Parmi les bactéries lactiques, Lactococcus lactis est la plus utilisée en fabrication fromagère. Actuellement, les ferments lactiques sont majoritairement choisis pour leurs propriétés acidifiantes, protéolytiques et aromatiques. Un autre paramètre majeur est le potentiel redox (Eh). En effet, un Eh réducteur est souvent associé à une bonne qualité aromatique. L’activité réductrice de L. lactis pourrait donc être un nouveau paramètre à prendre en compte dans la maitrise du Eh dans la fabrication des produits laitiers fermentés. Néanmoins, les mécanismes impliqués dans l’activité réductrice de L. lactis demeurent encore inconnus. L’objectif de ce présent travail de thèse a été de les découvrir. Tout d’abord, nous avons développé des milieux de culture gélosé de discrimination redox utilisant des sels de tétrazolium pour cribler une banque de mutants aléatoires de L. lactis. Ceci a permis de démontrer la participation partielle de la chaine de transport d’électrons (Ménaquinones) dans l’activité réductrice de L. lactis. Ensuite, l’approche biochimique nous a permis de déterminer les composés biochimiques principaux contribuant à la diminution du Eh vers des valeurs très réductrices. La présence de groupements thiols exofaciaux est responsable du Eh réducteur atteint par L. lactis. Enfin, l’analyse protéomique utilisant un marquage spécifique des protéines thiols de surface a mis en évidence la présence d’une dizaine de protéines exposant des groupements thiols exofaciaux potentiellement impliquées dans l’activité réductrice de L. lactis. Les thiols sont connus pour être de très puissants antioxydants ce qui confère à L. lactis un intérêt supplémentaire à prendre en considération dans l’élaboration des produits laitiers fermentés. / Among the Lactic Acid Bacteria, Lactococcus lactis is the most used in cheese making. Nowadays, starters are used mainly for their acidifying, proteolytic and flavor properties. Another important parameter is the redox potential (Eh). Indeed, reducing Eh is often related to good flavor properties. The reducing activity of L.lactis should be therefore a new parameter to take into account in the monitoring of Eh during dairy fermented products making. Nevertheless, the mechanisms involved in the reducing activity of L.lactis are still unknown. The aim of this work was to understand them. First of all, we have developed tetrazolium salts agar plate media in order to screen a random bank of mutants of L. lactis on their redox capacities. These media allowed us to demonstrate the partial implication of the electron transport chain (Menaquinone) in the reducing activities of L. lactis. Secondly, we have determined the biochemical compounds involved in the decrease of Eh to very reducing values thanks to a biochemical approach. Exofacial thiol groups are mainly responsible for the reducing Eh reached by L.lactis. Lastly, a proteomical analysis using a specific staining of thiols surface proteins revealed the presence of about ten proteins displaying thiols exofacials groups. These proteins might be involved in the reducing activity of L.lactis. Thiols are known to be very strong antioxidants which confer to L. lactis an additional interest to consider in dairy products making.

Lactic acid bacteria were isolated from 10 samples of the traditionally fermented foods (5 samples of Vietnamese fermented pork roll and 5 samples of the salted field cabbage) and 5 samples of fresh cow milks collected from households in Vietnam. 22 strains of lactic acid bacteria were isolated for inhibition to Lactobacillus plantarum JCM 1149. Of these, only 2 strains including DC1.8 and NC1.2 have rod shape, the others have coccus shape. 7 strains showing higher antibacterial activity were selected for checking spectrum of antibacteria with indicator bacteria consistting of Bacillus subtilis ATCC 6633, Enterococcus faecium JCM 5804 and Staphylococcus aureus TLU. By which, 3 strains including NC3.5 (from Vietnamese fermented pork roll), DC1.8 (from salted field cabbage) and MC3.19 (from fresh cow milk) were selected because of their higher antibacterial ability. However, the antibacterial activity of the lactic acid bacteria can be based on their disposable compounds and some other antibacterial compounds produced during their growth (such as lactic acid, H2O2, bacteriocins, etc.). For seeking lactic acid bacteria with capability of producing bacteriocins, antibacterial compounds with protein nature, 3 above strains were checked sensitiveness to proteases (including protease K, papain, α – chymotrypsin and trypsin). Because bacteriocins are proteinaceous antibacterial compounds, so their antibacterial activity will be reduced if proteases are added. The result showed DC1.8 and MC3.19 were capable of producing bacteriocin during culture process. They were identified as Lactobacillus acidophilus and Lactococcus lactis and classified, respectively, based on analysis chemical characterisitcs by standard API 50 CHL kit and phylogeny relationship by 16s rRNA sequences. / Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ 10 mẫu thực phẩm lên men truyền thống (5 mẫu nem chua, 5 mẫu dưa cải bẹ muối) và 5 mẫu sữa bò tươi được thu thập từ các hộ gia đình ở Việt Nam. 22 chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập với tiêu chí có khả năng kháng lại vi khuẩn kiểm định Lactobacillus plantarum JCM 1149. Trong số đó, 2 chủng DC1.8 và NC1.2 có tế bào hình que, các chủng còn lại có tế bào hình cầu. 7 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao được lựa chọn để xác định phổ kháng khuẩn rộng hơn với ba loài vi khuẩn kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, Enterococcus faecium JCM 5804 và Staphylococcus aureus TLU. Từ đó lựa chọn được 3 chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn hẳn. Các chủng này gồm NC3.5 phân lập từ nem chua, DC1.8 phân lập từ dưa cải bẹ muối và MC3.19 phân lập từ sữa bò tươi. Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic bao gồm những hợp chất nội tại có trong nó và cả những hợp chất được sinh ra trong quá trình phát triển của nó (như axit lactic, H2O2, bacteriocin, …). Với định hướng tìm chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin, chất kháng khuẩn có bản chất protein, 3 chủng trên được kiểm tra độ nhạy cảm với các protease (gồm protease K, papain, α – chymotrypsin và trypsin). Do bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất protein nên hoạt tính kháng khuẩn của chúng sẽ bị giảm nếu protease được bổ xung vào. Kết quả lựa chọn được chủng DC1.8 và MC3.19 có khả năng sinh bacteriocin. Hai chủng này được phân loại đến loài nhờ vào phân tích đặc điểm sinh hóa bằng kit API 50 CHL và mối quan hệ di truyền thông qua trình tự gen 16s rRNA. Kết quả phân loại đã xác định chủng DC1.8 thuộc loài Lactobacillus acidophilus và chủng MC3.19 thuộc loài Lactococcus lactis.

Les bactéries lactiques (BL), communément employées en industrie agroalimentaire, font à présent l'objet d'études visant à les utiliser pour de nouvelles applications telles que le développement de vaccins vivants ou la délivrance de molécules d'intérêt biothérapeutique chez l'hôte. Dans cette optique, différents systèmes de présentation de protéines à la surface des bactéries à Gram positif ont été développés. L'un d'entre eux est basé sur l'activité d'enzymes, les sortases, liant de façon covalente les protéines à la paroi bactérienne. Nous avons utilisé la BL modèle, Lactococcus lactis, afin d'étudier les sortases, jusqu'alors étudiées essentiellement chez les bactéries pathogènes. La sortase A (SrtA) est responsable de l'ancrage d'au moins cinq protéines à motif LPxTG à la surface. Une seconde sortase, de classe C (SrtC), a été identifiée et caractérisée. Nous avons mis en évidence la capacité de L. lactis à produire des pili à sa surface qui sont polymérisés par SrtC et ancrés à la paroi par SrtA. Ces pili résultent de la polymérisation de la piline majeure YhgE qui peut être surplombée par la piline mineure de coiffe YhgD. La production de pili chez L. lactis entraîne un changement de comportement des cellules résultant à des phénotypes particuliers. Nous avons pu l'associer à l'auto-agrégation des cellules en culture liquide, à la formation de biofilms hétérogènes et aériens, et à l'adhésion à la mucine gastrique de porc. Plus précisément, YhgE a été impliquée dans l'auto-agrégation et les biofilms atypiques, et une troisième piline, dont l'appartenance au pilus n'a pas été démontrée, semble aussi impliquée dans la production de biofilms atypiques.

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Au Québec, plusieurs fromagers cherchent à produire des fromages du terroir, aux caractéristiques uniques, à partir d’un ou de quelques laits dont la composition est influencée par des facteurs génétiques et environnementaux. Ce projet vise à démontrer si des laits du terroir québécois crus et pasteurisés, ainsi que certaines de leurs composantes laitières (perméat (P), caséines (CN), protéines de lactosérum (IPL) et concentrés de bactéries (CB)), obtenues par microfiltration et ultrafiltration du lait, ont un impact sur la croissance et l’activité de microflores laitières. La croissance de Lactococcus lactis subsp. lactis et de Lactococcus lactis subsp. cremoris dans des laits du terroir crus et pasteurisés a été étudiée et le développement de trois souches de Geotrichum candidum a été suivi dans des caillés modèles faits à partir de certains de ces laits. De plus, la croissance de bactéries lactiques dans des mélanges de fractions laitières (P-CN-IPL, P-CN, P-IPL, P et P-CB) d’un lait du terroir et d’un lait industriel crus et pasteurisés a été évaluée. Les résultats ont démontré que l’origine des laits du terroir et le traitement thermique ont influencé le développement de certaines souches de lactocoques, alors que le développement de G. candidum était influencé par son caractère dimorphique. Dans les mélanges laitiers, la croissance des lactocoques était moins élevée dans les mélanges de laits pasteurisés que de laits crus, ce qui est contraire aux observations faites dans les laits entiers. La microfiltration 1,4 µm, lors du retrait de la fraction CB, semble avoir retenu des facteurs de croissance qui se retrouveraient dans les laits pasteurisés et qui favoriseraient la croissance de certaines bactéries lactiques. Ainsi, l’origine du lait, la pasteurisation et la filtration du lait sur membranes ont un impact sur le développement des microflores laitières et il est important pour le maître-fromager de s’adapter à ces changements. / In the province of Quebec, several cheese makers seek to produce local cheeses with unique characteristics, from one or a few milks whose composition is influenced by genetic and environmental factors. The aim of this project was to demonstrate whether raw and pasteurized milk from Québec, and certain milk components (permeate (P), caseins (CN), whey proteins (IPL) and concentrated bacteria (CB)), obtained by using microfiltration and ultrafiltration of milk, have an impact on the growth and activity of dairy microflora. The growth of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris in the raw and pasteurized local milks was studied and the development of three strains of Geotrichum candidum was followed in curds models made from some of these milks. In addition, the growth of lactic acid bacteria in mixtures of milk fractions (P-CN-IPL, P-CN, P-IPL, P and P-CB) of raw and pasteurized local milk and an industrial milk was evaluated. Results showed that the origin of the local milk and the heat treatment influenced the development of certain strains of Lactococcus, whereas the development of G. candidum was influenced by its dimorphic character. In dairy mixes, the growth of lactococci was lower in pasteurized milk mixtures than in raw milk mixtures, contrary to observations made in whole milk. The microfiltration at 1,4 µm, when removing the CB portion, seems to have retained growth factors that would be found in pasteurized milk and that would promote the growth of certain lactic acid bacteria. In this way, the origin of milk, pasteurization and filtration of milk on membranes have an impact on the development of dairy microflora and it is important for the cheese maker specialist to adapt to these changes.

Le principal objectif de ce projet était d'étudier un système d'inoculation et préfermentation en continu du lait par une culture mixte avec cellules immobilisées et contenant une souche forte productrice de nisine Z, Lc. diacetylactis UL719, et deux souches sensibles à la bactériocine, un Lb. rhamnosus, producteur d’exopolysaccharides, et un Lc. cremoris, sélectionné pour ses capacités d’acidification. Des fermentations du lait inoculé de façon traditionnelle par la culture mixte en cellules libres ont également été réalisées. Durant ces fermentations en batch, la croissance de Lc. diacetylactis est stimulée par la présence des deux autres souches, entraînant une augmentation de la production de nisine. Le système d'inoculation et préfermentation en continu du lait avec cellules immobilisées, conduit sur une période de trois semaines, a permis d'inoculer massivement le lait par Lc. diacetylactis et Lb. rhamnosus. Le lait fermenté obtenu après une étape d'incubation additionnelle contenait également une population élevée de ces deux souches conduisant à une production élevée de nisine et une augmentation de la concentration d'exopolysaccharides comparativement à des fermentations en batch du lait par la culture mixte en cellules libres et inoculé de façon traditionnelle. La méthode de PCR en temps réel développée durant ce projet a permis de quantifier les faibles niveaux de populations de Lc. cremoris dans les laits fermentés et préfermentés. Une augmentation avec le temps de préfermentation de la tolérance à la nisine des cellules de Lb. rhamnosus ainsi que de la capacité acidifiante pour les deux souches majoritairement retrouvées dans le lait préfermenté fut également observée. / The objective of this work was to study an immobilized-cell system for continuous inoculation and prefermentation of milk by a mixed culture containing a nisin Z producer (Lc. diacetylactis UL719) and two nisin-sensitive strains for acidification (Lc. cremoris) and exopolysaccharide production (Lb. rhamnosus RW-9595M). Batch fermentations of milk traditionally inoculated with free-cell mixed culture of the three strains were also performed at different temperatures. In these conditions, we showed that growth of Lc. diacetylactis was stimulated by commensalism, leading to an increase of nisin Z production. Continuous prefermentation of milk with immobilized cells carried out over 3 weeks leads to high inoculation of milk with Lc. diacetylactis and Lb. rhamnosus . In fermented milk, obtained after an additional batch incubation, populations of these two strains remained at high concentrations leading to high nisin production and higher exopolysaccharide concentration compared to traditional batch fermentation of milk. The real-time PCR method, developed in this project, was successfully used to quantify very low cell concentrations of Lc. cremoris in prefermented and fermented milks. Immobilization and continuous culture also lead to important cell physiological adaptations for Lb. rhamnosus and Lc. diacetylactis. Lb. rhamnosus became much more tolerant to nisin Z, and both strains exhibited a large increase in milk acidification capacity.

Le chloroplaste est un organite spécifique de la cellule végétale. Il est délimité par une double membrane ou enveloppe qui renferme de nombreux systèmes de transports d'ions et de métabolites essentiels au fonctionnement du chloroplaste et de la cellule végétale. A ce jour, seuls quelques transporteurs de métaux associés à l'enveloppe des plastes ont été identifiés : un transporteur de fer, un transporteur de magnésium ainsi que deux ATPases à cuivre de type P1B : HMA1 et PAA1. PAA1 représenterait la voie principale d'import du cuivre dans le chloroplaste, notamment pour alimenter la photosynthèse. HMA1 constituerait une voie additionnelle d'import du cuivre, voie essentielle pour répondre à un stress oxydatif qui apparaît en particulier lorsque la plante est cultivée en lumière forte. Afin de mieux comprendre les rôles respectifs de ces deux ATPases dans la régulation de l'homéostasie du cuivre chloroplastique, deux approches complémentaires ont été développées : - une approche in planta visant à produire de nouvelles lignées affectées dans l'expression de l'une (mutant paa1 surexprimant HMA1) ou de ces deux ATPases (double mutant hma1/paa1), puis à identifier des conditions (stress lumineux, stress salin, excès de métaux) révélant le rôle essentiel de ces ATPases ou induisant une réponse transcriptionnelle différente des gènes codant ces ATPases ou d'autres acteurs liés à l'homéostasie du cuivre... Les résultats obtenus montrent que la fonction de HMA1, connue pour être essentielle lors d'un stress lumineux, est aussi requise lorsque la plante subit un stress salin. Ces résultats confortent le rôle de HMA1 dans la délivrance du cuivre à la superoxyde dismutase (cuivre/zinc) du chloroplaste. D'autre part, nous avons montré qu'en condition de culture photoautotrophe, le cuivre permet de supprimer partiellement la photosensibilité du mutant hma1, validant ainsi l'implication de HMA1 dans l'homéostasie du cuivre. Nous avons aussi démontré que les fonctions de HMA1 et PAA1 ne sont pas redondantes. Le cuivre importé par ces deux ATPases est probablement délivré à des protéines cibles par des voies différentes. Enfin, nous avons montré qu'il existe une troisième voie d'import de cuivre dans le chloroplaste, voie encore non caractérisée. - une approche in vitro visant à produire ces deux ATPases HMA1 et PAA1 dans le système hétérologue Lactococcus lactis afin de déterminer leurs spécificités ioniques et leurs caractéristiques biochimiques. Le système d'expression procaryote L. lactis a été mis en place au laboratoire et s'avère parfaitement adapté à la production de protéines membranaires de plantes. Ce système a permis de produire plusieurs protéines membranaires d'Arabidopsis, dont HMA1 et PAA1, en quantités compatibles avec des analyses biochimiques. Nous avons déterminé les conditions de solubilisation et de purification de ces deux protéines. Nous n'avons pas pu mesurer d'activité ATPase associée à ces protéines. En revanche, nos données indiquent que ces deux protéines recombinantes peuvent lier l'un de leur substrat ; l'ATP. Nous avons aussi pu démontrer que PAA1 peut lier du cuivre sous forme 1+ et sous forme 2+. Au bilan, ces données suggèrent que le contrôle de l'homéostasie du cuivre chloroplastique requiert plusieurs systèmes de transport indépendants et une régulation fine de ces voies d'import de cuivre afin d'alimenter les besoins liés à la photosynthèse et les besoins liés aux mécanismes de résistance aux stress oxydatifs.

The use of Lactic Acid Bacteria (LAB), such as Lactococcus lactis (LL), as DNA delivery vehicles represents an interesting strategy as they are regarded as safe. Wild type (wt) LL or recombinant invasive LL, were able to trigger DNA expression by epithelial cells both in vitro and in vivo. However, important information about how LL can transfer DNA plasmids is still missing. Therefore, we decided to construct a new recombinant invasive LL strain expressing mutated Internalin A (mInlA) from the pathogen Listeria monocytogenes to understand the manner by which the DNA is transferred to mammalian cells. mInlA expression was detected by FACS analysis and LL-mInlA strain showed to be more invasive than the wt strain after co-incubation assays with non-confluent or polarized intestinal epithelial cells (IECs). Confocal microscopy confirmed the invasive status of LL-mInlA which demonstrated to deliver more efficiently the eukaryotic expression vector coding the allergen β-lactoglobulin, pValac:BLG, in vitro to IECs and to dendritic cells (DCs). LL-mInlA was also capable to transfer pValac:BLG to DCs across a monolayer of differentiated IECs. In vivo, invasive lactococci tended to increase the number of mice expressing BLG. Moreover, noninvasive or invasive LL-mInlA stimulated the secretion of the pro-inflammatory cytokine IL-12 in DCs and, in vivo, after oral or intranasal immunization trials, non-invasive LL polarized the immune response more in the type 1 direction while invasive LL generated a Th2-type response in immunized animals. All these data gives new insights on the mechanism of lactococci uptake for delivery of therapeutics.

Streptococcus equi is the causative agent of strangles, a prevalent and highly contagious disease of horses. Despite the animal suffering and economic burden associated with strangles, little is known about the molecular basis of S. equi virulence. Here we have investigated the contributions of a specific lipoprotein and the general lipoprotein processing pathway to the abilities of S. equi to colonize equine epithelial tissues in vitro and to cause disease in both a mouse model and the natural host in vivo. Colonization of air interface organ cultures after they were inoculated with a mutant strain deficient in the maturase lipoprotein (prtM138-213, with a deletion of nucleotides 138 to 213) was significantly less than that for cultures infected with wild-type S. equi strain 4047 or a mutant strain that was unable to lipidate preprolipoproteins (lgt190-685). Moreover, mucus production was significantly greater in both wild-type-infected and lgt190-685-infected organ cultures. Both mutants were significantly attenuated compared with the wild-type strain in a mouse model of strangles, although 2 of 30 mice infected with the lgt190-685 mutant did still exhibit signs of disease. In contrast, only the prtM138-213 mutant was significantly attenuated in a pony infection study, with 0 of 5 infected ponies exhibiting pathological signs of strangles compared with 4 of 4 infected with the wild-type and 3 of 5 infected with the lgt190-685 mutant. We believe that this is the first study to evaluate the contribution of lipoproteins to the virulence of a gram-positive pathogen in its natural host. These data suggest that the PrtM lipoprotein is a potential vaccine candidate, and further investigation of its activity and its substrate(s) are warranted.

Le stress gastro-intestinal représente une condition physiologique cruciale rencontrée par les bactéries probiotiques durant le transit digestif. En effet, ces bactéries ingérées doivent survivre et exprimer leurs fonctions métaboliques spécifiques sous les conditions acides dans l'estomac, et en présence de bile dans l'intestin. Dans le cadre de ce projet de maîtrise, nous proposons d'étudier l'effet d'un stress gastro-intestinal sur la capacité de certaines souches de bactéries lactiques et probiotiques à produire leur bactériocines. Deux souches commerciales à savoir Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis UL719 et Pediococcus diacetilactici UL5, et une souche récemment isolée et caractérisée à partir de fèces de nouveaux- nés à savoir Bifidobacterium thermophilum RBL67, souches productrices de la nisine Z, de pediocine PA-1 et de composés anû-Listeria, ont été utilisées respectivement. Dans un premier temps, l'effet du pH acide (pH 2.0), de la bile (0.3%) de même que leur combinaison (acide/bile) sur la capacité de ces souches à produire leurs substances inhibitrices ont été testées dans un milieu simulant le suc gastrique et intestinal. Deuxièmement et afin de confirmer la capacité de Lac. diacetylactis et de B. thermophilum à survivre et à produire des bactériocines durant le stress gastro-intestinal, les résultats obtenus ont été confirmés en utilisant un simulateur dynamique in vitro du tube digestif (modèle TIM-1). Les deux souches ont montré une résistance à l'acide gastrique. Cependant, leur survie a été réduite dans le duodénum due à la présence de bile. Lac. diacetylactis UL719 était beaucoup plus tolérante à la bile que B. thermophilum RBL67. Des colonies dans chaque compartiment ont été isolées afin d'évaluer l'impact du stress gastro-intestinal sur la capacité des souches testées à produire des acides organiques et des bactériocines. Les résultats ont indiqué que le passage sur le modèle gastro-intestinal et l'exposition à différentes conditions de stress n'ont pas affecté la production d'acides organiques et de bactériocines par les deux souches testées.