O objetivo desta pesquisa foi avaliar a magnitude da interação genótipos x ambientes (G x E) e a sua conseqüência na adaptabilidade e na estabilidade fenotípica de 100 linhagens experimentais de soja pertencentes a quatro ciclos de maturação (28 precoces, 38 semiprecoces, 27 intermediárias e sete semitardias), através de três metodologias que quantificam a adaptabilidade e/ou estabilidade fenotípica (ecovalência, regressão linear de Eberhart & Russel e AMMI ou "Additive Main effects and Multiplicative Interaction"), com ênfase nas produtividades de grãos e óleo. Os experimentos foram conduzidos em três localidades (Anhembi, Areão e ESALQ) do município de Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil (540 m de altitude, 22 o 42' de latitude sul e 47 o 39' de longitude oeste), em cultivo de verão (semeadura em novembro), nos anos agrícolas de 1996/97, 1997/98, 1998/99 e 1999/00. Em cada local foram avaliados quatro experimentos, correspondentes a quatro ciclos de maturação (CM). O delineamento utilizado foi o de blocos ao acaso com duas repetições estratificadas em conjuntos experimentais e quatro testemunhas comuns por conjunto. A parcela experimental foi representada por quatro fileiras de 5 metros de comprimento, espaçadas de 0,5 metro, sendo utilizadas para a tomada de dados apenas os 4 metros centrais das duas fileiras intermediárias da parcela. Os ambientes corresponderam à combinação de ano e local, totalizando 12 ambientes por CM. Os caracteres avaliados foram: número de dias para a maturidade (NDM), altura de planta na maturidade (APM), acamamento (Ac), valor agronômico (VA), produtividade de grãos (PG), porcentagem de óleo nas sementes (%OL) e produtividade de óleo (PO). Para a análise de adaptabilidade e estabilidade fenotípica utilizou-se apenas os caracteres PG, %OL e PO. Os resultados mostraram que o efeito de ambientes foi mais importante do que o efeito da interação genótipos (G) x ambientes (E), e este, mais importante do que o efeito de genótipos (linhagens). A magnitude da interação G x E, para a PG e PO, foi maior do que para a %OL, indicando que este último caráter foi mais estável. As linhagens precoces (LP) e semiprecoces LSP) foram mais adaptadas, mas exibiram interações G x E mais complexas e foram mais instáveis do que as intermediárias (LI) e semitardias (LST). As LI associaram alta adaptabilidade com estabilidade média para PG e PO, ao contrário¶ das LP, LSP e LST, nas quais a alta adaptabilidade esteve sempre associada com baixa estabilidade. Os anos agrícolas associados com os locais Anhembi e ESALQ foram mais favoráveis que os ambientes relacionados com o local Areão, mas estes apresentaram maior previsibilidade. A seleção de linhagens com média e previsibilidade altas foi mais difícil para a %OL do que para PG e PO, em decorrência das correlações negativas entre as médias e os parâmetros de estabilidade; a utilização desses parâmetros em conjunto mostrou-se mais eficiente na seleção simultânea para adaptabilidade e estabilidade. As metodologias foram similares quanto ao ordenamento das linhagens; no entanto, diferiram quanto à precisão, explicação, informação sobre a interação G x E e adaptabilidade das linhagens. O método da ecovalência pode ser utilizado para selecionar para estabilidade e, quando associado com a média, também para adaptabilidade, sempre que o melhorista não esteja interessado em obter informações adicionais sobre recomendações de linhagens para ambientes específicos. A regressão linear de Eberhart & Russel foi mais influenciada pelos efeitos ambientais do que pelos efeitos da interação G x E, não explicando satisfatoriamente o comportamento das linhagens. O padrão adjacente à interação G x E foi baixo e a presença de ruídos (efeitos aleatórios causados por fatores micro-ambientais) foi alta, evidenciando que apenas parte da variação total observada para a interação G x E foi importante para explicar o comportamento das linhagens. A interpretação gráfica da análise AMMI pelos biplots AMMI1 e AMMI2, para modelos que incluem mais de dois eixos, foi eficiente em explicar a estabilidade das linhagens e ambientes, mas a adaptabilidade foi melhor compreendida com o auxílio das médias preditas para linhagens e ambientes pelo modelo selecionado. O método AMMI foi mais eficiente do que os métodos da ecovalência e da regressão linear de Eberhart & Russel, pois permitiu analisar com mais detalhes os efeitos da interação G x E, ganhando precisão e melhorando o processo de seleção. As linhagens que reuniram maior adaptabilidade com estabilidade para PG e PO dentro de cada CM foram: USP 94-1086 (precoce), USP 93-2316 (semiprecoce), USP 93-5243 (intermediária) e USP 93-5684 (semitardia). / The objective of this research was to evaluate the magnitude of the genotype-environment interaction (G x E) and its consequence on the phenotypic adaptability and stability of one hundred soybean experimental lines belonging to four maturity cycles (28 early, 38 semi-early, 27 intermediate, and seven semi-late), through three methodologies that quantify the phenotypic adaptability and/or stability (ecovalence, linear regression of Eberhart & Russel and AMMI or "Additive Main effects and Multiplicative Interaction"), with emphasis in the seed and oil yield. The experiments were carried out at three localities (Anhembi, Areão and ESALQ) of the Piracicaba county, State of São Paulo, Brazil (540 m of altitude, 22 o 42' South latitude, and 47 o 38' West longitude), during the summer crop season (sowing in november) in the agricultural years of 1996/97, 1997/98, 1998/99, and 1999/00. For each locality and maturity cycle, a randomized complete block experiment was designed, with two replications stratified in experimental sets and four common checks in each set. The experimental plot corresponded to four rows 5.0 m x 0.5 m, where the four central meters of the two intermediate rows were evaluated. Each environment corresponded to a combination of locality and year, totalizing 12 environments by maturity cycle. The traits number of days to maturity (NDM), plant height at maturity (APM), lodging (Ac), agronomic value (VA), seed yield (PG), oil percentage in the seeds (%OL), and oil yield (PO) were evaluated. For the phenotypic adaptability and stability analysis it was only used the characters PG, %OL, and PO. The results showed that the effect of environment was more important than the effect of G x E interaction, and this one more important than the genotype effect (lines). The magnitude of the G x E interaction for PG and PO showed larger than for %OL, indicating that this was more stable. The early and semi-early lines were more adapted, but exhibited G x E interactions more complex and were more ustable than the intermediate and semi-late lines. The intermediate lines associated high adaptability with medium stability for PG and PO, unlike the early, semi-early, and semil-ate lines, for which the high adaptability was always associated with low stability. The agricultural year associated with the Anhembi and ESALQ localities were more favorable than the environments related with Areão locality, but those showed larger predictability. The selection of lines with high means and predictability went more difficult for %OL than for PG and PO, due to the negative correlations between the means and the stability parameters; the combined use of those parameters was shown more efficient in the selection for adaptability and stability. The methodologies were similar with relationship to the ranking of the lines; however, they differed for the precision, explanation, information on the G x E interaction and on adaptability of the lines. The ecovalence method can be used to select for stability and, when associated with the mean, also for adaptability, whenever the breeder is not interested in obtaining additional information on recommendation lines for specific environments. The linear regression of Eberhart & Russel was more influenced by the environmental effects than the effect of G x E interaction, and it did not explain satisfactorily the performance of the lines. The pattern adjacent to G x E interaction was low and the high presence of noises (random variation caused by microenvironments factors), evidencing that only part of the variation observed for the G x E interaction was important to explain the line performance. The graphic interpretation of the AMMI analysis by biplots AMMI1 and AMMI2, for model that includes more than two axes, was efficient in explaining the stability of the lines and environments, but the adaptability was better understood with the aid of means predicted by the selected model for lines and environments. The AMMI method was more efficient than the ecovalence and linear regression of Eberhart & Russel methods, because allowed to analyze with more details the effects of G x E interaction, gaining precision and improving the selection process. The lines that gathered larger adaptability with stability for PG and PO, inside of each maturity cycle, were: USP 94-1086 (early), USP 93-2316 (semi-early), USP 93-5243 (intermediate), and USP 93-5684 (semi-late).

A pesquisa de linhagens com duplicação cromossômica, como a linhagem A de Aspergillus nidulans, teve oseu início no final da década de 1970. Durante este período foram isolados da linhagem A, diversos variantes deteriorados, que foram caracterizados genética e citologicamente. Neste trabalho de pesquisa, as analises genéticas demonstraram que os determinantes de deterioração ou segmentos de inserção de V5, V101, V102, V103 e V104 estão localizados nos grupos de ligação VIII, III, IV, VII e I respectivamente. As análises citogenéticas revelaram diversas alterações no ciclo celular e migração nucleares nas fases iniciais de desenvolvimento. A duplicação cromossômica da linhagem A e os variantes deteriorados foram investigados a nível molecular, por técnica de PCR. Os resultados mostraram que o segmento de inserção consiste de um provável Elemento de Transposição, denominado de MATE, o qual é característico do fungo Aspergillus nidulans. Os segmentos de inserção analisados apresentam características típicas de MATE, como o motivo “Spe” que é encontrado por toda seqüência dos Elementos MATE. / The research with chromosome duplication strains, as strain A of Aspergillus nidulans, began during the 70's, with isolation of several deteriorates variants of strain A and characterization by genetic and cytological analysis. In this work the genetic analysis has demonstrated that the deterioration determinant or insertion sequence in V5, V101, V102, V103 and V104 deteriorates variants are located in the linkages groups VIII, III, IV, VII and I, respectively. The cytological analyses have demonstrated changes in cellular cycle and nuclear migration in initial phases of development. The chromosome duplication of strain A and the deteriorated variants were investigated by PCR with designed primers to mobile elements, what have resulted in the identification of the transposable element MATE, mainly by great similarity with "Spe" motif sequence that is described as essential in activity of these elements.

No esquema de cruzamentos do dialelo parcial circulante interpopulacional (DPCI) cada linhagem da população é cruzada com s linhagens da população contrastante. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do número s nas estimativas de capacidade geral de combinação (CGC) e capacidade especifica de combinação (CEC) de linhagens S1 para duas populações contrastantes (GN-03 e GN-04) de milho (Zea mays L.). Dois dialelos (DPCI A e DPCI B) com 50 linhagens cada, foram cruzadas (GN-03 x GN-04) usando s=6, de acordo com o esquema circulante de cruzamento. Dos 300 híbridos possíveis de cada dialelo, foram obtidos 297 no DPCI (A) e 282 no DPCI B. Os híbridos foram avaliados em três locais (Piracicaba-SP e Uberlândia-MG, com três repetições; e em Jataí-GO com duas repetições); o DPCI B foi avaliado somente nos dois primeiros locais. Os híbridos foram divididos em seis experimentos para cada DPCI. As análises foram realizadas para cada experimento e agrupadas posteriormente; os caracteres analisados foram peso de espigas (t/ha) e altura de planta (cm). As análises do DPCI foram realizadas para diferentes tamanhos de s, a saber, s=3, 4, 5, e 6. A produtividade média dos híbridos S1 x S1 nos dois grupos variou de 94% a 99% em relação à média das testemunhas em Uberlândia e Piracicaba. Na época safrinha avaliada em Jataí, a média dos híbridos foi 17% superior a média da testemunha. A fonte de variação CEC não mostrou significância em todos locais e caracteres avaliados. Em alguns casos a perda de graus de liberdade para a fonte de variação CEC com a redução de s, diminuiu o poder do teste de F. A redução de s levou a uma maior variação das estimativas de CGC e também a uma diminuição na precisão das estimativas de CEC. Os coeficientes de correlação (r) entre os valores obtidos pelo modelo reduzido ( j i ij gˆ + gˆ + ˆ = Y ˆ m ) com os observados ( ij ij j i ij e + s + g + g + = Y m ) foram calculados para ambos os dialelos em todos os locais. Os maiores coeficientes de correlação foram observados com os menores valores de s, induzindo à falsa interpretação de que as estimativas de CEC têm pouca influência na média do híbrido.Resultados consistentes foram obtidos quando utilizou-se o mínimo de cinco cruzamentos por parental (s=5), pois pode-se obter estimativas significativas e adequadas de CGC e CEC. As estimativas de componentes de variância ao nível interpopulacional foram estimados para o caráter peso de espigas, usando s=6 . As estimativas de variância aditiva expressas em (g/planta)2 foram 120,56, 61,92 e 38,44 para os locais Piracicaba, Uberlândia e Jataí, respectivamente. A variância de dominância foi superior a variância aditiva ao nível interpopulacional em todos os locais. As relações encontradas foram 6,05, 4,30 e 7,15 para os locais Piracicaba, Uberlândia e Jataí, respectivamente evidenciando a importância dos efeitos não aditivos entre as populações. / In the partial mating scheme, each line of one population is crosses with a number (s) of lines of the opposite population. The objective of this work was to study the effect of the number s in the estimates of general combining ability (GCA) and specific combining ability (SCA) of S1 lines from two contrasting populations (GN-03 and GN-04) of maize (Zea mays L.) crossed according to the partial diallel. Two groups (GA and GB) of fifth S1 lines were randomly crossed (GN-03 x GN-04) using s=6. From the 300 possible crosses in each group, some were last resulting 297 in GA and 282 in GB. Crosses were evaluated in three locations (Piracicaba-SP and Uberlandia-MG with three replications; and Jatai-GO with two replications); group GB was evaluated only in the first two locations. The whole set of crosses was divided into six experiments for each group. The analyses of variance were performed for each experiment and then grouped over experiments. The traits ear yield (t/ha) and plant height (cm) were analysed. The analyses were performed for varying number of crosses per line; i.e., for s=3, 4, 5, 6. Ear yield of S1 xS1 crosses in both groups varied from 94% to 99% in relation to the mean of both checks in Uberlandia and Piracicaba. In Jatai, only group GA in midseason planting yielded 17% more than the average of checks. Specific combining ability didn’t showed significance for every traits and locations. While general combining ability was always significant. Decreasing s led to a higher variation in the estimates of GCA and also to a decrease in the precision of SCA estimates. The coefficient of correlation between observed means ( ij ij j i ij e + s + g + g + = Y m ) and predicted means through the reduced model ( j i ij gˆ + gˆ + ˆ = Y ˆ m ) was calculated for boths groups in all locations. The higher coefficients of correlations were observed for smaller s values, leading to a miss interpretation. That SCA is of low importance in the phenotypic expression. Consistent results were observed by using s=5 allowing the detection of significance and good of the estimates of GCA and SCA. The estimates of the interpopulation variance components were obtained for ear yield using s=6. The estimates of the additive genetic variance expressed in (g/plant)2 were 120.56, 61.92 and 38.44 in Piracicaba, Uberlandia and Jatai, respectively. The dominance variance were higher than the additive variance in all locations; the ratios ) / ( 2 A 2 D s s were 6.1, 4.3 and 7.2, respectively, indicating the importance of the non additive effects in the interpopulation.

A semente de milho, base da alimentação em muitos países na África, Ásia e América Latina, possui ~10% de proteína na semente. Por ser um cereal a proteína da semente de milho apresenta uma baixa concentração de aminoácidos essenciais como: lisina e triptofano. Com a descoberta do milho opaco-2, o qual apresenta um maior teor de lisina e triptofano em suas sementes, surgiu a oportunidade de se desenvolver milhos com qualidade protéica, aumentando o conteúdo de aminoácidos e a qualidade nutricional dos grãos. Assim, surgiu o milho QPM (quality protein maize), milho de alta qualidade protéica, melhorado pelo CIMMYT (México). O QPM possui duas vezes mais lisina que o milho normal mantendo a sua produtividade equivalente. A EMBRAPA, Milho e Sorgo, desenvolveu duas variedades QPM comercializadas: BR451 e BR473. A linhagem QPM 161 (EMBRAPA Milho e Sorgo) teve suas proteínas de reserva analisadas bioquimicamente neste trabalho, concluindo que o QPM 161, possui uma concentração maior de lisina em suas sementes, chegando a superar o BR 451 e a manter a mesma concentração de lisina que o BR 473. Em outra parte do trabalho, sementes imaturas (14, 20 e 14 DAP) das linhagens 161, assim como as do selvagem W22+ e de seus mutantes W22o10, W22o11 e W22o13, foram utilizadas para caracterizar a enzima homoserina quinase (HK). A HK faz parte da via de biossíntese do aminoácido essencial treonina. Constatou-se que uma alta atividade desta enzima está relacionada ao aumento de treonina na semente, porém, a alta atividade de HK foi observada nos menores estágios de maturação. Assim os resultados mostram que mais estudos sobre a regulação desta enzima devem ser realizados para que se possam desenvolver sementes ricas em lisina e também em treonina. / Maize which is the staple food in many countries in Africa, Asia and Latin America, has ~10% of protein in the seeds. Maize seeds protein presents low contents of essential amino acids, such as lysine and tryptophan. Since the discovery of the opaque-2 maize, a recessive mutation that results in high concentrations of lysine and tryptophan, the major challenge has been to develop better quality protein maize to increase the rate of amino acids consumed by population. The QPM (quality protein maize), originally produced and breeded at CIMMYT in Mexico, came to solve the issue. The QPM protein has twice as much lysine and tryptophan, with the same yield of normal maize. The EMBRAPA, Maize and Sorghum, has bred two QPM varieties that are already commercialized (BR 451 and BR 473), but to increase the quality of the Brazilian QPM, EMBRAPA developed a new QPM line, the 161, whose storage proteins were biochemically analyzed in this study. Line 161 exhibited a higher lysine concentration than BR 451, but about the same concentration of that exhibited by BR 473. Further analyses conducted in this research involved the study of immature seeds (14, 20 and 24 DAP) of line 161, and the wild-type W22+ and its counterpart mutants W22o10, W22o11 and W22o13, and the characterization of the enzyme homoserine kinase (HK). HK is a key enzyme of the threonine biosynthetic pathway. The high HK activity was shown to be related to the increased threonine concentration in the maize seeds. HK activity was shown to reach the highest level in the first developmental stage, whereas in the last developmental stage the activity is lower and so is the rate of threonine. Therefore, it is necessary more studies on HK regulation to improve the mature maize seeds with the best rate of lysine and threonine.

O Fator VII recombinante (FVIIr) tem sido a principal escolha terapêutica dos pacientes hemofílicos que desenvolvem inibidores contra os fatores VIII e IX utilizados como tratamento. Atualmente, o produto utilizado é produzido em células de camundongo (BHK-21), o qual oferece desvantagens considerando a complexidade das modificações pós-traducionais desta proteína e a inserção de glicosilações de origem murina altamente imunogênicas aos seres humanos. Dessa maneira a produção de proteínas para uso terapêutico em linhagens celulares humanas surge como uma alternativa promissora. Dentro desse contexto, o objetivo principal deste trabalho foi clonar e expressar o FVII de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (HepG2, Sk-Hep, HKB-11), compará-las com a linhagem murina BKH-21, e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. As células foram modificadas com o vetor lentiviral p1054-CIGWS, contendo os genes do FVII e do marcador GFP. Após a modificação das células foi observada uma eficiência de transdução de 80% nas células BHK-21-FVIIr, 73% nas células HepG2-FVIIr, 32% nas células HKB-11-FVIIr e 95% Sk-Hep-FVIIr. Análises da expressão gênica por PCR em Tempo Real mostraram que as três linhagens humanas modificadas apresentaram expressão do RNAm relativo ao FVIIr, sendo que a linhagem celular HepG2 foi a que teve maior expressão de FVIIr, seguida da Sk-Hep-1 e HKB-11. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 dias em cultura, a expressão do gene FVIIr foi semelhante para as três linhagens (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE). O FVII é uma proteína que para sua ativação, possui como principal modificação pós traducional a -carboxilação vitamina K dependente, que ocorre por meio do ciclo da vitamina K com a participação de 3 enzimas, -carboxilase, VKORC1 e calumenina (inibidor). A expressão gênica dessas enzimas foi avaliada antes e após o tratamento com a vitamina K. Foi possível observar que houve um aumento nos níveis de RNAm nas células humanas tratadas com vitamina K, sugerindo que esta é capaz de ativar as enzimas do ciclo da -carboxilação. A cinética de crescimento celular em garrafas estáticas mostrou que a as células murinas BHK-21 modificadas possuem uma velocidade específica de crescimento 25% mais elevada que das células humanas. Contudo a cinética de produção das linhagens recombinantes mostrou que as células humanas produzem cerca de 3 vezes mais FVIIr do as células BHK-21. Devida a baixa produção de FVIIr na linhagem celular murina, e ao fato de que a linhagem humana HepG2 apresenta um perfil de crescimento extremamente lento, as linhagens recombinantes Sk-Hep-1-FVIIr e HKB-11-FVIIr foram selecionadas para ensaios de cultivo em suspensão utilizando microcarregadores em frascos spinners. Ao longo de 10 dias de cultivo as células HKB-11-FVIIr mostraram uma produção acumulada de 152 g de FVIIr, o que corresponde a 304 UI. As células Sk-Hep-1-FVIIr produziram cerca de 202,6 g de FVIIr, o que corresponde a 405,2 UI. Em suma, nossos dados comprovam que as linhagens celulares humanas são eficazes para a produção de fator VII recombinante, uma vez que, utilizando nosso modelo de produção, estas mostraram-se melhores do que a de células murinas (BHK-21) utilizadas pela indústria. Assim, estas linhagens celulares humanas podem ser usadas como uma nova plataforma para a produção de FVII, bem como para outras proteínas recombinantes, de maneira mais segura e com menor risco de desenvolvimento de anticorpos inibidores / Recombinant factor VII (FVIIr) has been the main therapeutic choice for hemophilic patients who develop inhibitors antibidies to conventional treatments (FVIII and FIX). Currently, the comercial product is produced in murine cells (BHK-21) which gives disadvantages considering the complexity of post-translational modifications of these proteins. The insertion of murine residues can be highly immunogenic in humans. Thus the production of proteins for therapeutic use in human cell lines appears as a promising alternative. In this context, the aim of this study was to clone and express the blood coagulation FVII in 3 human cell lines (HepG2, Sk-Hep-1, HKB-11) and select the best cell line for production of recombinant protein. The cells were modified with the lentiviral vector p1054-CIGWS containing the FVII gene and GFP gene marker. After cells modification we observed efficiency of transduction, in which 80% of BHK-21-FVIIr cells showed GFP expression, 73% of HepG2-FVIIr cells, 32% of HKB-11-FVIIr cells and 95% SK- Hep-FVIIr. Gene expression analysis by real-time PCR showed that the three modified human cell lines exhibited RNAm expression relative to FVIIr. When cells were treated with 5 ug/mL vitamin K in culture, the gene expression of FVIIr was similar in the three cell lines (HepG2: 164 563 URE, HKB-11: 119122 and SK-Hep URE: 124919 URE). For FVII activation, the main post translational modification is -carboxylation vitamin-K-dependent which envolves three enzymes, -carboxylase, VKORC1 and calumenina (inhibitor) . Gene expression of these enzymes was evaluated before and after treatment with vitamin K. It was observed that there was an increase in mRNA levels in human cells treated with vitamin K, suggesting that the treatment is capable of activating the enzymes of the vitamin K cycle. Cell growth kinetics showed that modified murine cells BHK-21 have a higher specific growth rate, around 25% more than human cells. However the kinetics of production of recombinant cell lines showed that human cells expressing rFVII 3-fold more rFVII than BHK-21 cells. Due the low rFVII production of murine cells, and the extremely slow growth profile of human cell line HepG2, the recombinant cell lines Sk-Hep-1-rFVII and HKB-11-rFVII have been selected for cultivation tests in suspension using microcarriers in spinners flasks. Over 10 days of cultivation the HKB-11 cells showed a cumulative production of rFVII 152 ug, corresponding to 304 IU and SK-Hep-1 cells showed a rFVII production of 202.6 ug, corresponding to 405.2 IU. In summary, our data demonstrate that human cell lines are effective for producing recombinant factor VII. Using our production model, human cells were better than murine cells (BHK-21) used by the industry. Thus, these human cell lines can be used as a new platform for the FVII production, as well as for other recombinant proteins, with less risk of developing inhibitor antibodies

Duas linhagens filogenéticas principais (LI e L2) foram definidas em Trypanosoma cruzi, com base em sequências de genes de rDNA e mini-exon e análise por RAPD (Souto et al. 1996). Neste trabalho investigamos a estrutura e atividade dos promotores do cistron ribossômico das duas linhagens de T. cruzi. O promotor da cepa Dm28 (L2) foi clonado e sua seqüência foi comparada com seqüências publicadas da região homóloga de CL (L1) e La Cruz (L2). A identidade entre os dois promotores de L2 foi de 98%, e entre estes e o de L1 foi de 82%. O ponto de início de transcrição foi mapeado, apresentando a mesma localização nas duas linhagens. A atividade dos promotores de L1 e L2 foi determinada em construções plasmidiais contendo o gene reporter da cloranfenicol acetil transferase (CAT). Experimentos de expressão transitória mostraram que o promotor de L1 foi funcional apenas em isolados de L1, enquanto que o promotor de L2 foi funcional em ambas as linhagens. A expressão do promotor de L2 em isolados de L1 foi maior do que a do promotor homólogo. Analisamos ainda a atividade dos dois promotores em um grupo de isolados que apresentam dois tipos de cistrons ribossômicos (grupo 1/2). Neste grupo de cepas observamos que ambos os promotores presentes nas construções são funcionais, embora o promotor de L2 induza maior expressão de CAT. Por outro lado, demonstramos que nestes isolados apenas o cistron ribossômico de tipo 2 é expresso in vivo. Neste trabalho analisamos ainda a eficiência de entrada das construções plasmidiais nas cepas de T. cruzi; caracterizamos a atividade de regiões do promotor de L2 e a eficiência do processo de \"trans-splicing\" para gerar mRNA de CAT contendo a seqüência de mini-exon na extremidade 5\'. / Two major phylogenetic lineages (L1 and L2) have been defined in Trypanosoma cruzi based on rDNA and mini-exon sequences and RAPD analysis (Souto et al., 1996). In the present work we have investigated the structure and activity of ribosomal RNA promoters from the two T. cruzi lineages. The promoter region of Dm28 strain (L2) was cloned and its sequence was compared with the homologous regions from the CL (L1) and La Cruz (L2) strains, whose sequences were previously published. The identity found between promoters of the two L2 strains was 98%, while the identity between L2 and L1 promoters was 82%. The transcription start point mapped in the two Lineages showed the same localization. The activity of L1 and L2 promoters was investigated through the use of plasmid constructs bearing bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) as reporter gene. Experiments of transient expression showed that the L1 promoter drove high CAT activity in L1 isolates, but essentially no activity in L2 strains. On the other hand, L2 promoter was functional in both Lineages. The expression driven by L2 promoter in L1 isolates was higher than that driven by the homologous promoter. We have also analysed the activity of both L1 and L2 promoters in a particular group of T. cruzi isolates (group 1/2) which contains two types of rRNA cistrons. It was observed that both promoters were functional in this group of strains, although L2 promoter drove higher CAT activity. This is an interesting result since we have shown that in group 1/2 isolates only the type 2 rRNA cistron is expressed in vivo. In the present study, we have also analysed the transfection efficiency of the plasmid constructs in T. cruzi strains; the activity of segments of the L2 promoter; and the efficiency of the \"trans-splicing\" process involved in the generation of mature CAT mRNA containing the mini-exon sequence at the 5\' end.

[pt] Linhagens de animais são bastante usadas para investigar as bases genéticas de várias desordens psiquiátricas. No primeiro estudo deste trabalho, desenvolveu-se ao longo de três gerações, duas linhagens de ratos para reagirem com alta (Cariocas com Alto Congelamento - CAC) ou baixa (Cariocas com Baixo Congelamento - CBC) resposta condicionada de congelamento a estímulos contextuais previamente associados a choques elétricos. Um segundo estudo investigou os efeitos de lesões eletrolíticas no complexo amigdalóide sobre a resposta condicionada de congelamento nestas duas linhagens de animais. Ratos controles, que não pertenciam a estas linhagens, foram usados para determinar uma linha de base da resposta de congelamento. Lesões foram feitas após a fase de aquisição, quando os ratos receberam 3 choques não sinalizados numa caixa de condicionamento. Lesões falsas foram feitas em ratos dos três grupos. Resultados mostraram que as lesões na amígdala diminuíram a resposta de congelamento nos três grupos. Os resultados também mostraram que lesões na amígdala produziram efeitos semelhantes nas linhagens CAC e CBC. Estes resultados são discutidos levando-se em conta possíveis circuitos neurais envolvidos na resposta de congelamento. / [en] Animal selected lines are often used to investigate the genetic basis of many psyquiatric disorders. In the first study of this work, selected lines of rats with high (Carioca High freezing- CHF) and low (Carioca Low Freezing- CLF) conditioned freezing to contextual cues previously associated with electric shocks were developed. In a second study, the effect of amygdaloid electrolytic lesions on conditioned freezing was investigated in these two selected lines. Control rats, which did not belong to the selected lines, were employed to determine conditioned freezing baseline. Lesions were made after the acquisition phase, when the rats received 3 unsignaled shocks in a conditioning chamber. Sham lesions were made in rats of all groups. Results indicated that the amygdaloid lesions decreased the freezing response in all the groups of animals. Results also revealed that the amigdaloid lesions produced similar effects in the CHF and CLF lines. These results are discussed in terms of possible neural circuitry involved in freezing response.

Um total de 8.961 amostras fecais coletadas de pacientes com diarréia aguda, no período de 1996 a 2006, no Estado de São Paulo foi testado para rotavírus por EIE. Destas, 20,0% foram positivas e posteriormente realizadas a caracterização dos rotavírus em genótipos G e P por nested RT-PCR. O genótipo G1 de rotavírus foi o mais freqüente, detectado em 35,2% das amostras, seguidos dos tipos G9, G2, G3, G4, infecção mista e G12. A associação mais freqüente foi a P[8]G1 e P[8]G9. Foi realizada a sequencia nucleotídica do gene 9 (VP7) de 38 rotavirus genótipo G1. Duas cepas foram analisadas dos anos de 1997, 1998, 2001 e 2002, três cepas dos anos 1996, 1999 e 2003, quatro cepas em 2000, sete cepas em 2004 e 2005, e cinco em 2006. Os 38 rotavírus G1 foram classificados em duas linhagens distintas, linhagem G1-I e linhagem G1-II. A linhagem G1-I foi detectada durante seis anos, 1996-1997, 2001-2002 e 2004-2006, e a linhagem G1-II foi detectada durante os anos de 1998-2001, e 2003-2005. Análises preliminares mostraram que Rotarix ® foi eficiente contra estas linhagens G1. / Rotavirus (RV) infections are recognized as a major cause of severe gastroenteritis in children worldwide. In March 2006, a monovalente P[8]G1, human RV vaccine (Rotarix® GlaxoSmithKline Biologicals) was introduced in Brazil into the routine childhood immunization schedule. Therefore, the study of genetic diversity among rotavirus strains before and after the introduction of this vaccine may be important for the development of vaccination strategies. A total of 8,961 fecal samples collected from patients with acute diarrhea, during the 11-year period surveillance in São Paulo State (1996 to 2006) were tested for rotavirus by ELISA. One thousand seven hundred eighty- four (1,784, 20.0%) were positive, and the characterization of the G and P genotypes was performed on 1,300 rotavirus samples by nested RT-PCR. The G1 type was the most prevalent rotavirus strain (35.2%). The second most prevalente was the G9 type (31.2%), followed by G2 (4.0%), G3 (3.5%), G4 (2.2%), mix infection (1.8%) and G12 (0.5%). The more frequent association was P[8]G1 and P[8]G9. We performed a sequence analysis of 38 P[8]G1 rotavirus strains, selected from a total of 341 P[8]G1.Two strains from 1997, 1998, 2001, and 2002 were analyzed; three strains from 1996, 1999, and 2003; four strains from 2000; seven strains from 2004, and 2005; and five strains from 2006. All 38 rotavirus G1 sequence in this study were found to be classified into two distinct lineages, lineage I with 44.7% (17/38) and lineage II with 55.3% (21/38). The G1I lineages were detected during six rotavirus seasons 1996-1997, 2001- 2002, and 2004-2006 whereas and lineage G1- II was detected during 1998-2001, and 2003-2005. Preliminary analyses 4 demonstrated that Rotarix® has been efficacious against these G1 lineages.

A doença de Chagas, zoonose causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, apresenta uma ampla distribuição na América Latina estendendo-se do Sul dos Estados Unidos até a Argentina. Estima-se existirem 10 milhões de pessoas infectadas e outras 25 milhões expostas ao risco. Apesar de descoberta há mais de um século, o mal de Chagas ainda é uma infecção grave que provoca grande impacto sócio-econômico, sem tratamento efetivo na fase crônica e que carece de conhecimentos científicos. O presente trabalho teve como objetivo a obtenção e o uso de linhagens consômicas de camundongos, na investigação da resistência. As linhagens consômicas foram produzidas por meio de acasalamentos programados e monitoração com marcadores polimórficos de DNA, onde um de seus cromossomos foi substituído pelo seu homólogo da outra linhagem. Como parentais foram utilizadas as linhagens isogênicas C57BL/6/J Unib, de fenótipo resistente (doadora) e A/JUnib, susceptível (receptora) empregadas na produção de cinco linhagens consômicas para os cromossomos 7 (CSs7), 11 (CSs11),14 (CSs14),17 (CSs17) e 19 (CSs19); descritos por Passos et al. (2003), como importantes no controle da infecção causada pela cepa Y do T.cruzi. Nos ensaios experimentais, os consômicos foram inoculados pela via i.p., com as doses de 101, 102, 103 e 104 empregando-se como controles animais de ambas as linhagens parentais. Em todos os consômicos, a resistência foi superior àquela observada no parental susceptível. Em um segundo protocolo, os consômicos foram acasalados com associações programadas e as progênies foram desafiadas empregando-se inóculos com doses crescentes de tripomastigotas. A resistência observada neste grupo foi também superior àquela observada no parental de fenótipo susceptível. Os resultados observados demonstram que o emprego das linhagens consômicas produzidas possibilitam avaliar a participação de cada cromossomo na resistência, bem como os efeitos da associação entre os cromossomos, que são uma estratégia eficiente no estudo de doenças multifatoriais de trato complexo, como a doença de Chagas. / Chagas disease, a zoonosis caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, has a wide distribution in Latin America and extends from the southern part of the United States to Argentina. A number of 10 million of infected people is estimated and another 25 million exposed to the risk. Although discovered over a century, Chagas disease is still a serious infection that causes great socioeconomic impact, with no effective treatment at the chronic phase and in which, a lack of scientific knowledge can be observed. The main goal of this work was that obtaining and using consomic strain of mice, the resistance could be investigated. Consomic strains were produced by programmed mating, in which the animals were monitored with DNA polymorphic markers, and one of his chromosomes was replaced by his homologue from another strain. As parental, were used, the inbred strains C57BL/6/J Unib with resistant phenotype (donor) and as receiver, the A/JUnib strain, that has a susceptible phenotype. These models were used to produce five consomic strains: for the chromosomes 7 (CSs7), 11 (CSs11), 14 (CSs14), 17 (CSs17) and 19 (CSs19), described by Passos et al. (2003) as important in controlling infection caused by the Y strain of T. cruzi. In experimental testing, the consomics were inoculated intraperitoneally at doses of 101, 102, 103 and 104 using as control, animals from both parental lines. In all consomics, resistance was higher than that observed in the susceptible parental. In a second protocol, the consomics were mated with scheduled associations and the progenies were challenged with inocula employing increasing doses of trypomastigotes. The resistance observed in this group was also higher than that observed in the parental with susceptible phenotype. The observed results demonstrate that the use of the consomic strains that were produced order to assess the contribution of each chromosome in the resistance, as well as the effects of association between chromosomes are an effective strategy in the study of complex multifactorial diseases tract, such as Chagas disease.

O fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da Hemofilia B, o qual é baseado na administração do fator de coagulação derivado de plasma humano ou da proteína recombinante produzida em células murinas. A terapia baseada nestas abordagens apresenta alto custo e está associada às contaminações com vírus e príons, além do desenvolvimento de inibidores de FIX. Esses efeitos aumentam o risco de morbidade e mortalidade relacionadas às hemorragias. Neste trabalho, clonamos o cDNA do FIX em um vetor lentiviral e avaliamos a expressão da proteína recombinante em duas linhagens celulares humanas. A clonagem do cDNA do FIXh no vetor de expressão lentiviral 1054 foi confirmada através da análise com enzimas de restrição específicas obtendo-se as bandas esperadas de 1407 pb e 10054 pb visualizadas em gel de agarose. As linhagens celulares 293T e SK-Hep-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral 1054-FIX gerado em nosso laboratório e as células que apresentaram maior expressão de EGFP foram selecionadas e separadas por citometria de fluxo. A quantificação da expressão de FIXrh foi realizada por ensaios de ELISA e cromogênico. A quantificação de FIXrh total foi de 500 ng/106 células para a linhagem 293T e 803 ng/106 células para a linhagem SK-Hep-1. A atividade biológica específica de FIXh nas células 293T e SK-Hep-1 foi 0,047 UI/106 células e 0,186 UI/106 células, respectivamente. Com o intuito de avaliar o perfil de produção de FIXrh ativo ao longo do tempo, foi realizado um acompanhamento de 180 dias, no qual foi observado que a linhagem SK-Hep-1 cessou a expressão de FIX, enquanto as células 293T mantiveram a expressão durante o período. O FIXrh foi caracterizado por western blot confirmando a presença de uma banda imunoreativa esperada de 57 kDa. As linhagens 293T e SK-Hep-1 apresentaram 7,67 e 17 cópias do vetor inserido/célula, respectivamente. Considerando a importância do processo de ?-carboxilação, foi realizada uma análise da expressão gênica dos genes envolvidos neste processo, tais como o VKORC1, ?-carboxilase e o inibidor calumenina, nas linhagens celulares. Os resultados demonstraram razões elevadas entre os genes VKORC1 e calumenina e VKORC1 e ?-carboxilase nas duas linhagens. A cinética de crescimento das células foi realizada por um período de 7 dias apresentando diferenças significativas entre as células SK-Hep-1 transduzidas e não transduzidas, enquanto que as células 293T não presentaram diferenças estatísticas no crescimento celular. A suplementação do meio de cultura com íons Ca+2 e Mg+2 foi testada para avaliar sua influência na expressão de FIXrh ativo. As células 293T apresentaram melhor desempenho nas concentrações de 0,5 mmol/L de Ca+2 e 1,0 mmol/L de Mg+2 e as células SK-Hep-1 no meio de cultura não suplementado. Nossos dados indicam que a linhagem hepática SK-Hep-1 é a melhor produtora de FIXrh funcional e as comparações realizadas entre os dois tipos celulares são importantes na caracterização do comportamento de linhagens geneticamente modificadas voltadas para a expressão de proteínas recombinantes heterólogas e abre novos caminhos para futuros estudos que visam o melhoramento da produção desse tipo de proteína. / Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of Hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factors or recombinant protein produced in murine cells. Coagulation therapy based on these approaches has high costs and is closely associated with prion and virus contamination besides the FIX inhibitors development. These effects increase the risk for bleeding-related morbidity and mortality. The purpose of this study was to clone hFIX into a lentiviral vector and evaluate the expression of the recombinant protein in two human cell lines. The cloning of the hFIX cDNA into 1054 lentiviral expression vector was confirmed by enzymatic restriction obtaining the expected 1407 bp and 10054 bp bands in agarose gel. The 293T and SK-Hep-1 cell lines have been stable transduced with 1054-FIX lentiviral vector generated in our laboratory and the cells with higher expression of EGFP were selected and separated by flow cytometry. The quantification of the expression of rhFIX was performed by ELISA and chromogenic assays. The concentration of total rhFIX was 500 ng/106 cells in 293T cell line and 803 ng/106 cells in SK-Hep-1 cell line. The biological activity of FIX secreted by 293T and SK-Hep-1 was 0,047 UI/106 cells and 0,186 UI/106 cells, respectively. In order to evaluate the active rhFIX production profile over time, we conducted a monitoring of 180 days, which was noted that the SK-Hep-1 cell line ceased FIX expression, while 293T cells maintained the expression during this period. rhFIX was characterized by western blot analysis confirming the presence of a expected 57 kDa immunereactive band. The 293T and SK-Hep-1 cell lines showed 7.67 and 17 integrated vector copies/cell, respectively. Considering the importance of the ?-carboxylation process, we performed a gene expression analysis of genes involved in this process, such as VKORC1, ?-carboxylase and calumenin, in cell lines. The results showed high ratios among the genes VKORC1 and calumenin and among VKORC1 and ?-carboxylase in both cell lines. The cell growth kinetics was performed by a 7-day period, showed significant differences between SK-Hep-1 transduced cells and non-transduced cells, whereas 293T cells showed no difference in cell growth. Enrichment of culture medium with Ca +2 and Mg +2 ions was tested to evaluate its influence on the expression of active FIX. 293T cells showed better performance in 0.5 mmol/L Ca+2 and 1.0 mmol/L Mg +2 concentrations and SK-Hep-1 cells in culture medium control. Our data indicate that transduced SK-Hep-1 cells are the best producer of functional rhFIX, and comparisons between these two cell lines are important in characterizing the behavior of genetically modified cell lines focused on the heterologous expression of recombinant proteins and opens new avenues for future studies aimed at improving the production of this type of protein.