No ciclo natural de transmissão da leishmaniose, as fêmeas infectadas de flebotomíneos regurgitam promastigotas na pele de hospedeiro junto com a saliva. Tem sido descrito que componentes da saliva do vetor possuem propriedades imunomodulatórias que facilitam o estabelecimento da infecção no hospedeiro, contudo a maior parte dos estudos emprega lisado de glândula salivar (LGS) de vetores colonizados em laboratório. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a especificidade do LSG dos flebotomíneos Lutzomyia flaviscutellata e Lutzomyia (Psychodopygus) complexus capturados no campo na infectividade de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Camundongos BALB/c foram inoculados no coxim plantar traseiro com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis na ausência ou presença do LGS de L. flaviscutelata, e L. (P.) complexus. A evolução da infecção foi acompanhada semanalmente e biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para análise histopatológica e determinação de carga parasitária na 4ª e 8ª semana pós-infecção (PI); e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram também cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-10, IL- 12 e IL-4) no sobrenadante. A infecção por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis não se mostrou exacerbada nos grupos co-inoculados com o LGS de ambas as espécies em relação ao grupo controle, inoculado somente com o parasito. O tamanho de lesão e carga parasitária do grupo controle foi maior ou igual aos grupos com saliva. Na infecção por L. (L.) amazonensis houve diminuição dos linfócitos CD4+ e aumento na população de linfócitos CD8+ enquanto na infecção por L. (V.) braziliensis houve manutenção da população de linfócitos CD4+ e aumento de linfócitos CD8+ em todos os grupos quando comparados ao grupo saudável. A produção de IL-10 e IL-12, não diferiram entre os grupos, assim como a produção de IL-4 no grupo infectado por L. (V.) braziliensis. No entanto, nos grupos infectados apenas com L. (L.) amazonensis e com saliva de L. flaviscutellata, foi observada uma maior produção de IL-4 em relação ao grupo saudável. De forma geral, os resultados mostraram que a saliva de L. flaviscutellata e de Lutzomyia (P.) complexus, no seu binômio natural vetor/parasito ou não, não favoreceram o estabelecimento da infecção causada por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em camundongos BALB/c. / During the natural transmission of leishmaniasis, the infected female phlebotomine regurgitates promastigotes into the host\'s skin together with the saliva. It has been reported that components of vector saliva contain immunomodulatory properties that facilitate the establishment of infection in the host, however the most studies employed salivary gland lysate (SGL) of laboratory colonized vectors. Thus, the main objective of this study was to evaluate the specificity of SGL of the phlebotomines Lutzomyia flaviscutellata and Lutzomyia (Psychodopygus) complexus caught in the field in the infectivity of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis. BALB/c mice were inoculated in the hind footpad with promastigotes of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in the absence or presence of L. flaviscutelata, and L. (P.) complexus SGL. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and biopsies from the site of infection were collected for histopathological analysis and determination of parasite load in the 4th and 8th week post infection (PI), and the draining lymph node to characterize subsets of T cells by flow cytometry. The draining lymph nodes cells were also cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-10, IL-12 and IL-4) in the supernatant. L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis infection was not exacerbated in the groups co-inoculated with the SGL of both species in the control group, only inoculated with the parasite. The lesion size and parasite burden of the control group was higher or equal to the groups with saliva. In L. (L.) amazonensis infection there was a decrease of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells while in L. (V.) braziliensis infection there was a maintenance of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells in all groups compared with the health group. The production of IL-10 and IL-12, did not differ between groups, as well as the production of IL-4 in the group infected by L. (V.) braziliensis. However, in the groups infected only with L. (L.) amazonensis in the presence of L. flaviscutellata saliva, it was observed a higher production of IL-4 in relation with the health group. As a whole, the results show that the saliva of L. flaviscutellata and L. (P.) complexus, in the natural vector/parasite binomium or not, did not favor the establishment of the infection caused by L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in BALB/c mice

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-07-07T19:34:26Z No. of bitstreams: 1 LuecyaSilva.pdf: 2660181 bytes, checksum: 43c675e9011eb6a8b5a8e8e2efc29119 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T19:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuecyaSilva.pdf: 2660181 bytes, checksum: 43c675e9011eb6a8b5a8e8e2efc29119 (MD5) Previous issue date: 2016-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / The plant species Anacardium Occidentale known in Brazil as cashew tree represents a great economic, social and medical relevance. This study aims to perform the synthesis of the emulsion-type formulation with extract of flowers from A. occidentale L. and evaluates its cicatrizant effect (Chapter I); evaluates the leishmanicidal activity in vitro and in vivo from the extract and base formulation of the flowers from A. occidentale L. (Chapter II); develops and testes a biotech product with biological activity, based on the extract from the flowers of A. occidentale (Chapter III). After developing the biotechnological product, a formulation of emulsion-type based extract of A. occidentale flowers, physicochemical stability tests were performed. It was found, that the formulation showed more stability at room temperature showing no phase separation, loss of viscosity or any of its desirable characteristics throughout the study. In addition, it was shown that the formulation has important cicatrizing activity, possibly related to the IL-6 increase. Furthermore, in vitro antiLeishmania tests were performed using infected macrophages Raw and promastigotes of Leishmania amazonensis, and in vivo using BALB / c mice infected with this protozoan. The results show that the extract of A. occidentale flowers inhibits the growth of promastigotes of L. amazonensis, in vitro and in vivo, as it reduces the viability of promastigotes and infection in macrophages, and reduce the parasitic load of the infection in vivo, possibly by direct action of the extract on the protozoa. Isolated compounds present in plant species, on the other hand, do not exhibit Leishmanicidal effect against L. amazonensis promastigotes. In the same manner, the formulation emulsion-type containing A. occidentale extract has no Leishmanicidal effect while reducing the size of the lesion, when compared to treatment with standard drugs. In conjunction, the results indicate that Anacardium occidentale has pharmacological potential for mining products to be used in the treatment of leishmaniasis and scarring. / A espécie vegetal Anacardium occidentale, conhecida, no Brasil, como cajueiro é uma árvore que apresenta grande relevância econômica, social e medicinal. Este trabalho teve como objetivos: realizar a síntese de formulação do tipo emulsão com extrato das flores de A. occidentale L e avaliar seu efeito cicatrizante (CAPÍTULO I); avaliar a atividade leishmanicida in vitro e in vivo do extrato e formulação a base das flores de A. occidentale L. (CAPÍTULO II); desenvolver e testar um produto biotecnológico com atividade biológica, tendo como base o extrato das flores de A. occidentale (CAPÍTULO III). Após o desenvolvimento do produto biotecnológico, uma formulação do tipo emulsão a base do extrato de flores de A. occidentale, foram realizados testes de estabilidade físico-química. Constatou-se que a formulação demonstrou maior estabilidade na temperatura ambiente não apresentando separação de fases, perda de viscosidade ou de qualquer uma das suas características ideais durante todo o estudo. Em adição, mostrou-se que a formulação possui importante atividade cicatrizante, possivelmente associada ao aumento de IL-6. Ademais, foram realizados ensaios anti-Leishmania in vitro, utilizando macrófagos Raw infectados, bem como formas promastigotas de Leishmania amazonensis, e in vivo utilizando-se camundongos Balb/c infectados com este protozoário. Os resultados obtidos mostram que o extrato das flores de A. occidentale inibe o crescimento das formas promastigotas de L. amazonensis, in vitro e in vivo, pois reduz a viabilidade de promastigotas, bem como a infecção em macrófagos, além de diminuir a carga parasitária na infecção in vivo, possivelmente por ação direta do extrato sobre os protozoários. Compostos isolados presentes na espécie vegetal, por outro lado, não apresentam efeito leishmanicida contra as formas promastigotas de L. amazonensis. Do mesmo modo, a formulação do tipo emulsão contendo extrato de A. occidentale não apresenta efeito leishmanicida embora reduza o tamanho da lesão, quando comparado ao tratamento com droga padrão. Em conjunto os resultados indicam que Anacardium occidentale apresenta potencial farmacológico para prospecção de produtos a serem utilizados no tratamento das leishmanioses e cicatrização.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-27T14:35:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoAtividadeImunolocalizacao.pdf: 1867557 bytes, checksum: 77ff96d87954f2519ef1c983d7f73eb0 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-04-11T14:07:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoAtividadeImunolocalizacao.pdf: 1867557 bytes, checksum: 77ff96d87954f2519ef1c983d7f73eb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T14:07:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoAtividadeImunolocalizacao.pdf: 1867557 bytes, checksum: 77ff96d87954f2519ef1c983d7f73eb0 (MD5) Previous issue date: 2014-10-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / INCT/BEB - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem / As leishmanioses são protozoonoses causadas por parasitos do gênero Leishmania e estão distribuídas por diversas partes do mundo. Essa patologia se manifesta sobre diversas formas clínicas: Leishmaniose visceral (LV), Leishmaniose cutânea (LC) e Leishmaniose cutaneomucosa (LM). O parasito Leishmania apresenta duas formas evolutivas: a forma promastigota, de vida livre, e a forma amastigota, intracelular obrigatório, presente principalmente nas células fagocíticas mononucleadas. A inibição do crescimento ou destruição dos parasitos dentro da célula hospedeira é um mecanismo fundamental para erradicar a infecção. A inibição dos efeitos leishmanicidas do macrófago parece estar relacionada com a capacidade de algumas espécies em inibir a produção de óxido nítrico (NO). Estudos recentes têm mostrado que algumas espécies de Leishmania possuem a capacidade de produzir NO a partir de uma forma constitutiva da enzima Óxido Nítrico Sintase (cNOS). Este trabalho tem como objetivo detectar e localizar a enzima cNOS presente em promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Para isto, o presente estudo utilizou citometria de fluxo, a qual permitiu quantificar a produção de NO nos parasitos, evidenciando a maior atividade da enzima cNOS em Leishmania (L.) amazonensis quando comparada com a espécie Leishmania (V.) braziliensis. Foi realizada a imunomarcação das formas promastigotas com o anticorpo anti-cNOS para observar a localização ultraestrutural da enzima por microscopia eletrônica de transmissão (MET), posteriormente a co-marcação com os anticorpos anti-cNOS e anti-GAPDH para confirmar a provável compartimentalização desta enzima em organelas glicossomais. Os resultados sugerem que a produção de NO por diferentes espécies de Leishmania é um processo localizado em organelas glicossomais com a captura do aminoácido L-arginina da célula hospedeira, o sequestro deste substrato priva o hospedeiro de sintetizar o NO exógeno danoso ao parasito. Esta modulação sugere mais um mecanismo de escape que os protozoários tripanossomatídeos apresentam durante a complexa interação parasito-hospedeiro. / The Leishmaniasis is an infectious disease caused by parasites of the Leishmania genus and are distributed in different parts of the world. This pathology manifests in several clinical forms: Visceral leishmaniasis (VL), cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). The Leishmania parasite presents two evolutionary forms: promastigote form, free life parasite, and amastigotes, intracellular binding, present mainly in the mononuclear phagocytic cells. The growth inhibition or destruction of parasites within the host cell is an essential to break the infection mechanism. Inhibition of macrophage leishmanicidal effect appears to be related to the ability of some species to inhibit the nitric oxide (NO) production. Recent studies have shown that some species of Leishmania have the ability to produce NO by the constitutive form of nitric oxide synthase (cNOS). This work aims to detect and locate the cNOS enzyme present in Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes. For this reason, this study used flow cytometry, which allowed to quantify NO production in parasites, indicating the increased activity of the cNOS enzyme in Leishmania (Leishmania) amazonensis compared with Leishmania (Viannia) braziliensis species. We performed immunostaining of promastigotes with anti-cNOS antibody to watch the ultrastructural localization of the enzyme by transmission electron microscopy (TEM), then co-labeling with anti-cNOS and anti-GAPDH antibody to confirm the probable compartmentalization this enzyme in glycossomal organelles. The results suggest that NO production by different strains of Leishmania is a process located in the glycossomal organelles capturing L-arginine from the host cell, the substrate depletion deprives the host to synthesize the harmful exogenous NO to the parasite. This modulation suggests another escape mechanism that trypanosomatid protozoa present in the complex host-parasite interaction.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmania is the etiological agent of leishmaniasis. are protozoan trypanosomes genus, obligatory intracellular parasite of the phagocytic system cells mononuclear, with a flagellate form (promastigote), found in the intestinal tract of the insect vector and other intracellular aflagellate (amastigote). In leishmaniasis chemotherapy, pentavalent antimonial are used as first choice drugs. Other drugs such as pentamidine and amphotericin B have been used as alternative drugs. However, these drugs require parenteral administration in the long-term and exhibit serious side effects. Thus, the high toxicity, costs and associated resistance treatments available make it increasingly a search for new substances which can be used in therapy, especially those obtained from natural sources. The objective of this study was to evaluate the chemical profile and the leishmanicide effect in vitro red propolis extracts and Dalbergia ecastophyllum in promastigotes forms of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis. Red Propolis samples and Dalbergia ecastophyllum were collected in the low São Francisco River in Sergipe state, Brazil. The chemical characterization of hydroethanolic extract of propolis was made by Reverse Phase High-performance liquid chromatography (HPLC-FR). Leishmanicidal effect of red propolis extracts and D. ecastophyllum were made in promastigotes of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis by using the Alamar Blue staining method. The cytotoxicity of the propolis extract was evaluated in human macrophages J774 line using the MTT method. By chemical analysis could be identified in red propolis extracts the following phenolic compounds: Vanillic Acid, Ferulic Acid, Rutin, Isoliquiritigenin, Formononetin and Biochanin A, whereas the D. ecastophyllum extract were identified: vanillic acid, Isoliquiritigenin, Formononetin and Biochanin A. As the viability assessment, the obtained ICs50 for red propolis were: 21.54 μg/mL for L. chagasi and 9.73μg/mL for L. amazonensis. For the extract of D. ecastophyllum the ICs50 obtained were 70.47 μg/mL for L. chagasi and 53.42 μg/mL for L. amazonensis. The CC50 of propolis extract in macrophages was 72.63 μg/mL. These results show that the red propolis extract of the low São Francisco has the D. ecastophyllum as botanical origin and it presents leishmanicide potential, with low toxicity. / Os agentes etiológicos da leishmaniose são protozoários tripanossomatídeos do gênero Leishmania, parasito intracelular obrigatório das células do sistema fagocítico mononuclear, com uma forma flagelada (promastigota), encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e outra aflagelada intracelular (amastigota). Na quimioterapia da leishmaniose, são utilizados os antimoniais pentavalentes como fármacos de primeira escolha. Outros medicamentos tais como pentamidina e anfotericina B, têm sido empregados como drogas alternativas. Entretanto, estas drogas necessitam de administração parenteral em longo prazo e exibem efeitos secundários graves. Logo, a elevada toxicidade, os custos e a resistência associada aos tratamentos disponíveis fazem com que seja crescente a busca por novas substâncias que possam ser utilizadas na terapia, especialmente aquelas obtidas de fontes naturais. O Objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil químico e o efeito leishmanicida in vitro de extratos da própolis vermelha e Dalbergia ecastophyllum, em formas promatigotas de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis. As amostras de própolis vermelha e Dalbergia ecastophyllum foram coletadas na região do baixo São Francisco em Sergipe, Brasil. A caracterização química do extrato hidroetanólico da própolis e D. ecastophyllum foi feita por Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR). A efeito leishmanicida dos extratos da própolis vermelha e da D. ecastophyllum foi feita em promastigotas de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis utilizando método colorimétrico com Resazurina. A citotoxicidade do extrato de própolis foi avaliada em macrófagos humanos da linhagem J774 utilizando o método do MTT. Pela análise química puderam ser identificados no extrato da própolis vermelha os seguintes compostos fenólicos: Ácido Vanílico, Ácido Ferúlico, Rutina, Isoliquiritigenina, Formononetina e Biochanina A, enquanto que no extrato de D. ecastophyllum foram identificados: ácido vanílico, Isoliquiritigenina, Formononetina e Biochanina A. Quanto a avaliação da viabilidade, as ICs50 obtidas para a própolis vermelha foram: 21,54 μg/mL para promastigotas de L. chagasi e 9,73 μg/mL para L. amazonensis. Para o extrato de D. ecastophyllum as ICs50 obtidas foram 70,47 μg/mL para L. chagasi e 53,42 μg/mL para L. amazonensis. A CC50 do extrato de própolis em macrófagos foi de 72,63 μg/mL. Tais resultados mostram que o extrato da própolis vermelha do Baixo São Francisco tem a D. ecastophyllum como origem botânica e que o mesmo apresenta potencial leishmanicida, com baixa toxicidade.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fatty acids, especially those from phospholipids (PLFA), are essential membrane components, present in a relatively constant proportion in the biological membranes under natural conditions. However, under harmful growth conditions such as diseases, environmental changes and chemical exposure, the proportion of lipids may vary. Once these changes could be identified and revel to be specific for such adverse situation, it could be used as a biomarker. Thus, the biomarkers can help, for example, to identify a virulence and resistance mechanism to a particular chemotherapeutic agent. Therefore, to make treatment more effective, a specific biomarker could lead to a better therapeutic decision, regarding candidate drugs and their indications. The objective of this study was to compare the fatty acid profiles of L. chagasi and L. amazonesis isolates resistant and sensitive to antimony (Glucantime ®) and to nitric oxide (NO). We studied 2 isolates of L. amazonensis and 8 of L. chagasi. Total lipids were extracted from lyophilized promastigotes forms in late logarithmic growth phase (50 mL; 5x108/mL cells). Fatty acid methyl esters (FAMEs) were obtained from total lipids, ester-linked lipids and ester-linked phospholipids by MIDI, ELFA and PLFA techniques respectively. FAMEs were analyzed by chromatography and mass spectrometry. Differences in FAME profiles associated with species or resistance were assessed by non-metric multidimensional scaling, multiresponse permutation procedures and indicator species analyses using PC-ORD 6.0. Previously to these analyses, molar masses of individual FAMEs were relativized by FAMEs totals within each sample. Isolates resistant and sensitive to NO and antimony had different MIDI-FAME profiles, regardless the species. However, neither ELFA nor PLFA profiles differed between sensitive and resistant isolates. The fatty acid 18:1 δ9c was increased in sensitive isolates (p<0,001), whereas an yet unidentified peak showed the opposite trend (p<0,01). We can conclude that these two fatty acids are potential biomarkers for NO and antimony resistance in L. chagasi and L. amazonesis and they can be helpful for therapeutical diagnosis. / Acidos graxos, especialmente aqueles de fosfolipideos (PLFA), sao componentes essenciais das membranas biologicas que estao em proporcao relativamente constante em condicoes naturais. No entanto, sob condicoes adversas de crescimento, como doencas, mudancas ambientais e exposicao a substancias quimicas, pode ocorrer uma variacao na proporcao dos lipideos. A identificacao destas modificacoes especificas pode revelar um biomarcador. Assim, os biomarcadores podem ajudar, por exemplo, na identificacao de um mecanismo de virulencia e de resistencia a um agente quimioterapico particular. Portanto, um biomarcador especifico pode levar a uma melhor decisao terapeutica, a respeito da indicacao e escolha de drogas, tornando o tratamento mais eficaz. O objetivo deste estudo foi comparar os perfis de acidos graxos de L. chagasi e L. amazonesis em isolados resistentes e sensiveis a antimonio (Glucantime R) e oxido nitrico (NO). Os lipidios totais foram extraidos a partir de formas promastigotas liofilizadas em fase tardia de crescimento logaritmico (50 mL celulas 5x108/mL). Foram estudados 2 isolados de L. amazonensis e 8 de L. chagasi. Os esteres metilicos de acidos graxos (FAMEs) foram obtidos a partir de lipideos totais, lipideos e fosfolipideos ester ligados, respectivamente, pelas tecnicas MIDI, ELFA e PLFA. Os FAMEs foram analisados por espectrometria de massa e cromatografia gasosa. Diferencas nos perfis de acidos graxos associadas a especies ou resistencia foram avaliadas por escalonamento multidimensional nao metrico, procedimentos de permutacao de respostas multiplas e analises indicadoras de especies, usando o PC-ORD 6.0. Anteriormente a essas analises, as massas molares individuais dos FAMEs foram relativizadas por FAMEs totais dentro de cada amostra. Os isolados resistentes e sensiveis ao NO e ao antimonio apresentaram diferentes perfis FAME-MIDI, independentemente da especie. No entanto, os perfis de ELFA e PLFA nao diferiram entre os isolados sensiveis e resistentes. O acido graxo 18:1 Â9c foi aumentado em isolados sensiveis (p <0,001), ao passo que um pico ainda nao identificado mostrou a tendencia oposta (p <0,01). Assim, podemos concluir que esses dois acidos graxos sao potenciais biomarcadores para sensibilidade e resistencia ao NO e ao antimonio em L. chagasi e L. amazonesis e podem ajudar no diagnostico terapeutico.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas resultante da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis são as espécies de maior potencial patogênico para o homem e de importância médica no Brasil. As células TCD4, quando ativadas por antígenos via MHC II podem se diferenciar em linhagens de células efetoras como Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). IL-23 é indispensável para as funções efetoras e manutenção de células Th17. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 em lesões cutâneas de pacientes com diferentes formas clínicas da LTA. Biópsias parafinadas de 44 pacientes foram submetidas à imunoistoquímica, sendo 6 casos de leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCADIDRM-) e leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDBIDRM-), ambas causadas por L.(L) amazonensis e 16 casos de leishmaniose cutânea localizada (LCLIDRM+) também causada por L.(L.) amazonensis; 9 casos de LCLIDRM+, 2 casos de LCDBIDRM- e 5 casos de leishmaniose cutâneo-mucosa (LCMIDRM+), todos causados por L.(V.) braziliensis. A densidade de células Tregs Foxp3+ no espectro clínico da LTA mostrou um aumento progressivo partindo das formas centrais LCL causadas por L.(V.) braziliensis (170mm2) e L.(L) amazonensis (140mm2) para as formas polares, LCADIDRM- (289mm2) e LCDBIDRM- (183mm2) causada por L.(L) amazonensis, LCDBIDRM- (189mm2) e LCMIDRM+, causadas por L.(V.) braziliensis (158mm2). A comparação entre as densidades de células IL-17+ nas diferentes formas clínicas da LTA mostrou um perfil semelhante também com um aumento progressivo da expressão de IL-17 partindo das formas centrais LCLIDRM+ causadas por L.(V.) braziliensis (232mm2) e L.(L) amazonensis (197mm2) em direção as formas polares, LCADIDRM- (470mm2) e LCDBIDRM- (340mm2) causada por L.(L.) amazonensis, LCDBIDRM- (431mm2) e LCMIDRM+ (372mm2) causada por L.(V.) braziliensis. A densidade de células IL-23+ mostrou perfil similar ao de IL-17 como no espectro de doença causada por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis: LCADIDRM- (687mm2), LCDBIDRM- (518mm2) e LCLIDRM+ (348mm2) por L.(L.) amazonensis, LCLIDRM+ (457mm2), LCDBIDRM- (609mm2) e LCMIDRM+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. Diante dos nossos achados, observa-se que as células Foxp3+, IL-17+ e IL-23+ desempenham um papel importante na imunopatogênese das diferentes formas clínicas da LTA causadas por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis, caracterizada por uma resposta imune polarizada de diferente expressão patológica / The American cutaneous leishmaniasis (ACL) presents a wide spectrum of clinical and immunopathological manifestations resulting from the interaction between the different species of Leishmania and the mechanisms of the host immune response. Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis are the species with the largest pathogenic potential for humans and medical importance in Brazil. The CD4+ T cells can be differentiated into effector cell lines as Th1, Th2, Th17 and regulatory T cells (Treg). IL-23 is essential for effector functions and maintenance of Th17 cells, that produces IL-17. The aim of this study was to evaluate the expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in cutaneous lesions of patients with different clinical forms of ACL. Paraffin embedded biopsies from 44 patients were submitted to immunohistochemistry, there were 6 cases of anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCLDTH-) and borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCLDTH-) both caused by L. (L.) amazonensis 16 cases of cutaneous leishmaniasis (LCLDTH+) caused by L. (L.) amazonensis, 9 cases of LCLDTH+, 2 cases of BDCLDTH- and 5 cases of mucocutaneous leishmaniasis (MCLDTH+) all caused by L. (V.) braziliensis. The density of Treg Foxp3+ cells in the clinical spectrum of ACL showed a progressive increase starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (170mm2) and L. (L) amazonensis (140mm2) towards the polar forms ADCLDTH- (289mm2). The intermediate clinical forms BDCLDTH- (183mm2) caused by L. (L) amazonensis and BDCLDTH-(189mm2) by L. (V.) braziliensis as well as, MCLDTH+(158mm2) did not present any significant differences. The comparison between the densities of IL-17+ cells in different clinical forms of ACL showed progressive increasing starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (232mm2) and L. (L) amazonensis (197mm2) towards the polar forms, ADCLDTH-(470mm2) and BDCLDTH-(340mm2) caused by L. (L.) amazonensis BDCLDTH- (431mm2) and MCLDTH+ (372mm2) caused by L. (V.) braziliensis. The density of IL-23+ cells showed a similar profile to that of IL-17 at the disease spectrum caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis: ADCLDTH-(687mm2) BDCLDTH-(518mm2) and LCLDTH+ (348mm2) by L. (L.) amazonensis; LCLDTH+ (457mm2) LCDBDTH-(609mm2) and MCLDTH+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. In view of our findings, we notice that the Foxp3+, IL-17+ and IL-23+ cells play an important role in the immunopathogenesis of different clinical forms of ACL caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis, characterized by an immune polarized response with different pathological expression

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-08-04T16:19:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EstudoAcaoCrotoxina.pdf: 1097986 bytes, checksum: 66081e843a1d162632a99dfcc3d73c8e (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-08T12:02:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EstudoAcaoCrotoxina.pdf: 1097986 bytes, checksum: 66081e843a1d162632a99dfcc3d73c8e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T12:02:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EstudoAcaoCrotoxina.pdf: 1097986 bytes, checksum: 66081e843a1d162632a99dfcc3d73c8e (MD5) Previous issue date: 2016-04-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença parasitária amplamente disseminada na maioria dos países da América Latina, e pode ser causada por diferentes espécies do gênero Leishmania. Este protozoário é um parasito intracelular obrigatório que desenvolveu mecanismos para subverter a atividade microbicida dos macrófagos, como a inibição da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO). A quimioterapia ainda é um dos tratamentos mais efetivos para esta doença, entretanto, as drogas leishmanicidas disponíveis são, em geral, tóxicas, apresentam custo elevado e necessitam da utilização por longos períodos. Assim, o desenvolvimento de novos produtos naturais para o tratamento da leishmaniose se tornou prioridade. As toxinas ofídicas são fontes naturais de produtos bioativos com propriedades terapêuticas amplamente descritas na literatura. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar a ação da crotoxina (CTX), uma proteína dimérica e o principal componente do veneno de serpente da espécie Crotalus durissus terrificus, sobre a interação Leishmania (Leishmania) amazonensis e macrófagos. A toxina diminuiu significativamente em 32,5% o crescimento de promastigotas na concentração de 1,2 μg/mL e 24,9% na concentração de 2,4 μg/mL após 96 horas de tratamento (IC50 = 22,86 μg/mL). O teste colorimétrico (MTT) demonstrou que essa toxina não induziu efeito tóxico sobre macrófagos. Também foi observado que macrófagos tratados com CTX apresentaram um significativo aumento na capacidade de metabolizar o substrato MTT (média = 59,78% ± 3,31, mais elevado) quando comparados ao controle sem tratamento. Além disso, foi observado que os macrófagos tratados apresentaram intensa produção de ROS (média= 35,95% ±2,76, mais elevado) comparado ao controle. Outro dado importante observado foi o fato de células hospedeiras infectadas e tratadas com CTX apresentarem um aumento significativo na capacidade fagocítica e na eliminação dos parasitas intracelulares, com aumento na produção de NO, aumento da área celular e a intensa produção de citocinas pró-inflamatórias, caracterizando o perfil M1 de ativação celular. Esta ativação teve como consequência a morte dos parasitas através da resposta do hospedeiro, diminuindo o número de parasitos após 48h de tratamento com 2,4 e 4,8 μg/mL de CTX, revertendo, assim, a ação anérgica promovida pela L. amazonensis. Portanto, a CTX promove um bom prognóstico para esta infecção, evidenciando a possibilidade desta substância atuar como possível alternativa de tratamento contra leishmaniose, especialmente em casos de infecções por espécies que induzem respostas anérgicas. / American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is a parasitic disease widely spread in most countries of Latin America, and caused by different species of the genus Leishmania. This protozoan is an obligate intracellular parasite that developed mechanisms to subvert the microbicidal activity of macrophages, such as inhibition of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) production. The chemotherapy is one of the most effective treatments for this disease, although the antileishmanial drugs available are in general toxic, expensive and require long-term treatment. Thus, the development of new natural products to treat leishmaniasis has become a priority. Ophidian toxins are natural sources of bioactive products with therapeutic properties already described. Therefore, we considered analyze the activity of crotoxin (CTX), a dimeric protein and the main neurotoxic component of Crotalus durissus terrificus snake venom, against promastigotes of Leishmania (L.) amazonensis and macrophages. The toxin significantly decreasing of 32,5% on the growth of promastigotes at 1,2μg/mL and 24,9% at 4,8μg/mL after 96 hours of treatment (IC50= 22,86μg/mL). The colorimetric assay (MTT) showed that this compound presented no cytotoxic effects against macrophages. Interestingly, CTX treated macrophages presented a significant higher capacity to metabolize the MTT substrate (mean= 59,78% ±3,31, higher) when compared with untreated control. It was observed that treated macrophages presented intense production of ROS (mean= 35,95% ±2,76, higher) when compared with untreated cells. Treated macrophages presented increased phagocytic activity and were capable to eliminate intracellular parasites. Besides that, these cells had it NO and pro-inflammatory cytokines production increased and morphological alteration that characterizes the M1 cellular activation profile. That activation culminates with the parasite elimination throughout host response, reverting the anergic action promoted by L. amazonensis, thereby leading to a good disease prognostic, evidencing that this compound could be a promising antileishmanial agent.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T17:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ, porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana (LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +, CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total, observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais (produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ (38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3 citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites. Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells (10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.

CHAPTER I: Leishmania spp are obligate intracellular protozoan that can cause a complex of known infectious diseases such as leishmaniasis, affecting millions of people worldwide. The host-pathogen interaction involves the parasite surface molecules and cellular receptors that culminate in phagocytosis. This internalization process involves changes in cytoskeleton through interaction with proteins related to actin polymerization, as AFAP, Arp 2/3 complex, Galectin-3, Septins and WASp, as well as activation and signaling pathways. It is known that L. amazonensis promastigotes after entry into phagocytes are present in phagosomes, and these vesicles undergo a maturation process, forming phagolysosome, important for differentiation of the promastigote forms to amastigotes. This study aimed to understand which proteins related to actin cytoskeleton exert role in the process of invasion and multiplication of L. amazonensis and which signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome, the invasion and multiplication of this protozoan process the host cell. For this, we did invasion and multiplication assays with macrophages C57 BL/6 and BALB/c peritoneal treated or not with cytochalasin D, invasion assay with macrophages C57 BL/6 previously fixed in formaldehyde (0.01%), assay with macrophages C57 BL/6 knockdown for AFAP-1L1, Arp2, Galectin-3, Septin 4, 14 and WASP proteins compared to wild type cells. And yet, assays phagolysosome kinetics of formation and proliferation and invasion assays using inhibitors of Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K and Ras signaling pathways. The results show that L. amazonensis invaded cells defective in actin polymerization, as well as fixed cells as well as decreased expression of Arp2, Galectin-3 and WASp proteins increased internalization of these parasites. The signaling pathways MEK1/2, ERK2 and AKT delayed the recruitment of the lysosomes to phagosome, and inhibition of PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways drastically decreased internalization of the parasite in the cells. We concluded that L. amazonensis were able to actively invade phagocytic cells, and that the Arp2, Galectin-3 and WASp proteins are involved in the process of entry into host cells. In addition, the MEK1/2, AKT and ERK2 signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome as well as PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways seem to favor infection with L. amazonensis. CHAPTER II: The flagellate protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent for Chagas disease. It is estimated that there are eight million people infected worldwide. T. cruzi has different surface proteins related to cell invasion. In this context, our research group identified in T. cruzi, a protein of 21 kDa (P21) showed that pro-phagocytic and chemotactic activities, playing an important role in the internalization of this parasite in vitro. This study aimed to evaluate the role of recombinant protein P21-His6 based on native P21 of T. cruzi in Leishmania amazonensis in order to seek greater understanding of the mechanism of action of this protein and its relationship with the host in vivo. To this end, the footpad infect BALB/c mouse treated with 40&#956;g of active and denatured recombinant P21, BSA and PBS for 6 weeks and assess the footpad size, parasitic load (real time PCR) and cytokine production of IL-1&#946; in the paws, the popliteal lymph nodes and spleen. The results showed an increase in the footpad area, as well as increased parasite load in the infected and treated animals with P21-His6. Also, increased production of IL-&#946; in the footpad and the popliteal lymph nodes also in animals treated with P21-His6. We conclude that the P21 protein plays a role in pro-phagocytic also in vivo experiments, favoring infection. / CAPÍTULO I: Leishmania spp são protozoários intracelulares obrigatórios, que podem causar um complexo de doenças infecciosas conhecidas como leishmanioses, que afetam milhões de pessoas mundialmente. A interação entre patógeno-hospedeiro envolve moléculas de superfície do parasito e receptores celulares que culminam na fagocitose. Este processo de internalização envolve modificações no citoesqueleto celular por meio da interação com proteínas relacionadas à polimerização de actina, como AFAP, Complexo Arp2/3, Galectina-3, Septinas e WASp, bem como a ativação de vias de sinalização. Sabe-se que formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis após a entrada nos fagócitos, estão presentes em fagossomos, e essas vesículas sofrem um processo de maturação, formando o fagolisossomo importante para a diferenciação da forma promastigota em amastigota. Este trabalho teve como objetivo, entender quais proteínas relacionadas ao citoesqueleto de actina exercem papel no processo de invasão e na multiplicação de L. amazonensis, bem como, quais vias de sinalização estão envolvidas no processo de formação do fagolisossomo, na invasão e na multiplicação deste protozoário na célula hospedeira. Para isso, fizemos ensaios de invasão e multiplicação em macrófagos imortalizados C57 BL/6 e peritoneais de BALB/c tratados ou não com citocalasina D, ensaio de invasão em macrófagos C57 BL/6 previamente fixadas em formaldeído, ensaio com macrófagos C57 BL/6 knockdown para as proteínas AFAP-1L1, Arp2, Galectina-3, Septina 4 e 14 e WASp, comparando com células Wild Type. E ainda, ensaios de cinética de formação do fagolissomo e ensaios de invasão e multiplicação utilizando inibidores das vias de sinalização envolvendo Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K e Ras foram realizados. Os resultados mostram que L. amazonensis invadiu células deficientes na polimerização de actina, e também células fixadas, bem como a diminuição da expressão das proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp aumentaram a internalização desses parasitos. As vias de sinalização MEK1/2, ERK2, AKT atrasaram o recrutamento de lisossomos para o fagossomo, e a inibição das vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 diminuíram drasticamente a internalização do parasito nas células. Concluímos que L. amazonensis foi capaz de invadir ativamente células fagocíticas, e que as proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp estão envolvidas no processo de entrada na células hospedeira. Além disso, as vias de sinalização MEK1/2, ERK2 e AKT estão envolvidas na formação do fagolisossomo, bem como as vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 parecem favorecer a infecção por L. amazonensis. CAPÍTULO II: O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o causador da Doença de Chagas. Estima-se a existência de 8 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo. T. cruzi apresenta diferentes proteínas de superfície relacionadas ao processo de invasão celular. Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa identificou em T. cruzi, uma proteína de 21 kDa (P21) que apresentou atividades pro-fagocíticas e quimiotáticas, exercendo papel importante na internalização desse protozoário in vitro. O presente trabalho teve como finalidade avaliar o papel da proteína recombinante P21-His6 baseada na P21 nativa de T. cruzi na infecção por Leishmania amazonensis, a fim de buscar maior entendimento no mecanismo de ação dessa proteína e sua relação com o hospedeiro in vivo. Para isso, infectamos as patas de animais BALB/c e tratamos os animais com 40&#956;g de P21 recombinante ativa e desnaturada, PBS e BSA por 6 semanas e avaliamos o tamanho da pata, a carga parasitária (PCR em tempo real) e a produção da citocina IL-1&#946; nas patas, linfonodos do poplíteo e baços. Os resultados mostraram aumento na área da pata, bem como aumento da carga parasitária nos animais infectados e tratados com a P21-His6. E ainda, aumento da produção da citocina Il-1&#946; na pata e no linfonodo do poplíteo também nos animais tratados com a P21-His6 também foram observados. Concluímos que a proteína P21 exerce papel pro-fagocítico também em experimentos in vivo, favorecendo a infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas resultante da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis são as espécies de maior potencial patogênico para o homem e de importância médica no Brasil. As células TCD4, quando ativadas por antígenos via MHC II podem se diferenciar em linhagens de células efetoras como Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). IL-23 é indispensável para as funções efetoras e manutenção de células Th17. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 em lesões cutâneas de pacientes com diferentes formas clínicas da LTA. Biópsias parafinadas de 44 pacientes foram submetidas à imunoistoquímica, sendo 6 casos de leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCADIDRM-) e leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDBIDRM-), ambas causadas por L.(L) amazonensis e 16 casos de leishmaniose cutânea localizada (LCLIDRM+) também causada por L.(L.) amazonensis; 9 casos de LCLIDRM+, 2 casos de LCDBIDRM- e 5 casos de leishmaniose cutâneo-mucosa (LCMIDRM+), todos causados por L.(V.) braziliensis. A densidade de células Tregs Foxp3+ no espectro clínico da LTA mostrou um aumento progressivo partindo das formas centrais LCL causadas por L.(V.) braziliensis (170mm2) e L.(L) amazonensis (140mm2) para as formas polares, LCADIDRM- (289mm2) e LCDBIDRM- (183mm2) causada por L.(L) amazonensis, LCDBIDRM- (189mm2) e LCMIDRM+, causadas por L.(V.) braziliensis (158mm2). A comparação entre as densidades de células IL-17+ nas diferentes formas clínicas da LTA mostrou um perfil semelhante também com um aumento progressivo da expressão de IL-17 partindo das formas centrais LCLIDRM+ causadas por L.(V.) braziliensis (232mm2) e L.(L) amazonensis (197mm2) em direção as formas polares, LCADIDRM- (470mm2) e LCDBIDRM- (340mm2) causada por L.(L.) amazonensis, LCDBIDRM- (431mm2) e LCMIDRM+ (372mm2) causada por L.(V.) braziliensis. A densidade de células IL-23+ mostrou perfil similar ao de IL-17 como no espectro de doença causada por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis: LCADIDRM- (687mm2), LCDBIDRM- (518mm2) e LCLIDRM+ (348mm2) por L.(L.) amazonensis, LCLIDRM+ (457mm2), LCDBIDRM- (609mm2) e LCMIDRM+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. Diante dos nossos achados, observa-se que as células Foxp3+, IL-17+ e IL-23+ desempenham um papel importante na imunopatogênese das diferentes formas clínicas da LTA causadas por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis, caracterizada por uma resposta imune polarizada de diferente expressão patológica / The American cutaneous leishmaniasis (ACL) presents a wide spectrum of clinical and immunopathological manifestations resulting from the interaction between the different species of Leishmania and the mechanisms of the host immune response. Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis are the species with the largest pathogenic potential for humans and medical importance in Brazil. The CD4+ T cells can be differentiated into effector cell lines as Th1, Th2, Th17 and regulatory T cells (Treg). IL-23 is essential for effector functions and maintenance of Th17 cells, that produces IL-17. The aim of this study was to evaluate the expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in cutaneous lesions of patients with different clinical forms of ACL. Paraffin embedded biopsies from 44 patients were submitted to immunohistochemistry, there were 6 cases of anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCLDTH-) and borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCLDTH-) both caused by L. (L.) amazonensis 16 cases of cutaneous leishmaniasis (LCLDTH+) caused by L. (L.) amazonensis, 9 cases of LCLDTH+, 2 cases of BDCLDTH- and 5 cases of mucocutaneous leishmaniasis (MCLDTH+) all caused by L. (V.) braziliensis. The density of Treg Foxp3+ cells in the clinical spectrum of ACL showed a progressive increase starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (170mm2) and L. (L) amazonensis (140mm2) towards the polar forms ADCLDTH- (289mm2). The intermediate clinical forms BDCLDTH- (183mm2) caused by L. (L) amazonensis and BDCLDTH-(189mm2) by L. (V.) braziliensis as well as, MCLDTH+(158mm2) did not present any significant differences. The comparison between the densities of IL-17+ cells in different clinical forms of ACL showed progressive increasing starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (232mm2) and L. (L) amazonensis (197mm2) towards the polar forms, ADCLDTH-(470mm2) and BDCLDTH-(340mm2) caused by L. (L.) amazonensis BDCLDTH- (431mm2) and MCLDTH+ (372mm2) caused by L. (V.) braziliensis. The density of IL-23+ cells showed a similar profile to that of IL-17 at the disease spectrum caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis: ADCLDTH-(687mm2) BDCLDTH-(518mm2) and LCLDTH+ (348mm2) by L. (L.) amazonensis; LCLDTH+ (457mm2) LCDBDTH-(609mm2) and MCLDTH+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. In view of our findings, we notice that the Foxp3+, IL-17+ and IL-23+ cells play an important role in the immunopathogenesis of different clinical forms of ACL caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis, characterized by an immune polarized response with different pathological expression