Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Resumo: A leishmaniose é uma doença crônica, causada por parasitos flagelados do gênero Leishmania, podendo se apresentar nas formas clínicas, tegumentar (cutânea), mucocutânea e visceral (calazar). A doença é considerada negligenciada pela OMS, pois não existem até o momento métodos eficientes de tratamento e controle para a mesma. Os telômeros desse parasito são um dos potenciais alvos no desenvolvimento de novos fármacos para o combate dessa doença e, para tanto, é necessário o entendimento da biologia desta estrutura. Uma enzima de grande interesse para o estudo dos telômeros é a telomerase que é a responsável pela manutenção e elongação dessas estruturas nos terminais dos cromossomos. A manutenção dos telômeros não é unicamente regulada pelo complexo ribonucleoproteico (RNP) da telomerase, mas também por proteínas que se associam ao complexo e ao DNA telomérico, tornando a ação do complexo mais efetiva e estável. Até o momento, o complexo telomérico de Leishmania amazonensis é o melhor caracterizado dentre os tripanosomatídeos, porém pouco se sabe sobre a biogênese e a composição do complexo RNP telomerase deste parasito. HSP83, ortólogo da HSP90 humana em Leishmania é uma chaperona altamente conservada, dependente de ATP e expressa quando as células são submetidas a diferentes tipos de estresse estando envolvida em transdução de sinal, crescimento, diferenciação celular e sobrevivência. Também é de grande importância para patógenos humanos, em particular aqueles cujo ciclo de v... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmaniasis is a chronic disease, caused by flagellated parasites of the genus Leishmania, which could be present in different clinical forms such as, tegumentar (cutaneous), mucocutaneous and visceral (kalazar). WHO classifies leishmaniasis as a neglected disease since there are no efficient methods for disease treatment and control. Parasites telomeres are one of the potential targets for the development of new anti-parasitic drugs to combat this disease and, thus, it is necessary to understand the biology of this structure. Telomerase is the enzyme responsible for maintaining and replicating these structures at the chromosomes termini. However, telomeres maintenance is not only regulated by the telomerase ribonucleoprotein complex (RNP), but also by proteins that associate with the complex and with telomeric DNA, making the action of the complex more effective and stable. To date, the telomeric complex of Leishmania amazonensis is the best characterized among trypanosomatids, although little is known about the biogenesis and composition of the RNP telomerase complex of this parasite. HSP90 is a highly conserved, ATP dependent chaperone and expressed when cells are subjected to different types of stress. It is also involved in signal transduction, growth, cell differentiation and survival of the chaperonin is of great importance for human pathogens, particularly those transmitted by insects to a mammalian host, and which suffer from environmental changes such as temperatu... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:37:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao completa - Lenilton Silveira.pdf: 2646876 bytes, checksum: fbad76d9c78a2517359d01fc6fc96b45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:37:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao completa - Lenilton Silveira.pdf: 2646876 bytes, checksum: fbad76d9c78a2517359d01fc6fc96b45 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Neste estudo nós realizamos um monitoramento cinético, ex vivo, da resposta imune do hospedeiro, induzida durante infecção murina por L. (L.) amazonensis. Fêmeas de camundongos BALB/c foram inoculadas subcutaneamente no coxim plantar esquerdo com 106 promastigotas de fase estacionária e o progresso da infecção foi monitorado por medição da área de lesão. Os linfócitos dos linfonodos poplíteos drenantes da lesão (LNs) foram analisados por citometria de fluxo (FACS - fluorescence-activated cell sorting) e por ressonância plasmônica de superfície (SPR - surface plasmon resonance). Os resultados de FACS indicaram que o perfil de linfócitos é definido na primeira semana de infecção e caracterizado por elevados níveis de linfócitos B e por uma diminuição de linfócitos T. O percentual de linfócitos B foi três vezes maior quando comparado com o dos camundongos não infectados e os linfócitos T eram 1,5 vezes mais baixo. Estes valores permaneceram constantes ao longo da infecção até o ultimo ponto analisado. Foi observado um discreto aumento (0.3 a 0.5) na relação CD8+/CD4+ nos animais infectados, enquanto nos não infectados esta relação permaneceu em torno de 0.35, até o último dia do estudo. Adicionalmente, nós realizamos ensaios de detecção de linfócitos T CD8+ dos LNs, em tempo real, por SPR, utilizando moléculas H-2 Ld:Ig ligadas à peptídeos da região COOH-terminal de cisteína-proteinase B de L. (L.) amazonensis (P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5= EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9= MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). Os peptídeos testados indicaram valores de constante de associação (0.16x107 – 22.0x107) e dissociação (0.047-0.123) favoráveis a formar complexos com os dímeros H-2 Ld em pH neutro, com valores de energia livre de Gibbs < 0. De forma geral, a ligação das células ao complexo H-2 Ld:Ig/peptídeo, mostrou uma resposta (RU - Response unit) de dissociação maior em células de animais infectados (113 RU – 465 RU) que nas dos animais não infectados (71 RU – 304 RU). A resposta aos complexos H-2 Ld:Ig/peptídeo revelou diferenças de reconhecimento nas semanas avaliadas, como alta resposta ao P1.10 (227 RU) na 3ª semana e ausência de resposta ao P1.7 na 16ª semana. Em uma mesma semana de análise, vimos que o nível de reconhecimento dos peptídeos difere entre eles, uns apresentando alto valor de RU e outros um valor mais baixo: 3ª (P1.10>P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4ª (P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6ª (P6.4>P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12ª (P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18ª semana (P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Embora, apenas, dois peptídeos tenham sido testados na 1ª semana, a maior resposta foi relacionada ao P1.7 (161 RU), seguido do P1.9 (115 RU). Os dados gerados indicaram uma flutuação na população dos linfócitos T e B, assim como o envolvimento de linfócitos T CD8+ direcionados a peptídeos da região COOH-terminal da CPB, ao longo da infecção / In this study, we performed a kinetic ex vivo monitoring of host immune responses during murine infection with Leishmania (Leishmania) amazonensis. Female BALB/c mice were injected subcutaneously in the left hind footpad with 106 promastigotes in stationary growth phase and the progression of infection was monitored by measuring lesion area expansion. Lymphocytes from lesion draining popliteal lymph nodes (LNs) were analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and surface plasmon resonance (SPR). FACS results indicated that the lymphocytes profile is defined in the first week post infection and was characterized by high levels of B cells and by a decrease in T cell numbers. The percentage of B lymphocytes was three times higher when compared to the non-infected mice and T lymphocytes were up to 1.5 times lower. These values remained constant throughout infection until the last point analyzed. It was observed a slight increase (0.3 to 0.5) in the CD8+/CD4+ ratio in the infected mice, whereas in the not infected group this ratio remained around 0.35, until the last assessed infection day. Additionally, we have performed an assay to detect CD8+ T lymphocytes from LNs in real time, by SPR, utilizing H-2 Ld:Ig molecules bound to peptides derived from the COOH-terminal region of cysteine-proteinase B from L. (L.) amazonensis (P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5= EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9= MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). The peptides tested presented values of association (0.16x107 – 22.0x107) and dissociation constant (0.047-0.123) favorable to form complexes with H-2 Ld at neutral pH, with values of Gibbs free energy < 0. In general, the binding of cells to the H-2 Ld:Ig/peptide complexes showed a response unit (RU) of dissociation higher in cell preparations from infected mice (113 RU - 465 RU) than the cells from uninfected mice (71 RU – 304 RU). The recognition response to the complex H-2 Ld:Ig/peptide were assessed at different weeks as high response to P1.10 (227 RU) at 3th week and absence of response to P1.7 at 16th week. In the same week of analysis, we found that the level of recognition of peptides differs among them, some presenting a high value of RU and others a lower value: 3th (P1.10 >P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4th (P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6th (P6.4> P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12th (P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18th week (P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Although only two peptides were tested at 1th week, the highest response was related to P1.7 (165 RU), followed by P1.9 (115 RU). Generated data indicated a fluctuation in the population of T and B lymphocytes, as well as the involvement of CD8+ T cells directed to peptides of the COOH-terminal region of the CPB, throughout the infection

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T16:00:52Z No. of bitstreams: 1 Mariela Ferreira de Vasconcelos.pdf: 1477755 bytes, checksum: ff699f8bebce035f77777ac4343e2091 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T16:00:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariela Ferreira de Vasconcelos.pdf: 1477755 bytes, checksum: ff699f8bebce035f77777ac4343e2091 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses constituem um conjunto de doenças negligenciadas que afetam cerca de 12 milhões de indivíduos em 98 países. Os medicamentos utilizados no controle da infecção estão associados à baixa eficácia, alta toxicidade, dificuldade de administração, altos custos e crescente resistência. A procura por novas alternativas de tratamento é, portanto, uma prioridade. Este trabalho tem como objetivo avaliar a atividade leishmanicida de novas hidroxietilpiperazinas sintéticas e de Momordica charantia (Cucurbitaceae). Uma série de oito hidroxietilpiperazinas foi sintetizada e testada, a que demonstrou ser mais ativa e com menor citotoxidade, PMIC4, foi selecionada. Promastigotas de Leishmania amazonensis foram cultivadas em diferentes concentrações da PMIC4, que inibiu acentuadamente a multiplicação do parasito, com IC50 de 11,6 μM. Em amastigotas, os resultados mostraram que macrófagos tratados com 20 μM de PMIC4 apresentaram uma redução de 82% nos níveis de infecção, com IC50 de 1,8 μM. Uma vez que hidroxietilpiperazinas são utilizadas como precursores na síntese dos inibidores de protease do HIV, foram realizados ensaios para detectar se a PMIC4 seria capaz de inibir a atividade de aspártico proteases em promastigotas de L. amazonensis. Concentrações de até 200 μM de PMIC4 não foram capazes de inibir esta atividade enzimática. Para avaliar se houve diferença na composição dos esteróis de membrana entre L. amazonensis tratadas com a PMIC4 e não tratadas, os lipídeos neutros foram analisados por cromatografia de camada fina. Foi possível notar uma diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. Para avaliar o efeito desta hidroxietilpiperazina no controle da infecção por L. amazonensis em camundongos BALB/c, os animais foram tratados com a PMIC4, que mostrou possuir atividade leishmanicida in vivo por via oral. Paralelamente, também foi demonstrada a atividade leishmanicida de frações de Momordica charantia em promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis. Ao longo do trabalho, foi realizado o fracionamento do extrato bruto das partes aéreas da planta, guiado pela atividade leishmanicida, até a obtenção de três frações semi-purificadas ativas. Em amastigotas intracelulares, as frações ativas MSØAc e F7 apresentaram IC50 de 1,69 μg/mL e 1,08 μg/mL, respectivamente. Este é o primeiro relato tanto da atividade de uma hidroxietilpiperazina quanto de Momordica charantia contra Leishmania amazonensis. Os extratos, frações e substâncias aqui apresentados podem ser considerados candidatos potenciais para o desenvolvimento de novos fitoterápicos e/ou quimioterápicos contra a leishmaniose cutânea. / Leishmaniasis is a group of neglected diseases that affect approximately 12 million people in 98 countries. The drugs used to control the disease are associated with low efficacy, high toxicity, difficulties of administration, high costs and increasing resistance. The search for new alternatives of treatment is a priority. This study aims to evaluate the leishmanicidal activity of new synthetic hidroxyethylpiperazines and of Momordica charantia (Cucurbitaceae). A series of eight hidroxyethylpiperazines was synthesized and the PMIC4 showed to be more active and less cytotoxic. Leishmania amazonensis promastigotes were cultivated in different concentrations of PMIC4, which strongly inhibited the multiplication of the parasite, with IC50 of 11.6 μM. In amastigotes, the results demonstrated that macrophages treated with 20 μM of PMIC4 presented 82% reduction in infection levels, with IC50 of 1.8 μM. Once hidroxyethylpiperazines are used as precursors in the synthesis of protease inhibitors of HIV, we tested whether the PMIC4 could inhibit the activity of aspartic proteases in promastigotes of L. amazonensis. Concentrations up to 200 μM of PMIC4 were not able to inhibit this enzyme activity. To determine differences in the composition of membrane sterols between L. amazonensis treated with PMIC4 and untreated, the neutral lipids were analyzed by thin layer chromatography. It was possible to observe a significant difference between treated and control groups. To evaluate the effect of this hidroxyethylpiperazine in controlling infection by L. amazonensis in BALB/c mice, animals were treated with PMIC4, which showed in vivo leishmanicidal activity orally. Moreover, we also demonstrated the leishmanicidal activity of fractions of Momordica charantia in promastigotes and intracellular amastigotes of L. amazonensis. Throughout the work, we performed the fractionation of crude extract of aerial parts of the plant, guided by the leishmanicidal activity until we get three very active fractions. In intracellular amastigotes, the active fractions MSØAc and F7 showed IC50 of 1,69 μg/mL and 1,08 μg/mL, respectively. This is the first report of the activity of hidroxyethylpiperazines and Momordica charantia against Leishmania amazonensis. The extracts, fractions and substances presented here can be considered potential candidates for the development of new phytotherapy and/or chemotherapy against cutaneous leishmaniasis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-29T19:07:35Z No. of bitstreams: 1 Ivana Nunes Gomes De Araujo Estudo de mecanismo... 2004.pdf: 52151625 bytes, checksum: 4f6174379d294a0210664b0966341227 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T19:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ivana Nunes Gomes De Araujo Estudo de mecanismo... 2004.pdf: 52151625 bytes, checksum: 4f6174379d294a0210664b0966341227 (MD5) Previous issue date: 2004 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Camundongos CBA são susceptíveis à Leishmania amazonensis e resistentes à L. major. Eventos da resposta imune inata parecem cruciais na determinação da resposta à infecção por Leishmania. Macrófagos desempenham papel importante no controle da infecção, pois in vitro controlam a infecção por L. major, entretanto são permissíveis à L. amazonensis. Neste trabalho, pretendeu-se investigar mecanismos moleculares envolvidos na determinação dos perfis de resposta de macrófagos de CBA infectados, in vitro, por L. amazonensis ou L. major. Observamos que IFN-y, apesar de induzir produção semelhante de NO, reduz a infecção causada por L. major, não alterando a infecção por L. amazonensis. Essa redução é dependente de TNF-a. Em estudos de biogênese do vacúolo parasitóforo, observou-se que há semelhança na cinética de fusão dos vacúolos contendo L. amazonensis ou L. major com lisossomas, evidenciando que a maior sobrevivência de L. amazonensis não está relacionada a um retardo na formação do fagolisossomo. O padrão de expressão de genes, que poderiam influenciar no desenvolvimento da resposta imune do hospedeiro à infecção por Leishmania, foi avaliado, utilizando-se a técnica de JMP^icroarray. A infecção por L. amazonensis ou L. major induz aherações no padrão de expressão de genes anteriormente relacionados à infecção por Leishmania, e outros que ainda não tinham sido associados. Genes relacionados á explosão respiratória, formação do vacúolo parasitóforo e receptores de superfície, envolvidos na ativação celular e fagocitose, estão induzidos ou suprimidos a depender da espécie de Leishmania e o tempo de infecção. Genes relacionados a receptores do tipo scavenger foram induzidos na infecção por L. major. Esse resultado está relacionado ao aumento na expressão in vitro do receptor scavenger MARCO em células infectadas por L. major, quando comparada à infecção por L. amazonensis. Estudos in vivo demonstraram que linfonodos de camundongos infectados por L. major apresentaram um aumento da expressão de MARCO em comparação à infecção por L. amazonensis. Observamos que L amazonensis induziu gene da catalase, enzima que inibe a explosão respiratória. Esse dado pode estar relacionado com a observação anterior, que na infecção in vitro de macrófagos com L. amazonensis há uma inibição da produção de H2O2, em comparação á célula controle. Esses dados sugerem que diferenças encontradas na infecção de macrófagos podem estar relacionadas com a determinação dos perfis de resistência ou susceptibilidade, reforçando a importância do macrófago para o estabelecimento da infecção. / CBA mice are susceptible to Leishmania amazonensis and resistant to L. major infection. Events of innate immune response are supposed to be determinants of Leishmania infection outcome. CBA macrophages control L. major and are permissive to L. amazonensis infection in vitro, indicating that macrophages participate in determination of host immune profile. In the present work, we intended to investigate the molecular mechanisms, which underlie these differences. We demonstrated that IFN-y was only able to reduce L. major infection although induced similar NO production by both L. amazonensis- and L. /wa/or-infected cells. This reduction is a TNF-a-dependent mechanism. Furthermore, the ability of L. amazonensis to survive inside CBA nacrophages was not related to a delay on L. amazonensis-mànceà phagosome fusion with lysosomes as both L. amazonensis- and L. mq/or-induced parasitophorous vacuoles present the same kinetic of fusion with lysosomes. DNAmicroarray was then performed in response to L. amazonensis or L. major infection which are the macrophages genes up or down-regulated. We showed that both parasites induced significant alterations on macrophage gene expression. Some of the expressed genes were previously related to Leishmania infection but some of them were not yet associated to Leishmania infection. Genes related to cell surface receptors, which participate both in cell activation and phagocytosis of microorganisms, as well as genes involved in respiratory burst response and in parasitophorous vacuole biogenesis had their expression modified dependending on the Leishmania species and time after infection. Interestingly, we observed that L. major induced higher expression of scavenger receptors. In addition, this result is related to a 20% higher expression of MARCO scavenger receptor in L. major-infected macrophages. We also demonstrated that L. amazonensis infected macrophages express genes of enzymes related to ROI scavenging such as catalase. These data is related to our previous observation that, in L. amazonensis-infected cells, there was similar H2O2 generation when compared to control non-infected cells. In summary, these data suggest that CBA macrophages are able to interact distinctly with L. amazonensis and L. major, supporting the idea that macrophage is a key cell in the determination of resistance and susceptibility in Leishmania infection.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-04-05T17:16:52Z No. of bitstreams: 1 COSTA, Jaqueline França - 2009.pdf: 5023458 bytes, checksum: 0aad0e59a4ee55dd3db0b89317f4bd80 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-05T17:16:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 COSTA, Jaqueline França - 2009.pdf: 5023458 bytes, checksum: 0aad0e59a4ee55dd3db0b89317f4bd80 (MD5) Previous issue date: 2009 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, Bahia, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A Leishmaniose Cutânea Difusa (LCD) é uma manifestação clínica rara das Leishmanioses, caracterizada pela presença de inúmeros macrófagos intensamente parasitados e baixa reação inflamatoria. No Brasil, a espécie envolvida em casos de LCD é a Leishmania (Leishmania) amazonensis. Tem sido descrito na literatura a exposição e o reconhecimento de fosfatidílserina (PS) na superfície de células apoptóticas fagocitadas por macrófagos como mecanismo de desativação de macrófagos por urna via dependente de TGF-pi e PGE2 (Fadok et al. 1998). Foi demonstrado por Barcinski e colaboradores que formas amastigotas de L. amazonensis expõem PS em sua superfície, em um mecanismo chamado “Mimetismo Apoptótico”. Nesse contexto, nosso objetivo foi investigar a exposição de PS na superfície de isolados de L, amazonensis obtidos de pacientes com LCD e seu papel durante a infecção de macrófagos. Inicialmente, macrófagos peritoneais de camundongos Fl(BALB/c x C57BL/6) estimulados com tioglicolato foram infectados com os diferentes isolados obtidos de pacientes com Leishmaniose Cutânea Localizada (LCL) e LCD. A exposição de PS na superfície das amastigotas purificadas de macrófagos F1 foi determinada por citometria de fluxo. Os isolados obtidos de pacientes com LCD apresentaram maior expressão de PS do que os isolados de pacientes com LCL após 24 horas de infecção. Em seguida, avaliamos se a diferença observada na exposição de PS em amastigotas estaria relacionada à infectividade dos diferentes isolados. Os resultados indicaram que as amastigotas de pacientes com LCD apresentaram maior porcentagem de macrófagos infectados e índice de infecção, quando comparados com amastigotas de pacientes com LCL. Quanto ao mecanismo, 0 grupo infectado com os isolados de pacientes com LCD não apresentou diferença em relação ao grupo LCL quanto a produção de TGF-pl e óxido nítrico, sugerindo que outros mecanismos imunorregulatórios estejam envolvidos. Os resultados em conjunto, sugerem que 0 aumento na exposição de PS nos isolados de L. amazonensis de pacientes com a forma difusa pode representar um mecanismo de adaptação importante para a sobrevivência e estabelecimento da infecção. A elucidação de mecanismos supressores da LCD induzidos por isolados de L. amazonensis poderá ampliar 0 conhecimento sobre a imunorregulação dessa patologia / Diffuse Cutaneous Leishmaniasis (LCD) is a rare clinical manifestation of Leishmaniasis, characterized by a number of macrophages heavily parasitized and low inflammatory reaction. In Brazil, Leishmania (Leishmania) amazonensis is the main specie involved in LCD cases. It has been described that the exposure and recognition of phosphatidylserine (PS) on the surface of apoptotic cells phagocytosed by macrophages is a macrophage deactivation mechanism dependent on TGF-pi and PGE2 (Fadok et al. 1998). Morover, it was demonstrated by Barcinski and colleagues that L. amazonensis amastigotes expose PS on its surface, in a mechanism called ’’Apoptotic Mimicry." In this context, our goal was to investigate the exposure of PS on the surface of L. amazonensis isolates obtained from LCD patients and its role during the infection of macrophages. Initially, peritoneal macrophages from FI mice (BALB/c x C57BL/6) stimulated with thioglycolate were infected with different L. amazonensis strains isolated from patients with Localized Cutaneous Leishmaniasis (LCL) or LCD. The exposure of PS on the surface of amastigotes was determined by flow cytometry using staining to annexin V and propidium iodide. Isolates from LCD patients showed higher PS exposure than the isolates from LCL patients 24 hours after infection. Then, we evaluated whether the differences of PS exposure in amastigotes would correlate with the infectivity of different isolates. Percentage of infected macrophages and infection index were higher in cultures using amastigotes from LCD patients compared to the ones infected with amastigotes from LCL cases. Furthermore, cultures infected with LCD isolates showed no difference to the LCL isolates regarding TGF>pl and nitric oxide production, suggesting that other immuneregulatory mechanisms are involved in this process. These results suggest that the increased exposure of PS in L. amazonensis isolates from patients with diffuse form may represent an important mechanism for the establishment of infection. The elucidation of the LCD suppressing mechanisms induced by L. amazonensis strains may expand the knowledge about the immune regulation of this disease

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-10-15T19:25:17Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ildefonso Alves da Silva Junior - 2013.pdf: 3624734 bytes, checksum: a431bde2aa4d96da0132f877c14e72bd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-10-15T19:27:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ildefonso Alves da Silva Junior - 2013.pdf: 3624734 bytes, checksum: a431bde2aa4d96da0132f877c14e72bd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-15T19:27:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ildefonso Alves da Silva Junior - 2013.pdf: 3624734 bytes, checksum: a431bde2aa4d96da0132f877c14e72bd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-02-18 / The American Tegumentary Leishmaniasis (ATL), caused by Leishmania protozoa, affects the skin and oropharyngeal/nasal mucosa. During transmission cycle, the procyclic promastigote forms grow in the vector gut and differentiate into infective metacyclic promastigotes by a process called metacyclogenesis, which also occurs in axenic cultures. The aim of this study was to evaluate the in vitro metacyclogenesis of L. (Viannia) braziliensis and L. (L.) amazonensis isolates obtained from patients with different clinical forms of ATL, using different methodologies, and the ability of these isolates to infect human macrophages. Parasites (L. (Viannia) braziliensis: IMG3, PPS6m, M2903 and L. (L.) amazonensis: MAB6 and PH8) were cultured in Grace´s insect medium and the amount of metacyclic forms was evaluated by using morphometry, Bauhinia purpurea lectin (BPL, to L. (Viannia) braziliensis) or 3A1-La antibody (to L. (L.) amazonensis) negative selection, flow cytometry and Complement-resistance test after 2, 6 and 10 days of culture. Human monocyte-derived macrophages from healthy donors, activated or not with interferon gamma (IFN) and lipopolysaccharide (LPS), were infected with parasites from different days of culture or with selected metacyclic forms with BPL/3A1-La (1:1 parasite: macrophage) for 24 or 72 h. Growth patterns were similar among the isolates. Stationary-phase promastigotes (6, 10 days) showed morphological changes such as a reduction of the cell body and an increase in the flagellum length, in comparison to the parasites of the 2nd day. Leishmania. (L.) amazonensis promastigotes of the 6th and 10th day of culture presented higher length of the cell body and flagellum than L. (Viannia) braziliensis isolates. In stationary phase there was a significant increase in the percentage of metacyclic forms detected by the four techniques used (M2903: 71-86%; IMG3: 41-85%; PPS6m: 39-76%; PH8: 38-69% e MAB6: 47-84%; 6th day, medians of the techniques used). Despite the four techniques demonstrated similar metacyclogenesis profiles for all isolates evaluated, metacyclic forms densities varied with the technique and the day of culture. The BLP/3A1-La selection consistently identified the highest frequencies of metacyclic forms for all isolates (6th day) among the four techniques. Metacyclogenesis of the isolates was confirmed in in vitro macrophage infection assays which showed a significant increase of the index of infection with parasites of the 6th and 10th day compared to those of the 2nd day (24 or 72 h). No significant differences in capability to infect macrophages were detected between unfractionated or 6th day-selected metacyclic forms. The isolates showed different profiles of susceptibility to macrophage microbicidal mechanisms. The M2903 and PH8 strains were the most susceptible whereas MAB6 isolate was the most resistant among the isolates. As high amounts of metacyclic forms were present in all isolate cultures, considering BPL/3A1-La selection, the results suggest that resistance/susceptibility to macrophage control mechanisms is an intrinsic characteristic of the isolates. To evaluate the metacyclogenesis of clinical isolates together with the ability of parasites to infect human macrophages sets the conditions for obtaining efficient parasites to establish a successful infection what is critical for the evaluation of the pathogenesis and natural immune response in leishmaniasis. / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), causada por protozoários Leishmania, acomete a pele e/ou as mucosas nasal e orofaríngea. Durante o ciclo de transmissão, as formas promastigotas procíclicas crescem no intestino do inseto vetor e diferenciam-se em formas promastigotas metacíclicas infectantes, por um processo chamado de metaciclogênese, que também ocorre em culturas axênicas in vitro. O objetivo deste estudo foi avaliar a metaciclogênese in vitro de isolados L. (Viannia) braziliensis e L. (L.) amazonensis, provenientes de pacientes com diferentes formas clínicas de LTA, usando diferentes metodologias, e a capacidade destes isolados em infectar macrófagos humanos. As curvas de crescimento (L. (V.) braziliensis: IMG3, PPS6m, M2903 e L. (L.) amazonensis: MAB6 e PH8) foram realizadas em meio Grace e após 2, 6 e 10 dias de cultivo, a quantidade de formas metacíclicas foi avaliada por meio de morfometria, ensaio de seleção com a lectina de Bauhinia purpurea (BPL, para L. (V.) braziliensis) ou anticorpo 3A1-La (para L. (L.) amazonensis), citometria de fluxo e ensaio de resistência ao Complemento. Macrófagos humanos derivados de monócitos de doadores sadios, ativados ou não com interferon gama (IFN e lipopolissacarídeo (LPS), foram infectados com os parasitos de diferentes dias de cultivo ou formas metacíclicas selecionadas com BPL/3A1-La (1:1, parasito:macrófago) por 24 ou 72 h. Os perfis das curvas de crescimento in vitro foram similares para todos os isolados. Parasitos da fase estacionária do crescimento (6, 10 dias) apresentaram alterações morfológicas, como a diminuição do tamanho do corpo celular e um aumento do comprimento do flagelo, em relação aos parasitos do 2º dia. As formas promastigotas L. (L.) amazonensis do 6º e do 10º dia de cultura apresentaram maiores comprimentos do corpo celular e do flagelo do que os parasitos L. (V.) braziliensis. Na fase estacionária houve um aumento significante da porcentagem de formas metacíclicas detectadas pelas quatro técnicas (M2903: 71-86%; IMG3: 41-85%; PPS6m: 39-76%; PH8: 38-69% e MAB6: 47-84%; 6º dia, valores min e max). Apesar das quatro técnicas mostrarem um similar perfil de metaciclogênese para todos os isolados avaliados, as densidades de formas metacíclicas variaram conforme a técnica utilizada, dependendo do dia de cultura. A técnica de seleção com BPL/3A1-La foi a que detectou maiores frequências de formas metacíclicas para todos os isolados no 6o dia. A metaciclogênese dos isolados foi confirmada nos ensaios de infecção in vitro dos macrófagos, mostrando um aumento significante no índice de infecção com parasitos do 6º e 10º dia em relação àqueles de 2o dia (24 ou 72 h). Não foram atestadas diferenças entre os índices de infecção de macrófagos incubados com parasitos totais ou formas metacíclicas selecionadas do 6º dia. Os isolados mostraram diferentes perfis de suscetibilidade aos mecanismos microbicidas dos macrófagos. As cepas M2903 e PH8 foram mais suscetíveis, enquanto o isolado MAB6, mais resistente. Como as quantidades de formas metacíclicas nas culturas, considerando a técnica de seleção BPL/3A1-La, foram elevadas para todos os isolados, os resultados sugerem que a resistência/suscetibilidade aos mecanismos de controle dos macrófagos seja uma característica intrínseca do isolado. Avaliar a metaciclogênese de isolados clínicos, simultaneamente à capacidade dos parasitos em infectar macrófagos humanos, define as condições necessárias para a obtenção de parasitos eficientes em estabelecer uma infecção, para uma adequada avaliação da patogenia e da resposta imune natural na leishmaniose.

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No. of bitstreams: 1 Dissertação Parcial - Pauline Soldera.pdf: 748540 bytes, checksum: 966764b9bef7541de4b3724ad90c77a6 (MD5) Previous issue date: 2015-07-11 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Leishmaniasis is an infectious disease - parasitic caused by a parasite of the genus Leishmania and transmitted by the bite of infected female sandfly. Human infections caused by Leishmania can manifest in different ways, depending on the causal species, such as cutaneous leishmaniasis (CL) or visceral leishmaniasis (VL). The therapeutic arsenal against LT is still very restricted. The pentavalent antimony remain the drugs of choice for the treatment and, despite its efficacy, have side effects with prolonged treatment time. Medicinal Chemistry Inorganic have offered new possibilities for research, and metals, especially transition, offer some advantages over drugs, including the variety of oxidation states, enabling their participation in redox biological processes. In the present work we studied the in vitro effect of two metal complexes silver base (Ag1 and Ag2), against promastigotes and amastigotes of Leishmania. (Leishmania) amazonensis and Leishmania. (Viannia) guyanensis in periods of 24, 48 and 72 hours. The metal complexes were synthesized by the team of "Istituto per l'Energetica and le Interfasi" IENI, Padua, Italy (CNR, National Research Council, IT) and sent to biological testing at the National Institute for Amazonian Research (INPA). Results of bioassays with L. (L.) amazonensis showed that Ag2 substance showed higher anti-leishmania activity in the concentration of 160μM/ml, from 72h, EC50 14.53 uM/ml in the manual counting method, and by the MTT method at 24 hours period with EC50 11.35 uM/mL. In cons tests the amastigote form, there was little infection of macrophages by Ag1 complex, 25% infected, compared with 61% without infection amastigotes. Results with L. (V.) guyanensis, the manual counting method, Ag1 did not show satisfactory values, with EC50> 60 uM / ml, Ag2 showed moderate activity in the period of 24h and 48h, EC50 43.22 uM / ml and 57, 64 uM / ml. For the MTT the two substances had EC50 values> 60 uM / ml. Against amastigote forms, with Ag1 complex was cell death of the macrophages. Ag2 showed 38% infection rate, with 47% of uninfected macrophages. Thus, the two metal complexes did not perform well when tested across the promastigote and amastigote forms of L. (V.) guyanensis. Against forms L. (L.) amazonensis, both complexes showed satisfactory results, and the Ag2 complex, with better results in promastigote and amastigote forms / A leishmaniose é uma doença infecto – parasitária causada por um parasita do gênero Leishmania e transmitida pela picada do flebotomíneo fêmea infectado. Infecções humanas causadas pela Leishmania podem manifestar-se de diferentes formas, dependendo da espécie causal, como leishmaniose tegumentar (LT) ou leishmaniose visceral (LV). O arsenal terapêutico contra a LT ainda é muito restrito. Os antimoniais pentavalentes permanecem como as drogas de primeira escolha para o tratamento e, apesar de sua eficácia, apresentam efeitos colaterais, com tempo de tratamento prolongado. A Química Inorgânica Medicinal têm oferecido novas possibilidades para a pesquisa, e os metais, em especial os de transição, oferecem algumas vantagens sobre os fármacos, incluindo a variedade de estados de oxidação, permitindo sua participação em processos biológicos redox. No presente trabalho foi estudado o efeito in vitro de dois complexos metálicos a base de prata (Ag1 e Ag2), contra as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania. (Leishmania) amazonensis e Leishmania. (Viannia) guyanensis nos períodos de 24, 48 e 72 horas. Os complexos metálicos foram sintetizados pela equipe do “Instituto per l’Energetica e le Interfasi”, IENI, Pádua, Itália(CNR, Conselho Nacional de Pesquisas, IT) e encaminhados para testes biológicos no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). Resultados dos bioensaios com L. (L.) amazonensis demonstraram que a substância Ag2 apresentou maior atividade anti-leishmania na concentração de 160μM/mL, no período de 72h, EC50 14,53 μM/mL no método de contagem manual, e pelo no método MTT, no período de 24h, com EC50 11,35 μM/mL. Nos testes contras as forma amastigota, houve pouca infecção de macrófagos pelo complexo Ag1, 25% infectados, contra 61% sem infecção do formas amastigotas. Resultados com L. (V.) guyanensis, pelo método de contagem manual, Ag1 não apresentou valores satisfatório, com do EC50 >60 μM/ mL, Ag2 apresentou atividade moderada nos período de 24h e 48h, EC50 43,22 μM/ mL e 57, 64 μM/ mL. Pelo método MTT as duas substâncias apresentaram valores de EC50 >60 μM/ mL. Contra as formas amastigotas, com o complexo Ag1, houve a morte celular dos macrófagos. Ag2 apresentou taxa de infecção de 38%, contra 47% de macrófagos não infectados. Sendo assim, os dois complexos metálicos não desempenharam bons resultados quando testados frente as formas promastigota e amastigota de L. (V.) guyanensis. Contra as formas de L. (L.) amazonensis, ambos complexos apresentaram resultados satisfatórios, sendo o complexo Ag2, tendo melhores resultados em formas promastigota e amastigota.

Orientador: Selma Giorgio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T09:19:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_AlexandraPaivaAraujo_D.pdf: 50601825 bytes, checksum: 773a42abde5c534f0e89ea97289c90b3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A leishmaniose experimental murina causada por Leishmania amazonensis é um modelo parasitário que apresenta variações no desenvolvimento da lesão dependendo da linhagem de camundongo utilizada, bem como do local de inoculação do parasito, e tem contribuído para o entendimento da imunopatologia das doenças infecciosas. Observação: o resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The experimental murine leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis parasite is a useful model to understanding the immunopathogenesis of the infectious diseases. It has some differences on the lesion development in according with the mouse strain and the site of the parasite inoculation. We evaluated the lesion development, hypoxia microenvironments¿The Abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

No ciclo natural de transmissão da leishmaniose, as fêmeas infectadas de flebotomíneos regurgitam promastigotas na pele de hospedeiro junto com a saliva. Tem sido descrito que componentes da saliva do vetor possuem propriedades imunomodulatórias que facilitam o estabelecimento da infecção no hospedeiro, contudo a maior parte dos estudos emprega lisado de glândula salivar (LGS) de vetores colonizados em laboratório. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a especificidade do LSG dos flebotomíneos Lutzomyia flaviscutellata e Lutzomyia (Psychodopygus) complexus capturados no campo na infectividade de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Camundongos BALB/c foram inoculados no coxim plantar traseiro com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis na ausência ou presença do LGS de L. flaviscutelata, e L. (P.) complexus. A evolução da infecção foi acompanhada semanalmente e biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para análise histopatológica e determinação de carga parasitária na 4ª e 8ª semana pós-infecção (PI); e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram também cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-10, IL- 12 e IL-4) no sobrenadante. A infecção por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis não se mostrou exacerbada nos grupos co-inoculados com o LGS de ambas as espécies em relação ao grupo controle, inoculado somente com o parasito. O tamanho de lesão e carga parasitária do grupo controle foi maior ou igual aos grupos com saliva. Na infecção por L. (L.) amazonensis houve diminuição dos linfócitos CD4+ e aumento na população de linfócitos CD8+ enquanto na infecção por L. (V.) braziliensis houve manutenção da população de linfócitos CD4+ e aumento de linfócitos CD8+ em todos os grupos quando comparados ao grupo saudável. A produção de IL-10 e IL-12, não diferiram entre os grupos, assim como a produção de IL-4 no grupo infectado por L. (V.) braziliensis. No entanto, nos grupos infectados apenas com L. (L.) amazonensis e com saliva de L. flaviscutellata, foi observada uma maior produção de IL-4 em relação ao grupo saudável. De forma geral, os resultados mostraram que a saliva de L. flaviscutellata e de Lutzomyia (P.) complexus, no seu binômio natural vetor/parasito ou não, não favoreceram o estabelecimento da infecção causada por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em camundongos BALB/c. / During the natural transmission of leishmaniasis, the infected female phlebotomine regurgitates promastigotes into the host\'s skin together with the saliva. It has been reported that components of vector saliva contain immunomodulatory properties that facilitate the establishment of infection in the host, however the most studies employed salivary gland lysate (SGL) of laboratory colonized vectors. Thus, the main objective of this study was to evaluate the specificity of SGL of the phlebotomines Lutzomyia flaviscutellata and Lutzomyia (Psychodopygus) complexus caught in the field in the infectivity of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis. BALB/c mice were inoculated in the hind footpad with promastigotes of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in the absence or presence of L. flaviscutelata, and L. (P.) complexus SGL. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and biopsies from the site of infection were collected for histopathological analysis and determination of parasite load in the 4th and 8th week post infection (PI), and the draining lymph node to characterize subsets of T cells by flow cytometry. The draining lymph nodes cells were also cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-10, IL-12 and IL-4) in the supernatant. L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis infection was not exacerbated in the groups co-inoculated with the SGL of both species in the control group, only inoculated with the parasite. The lesion size and parasite burden of the control group was higher or equal to the groups with saliva. In L. (L.) amazonensis infection there was a decrease of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells while in L. (V.) braziliensis infection there was a maintenance of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells in all groups compared with the health group. The production of IL-10 and IL-12, did not differ between groups, as well as the production of IL-4 in the group infected by L. (V.) braziliensis. However, in the groups infected only with L. (L.) amazonensis in the presence of L. flaviscutellata saliva, it was observed a higher production of IL-4 in relation with the health group. As a whole, the results show that the saliva of L. flaviscutellata and L. (P.) complexus, in the natural vector/parasite binomium or not, did not favor the establishment of the infection caused by L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in BALB/c mice

Made available in DSpace on 2016-08-16T18:18:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Richard Pereira Dutra.pdf: 10110933 bytes, checksum: 21ac06ca1d01c91986e9b53d029d42ea (MD5) Previous issue date: 2012-09-19 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / Melipona fasciculataSmith, occurs in Brazil, especially in the state of Maranhão, where it is popularly known as tiúba . The tiúba produces honey, wax, pollen and geopropolis. The aim of this study was to evaluate the leishmanicidal activity of different samples of geopropolis Melipona fasciculata, aiming to produce a product with leishmanicidal activity. Geopropolis samples were collected in different localities of the municipality of Fernando Falcão-MA and subjected to extractive process withhydroalcoholic solution, obtaining the hydroalcoholic extracts of geopropolis (HEG1, and HEG2 HEG3). The extracts were used for in vitro evaluation of leishmanicidal action, using promastigotes of Leishmania amazonensis. The HEG1, with the highest leishmanicidal activity, was subjected to liquid-liquid partition, resulting in hexanefraction (FH), chloroform fraction (CF), ethyl acetate fraction (AF) and hydroalcoholic fraction (FHA). The fractions were assessed for leishmanicidal activity and antioxidant, and also analyzed for total polyphenol concentration and chemical composition. Extracts of geopropolis showed inhibitory concentration (IC50) between 47-229 μg/mL. The most active extract was EHG1 and its most active fraction was the FA with IC50 of 29.89 μg/mL, while the IC50 FC fractions and FHA showed IC50of 43.21 μg/mL and 49.48 μg/mL, respectively. The HEG1 and fractions leishmanicidalshowed antioxidant activity towards DPPH and high levels of total polyphenols. The hexane fraction showed no leishmanicidal action, and had the lowest antioxidant concentrations of polyphenols. The extracts showed phenolic acids, organic acids, fatty acids, anthraquinones, sugars and alcohols, the analysis by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The most active fraction (AF) showed mainly gallic acid, while the other fractions were identified fatty acids, organic acids, anthraquinones, diterpenes, triterpenes, steroids, sugars and alcohols. In the analysis by High performance liquidchromatographycoupled tomass spectrometry (HPLC-MS) extract the most active fraction were identified phenolic acids, ellagitannins and gallotannins, confirming the data obtained by GC-MS. Based on the results obtained was a byproduct that when tested under the same conditions also showed leishmanicidal action. In conclusion, the leishmanicidal activity of geopropolis Melipona fasciculata is likely to be related to the presence of gallic acid derivaties and ellagic. / Melipona fasciculataSmith, ocorre no Brasil, especialmente no estado do Maranhão, onde é popularmente conhecida como tiúba. A tiúba produz mel, cera, geoprópolis e acumula pólen. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade leishmanicida de diferentes amostras da geoprópolis de Melipona fasciculata, visando à obtenção de um produto com atividade leishmanicida. As amostras de geoprópolis foram coletadas em diferentes localidades do município de Fernando Falcão-MA e submetidas a processo extrativo com solução hidroalcoólica, obtendo-se os extratos hidroalcoólicos da geoprópolis (EHG1, EHG2 e EHG3). Os extratos foram utilizados para avaliação in vitro da ação leishmanicida, utilizando formas promastigotas de Leishmania amazonensis. O EHG1, que apresentou maior atividade leishmanicida, foi submetido à partição líquido-líquido, resultando nas frações hexânica (FH), fração clorofórmica (FC), fração acetato de etila (FA) e fração hidroalcoólica (FHA). As frações foram avaliadas quanto à atividade leishmanicida e antioxidante, e ainda analisadas quanto à concentração de polifenóis totais e composição química. Os extratos da geoprópolis apresentaram concentração inibitória (CI50) entre 47 a 229 μg/mL. O extrato mais ativo foi EHG1 e a sua fração mais ativa foi a FA com CI50 de 29,89 μg/mL, enquanto as frações FC e FHA apresentaram CI50 de 43,21 μg/mL e 49,48 μg/mL, respectivamente. OEHG1 e as frações leishmanicidas apresentaram atividade antioxidante frente ao radical DPPH e elevados teores de polifenóis totais. A fração hexânica não apresentou ação leishmanicida, antioxidante e apresentou as menores concentrações de polifenóis. Os extratos apresentaram ácidos fenólicos, ácidos orgânicos, ácidos graxos, antraquinonas, açúcares e álcoois, nas analises por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). A fração mais ativa (FA) apresentou principalmente o ácido gálico, enquanto nas demais frações foram identificados ácidos graxos, ácidos orgânicos, antraquinonas, diterpenos, triterpenos, esteróides, açúcares e álcoois. Nas análises por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLAE-EM) do extrato fração mais ativos foram identificados ácidos fenólicos, galotaninos e elagitaninos, corroborando com os dados obtidos por CG-EM. Com base nos resultados foi obtido um bioproduto que quando testado nas mesmas condições também apresentou ação leishmanicida. Concluímos que a atividade leishmanicida e antioxidante da geoprópolis de Melipona fasciculataestãopossivelmente relacionadas à presença de derivados dos ácidos gálico e elágico.