Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-04-17T18:40:01Z No. of bitstreams: 1 2016_AntônioMiltonVieiraGomes.pdf: 3388910 bytes, checksum: 28c2639e6dd6374b37ddf0a5c1550cc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-17T21:45:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AntônioMiltonVieiraGomes.pdf: 3388910 bytes, checksum: 28c2639e6dd6374b37ddf0a5c1550cc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T21:45:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AntônioMiltonVieiraGomes.pdf: 3388910 bytes, checksum: 28c2639e6dd6374b37ddf0a5c1550cc5 (MD5) / O ácido hialurônico (AH) é um biopolímero composto de repetições alternadas dos monossacarídeos Ácido Glucurônico e N-Acetil glucosamina, sendo presente em todos os vertebrados e em humanos principalmente na pele. O AH possui aspecto viscoso, ajuda no rejuvenescimento da pele quando aplicado em humanos e é uma molécula considerada segura na utilização em animais em geral, por estes motivos o AH é muito utilizado na indústria farmacêutica e médica. Atualmente o AH é produzido por bactérias, que em diferentes níveis, são patogênicas aos animais, o que dificulta o escalonamento desta tecnologia e eleva os custos de purificação o que torna o AH uma molécula de alto custo financeiro. Leveduras não são capazes de sintetizar AH, mas são fábricas perfeitas para a sua produção, uma vez que são consideradas seguras, mais adaptadas às condições industriais quando comparado a bactérias e possuem parcialmente a via da síntese do ácido AH, sendo capazes de sintetizar um de seus precursores, o açúcar N-Acetil Glucosamina. As enzimas HAS (Hyaluronic Acid Synthases) que sintetizam AH são proteínas que se acoplam à membrana das células formando novas cadeias de AH pela junção dos dois açúcares precursores. Todos os vertebrados possuem HAS semelhantes e classificadas como Classe I, enquanto que a bactéria patogênica Pasteurella multocida, possui uma HAS diferente classificada como classe II. A fim de observar o possível impacto na síntese de AH devido às diferenças entre HAS de classe I de classe II, estes foram inseridos na levedura Klyveromyces lactis concomitante com o gene hasB (UDP-Glicose Desidrogenase). Com o auxílio de um estudo que testou a eficiência de transformação de K. lactis por metodologias de choque térmico e de eletroporação, foram construídas 4 cepas recombinantes de K. lactis contendo as diferentes formas de HAS de modo a aumentar a produção de AH pela levedura. Após a construção das cepas recombinantes, um meio otimizado baseado nas necessidades de co-fatores e metabólitos principais utilizados na via de síntese de AH foi desenvolvido e utilizado nas cinéticas de crescimento de K. lactis. Também testada, a influência das fontes de carbono glicose, sacarose, lactose e galactose foram visualizadas durante o crescimento nas cepas produtoras de AH, uma vez que diferentes fontes de carbono afetam de maneira diferente a glicólise e consequentemente o metabolismo de AH na célula. Lactose e sacarose aumentaram a produção de AH nas células em relação a galactose e glicose devido a um abastecimento mútuo da via de síntese dos dois precursores do AH. Utilizando lactose como fonte de carbono, foi alcançada uma melhor produção de 0,39 g/L de AH, valor competitivo com os alcançados por outra única levedura produtora de AH, o que prova pela primeira vez que K. lactis é uma potencial candidata para otimização da produção deste biopolímero. / Hyaluronic acid (HA) is a biopolymer composed of alternating repeats of monosaccharides Glucuronic Acid and N-Acetyl glucosamine, being present in all vertebrates and humans mainly in the skin. The HA has a viscous appearance, is used in skin rejuvenation when applied in humans and is a safe molecule for application in animals in general, for these reasons HA is widely used in the pharmaceutical and medical industry. Currently, HA is produced by bacteria pathogenic to humans, and are difficult to scale due to technology and purification costs. Yeasts are perfect factories for HA production, since they are considered safe, more adapted to industrial conditions when compared to bacteria and have partially complete the synthesis route of HA, being able to synthesize one precursor, the UDP-N-Acetyl Glucosamine. HA is produced by HAS (Hyaluronic Acid Synthase) enzymes. HAS enzymes have transmembrane domains that couple to the membrane of the cells forming new chains of HA by the junction of the two precursor sugars located in the cytoplasm. All vertebrates have HAS classified as Class I, whereas the pathogenic bacterium Pasteurella multocida have a different HAS (pmHAS) classified as Class II. To observe the impact on HA synthesis due to the differences between Class I and Class II HAS, in this study the hasA genes were inserted into yeast Klyveromyces lactis concomitant with the hasB gene (UDP-Glucose Dehydrogenase). A total of 4 recombinant strains of K. lactis containing different isoforms of HAS were constructed to increase a production of HA by yeast. After the construction of the recombinant strains, an optimized medium to auxiliary the needs of cofactors and metabolites was used in the synthesis pathway of HA for the development and use of K. lactis in fermentations. Also tested, the influence of the sources of carbon glucose, sucrose, lactose and galactose were visualized in fermentation in the HA producing strains, since different carbon sources affect glycolysis differently and consequently the metabolism of HA in the cell. Lactose and sucrose increased HA production in cells relative to galactose and glucose due to a mutual supply of the synthesis pathway of the two HA precursors. Using lactose as a carbon source, it obtained a better yield of 0.39 g / L of HA, a competitive value with the finished results of another single HA -producing yeast, which proves for the first time that K. lactis is a potential candidate for optimization of the production of this biopolymer.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-03T19:51:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-15T14:49:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T14:49:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) Previous issue date: 2017-09-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O aumento do número de cópias do gene heterólogo é uma das abordagens empregadas no melhoramento genético de Komagataella phaffii como sistema de expressão. O uso de marcas auxotróficas defectivas é uma estratégia para a obtenção de integrantes multicópia. Para garantir estabilidade mitótica, os cassetes de expressão são integrados no genoma por recombinação homóloga, portanto é necessário haver no vetor sequências genômicas que propiciem esses eventos de integração. O foco deste trabalho foi identificar sítios repetitivos no genoma de K. phaffii nunca antes testados como alvos de integração, em combinação com o uso da marca defectiva leu2-d, para aumentar a expressão heteróloga. Como alvos para integração múltipla foram avaliados os seguintes loci: rDNA 5S, região NTS do rDNA e regiões repetidas dos cromossomos 2 e 3. Um vetor contendo a marca leu2-d e o gene repórter EGFP (Enhanced Green FluorescentProtein) foi construído e foi usado como plataforma para clonar as diversas sequências repetidas. Todas as construções foram utilizadas para transformar K. phaffii M12 (leu2). A determinação do número de cópias integradas do cassete de expressão confirmou a obtenção de clones multicópia com todas as construções. Até 78 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. Todos os clones multicópiaapresentaram uma maior produção intracelular de GFP em comparação a um clone contendo uma única cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 197 vezes com o clone contendo 78 cópias integradas do cassete. Para validar a estratégia apresentada neste estudo, foi testada a produção extracelular da proteína repórter α-amilase. Clones multicópia foram obtidos com as diferentes construções e até 43 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. A atividade amilolítica no sobrenadante confirmou a produção de amilase, que foi maior para os clones multicópia em comparação a um clone contendo uma cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 4,6 vezes com o clone contendo 43 cópias integradas do cassete. A produção das duas proteínas avaliadas, demonstrou a possibilidade de obter clones multicópia que produzem uma maior quantidade da proteína recombinante. Contudo, foi observada perda de algumas cópias do cassete quando os clones transformantes foram crescidos em meio complexo, indicando baixa estabilidade genética na falta de pressão seletiva. Além disso, dependendo do local de integração, um alto número de cópias mostrou ter um efeito negativo no crescimento da levedura, porém, em nenhum dos casos a produção da proteína heteróloga diminuiu. / Increasing heterologous gene copy number is one of most commonly used strategies to improve Komagataellaphaffii as an expression system. The use of defective auxotrophic markers is an approach to obtain multicopy integrants. Expression cassettes must be integrated into the K. phaffii genome by homologous recombination to ensure mitotic stability. Therefore, it is necessary that the vector carries genomic sequences that will promote integration events. The aim of this work was to identify different sites for the integration of vectors carrying the auxotrophic defective marker leu2-d into the genome in order to increase the expression levels of heterologous genes in K. phaffii. The targets for integration studied were the following loci: 5S rDNA, NTS rDNA and repetitive regions of chromosomes 2 and 3. A vector carrying defective marker leu2-d and the EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) reporter gene was constructed. This vector was used as platform to test repetitive sequences as targets for DNA integration. All constructions were used to transform K. phaffii M12 (leu2). Copy number determination confirmed the generation of multicopy clones with all the constructions. Up to 78 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. All multicopy clones showed more intracellular GFP production compared with a single-copy clone. A 197- fold increase of protein production was observed with the clone containing 78 copies of the cassette. To validate the strategy presented in this study, the expression of the reporter protein α- amylase was evaluated. Multicopy clones were obtained with the diverse constructions. Up to 43 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. Amylolytic activity in culture supernatants confirmed amylase production, which was higher for multicopy clones in comparison with a single-copy clone. A 4.6-fold increase of protein production was observed with the clone containing 43 copies of the cassette. Production of the two proteins tested showed the possibility to obtain multicopy clones which produce a larger quantity of the recombinant protein. Nevertheless, loss of some copies of the expression cassette was observed when transformants were grown in complex medium. This indicated low genetic stability in the absence of selective pressure. Moreover, depending of the integration locus higher copy number showed a negative effect in yeast growth. However, heterologous protein production was not decreased.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:55:25Z No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / O aumento na demanda por fontes de energia alternativa e as preocupações com os impactos ambientais tem incentivado o desenvolvimento de tecnologias para a produção de combustíveis a partir de biomassa lignocelulósica, como o etanol de segunda geração (2G). No entanto um dos açúcares mais abundante nas biomassas lignocelulósicas, a xilose, não pode ser convertida a etanol devido à incapacidade da levedura Saccharomyces cerevisiae, microrganismo mundialmente utilizado na indústria para produção de etanol, de converter eficientemente esse substrato em xilulose. A tecnologia baseada em metabolômica mostra-se eficiente, como uma ferramenta para auxiliar na determinação das etapas limitantes na via metabólica de fermentação da xilose. Neste trabalho, foram desenvolvidos e otimizados dois protocolos para análise de metabolômica targeted, utilizando como plataforma analítica a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) com experimentos de MRM. Os métodos de separação foram baseados na cromatografia por pareamento iônico utilizando uma coluna de fase reversa (HSS-T3) e na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), utilizando uma coluna quimicamente modificada com o grupo amida. Catorze padrões de metabólitos presentes na via de fermentação da xilose puderam ser identificados através de dois métodos complementares. Estes protocolos foram aplicados qualitativamente durante a avaliação de duas leveduras, Scheffersomyces stipitis e Spathaspora passalidarum. O preparo de amostra foi realizado em duas etapas: quenching e extração dos metabólitos. Os métodos de separação e detecção se mostraram promissores para a análise de rotina em processos de fermentação de xilose. / The increase in demand for alternative energy sources and concerns about the environmental impacts has encouraged the development of technologies for the production of fuels from lignocellulosic biomass, such as ethanol from second generation (2G). However one of the most abundant sugars in lignocellulosic biomass, xylose, can not be converted into ethanol due to the inability of yeast Saccharomyces cerevisiae, which is a microorganism used worldwide in the industry for the production of ethanol, to convert this substrate into xylulose efficiently. The technology based on metabolomics proves to be efficient as a tool to identify the crucial steps in the metabolic pathway of xylose fermentation. In this work, we developed and optimized two protocols for targeted metabolomics analysis, using as an analytical platform liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with MRM experiments. Separation methods were based on the ion pairing chromatography using a reverse phase column (HSS-T3) and hydrophilic interaction chromatography (HILIC) with a chemically modified column with amide group. Fourteen patterns of metabolites present in the xylose fermentation pathway could be identified using two complementary methods. These protocols were applied qualitatively during the evaluation of two yeast, Scheffersomyces stipitis and Spathaspora passalidarum. The sample preparation was performed in two stages: quenching and extraction of metabolites. The methods of separation and detection were promising for routine analysis in the xylose fermentation processes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-01-14T16:07:26Z No. of bitstreams: 1 2015_MarcosdeOliveira.pdf: 1836139 bytes, checksum: 68c2be046bbcda4dd5c74438f2d2481e (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-01-22T11:46:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MarcosdeOliveira.pdf: 1836139 bytes, checksum: 68c2be046bbcda4dd5c74438f2d2481e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-22T11:46:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MarcosdeOliveira.pdf: 1836139 bytes, checksum: 68c2be046bbcda4dd5c74438f2d2481e (MD5) / O cerrado é o segundo maior bioma do Brasil, guardando um grande potencial microbiológico. Sua vegetação endêmica é rica em frutos que muitas vezes são desconhecidos dentro da própria população brasileira. Frutos como araticum, pequi, mangaba, coquinho, buriti são alguns exemplos destes frutos ricos em nutrientes, principalmente carboidratos e lipídios. Devido essas características químicas e o ambiente onde residem os frutos promovem um cenário ideal para o desenvolvimento de leveduras. É importante conhecer estes micro-organismos, pois podem produzir várias substâncias com potêncial biotecnológico nas áreas da produção agrícola, saúde, indústrias e alimentícios. O objetivo deste trabalho foi estudar a ocorrência de leveduras em frutos do cerrado, fazer a caracterização molecular e enzimática destes isolados. Foram coletados 13 frutos do cerrado: pequi, mangaba, caju do cerrado, cagaita, pitomba, coco guariroba, araçá, jatobá do cerrado, maracujá do cerrado, lobeira, buriti, araticum e coquinho azedo sendo isoladas 85 leveduras. A caracterização genética dos isolados foram feitas por meio de técnica de MSP-PCR e posteriormente agrupadas pelo programa Bionumerics® por similaridades de seus perfis eletroforéticos. Para a identificação dos isolados foi realizado o sequenciamento da região D1/D2 do gene 26S. Foram encontrados 14 gêneros: Candida, Meyerozyma, Hanseniaspora, Debaryomyces, Pichia, Wickerhamomyes, Lodderomyces, Eremothecium, Bandoniozyma, Issatchenkia, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pseudozyma e Cryptococcus. Os testes enzimáticos com amilase, pectinase, celulase e protease mostraram que 54 isolados produziram algum tipo dessas enzimas e 25 apresentaram no mínimo duas. As enzimas mais produzidas pelos isolados foram protease com aproximadamente 35%, seguida de celulase com 23%, pectinase com 16% e amilase com 13%. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Cerrado is the second largest biome in Brazil, keeping a large microbiological potential. Its endemic vegetation is rich in fruits that are often unknown within the brazilian population. Fruits like araticum, pequi, mangaba, coconuts, buriti are some examples of these fruits rich in nutrients, especially carbohydrates and lipids. Because of these chemical characteristics and the environment in which the fruits reside promote an ideal setting for the growth of yeasts. It is important to know these microorganisms as they can produce various substances with biotechnological potential in the areas of agriculture, health and food industries. The objective of this work was to study the occurrence of yeasts in fruits of the cerrado, make the molecular and enzymatic characterization of isolates. Were collected 13 fruits of the cerrado: pequi, mangaba, caju the cerrado, cagaita, pitomba, guariroba coconut, araçá, jatoba the cerrado, maracujá the cerrado, lobeira, buriti, araticum and sour coquinho being isolated 85 yeasts. Genetic characterization of the isolates were made by MSP-PCR and subsequently grouped by Bionumerics® program for similarities of their electrophoretic profiles. For the identification of the isolates was carried region sequencing the D1 / D2 26S gene. 14 genera were found: Candida, Meyerozyma, Hanseniaspora, Debaryomyces, Pichia, Wickerhamomyes, Lodderomyces, Eremothecium, Bandoniozyma, Issatchenkia, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pseudozyma and Cryptococcus. Enzymes tested amylase, pectinase, cellulase and protease showed that 54 isolates produced some type of these enzymes and 25 had at least two. The enzymes produced by the isolates were more protease about 35%, then 23% of cellulase, pectinase and amylase with 16% to 13%.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-04T20:01:05Z No. of bitstreams: 1 2018_BrunoRibeiroFreire.pdf: 2010959 bytes, checksum: 3596649c43c85a48b96fa9451d82b7d2 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-11T18:19:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_BrunoRibeiroFreire.pdf: 2010959 bytes, checksum: 3596649c43c85a48b96fa9451d82b7d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T18:19:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_BrunoRibeiroFreire.pdf: 2010959 bytes, checksum: 3596649c43c85a48b96fa9451d82b7d2 (MD5) Previous issue date: 2018-09-04 / Esse estudo teve como objetivos a produção de cervejas artesanais no estilo Pilsen com adição das frutas sapoti e atemoia em sua composição e a utilização de leveduras imobilizadas em sistemas micro e nanoestruturados para avaliação dos processos de fermentação alcoólica. A polpa de atemoia foi adicionada no mosto cervejeiro na concentração de 8,5% (p/v) e a polpa de sapoti na concentração de 17% (p/v). A adição de frutas aumentou o teor de compostos fenólicos totais das cervejas de atemoia (111,29 mg/100 mL) e de sapoti (77,61 mg/100 mL) em relação à cerveja sem frutas (64,00 mg/100 mL) e também aumentou o teor alcoólico das cervejas com frutas (5,0ºGL) em relação à cerveja sem frutas (4,6ºGL). Para a produção da cerveja artesanal no estilo Pilsen com o uso de leveduras imobilizadas utilizou-se a concentração de leveduras 10 % (p/v) imobilizadas em alginato 2 % (p/v). A fermentação alcoólica se completou em 6 dias, quando o teor de sólidos solúveis do mosto (14ºBrix) foi reduzido a 7,0ºBrix e a cerveja atingiu a graduação alcoólica de 4,9°GL. E no estudo do desenvolvimento de um conjugado de nanopartículas magnéticas (NPM) com as leveduras imobilizadas, as leveduras realizaram a fermentação alcoólica do mosto em 96 horas. O problema apresentado pela matriz de alginato-NPM foi que as nanopartículas de ferro se soltaram do alginato e migraram para o mosto fermentado. Na tentativa de imobilizar as NPM na matriz, foi realizado um ensaio de fermentação alcoólica com uso das leveduras imobilizadas em matriz de alginato-NPM-glutaraldeído-quitosana. Nesse ensaio as NPM ficaram ligadas na matriz e não houve escape de ferro para o mosto. Porém a difusão de substrato para dentro da levedura encapsulada ficou prejudicada e dessa forma não houve fermentação alcoólica do mosto em 96 horas. As sugestões futuras de modificações de metodologia para o uso das leveduras imobilizadas em matriz de alginato-NPM-glutaraldeído-quitosana são: diminuir o tempo de permanência das leveduras imobilizadas na solução de quitosana de 12 horas para 1 hora para que não ocorra fechamento excessivo dos poros da matriz polimérica e fazer primeiro a encapsulação das leveduras no alginato e depois a imersão dessas na solução de glutaraldeído. Dessa forma, as leveduras estarão mais protegidas da toxicidade do glutaraldeído e ainda assim, será possível o glutaraldeído fazer ligações cruzadas com a parte externa do suporte de imobilização, garantindo que as nanopartículas magnéticas fiquem presas no alginato. / This study had as objectives the production of artisanal beers in the Pilsen style with the addition of sapoti and atemoia fruits in their composition and the use of immobilized yeasts in micro and nanostructured systems for the evaluation of alcoholic fermentation processes. The atemoia pulp was added to the brewing wort at a concentration of 8.5% (w/v) and the sapoti pulp at the concentration of 17% (w/v). The addition of fruits increased the total phenolic compounds content of atemoia (111.29 mg/100 mL) and sapoti (77.61 mg/100 mL) beers compared to non-fruit beer (64.00 mg/100 mL) and also increased the alcoholic content of beers with fruit (5.0°GL) compared to non-fruit beer (4.6°GL). The concentration of 10% (w/v) yeasts immobilized in 2% (w/v) alginate was used for the production of the Pilsen style beer using immobilized yeasts. The alcoholic fermentation was completed in 6 days, when the soluble solids content of the wort (14ºBrix) was reduced to 7.0ºBrix and the beer reached the alcoholic grade of 4.9°GL. And in the study of the development of a conjugate of magnetic nanoparticles with the immobilized yeasts, the yeasts carried out the alcoholic fermentation of the wort in 96 hours. The problem presented by the alginate- magnetic nanoparticles matrix was that the iron nanoparticles were released from the alginate and migrated to the wort. In the attempt to trap the magnetic nanoparticles in the matrix, an alcoholic fermentation test was carried out using yeasts immobilized in alginate- magnetic nanoparticles -glutaraldehyde-chitosan matrix. In this assay the magnetic nanoparticles were bound in the matrix and there was no escape of iron to the wort. However, the diffusion of the substrate into the encapsulated yeast was impaired and in this way there was no alcoholic fermentation of the wort in 96 hours. Future suggestions for modifications of methodologies for the use of immobilized yeasts in alginate- magnetic nanoparticles -glutaraldehyde-chitosan matrix are: decrease the residence time of the immobilized yeasts in the chitosan solution from 12 hours to 1 hour so that there is no excessive closure of the polymer matrix pores and first encapsulating the yeasts in the alginate and then immersing them in the glutaraldehyde solution. Thus, yeasts will be more protected from the toxicity of glutaraldehyde and yet, it will be possible for glutaraldehyde to cross-link with the outside of the immobilization support, ensuring that the magnetic nanoparticles are trapped in the alginate.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-29Bitstream added on 2014-06-13T20:35:52Z : No. of bitstreams: 1 sousa_ps_me_rcla.pdf: 1485165 bytes, checksum: e9ca52a65116171ad1d3dcc0860839f6 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Polybia ignobilis é uma vespa social que apresenta uma alimentação variável e inespecífica, consumindo outros insetos, pedaços de animais mortos, néctar, polpa de madeira e água. Dentro do ninho ocorre a trofalaxia, onde o alimento é distribuído entre os indivíduos da colônia através de secreção labial, podendo ocorrer entre adulto e larva ou apenas entre adultos, propiciando a dispersão de micro-organismos. A associação entre leveduras e insetos pode ser considerada transitória, onde os insetos podem atuar como vetores na dispersão desses micro-organismos sem benefício nutricional; por outro lado, também pode ser considerada como uma associação benéfica, onde o inseto utiliza as leveduras como complemento alimentar. O presente estudo teve como objetivos: caracterizar a comunidade de leveduras associadas à P. ignobilis; verificar se há relação entre a distribuição das leveduras nas diferentes castas da vespa e contribuir com a formação de um banco temático de leveduras isoladas de insetos sociais. Indivíduos do ninho de P. ignobilis e amostras de mel foram coletados no campus da UNESP - Rio Claro. O isolamento e identificação das estirpes foi feita de acordo com a metodologia clássica descrita em YARROW (1998). Foram isoladas 167 estirpes, sendo 59 do primeiro ninho e 108 do segundo. Após uma seleção baseada em análises morfológicas, bioquímicas e perfil de bandas de microsatélites (MSP-PCR) estirpes representativas de cada grupo, bem como as estirpes únicas foram identificadas pelo sequênciamento da região D1/D2 do rDNA 26S. Os resultados revelaram a prevalência no primeiro ninho dos gêneros Candida, Cryptococcus, Hanseniaspora e Rhodotorula, compreendendo 45% do total das estirpes, sendo as espécies mais freqüentes Candida azyma, Candida chrysomelidarum, Cryptococcus liquefaciens e Rhodotorula mucilaginosa. No segundo ninho, as espécies... / Polybia ignobilis is a social wasp that features a variable and unspecific alimentation, eats other insects, bits of dead animals, nectar, wood pulp and water. Inside the nest occurs trofalaxis, where food is distributed among individuals of the colony through labial secretion, it can occur between adult and larva or adults only, being vectors in the dispersion of microorganisms. The association between yeasts and insects can be considered temporary, where the insects serve as vectors in the dispersal of these micro-organisms without nutritional benefit; on the other hand, can also be regarded as a beneficial association, where the insect uses the yeasts as a food supplement. This present study aimed to characterize the yeast community associated with P. ignobilis; verify whether exists a relation between the distribution of yeasts in different varieties of wasp and contribute to the formation of a thematic database of yeasts isolated from social insects. Individuals from the nest of P. ignobilis and honey samples were collected on the campus of UNESP - Rio Claro. The isolation and identification of strains was made according to classical methodology described in YARROW (1998). We isolated 167 strains, 59 and 108 of the first and second nest. After a selection based on morphological, biochemical and microsatellite band profiles (MSP-PCR) representative strains of each group as well as unique strains were identified by sequencing the D1/D2 region of 26S rDNA. The results revealed the prevalence in the first nest of Candida, Cryptococcus, Hanseniaspora and Rhodotorula, comprising 45% of all strains, being the most frequent species Candida azyma, Candida chrysomelidarum, Cryptococcus liquefaciens and Rhodotorula mucilaginosa. In the second nest of the species that prevailed were Aureobasidium pullulans, Meyerozyma guillermondii. Some strains may constitute new... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-01-10T12:27:17Z No. of bitstreams: 1 DissMSCP.pdf: 2238237 bytes, checksum: 45491802360ff30f68b05e329839935b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-13T19:41:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMSCP.pdf: 2238237 bytes, checksum: 45491802360ff30f68b05e329839935b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-13T19:42:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMSCP.pdf: 2238237 bytes, checksum: 45491802360ff30f68b05e329839935b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-13T19:42:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMSCP.pdf: 2238237 bytes, checksum: 45491802360ff30f68b05e329839935b (MD5) Previous issue date: 2016-08-26 / Não recebi financiamento / The viability of technologies that make possible to use all available plant biomass, such as the production of lignocellulosic ethanol, faces challenges as the search for microorganisms capable of fermenting pentoses with high tolerance to inhibitors released in the biomass hydrolysis step, such as acetic acid and furfural. This study aimed to evaluate the metabolizing capacity of pentoses and glucose by a yeast strain of Meyerozyma guilliermondii (CCT7783) in the presence of furfural and acetic acid. The first set of experiments comprised the evaluation of cell growth in a synthetic medium containing acetic acid as the sole carbon source at concentrations of 1.5; 2.5; 4.5; 10.5; 13.5; 16.5 and 19.5 g/L at 30°C, 160 rpm, pH 5.5, with initial concentration of 0.2 g/L of dry mass for a period of 96 hours of incubation. It was also evaluated the effect of pH (3.5 and 5.5) and the initial concentration of dry mass (0.2, 0.5 and 2.5 g/L). The second set of experiments consisted in the evaluation of the effect of furfural (20 and 40 mg/L) and acetic acid (5 and 10 g/L) in the fermentation of pentoses (arabinose and xylose) and glucose, biomass and ethanol production. The yeast M. guilliermondii was able to grow in synthetic medium in all the acetic acid concentrations tested, at pH 5.5. The concentrations of acetic acid evaluated were much higher than those commonly found in hemicellulosic hydrolysates. Growth inhibition occurred in concentrations of acetic acid beyond 10.5 g/L. The initial pH and the initial cell concentration influenced the growth and the acetic acid consumption. In synthetic medium containing glucose, pentoses and acetic acid as carbon sources, the highest specific growth rate was obtained in the treatment with the addition of 5 g/L of acetic acid, which was consumed concomitantly with the pentoses and glucose in all treatments, however the acetic acid was an inhibitor at the concentration of 10 g/L. Furfural inhibited the growth of the yeast in the concentration of 40 mg/L. The ethanol production by M. guilliermondii was lower comparing to the micro-organisms commonly utilized in the fermentation process. The yeast was able to grow and promote the biological detoxification even in the presence of the inhibitors like acetic acid and furfural, showing that the process requires optimization and that the yeast M. guilliermondii may be applied in biotechnological routes for the production of second generation ethanol. / A viabilidade de tecnologias que aproveitem ao máximo toda a biomassa vegetal disponível, como a produção de etanol lignocelulósico, enfrenta desafios como a busca por micro-organismos capazes de fermentar pentoses, com alta tolerância aos inibidores liberados na etapa de hidrólise da biomassa, como o ácido acético e o furfural. O presente trabalho objetivou avaliar a capacidade de metabolização de pentoses e glicose por uma linhagem da levedura Meyerozyma guilliermondii (CCT7783), na presença de furfural e ácido acético. A primeira fase experimental consistiu da avaliação do crescimento celular em meio sintético contendo ácido acético como única fonte de carbono nas concentrações de 1,5; 2,5; 4,5; 10,5; 13,5; 16,5 e 19,5 g/L, a 30ºC, 160 rpm, pH 5,5, com concentração inicial de 0,2 g/L de massa seca durante um período de incubação de 96 h. Avaliou-se ainda nesta etapa a influência do pH (3,5 e 5,5) e concentração inicial de massa seca (0,2; 0,5 e 2,5 g/L). A segunda fase consistiu na avaliação do efeito do furfural (20 e 40 mg/L) e ácido acético (5 e 10 g/L) na fermentação de pentoses (arabinose e xilose) e glicose, produção de biomassa e etanol. A levedura M. guilliermondii foi capaz de crescer em meio sintético em todas as concentrações de ácido acético testadas, em pH 5,5, sendo essas concentrações muito acima daquelas normalmente encontradas em hidrolisados hemicelulósicos. A concentração a partir da qual ocorreu inibição do crescimento foi 10,5 g/L. O pH inicial teve influência no consumo do ácido acético e crescimento assim como a concentração celular inicial. Em meio sintético contendo glicose, pentoses e ácido acético como fontes de carbono, a maior velocidade específica de crescimento foi obtida no tratamento com adição de 5 g/L de ácido acético, o qual foi consumido concomitantemente com as pentoses e glicose em todos os tratamentos, porém o ácido acético atuou como inibidor na concentração de 10 g/L. O furfural inibiu o crescimento da levedura na concentração de 40 mg/L. A produção de etanol (g/L) foi baixa em relação aos micro-organismos comumente aplicados no processo de fermentação, porém a levedura foi capaz de crescer e promover a detoxificação biológica mesmo na presença de inibidores como ácido acético e furfural, denotando que o processo requer otimização e que a levedura M. guilliermondii pode ser aplicada em rotas biotecnológicas de produção de etanol de segunda geração.

Os resíduos lignocelulósicos agroindustriais são substratos abundantes e de baixo custo para a produção de vários compostos de valor agregado como etanol e xilitol, por isso a importância de estudos para ampliar as formas de aproveitamento das pentoses e hexoses presentes nestas matérias primas. Em vista disso, o presente trabalho buscou estudar a composição e os processos de hidrólise ácida diluída e enzimática da casca de soja (Glycine max) e da casca de aveia (Avena sativa L), bem como avaliar a fisiologia e a capacidade de produção de metabólitos como etanol e xilitol por novas leveduras recombinantes e selvagens, a partir da fermentação destes hidrolisados. Na primeira etapa do estudo, testou-se diferentes concentrações de ácido sulfúrico em diferentes tempos de autoclave para o pré-tratamento e solubilização da fração de hemicelulose da mistura de casca de soja e casca de aveia, através do processo de hidrólise ácida diluída. A condição de 1 % de ácido em 40 minutos de autoclave foi escolhida para a obtenção do hidrolisado ácido para a fermentação. No sólido resultante do tratamento anterior, foram testadas duas enzimas, o extrato do fungo Penicillium echinulatum e a enzima comercial novozymes CELLUCLAST 1.5 ®, em três concentrações enzimáticas (10 FPU g-1,,15 FPU g-1, 20 FPU g-1).A enzima comercial novozymes CELLUCLAST 1.5 ®, na concentração de 15 FPU g-1 foi escolhida para a obtenção do hidrolisado enzimático pela maior liberação de açúcares no meio. Em uma segunda etapa, os hidrolisados ácido e enzimático e a mistura destes foram testados como meio de fermentação para duas linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae YRH 396 e YRH 400 que foram recombinadas por integração cromossômica dos genes da xilose redutase (XYL1), xilitol desidrogenase (XYL2) de Pichia stipitis e xiluloquinase (XKS1) de S. cerevisiae conferindo capacidade de metabolização da xilose. Nos ensaios em agitador orbital, a linhagem YRH 396 obteve parâmetros fermentativos (Yp/s e QP) superiores e teve seu metabolismo estudado em biorreator, apresentando valor de Yp/s de 0,39 gg-1 na fermentação do hidrolisado enzimático concentrado. Na fermentação do hidrolisado ácido em anaerobiose 71,2 % da xilose foi consumida com Yp/s (etanol) de 0,33 gg-1. Na fermentação do hidrolisado acido em um biorreator aerado com 1 vvm 64,3 % da xilose foi consumida com produção de 2,9 g L -1 de etanol e 8,17 g L -1 de xilitol. Em uma terceira etapa do trabalho, as novas espécies recentemente isoladas Spathaspora girioi e Spathaspora hagerdaliae foram testadas fermentando o hidrolisado ácido em anaerobiose e oxigênio limitado em agitador orbital. A fermentação pela espécie S. hagerdaliae foi escalonada em biorreator e apresentou Yp/s (etanol) de 0,32 gg-1 no cultivo em anaerobiose e Yx/x (xilitol) de 0,31 gg-1 em biorreator aerado. / Agroindustrial lignocellulosic residues are abundant, low-cost substrates for the production of various value-added compounds such as ethanol and xylitol. Therefore, the importance of extensive studies to increase the uses of pentoses and hexoses present in these raw materials. In this context, the present study sought to study the composition and the processes of diluted acid and enzymatic hydrolysis of soybean hulls and oat hulls, and to evaluate the physiology and production of ethanol and xylitol by new wild and recombinant yeast strains during fermentation of these hydrolysates. In the first stage of the study, different concentrations of sulfuric acid were tested in different autoclave times for the pre-treatment and solubilization of the hemicellulose fraction of the soybean hull and oat bark mixture through the diluted acid hydrolysis process. The condition of 1% acid in 40 minutes of autoclaving was chosen to obtain the hydrolysate resulting from the acid treatment for fermentation. In the solid resulting from the previous treatment, two enzymes, an extract of the fungus Penicillium echinulatum and the commercial enzyme CELLUCLAST 1.5 ® Novozymes, were tested in three enzymatic concentrations (10 FPU g-1,,15 FPU g-1, 20 FPU g-1).The commercial enzyme Novozymes CELLUCLAST 1.5 ® in the concentration of 15 FPU g-1 was chosen to obtain the enzymatic hydrolysate. In the second part, the acid and enzymatic hydrolysates and the mixture of these were tested as a fermentation medium for two recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae YRH 396 and YRH 400 that were recombined by chromosomal integration of the genes xylose reductase (XYL1), xylitol dehydrogenase (XYL2) di Pichia stipitis and xylulokinase (XKS1) genes of S. cerevisiae conferring capacity of xylose metabolism. In the orbital shaker assays the YRH 396 strain showed better fermentation parameters (Yp/s and QP) and had its metabolism studied in a bioreactor, showing an Yp/s of 0.39 g g-1 in the fermentation of the concentrated enzymatic hydrolysate and consumption of 71.2 % of xylose in the fermentation of the acid hydrolysate under anaerobiosis, with Yp/s of 0.33 gg-1. In the fermentation of the acid hydrolysate in an aerated bioreactor with 1 vvm, 64.3% of xylose was consumed with production of 2.9 g L -1 of ethanol and 8.17 g L -1 of xylitol. In the third stage of the work, the species Spathaspora girioi and Spathaspora hagerdaliae were tested fermenting the acid hydrolysate in anaerobiosis and limited oxygen in orbital shaker. Fermentation by the Spathaspora hagerdaliae was staged in a bioreactor and presented Yp/s (ethanol) of 0.32 gg-1 under anaerobiosis and Yx/x (xylitol) of 0.31 under microaerobiosis.

Atualmente o óleo microbiano está sendo intensivamente estudado com a intenção de suprir o mercado que o consome, principalmente tendo um grande interesse no emprego como uma fonte alternativa de biocombustível, sendo limpa e renovável. Com o objetivo de otimizar a produção do óleo microbiano, o presente trabalho avaliou a produção de biomassa, lipídeos e composição de ácidos graxos da levedura Candida zeylanoides QU 33 quando cultivada em diferentes fontes de carbono (lactose, glicose, glicerol e xilose), nitrogênio (sulfato de amônio, nitrato de amônio, peptona e extrato de levedura), assim como diferentes condições de cultivo (temperatura, agitação, pH e razão carbono/nitrogênio). Este trabalho também apresenta uma técnica de triagem de acumulo de lipídeo intracelular, com a metodologia do Vermelho de Nilo, na qual as células boas acumuladoras de lipídeo emitiram fluorescência amarelo-ouro. A composição de ácidos graxos do óleo produzido pela C. zeylanoides QU33 quando cultivada em glicose com diferentes fontes de nitrogênio apresentou potencial na utilização como matéria prima tanto para o biodiesel quanto para indústria de alimentos. O uso combinado de glicose com sulfato de amônio pela C. zeylanoides QU33 resultou na produção de óleo com elevado teor de ácidos graxos poli-insaturados. Feita a triagem dos fatores que mais interferiram na produção do óleo microbiano, foi delineado um modelo experimental usando a metodologia de superfície de reposta a fim de otimizar a produção de lipídeo intracelular por esta levedura. / Currently, microbial oil is being intensively studied aiming to suply the consumer market, especially with a great interest in its use as an alternative source of biofuel, clean and renewable. Aiming the optimization of the production of microbial oil, in the present work it was evaluated the production of biomass, lipids and the fatty acid composition of the yeast Candida zeylanoides QU 33 when cultivated with different carbon sources (lactose, glucose, glycerol and xylose), nitrogen (ammonium sulfate, ammonium nitrate, peptone and yeast extract), as well as different culture conditions (temperature, shaking speed, pH and carbon/nitrogen ratio). A new screening methodology for the evaluation of intracellular lipid accumulation is also presented, using Nile Red, in which the cells that are good lipid producers present a golden-yellow fluorescence. The fatty acid composition of the oil produced by C. zeylanoides QU33 cultivated in glucose and different nitrogen sources presented potential for use as raw material for biodiesel production or at the food industry. The combined use of glucose and ammonium sulfate by C. zeylanoides QU33 resulted in the production of oil with elevated levels of polyunsaturated fatty acids. After the evaluation of the factors that mainly interfered in the production of microbial oil, an experimental model was designed using the response surface methodology for optimization of the production of intracellular lipids by this yeast.

Utensílios constituídos de material poroso são geralmente empregados na produção do queijo, sendo comum a formação de biofilmes microbianos. Com o intuito de evitar essa adesão microbiana, diferentes categorias de produtos químicos são comumente empregados. Entretanto, poucos estudos avaliam a eficácia de sua ação antibiofilme. A Yarrowia lipolytica é uma levedura constantemente relacionada com alimentos com elevadas proporções de gordura e proteína e já foi detectada em diferentes tipos de queijo, tanto na sua superfície como no seu interior, contribuindo para o processo de maturação do produto ou alterando as propriedades organolépticas. Todavia, há poucos estudos quanto à formação de seu biofilme no processo de produção do queijo, assim como quanto ao seu impacto na qualidade final do produto. Diante disto, o objetivo geral deste estudo foi avaliar a capacidade de formação e remoção do biofilme dos isolados de Y. lipolytica por meio do uso de detergentes e hipoclorito de sódio aplicados em diferentes utensílios e materiais utilizados no processo de fabricação de queijos do tipo colonial. Em todos os corpos de prova houve formação de biofilme pelos isolados de Y. lipolytica testados, com a contagem de células aderentes variando entre 3,95-6,20 log UFC/cm2. Os utensílios e materiais foram submetidos a um processo de higienização, usando as soluções de detergente neutro (3%), detergente alcalino (6%, 8%) e hipoclorito de sódio (1% e 1,5%) no qual o corpo de prova “mangueira” (PVC espiral) foi o material que apresentou uma melhor redução dos isolados de Y. lipolytica com os detergentes e hipoclorito de sódio. No entanto, no corpo de prova “forma” (polipropileno) ocorreu uma menor redução de biofilme se comparamos aos demais corpos de prova. Destacando uma menor eficiência quando utilizado o detergente alcalino (6%) e (8%) nos isolados QU13, QU77 e QU22. Na curva de morte, observou-se que não houve inibição do crescimento em nenhum dos tempos testados para o detergente neutro a 3%. Houve significância nos resultados (p <0,05) ao relacionar todos os ângulos de contato dos isolados estudados. Os índices de emulsificação (E24) variaram entre 49,7 - 88,3% nos isolados de Y. lipolytica demonstrando uma larga produção de bioemulsificante em todos os isolados testados. Os resultados obtidos neste trabalho pode alterar a qualidade do queijo colonial, afetando negativamente o sabor, textura, escurecimento da superfície e contribuir para formação de aminas biogênicas que atuam na decomposição do produto final. / Microbial biofilm formation on utensils made with porous material normally employed in cheese production is common. In order to avoid this microbial adhesion, different categories of chemical products are commonly employed. However, few studies evaluate the effectiveness of its antibiofilm activity. Yarrowia lipolytica is an yeast constantly related to food with high proportions of fat and protein and has been detected in different types of cheese, both on the surface and inside, contributing to the process of product maturation or changing its organoleptic properties. Nevertheless, there are few studies regarding its biofilm formation in cheese production process, as well as regarding its impact on final product quality. Faced with that, the general goal of this study was to evaluate the biofilm formation and removal capacity of isolates of Y. lipolytica using detergents and sodium hypochlorite applied in different utensils and materials used in the process of colonial cheese production. In all specimens there was biofilm formation by the tested isolates of Y. lipolytica, with adherent cell count ranging between 3.95 to 6.20 log UFC/cm2. The utensils and materials were submitted to a sanitization process, using mild detergent (3%), alkaline detergent (6%, 8%) and sodium hypochlorite (1% and 1.5%) solutions, in which the specimen "hose" (PVC spiral) presented the best decrease of Y. lipolytica isolates with the detergents and sodium hypochlorite. However, on the specimen "mold" (Polypropylene) there was lower reduction of biofilm comparing to other specimens. Reduced efficiency when using the alkaline detergent (6%) and (8%) on QU13, QU77 and QU22 isolates can be highlighted. In the Time Kill Assay, no growth inhibition within none of the tested times was detected for the mild detergent (3%). There was significance level in the results (p < 0.05) when relating all contact angles of the studied isolates. The emulsification indexes (E24) in the Y. lipolytica isolates ranged between 49.7% and 88.3% demonstrating a large production of bioemulsificant in all tested isolates. The results found in this work may lead to changes in the quality of the colonial cheese, affecting negatively the taste, texture, darkening the surface and contribute to biogenic amine formation that act on end product decomposition.