3 gene (aldose reductase) was developed. In addition, we considered introducing a gene coding for a membrane transporter with affinity for xylose to increase the influx of xylose to cell. To this end, we carried out a transcriptional analysis of the yeast Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 that had been adapted to sugarcane bagasse hydrolysate in order to understand gene regulation under different xylose and glucose concentrations and thus select a putative xylose transporter that could be expressed in S. cerevisiae (Chapter 3). Preliminary data indicate that the most upregulated gene with xylose as carbon source was XYL3 and, among putative xylose transporters, XUT1. The present work was one of the first attempts in the country to use metabolic engineering to develop a bioprocess in an industrial strain of S. cerevisiae. Overall, our preliminary results show that it is fully possible to develop national technology for production of ethanol from lignocellulosic residues using genetically modified microorganisms. Although the strain obtained in the present study did not show the desired ethanol yield from xylose, the molecular tools developed in this work were shown to be effective and validated to be used in future studies. Besides, we showed that the genetic features of the industrial strain JP1 make it interesting for future modifications related to other bioprocesses.

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T15:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_FelipeBastos_M.pdf: 972824 bytes, checksum: a462e688ab46d2def7974c05146d274b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A endo-1,4-ß-xilanase (E.C. 3.2.1.8), comumente chamada de xilanase, possui grande aplicação em diferentes tipos de indústrias tais como a de ração animal, alimentos, têxteis, de papel, de produção de etanol a partir de biomassa, entre outras. Isso se deve ao fato de que esta enzima atua na hidrólise da xilana, o segundo mais abundante polissacarídeo encontrado na natureza, que está presente ligado a hemicelulose da parece celular de plantas. O objetivo deste trabalho foi selecionar, através do método de screening em placas de Petri, e avaliar a atividade enzimática de leveduras silvestres isoladas de diversas regiões do Brasil (Mata Atlântica, Floresta Amazônica, Cerrado e Pantanal) quanto à produção de xilanase. Para o screening em placas, utilizou-se um meio de cultura no qual a única fonte de carbono era a xilana para induzir a produção da enzima. De um total de 349 microrganismos analisados, foram obtidas 84 cepas produtoras, porém somente 37 possuíam um índice de relação enzimática (diâmetro do halo descolorido / diâmetro da colônia) maior que 2,5. Em função deste resultado prosseguiu-se com a seleção dos melhores microrganismos para a produção da enzima em meio líquido. Após observações preliminares apenas 9 cepas obtiveram um crescimento satisfatório em meio líquido a 30ºC e 150 rpm. Estes foram avaliados em dois meios de culturas diferentes em relação à atividade enzimática do caldo enzimático à 50ºC por 5 min em shaker. Dentre estes, os microrganismos AAD5 e AY10 se destacaram por apresentarem a atividade enzimática em torno de 2 µmol/mL.min . Posteriormente, foi realizada a caracterização das enzimas produzidas, sendo que a proveniente do microrganismo AAD5 possui condições ótimas na faixa de 57,5 ¿ 67,5 ºC e pH entre 4,7 ¿ 5,5, além de meia vida de 21,33 horas a 52ºC e pH 5,3, com vmax de 1,77 µmol/mL.min e Km de 0,44 g/L. Já a enzima produzida pela cepa AY10 possui condições ótimas na faixa de pH entre 4,8 ¿ 4,1 à temperatura de 80°C, além de meia vida de 11,21 horas a 72ºC e pH 5,3, com vmax de 5,47 µmol/mL.min e Km de 1,37 g/L. Estes resultados demonstram o potencial de aplicação de leveduras na produção de xilanase, porém, para as cepas estudadas, há a necessidade de purificação das enzimas produzidas para que estas sejam aplicadas industrialmente / Abstract: Endo-1,4-ß-xylanase (E.C. 3.2.1.8), commonly called xylanase, has great application in different types of industries such as feed, food, textiles, paper, ethanol from biomass, among others. These enzymes act in hydrolysis of the xylan, one of the most abundant polysaccharides found in the nature, present in cell plants linked to the hemicelullose. The main goal of this work was to select, through a screening method using Petri dishes, and to evaluate the enzymatic activity of isolated wild yeasts from several brazilian regions (Atlantic Forest, Amazonian Forest, Cerrado and Pantanal) about the production of xylanase. For the screening in Petri dishes, the culture medium used has xylan as the only carbon source to induce the production of the enzyme. From 349 evaluated microorganisms, 84 could produce xylanase, although only 37 showed an enzymatic ration (diameter of the undye halo/diameter of the colony) higher than 2.5. And, after initial assays in submerged method, 9 strains showed a satisfactory growth at 30ºC and 150 rpm. Among them, the microorganisms AAD5 and AY10 presented a higher potential, with the enzymatic activity above 2 µmol/mL.min. The characterization of the produced enzymes was carried out and the one produced by the strain AAD5 has, as optimal conditions, temperature between 57.5 ¿ 67.5 ºC and pH 4.7 ¿ 5.5. Also, it was shown 21.33 hours of half-life at 52ºC and pH 5.3, with vmax of 1.77 µmol/mL.min and Km of 0.44 g/L. The enzyme produced by the strain AY10 has, as optimal conditions, pH between 4.8 ¿ 4.1 and temperature around 80ºC. The half-life of the enzyme was 11.21 hours at 72ºC and pH 5.3, with vmax of 5.47 µmol/mL.min and Km of 1.37 g/L. These results demonstrate the potential application of the yeasts for xylanase production, although, for those enzymes, further works are necessary to establish the actual industrial and technical potentialities / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Utensílios constituídos de material poroso são geralmente empregados na produção do queijo, sendo comum a formação de biofilmes microbianos. Com o intuito de evitar essa adesão microbiana, diferentes categorias de produtos químicos são comumente empregados. Entretanto, poucos estudos avaliam a eficácia de sua ação antibiofilme. A Yarrowia lipolytica é uma levedura constantemente relacionada com alimentos com elevadas proporções de gordura e proteína e já foi detectada em diferentes tipos de queijo, tanto na sua superfície como no seu interior, contribuindo para o processo de maturação do produto ou alterando as propriedades organolépticas. Todavia, há poucos estudos quanto à formação de seu biofilme no processo de produção do queijo, assim como quanto ao seu impacto na qualidade final do produto. Diante disto, o objetivo geral deste estudo foi avaliar a capacidade de formação e remoção do biofilme dos isolados de Y. lipolytica por meio do uso de detergentes e hipoclorito de sódio aplicados em diferentes utensílios e materiais utilizados no processo de fabricação de queijos do tipo colonial. Em todos os corpos de prova houve formação de biofilme pelos isolados de Y. lipolytica testados, com a contagem de células aderentes variando entre 3,95-6,20 log UFC/cm2. Os utensílios e materiais foram submetidos a um processo de higienização, usando as soluções de detergente neutro (3%), detergente alcalino (6%, 8%) e hipoclorito de sódio (1% e 1,5%) no qual o corpo de prova “mangueira” (PVC espiral) foi o material que apresentou uma melhor redução dos isolados de Y. lipolytica com os detergentes e hipoclorito de sódio. No entanto, no corpo de prova “forma” (polipropileno) ocorreu uma menor redução de biofilme se comparamos aos demais corpos de prova. Destacando uma menor eficiência quando utilizado o detergente alcalino (6%) e (8%) nos isolados QU13, QU77 e QU22. Na curva de morte, observou-se que não houve inibição do crescimento em nenhum dos tempos testados para o detergente neutro a 3%. Houve significância nos resultados (p <0,05) ao relacionar todos os ângulos de contato dos isolados estudados. Os índices de emulsificação (E24) variaram entre 49,7 - 88,3% nos isolados de Y. lipolytica demonstrando uma larga produção de bioemulsificante em todos os isolados testados. Os resultados obtidos neste trabalho pode alterar a qualidade do queijo colonial, afetando negativamente o sabor, textura, escurecimento da superfície e contribuir para formação de aminas biogênicas que atuam na decomposição do produto final. / Microbial biofilm formation on utensils made with porous material normally employed in cheese production is common. In order to avoid this microbial adhesion, different categories of chemical products are commonly employed. However, few studies evaluate the effectiveness of its antibiofilm activity. Yarrowia lipolytica is an yeast constantly related to food with high proportions of fat and protein and has been detected in different types of cheese, both on the surface and inside, contributing to the process of product maturation or changing its organoleptic properties. Nevertheless, there are few studies regarding its biofilm formation in cheese production process, as well as regarding its impact on final product quality. Faced with that, the general goal of this study was to evaluate the biofilm formation and removal capacity of isolates of Y. lipolytica using detergents and sodium hypochlorite applied in different utensils and materials used in the process of colonial cheese production. In all specimens there was biofilm formation by the tested isolates of Y. lipolytica, with adherent cell count ranging between 3.95 to 6.20 log UFC/cm2. The utensils and materials were submitted to a sanitization process, using mild detergent (3%), alkaline detergent (6%, 8%) and sodium hypochlorite (1% and 1.5%) solutions, in which the specimen "hose" (PVC spiral) presented the best decrease of Y. lipolytica isolates with the detergents and sodium hypochlorite. However, on the specimen "mold" (Polypropylene) there was lower reduction of biofilm comparing to other specimens. Reduced efficiency when using the alkaline detergent (6%) and (8%) on QU13, QU77 and QU22 isolates can be highlighted. In the Time Kill Assay, no growth inhibition within none of the tested times was detected for the mild detergent (3%). There was significance level in the results (p < 0.05) when relating all contact angles of the studied isolates. The emulsification indexes (E24) in the Y. lipolytica isolates ranged between 49.7% and 88.3% demonstrating a large production of bioemulsificant in all tested isolates. The results found in this work may lead to changes in the quality of the colonial cheese, affecting negatively the taste, texture, darkening the surface and contribute to biogenic amine formation that act on end product decomposition.

Atualmente o óleo microbiano está sendo intensivamente estudado com a intenção de suprir o mercado que o consome, principalmente tendo um grande interesse no emprego como uma fonte alternativa de biocombustível, sendo limpa e renovável. Com o objetivo de otimizar a produção do óleo microbiano, o presente trabalho avaliou a produção de biomassa, lipídeos e composição de ácidos graxos da levedura Candida zeylanoides QU 33 quando cultivada em diferentes fontes de carbono (lactose, glicose, glicerol e xilose), nitrogênio (sulfato de amônio, nitrato de amônio, peptona e extrato de levedura), assim como diferentes condições de cultivo (temperatura, agitação, pH e razão carbono/nitrogênio). Este trabalho também apresenta uma técnica de triagem de acumulo de lipídeo intracelular, com a metodologia do Vermelho de Nilo, na qual as células boas acumuladoras de lipídeo emitiram fluorescência amarelo-ouro. A composição de ácidos graxos do óleo produzido pela C. zeylanoides QU33 quando cultivada em glicose com diferentes fontes de nitrogênio apresentou potencial na utilização como matéria prima tanto para o biodiesel quanto para indústria de alimentos. O uso combinado de glicose com sulfato de amônio pela C. zeylanoides QU33 resultou na produção de óleo com elevado teor de ácidos graxos poli-insaturados. Feita a triagem dos fatores que mais interferiram na produção do óleo microbiano, foi delineado um modelo experimental usando a metodologia de superfície de reposta a fim de otimizar a produção de lipídeo intracelular por esta levedura. / Currently, microbial oil is being intensively studied aiming to suply the consumer market, especially with a great interest in its use as an alternative source of biofuel, clean and renewable. Aiming the optimization of the production of microbial oil, in the present work it was evaluated the production of biomass, lipids and the fatty acid composition of the yeast Candida zeylanoides QU 33 when cultivated with different carbon sources (lactose, glucose, glycerol and xylose), nitrogen (ammonium sulfate, ammonium nitrate, peptone and yeast extract), as well as different culture conditions (temperature, shaking speed, pH and carbon/nitrogen ratio). A new screening methodology for the evaluation of intracellular lipid accumulation is also presented, using Nile Red, in which the cells that are good lipid producers present a golden-yellow fluorescence. The fatty acid composition of the oil produced by C. zeylanoides QU33 cultivated in glucose and different nitrogen sources presented potential for use as raw material for biodiesel production or at the food industry. The combined use of glucose and ammonium sulfate by C. zeylanoides QU33 resulted in the production of oil with elevated levels of polyunsaturated fatty acids. After the evaluation of the factors that mainly interfered in the production of microbial oil, an experimental model was designed using the response surface methodology for optimization of the production of intracellular lipids by this yeast.

A erva-mate (Ilex paraguariensis Saint Hillarie) é uma espécie nativa da região meridional do Brasil, cujas folhas, após o processamento, são utilizadas como bebida pelas populações do Brasil, Argentina, Paraguai, Uruguai e outros países da América do Sul. O objetivo deste trabalho foi verificar a presença de bactérias mesófilas, termófilas, bolores, leveduras e a diversidade de bactérias e leveduras nas amostras in natura e após processamento. Também de verificar a qualidade sanitária na erva-mate já processada. As coletas das amostras foram realizadas de janeiro a junho de 2013, no município de Vargeão, Santa Catarina. Foram utilizados os métodos oficiais de análises de alimentos da Association of Analytical Communities e do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. O termófilo mais encontrado tanto na erva-mate processada quanto nas folhas foi o Bacillus licheniformis. Os mesófilos que predominaram nas folhas foram: Pantoea ananatis, Staphylococcus sciuri e Staphylococcus epidermidis. Já na erva-mate processada os mesófilos mais frequentes foram: Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens e Klebsiella pneumoniae. As principais leveduras identificadas nas folhas foram: Aureobasidium pullulans e Sympodiomycopsis sp. Dois isolados do gênero Sympodiomycopsis foram sequenciados e trata-se de uma nova espécie. Na erva-mate processada as leveduras identificadas foram: Rhodosporidium kratochvilovae, Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomyces nylandii. E verificou-se que todos os parâmetros microbiológicos para a erva-mate processada atenderam tanto à legislação brasileira vigente, como também aos parâmetros estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde. / Yerba mate (Ilex paraguariensis Saint Hillarie) is a native species of the southern region of Brazil, whose leaves, after processing, are mainly used as a beverage by Brazilian, Argentine, Paraguayan and Uruguayan people. The purpose of this work was to verify the presence of thermophilic and mesophilic bacteria, molds and yeasts, and microbial diversity in leaves and in the products ready for the consumption and to determine the sanitary quality in processed yerba mate. The collection of the samples was carried out from January to June 2013, in the city of Vargeão, Santa Catarina, Brazil. Official methods of analysis of foods of the Association of Analytical Communities and of the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply were used. The mainly thermophilic bacteria found in yerba mate and leaves were Bacillus licheniformis. The mesophilic bacteria that predominated in leaves were: Pantoea ananatis, Staphylococcus sciuri and Staphylococcus epidermidis. In yerba mate the most common mesophilic bacteria were: Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens and Klebsiella pneumoniae. The main yeast identified in the leaves were Aureobasidium pullulans and Sympodiomycopsis sp. Two isolates of the genus Sympodiomycopsis were a new species. The yeasts identified in the yerba mate were: Rhodosporidium kratochvilovae, Rhodotorula mucilaginosa and Sporobolomyces nylandii. And it was found that all microbiological parameters for processed yerba mate attended both the current Brazilian legislation, as well as parameters established by the World Health Organization.

O Arroio Dilúvio é um dos principais cursos d’água de Porto Alegre possuindo 17.605m de extensão com a sua nascente localizada na cidade de Viamão e o seu deságue junto ao Lago Guaíba. Ao longo do seu percurso o Arroio Dilúvio recebe diversos dejetos oriundos de esgoto pluvial, doméstico e hospitalar, favorecendo o crescimento de uma população microbiana diversificada, com a possível presença de microrganismos resistentes a antimicrobianos que podem comprometer a qualidade de vida da população. O objetivo do presente estudo foi avaliar a presença de leveduras oportunistas em amostras de água coletadas próximo a hospitais localizados ao longo do Arroio Dilúvio, buscando verificar a presença de fatores de virulência e resistência aos antifúngicos comumente utilizados nos tratamentos de micoses. As coletas ocorreram em três pontos em duas estações do ano. As amostras coletadas foram isoladas e semeadas em diferentes meios de cultura seletivos para leveduras. Para a verificação dos fatores de virulência foram realizados métodos de crescimento a 37C e meios de cultura para atividade de fosfolipase e proteinase. Para a caracterização de resistência, foram realizados métodos de fungigrama e concentração inibitória mínima (CIM) utilizando diferentes antifúngicos. Após os ensaios preliminares foi observado a predominância de leveduras pertencente ao filo Ascomycota. Aproximadamente 25% dos isolados inicialmente selecionados apresentaram um potencial de leveduras oportunista. No ensaio de fungigrama foi observado resistência dos isolados ao fluconazol e voriconazol, enquanto que no CIM ao fluconazol e itraconazol. Somente três isolados apresentaram resistência ao fluconazol em ambos os ensaios. / The Dilúvio Stream is one of the main watercourses in Porto Alegre, with 17.605m large with its headwaters located in the Viamão city and the outlet in the Guaíba lake. Throughout its course the Dilúvio Stream receives a high concentration of waste that comes with the rain, household and hospital sewage, promoting in this way the microbial growth of a diverse population, with the possible presence of microorganisms resistant that can compromise the quality of population life. The aim of this study was to evaluate the presence of opportunistic yeast in water samples collected near hospitals located along the Dilúvio Stream, to verify the presence of virulence factors and resistance to antifungal drugs commonly used in the treatment of fungal infections. Sampling occurred at three points in winter and summer time. The samples were isolated on different selective culture media for yeasts. To verify the virulence factors, the growth at 37°C and activity for phospholipase and proteinase were performed. To characterize the resistance, two methods were performed, the fungigrama and minimum inhibitory concentration (MIC) for different antifungal agents. After preliminary tests the prevalence of yeasts belonging to the phylum Ascomycota was observed. Approximately 25% of the initially selected isolates presented a potential to be opportunistic yeasts. In the fungigrama test was observed a resistance to fluconazole and voriconazole, while in the MIC against fluconazole and itraconazole. Only tree isolates were resistant to fluconazole in both trials.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5106_1.pdf: 3183906 bytes, checksum: 2e940415f50a8b240c639a58645d7142 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A levedura Kluyveromyces marxianus Hansen tem sido apontada como sistema biológico para estudos genéticos e biotecnológicos baseado nas suas vantagens fisiológicas e bioquímicas. Contudo, a ausência de plasmídios naturais e o pouco conhecimento sobre sua genética e comportamento têm sido os principais entraves para estudos mais aplicados. Sua capacidade de utilizar lactose como fonte de carbono possibilita o uso do soro de queijo, atualmente um importante poluente da indústria de laticínios, como matéria-prima para outros processos industriais. Buscou-se, portanto, construir vetores plasmidiais eficientes e compatíveis com a levedura K. marxianus para avaliar a capacidade de linhagens recombinantes utilizarem o soro de queijo como meio de crescimento de baixo custo no processo de expressão de genes de interesse industrial, tais como enzimas extracelulares ou peptídeos antimicrobianos. Este trabalho permitiu verificar que: um método simples e rápido de transformação mediado por acetato de lítio permitiu um aumento da eficiência de transformação de células de K. marxianus em 2,5 vezes em relação ao método convencional; o crescimento de células de leveduras recombinantes transformadas com pDblet ou seus derivados não foi afetado pela alta concentração de lactose no soro de queijo, apresentando perfil de crescimento similar ao de células parentais. Esses dados sugerem a possibilidade do uso de linhagens recombinantes de Kluyveromyces marxianus portadoras de plasmídios baseados no pDblet para processos biotecnológicos a partir do soro de queijo advindo das indústrias de laticínios